Name: imaging g protein-coupled receptor-mediated chemotaxis and its signaling events in neutrophil-like hl60 cells
Uploaded: 2016-09-14T14:00:00
Duration: 8 min 24 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Imaging G Protein-coupled Receptor-mediated Chemotaxis and its Signaling Events in Neutrophil-like HL60 Cells at JoVE.com

This work is supported by the intramural fund of NIAID, NIH.

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	<li>Pocha, S. M., Montell, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cellular+and+molecular+mechanisms+of+single+and+collective+cell+migrations+in+Drosophila:+themes+and+variations.">Cellular and molecular mechanisms of single and collective cell migrations in Drosophila: themes and variations.</a> Annual review of genetics. 48, 295-318 (2014).</li><li>Wen, Z., Zheng, J. Q. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Directional+guidance+of+nerve+growth+cones.">Directional guidance of nerve growth cones.</a> Current opinion in neurobiology. 16, 52-58 (2006).</li><li>Bravo-Cordero, J. J., Hodgson, L., Condeelis, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Directed+cell+invasion+and+migration+during+metastasis.">Directed cell invasion and migration during metastasis.</a> Current opinion in cell biology. 24, 277-283 (2012).</li><li>Zigmond, S. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chemotaxis+by+polymorphonuclear+leukocytes.">Chemotaxis by polymorphonuclear leukocytes.</a> The Journal of cell biology. 77, 269-287 (1978).</li><li>Jin, T., Xu, X., Hereld, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chemotaxis,+receptors+and+human+disease.">Chemotaxis, receptors and human disease.</a> Cytokine. 44, 1-8 (2008).</li><li>Dong, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=P-Rex1+is+a+primary+Rac2+guanine+nucleotide+exchange+factor+in+mouse+neutrophils.">P-Rex1 is a primary Rac2 guanine nucleotide exchange factor in mouse neutrophils.</a> Current biology : CB. 15, 1874-1879 (2005).</li><li>Li, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Directional+sensing+requires+G+beta+gamma-mediated+PAK1+and+PIX+alpha-dependent+activation+of+Cdc42.">Directional sensing requires G beta gamma-mediated PAK1 and PIX alpha-dependent activation of Cdc42.</a> Cell. 114, 215-227 (2003).</li><li>Van Haastert, P. 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H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ability+of+polymorphonuclear+leukocytes+to+orient+in+gradients+of+chemotactic+factors.">Ability of polymorphonuclear leukocytes to orient in gradients of chemotactic factors.</a> The Journal of cell biology. 75, 606-616 (1977).</li><li>Zicha, D., Dunn, G. A., Brown, A. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+new+direct-viewing+chemotaxis+chamber.">A new direct-viewing chemotaxis chamber.</a> Journal of cell science. 99 (Pt4), 769-775 (1991).</li><li>Muinonen-Martin, A. J., Veltman, D. M., Kalna, G., Insall, R. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+improved+chamber+for+direct+visualisation+of+chemotaxis.">An improved chamber for direct visualisation of chemotaxis.</a> PloS one. 5, e15309 (2010).</li><li>Bozzaro, S., Fisher, P. R., Loomis, W., Satir, P., Segall, J. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Guenther+Gerisch+and+Dictyostelium,+the+microbial+model+for+ameboid+motility+and+multicellular+morphogenesis.">Guenther Gerisch and Dictyostelium, the microbial model for ameboid motility and multicellular morphogenesis.</a> Trends in cell biology. 14, 585-588 (2004).</li><li>Xu, X., Jin, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Imaging+G-protein+coupled+receptor+(GPCR)-mediated+signaling+events+that+control+chemotaxis+of+Dictyostelium+discoideum.">Imaging G-protein coupled receptor (GPCR)-mediated signaling events that control chemotaxis of Dictyostelium discoideum.</a> Journal of visualized experiments : JoVE. , (2011).</li><li>Lin, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Generation+of+dynamic+temporal+and+spatial+concentration+gradients+using+microfluidic+devices.">Generation of dynamic temporal and spatial concentration gradients using microfluidic devices.</a> Lab Chip. 4, 164-167 (2004).</li><li>Eiseler, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Protein+kinase+D1+regulates+cofilin-mediated+F-actin+reorganization+and+cell+motility+through+slingshot.">Protein kinase D1 regulates cofilin-mediated F-actin reorganization and cell motility through slingshot.</a> Nature cell biology. 11, 545-556 (2009).</li><li>Roddie, P. H., Paterson, T., Turner, M. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Gene+transfer+to+primary+acute+myeloid+leukaemia+blasts+and+myeloid+leukaemia+cell+lines.">Gene transfer to primary acute myeloid leukaemia blasts and myeloid leukaemia cell lines.</a> Cytokines Cell Mol Ther. 6, 127-134 (2000).</li><li>Schakowski, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Novel+non-viral+method+for+transfection+of+primary+leukemia+cells+and+cell+lines.">Novel non-viral method for transfection of primary leukemia cells and cell lines.</a> Genet Vaccines Ther. 2, 1 (2004).</li><li>Uchida, E., Mizuguchi, H., Ishii-Watabe, A., Hayakawa, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comparison+of+the+efficiency+and+safety+of+non-viral+vector-mediated+gene+transfer+into+a+wide+range+of+human+cells.">Comparison of the efficiency and safety of non-viral vector-mediated gene transfer into a wide range of human cells.</a> Biol Pharm Bull. 25, 891-897 (2002).</li></ol>

The authors declare no competing financial interest for this work.

本研究では、我々は、走化性アッセイの二つの例を示す：細胞移動度分析装置による複数の走化性アッセイの最初の、同時モニタリングを。第二に、化学誘引物質勾配の可視化とリアルタイムで同じ細胞内シグナル伝達事象の時空間ダイナミクス。 複数の同時走化性アッセイのための細胞移動度分析装置本研究では、細胞移動度分析装置を用いて複数の同時走化性アッセイを実行するための詳細なプロトコルを導入しました。このデバイスは、ユーザは、従来の明視野観察では10倍の対物レンズで細胞走化性の挙動を観察することができます。なぜなら、流体の流れの拡散支配的特性を、細胞移動度分析装置は非常に予測可能な、安定した勾配を生成し、同時に実施される6走化性アッセイまで可能にします。プロトコルの重要なステップがあります信頼性の勾配を得るために、テラスライン上のセルを配置します。ユーザーは、厳密にホルダアセンブリおよび化学誘引物質と細胞を注入するための製造元の指示に従ってください。詳細な手順については、オンラインでもご利用いただけます。代替走化性方法11-13,15と比較して、このデバイスは、著しく走化性アッセイの信頼性と効率を向上させます。サイズのセルの移動度分析装置チップの4つのサイズは4、5、6、8ミクロンの異なるタイプ、細胞の大きさを収容するのに利用可能です。我々は、4または5μmの細胞移動度分析装置チップHL60およびDに適していることが見出さ直径約10〜15ミクロンであるdiscoideumの細胞 。しかし、1つの制限は、この装置は、セルの全てのタイプに適していないということです。我々は、Raw267.4細胞と細胞移動度分析装置走化性アッセイを使用してほとんど成功していました。その理由は、Raw267.4細胞があまりにもゆっくりと移行している可能性があります。効率的なチェために必要な時間Raw267.4細胞のmotaxisは勾配がデバイスによって維持されている時間よりもはるかに長くなる可能性があります。代わりに、トランスウェル遊走アッセイは、Raw267.4細胞9のためによく働きました。別の制限は、蛍光観察は、現在の装置では不可能であるということです。今後の方向性は、より高い倍率で蛍光イメージングを監視することです。これは、蛍光検出および100倍の対物レンズを備えている改善された細胞の移動度分析装置を用いて可能です。また、同時に多数のアッセイはまた、すべてのこれらの改善は、走化性アッセイの増強能力、細胞の移行における細胞内動態の観察を容易に12に増加します。 HL60細胞の高いトランスフェクション効率は、蛍光タンパク質タグ化タンパク質を発現します HL60細胞は活発に分裂白血病細胞株であり、懸濁液中で増殖します。以前18-20に報告されたように、HL60細胞は、Gに耐性でありますエン転送。脂質及びエレクトロポレーション、遺伝子転写の両方がテストされている、およびエレクトロポレーションが原因でエレクトロポレーションに起因する深刻な損傷の高いトランスフェクション効率を得るために重要である後に高い生存率を取得部4で詳細に説明するように、より高いトランスフェクション効率は、エレクトロポレーションを用いて得ました。続いて、徹底した穏やかな細胞処理は、特にエレクトロポレーション後、必要とされます。すべてのメディアは、予め温め、ゆっくりとエレクトロポレーション後の任意の段階で細胞に添加しなければなりません。また、エレクトロポレーション試薬への細胞の暴露時間を最小限に抑えることが重要です。細胞死を回避するために、エレクトロポレーション後、RPMI1640培地エレクトロ回復培地は直ちに細胞に添加されなければなりません。我々は、回復培地中20％FBS、10％FBSよりもはるかに高い細胞回収率を与えることを見出しました。エレクトロポレーション後、30分間のRPMI1640エレクトロ回復培地でのインキュベーションは、より高い生存率およびトランスフェクションのために重要です効率。さらに、トランスフェクション効率を高めるために、我々はまた、製造業者が推奨するプラスミドのほぼ二倍の量は、トランスフェクションあたり4μgのプラスミドDNAを使用しました。 タンパク質発現の仮初と細胞数の制限（トランスフェクションあたり2×10 6細胞）：エレクトロポレーショントランスフェクション上の2つの主要な制限があります。ベクタープラスミドは、各細胞分裂の後半分に希釈されるの​​で、未分化細胞においては、発現は、唯一の細胞分裂の最初のカップルの間に検出可能です。分化したHL60細胞には48を超える時間を生き残るありません。その結果、いずれの実験では、新鮮なトランスフェクションを、実験前に6時間を必要とします。 1エレクトロポレーション用の細胞数は、単に任意の生化学的アッセイのための最小要件を満たしています。繰り返し使用や大量の目的のために、強く、未分化のHL60細胞株を安定的に目的のタンパク質を発現することを確立することをお勧めしますWHIウイルスベクターが利用可能であるか、または構築することができる場合はchが、ウイルスベクターにより蛍光タンパク質でタグ付けされています。

真核細胞は感知し、化学誘引物質勾配、走化性と呼ば細胞プロセス内のより高い濃度に向かって移動します。走化性は、胚発生1、ニューロンパターニング2、癌細胞の転移3、炎症4の部位への好中球の動員、およびモデル生物細胞性粘菌 5の開発など多くの生理学的プロセスにおいて重要な役割を果たしています。一般に、真核細胞は、Gタンパク質共役型受容体5を使用して化学誘引物質を感知します。これらの受容体との化学誘引物質の係合は、次に、最終的に細胞遊走5-9を駆動するアクチン細胞骨格の時空間組織を調節する下流のシグナル伝達経路を活性化するヘテロ三量体Gタンパク質GαとGβγの分離を促進します。 細胞生物学者が開発し、走化を改善してきましたアッセイは、Gタンパク質共役受容体（GPCR）シグナル伝達仲介は、細胞遊走を向け方法調べることです。 Boydenチャンバーまたはトランスウェル遊走アッセイはボイデン10によって1960年に開発されました。アッセイは、微多孔膜によって分離された2つのウェル間の化学誘引物質化合物の勾配を作成することによって動作します。そのシンプルさと使いやすさは、それまでで最も広く使用されている走化性アッセイ作ります。しかし、細胞の移行プロセスを有効にしないアッセイが可視化されます。 Zigmond室は、ソース化学誘引物質11に向かって狭いくびれ全体でカバースリップ上の細胞移動の明確なイメージングを可能にする第1の視覚マイクロ流体デバイスです。ダン12とInsall 13は、修正されたとZigmondチャンバー走化性アッセイの高解像度と長期撮像能力を向上させました。そのため、流体の流れの高度に予測可能な、拡散支配的な特性のため、マイクロフルイディクスは、次の-generatiのためのソリューションを提供してきましたこのようなEZ-TAXIScan（セル移動度分析装置）などの走化性アッセイに。 傾斜の安定性を確保して、装置は6走化性アッセイを同時に行うことを可能にする（ 図1A）。上記の様々なチャンバアッセイにおいて生成された方向に固定勾配とは対照的に、ギュンターGerischによって開発された針又はマイクロピペットアッセイは、可動ソース14との勾配を生成します。アッセイでは、化学誘引物質は、安定した勾配を生成するために、可動マイクロピペットから放出されます。この針アッセイで、研究者らは、異なる細胞が根本的に異なる特性を持つ偽足を生成することがわかりました。蛍光顕微鏡を適用して、我々は15を通じて、その定量的な測定を容易にするために、勾配を可視化することができました。本研究では、同時に複数の走化性ASSAを監視し、走化性HL60（ヒト前骨髄球性白血病）細胞を調製するための詳細な方法について説明しますセル移動度分析装置、および可視、時空制御可能な化学誘引物質の刺激に応答して、このような単一生細胞におけるタンパク質キナーゼD1とシグナル伝達分子のGPCRが媒介する時空間的動態を可視化するとYS。私たちの高度な画像処理方法は、一般的な走化性の研究に適用され、そして哺乳動物細胞系に特に適していることができます。

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="459">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="61">
			<td height="61" style="height:61px;width:120px;">RPMI 1640 Medium GlutaMAX</td>
			<td style="width:107px;">Life technologies</td>
			<td style="width:120px;">61870-036</td>
			<td style="width:113px;"></td>
		</tr>
		<tr height="41">
			<td height="41" style="height:41px;width:120px;">Sodium pyruvate</td>
			<td style="width:107px;">Thermo Fisher Scietific</td>
			<td style="width:120px;">11360-070</td>
			<td style="width:113px;"></td>
		</tr>
		<tr height="41">
			<td height="41" style="height:41px;width:120px;">Fetal bovine serum</td>
			<td style="width:107px;">Gemini Bio-Products</td>
			<td style="width:120px;">100-106</td>
			<td style="width:113px;"></td>
		</tr>
		<tr height="41">
			<td height="41" style="height:41px;width:120px;">1M HEPES sterile solution, pH7.3</td>
			<td style="width:107px;">Quality Biological Inc.</td>
			<td style="width:120px;">A611-J848-06</td>
			<td style="width:113px;"></td>
		</tr>
		<tr height="61">
			<td height="61" style="height:61px;width:120px;">Penicillin streptomycin solution</td>
			<td style="width:107px;">Fisher Scientific</td>
			<td align="right" style="width:120px;">15140122</td>
			<td style="width:113px;"></td>
		</tr>
		<tr height="25">
			<td height="25" style="height:25px;width:120px;">NucleofectorTM 2b</td>
			<td style="width:107px;">Lonza</td>
			<td style="width:120px;">AAB-1001</td>
			<td style="width:113px;"></td>
		</tr>
		<tr height="217">
			<td height="217" style="height:217px;width:120px;">AmaxaTM Cell Line NucleofectorTM Kit V including NucleofectorTM Solution, Singe use pipettes, AmaxaTM certified 100 ml aluminum electrode cuvettes</td>
			<td style="width:107px;">Lonza</td>
			<td style="width:120px;">VCA-1003</td>
			<td style="width:113px;"></td>
		</tr>
		<tr height="81">
			<td height="81" style="height:81px;width:120px;">Lab-Tek chambered #1.0 Borosilicate Coverglass</td>
			<td style="width:107px;">Nalge Nunc International Inc</td>
			<td align="right" style="width:120px;">155383</td>
			<td style="width:113px;"></td>
		</tr>
		<tr height="41">
			<td height="41" style="height:41px;width:120px;">2 % Gelatin solution</td>
			<td style="width:107px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:120px;">G1393</td>
			<td style="width:113px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:120px;">Fibronectin</td>
			<td style="width:107px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:120px;">F1141</td>
			<td style="width:113px;"></td>
		</tr>
		<tr height="61">
			<td height="61" style="height:61px;width:120px;">HBSS (Hanks&#8217; Balanced Salt Solution)</td>
			<td style="width:107px;">Life technologies</td>
			<td style="width:120px;">14025-076</td>
			<td style="width:113px;"></td>
		</tr>
		<tr height="39">
			<td height="60" rowspan="2" style="height:60px;width:120px;">Bovine serum albumin</td>
			<td rowspan="2" style="width:107px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td rowspan="2" style="width:120px;">A3803</td>
			<td rowspan="2" style="width:113px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
		</tr>
		<tr height="61">
			<td height="61" style="height:61px;width:120px;">Single well Lab-Tek II coverglass chambers</td>
			<td style="width:107px;">Nalge Nunc International Inc</td>
			<td align="right" style="width:120px;">155361</td>
			<td style="width:113px;"></td>
		</tr>
		<tr height="61">
			<td height="61" style="height:61px;width:120px;">Four-well Lab-Tek II coverglass chambers</td>
			<td style="width:107px;">Nalge Nunc International Inc</td>
			<td align="right" style="width:120px;">155383</td>
			<td style="width:113px;"></td>
		</tr>
		<tr height="41">
			<td height="41" style="height:41px;width:120px;">Alexa 594</td>
			<td style="width:107px;">Thermo Fisher Scientific</td>
			<td style="width:120px;">A-10438</td>
			<td style="width:113px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:120px;">fMLP</td>
			<td style="width:107px;">Sigma -Aldrich</td>
			<td style="width:120px;">F3506-5MG</td>
			<td style="width:113px;"></td>
		</tr>
		<tr height="61">
			<td height="61" style="height:61px;width:120px;">Cover glass thickness 2 22 x 22 mm</td>
			<td style="width:107px;">Corning</td>
			<td style="width:120px;">2855-22</td>
			<td style="width:113px;"></td>
		</tr>
		<tr height="41">
			<td height="41" style="height:41px;width:120px;">EZ-TAXIScan</td>
			<td style="width:107px;">Effector Cell Institute, Inc.</td>
			<td style="width:120px;">MIC-1001</td>
			<td style="width:113px;"></td>
		</tr>
		<tr height="41">
			<td height="41" style="height:41px;width:120px;">EZ-TAXIScan chip (5 mm)</td>
			<td style="width:107px;">Effector Cell Institute, Inc.</td>
			<td style="width:120px;">EZT-F01-5</td>
			<td style="width:113px;"></td>
		</tr>
		<tr height="41">
			<td height="41" style="height:41px;width:120px;">1701RN 10ul syringe</td>
			<td style="width:107px;">Hamilton</td>
			<td align="right" style="width:120px;">80030</td>
			<td style="width:113px;"></td>
		</tr>
		<tr height="41">
			<td height="41" style="height:41px;width:120px;">Femtotips II Injection tips</td>
			<td style="width:107px;">Eppendorf</td>
			<td align="right" style="width:120px;">5242956003</td>
			<td style="width:113px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:120px;">Femtotips II</td>
			<td style="width:107px;">Eppendorf</td>
			<td align="right" style="width:120px;">930000043</td>
			<td style="width:113px;"></td>
		</tr>
		<tr height="121">
			<td height="121" style="height:121px;width:120px;">TransferMan NK2, including motor module, X head with angle adjuster, and Positioning aids.&#160;</td>
			<td style="width:107px;">Eppendorf</td>
			<td align="right" style="width:120px;">5188900056</td>
			<td style="width:113px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:120px;">DIAS software</td>
			<td style="width:107px;">Solltech Inc.</td>
			<td style="width:120px;"></td>
			<td style="width:113px;"></td>
		</tr>
		<tr height="181">
			<td height="181" style="height:181px;width:120px;">LSM 780 META or equivalent confocal microscope with a 40X 1.3 NA or 60X 1.4 NA oil DIC Plan-Neofluar objective lens</td>
			<td style="width:107px;">Carl Zeiss</td>
			<td style="width:120px;"></td>
			<td style="width:113px;"></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

imaging g protein-coupled receptor-mediated chemotaxis and its signaling events in neutrophil-like hl60 cells

Eukaryotic cells sense and move towards a chemoattractant gradient, a cellular process referred as chemotaxis. Chemotaxis plays critical roles in many physiological processes, such as embryogenesis, neuron patterning, metastasis of cancer cells, recruitment of neutrophils to sites of inflammation, and the development of the model organism Dictyostelium discoideum. Eukaryotic cells sense chemo-attractants using G protein-coupled receptors. Visual chemotaxis assays are essential for a better understanding of how eukaryotic cells control chemoattractant-mediated directional cell migration. Here, we describe detailed methods for: 1) real-time, high-resolution monitoring of multiple chemotaxis assays, and 2) simultaneously visualizing the chemoattractant gradient and the spatiotemporal dynamics of signaling events in neutrophil-like HL60 cells.

細胞移動度分析装置を使用して複数のHL60細胞の走化性の同時イメージングマイクロ流体16の原理に基づいて、製造業者は勾配のシミュレートされたプロファイルを提供した：勾配は、1分以内に生成された5分以内に安定化し、そして2時間にわたって維持されます。マイクロ流体工学により生成された安定した勾配の高度に予測可能なプロファイルが複数走化性アッセイを同時に行うことを可能にします。本研究では、我々は3同時走化性アッセイ（ 図2Aおよびムービー1）を観察しました。私たちは、HL60細胞が化学誘引物質は、化学誘引物質のウェルに注入した直後のchemotaxing開始したことを発見し、勾配の安定性のためのシミュレーション結果と一致し、次の60分間の直線路でchemotaxing続けました。移動経路および形態をトレース細胞の定量的測定および細胞（ 図2B）の合計のパスの長さ、速度、方向、および丸みを含み走化性インデックスを使用して、走化性行動のその後の比較を可能にします。総経路長は、パスの重心を結ぶ線分の長さの合計です。速度は、時間の総経路長を分割することにより得られます。総経路長さで割っ（Yパスの最後の座標マイナスYは最初の座標）方向が上向きに測定されると定義されます。これは、上方への直接移動物体のために1.0を提供します。セルの真円度は、周囲の所定量が領域を囲む方法を効率的に（パーセント）尺度です。円は、任意の周囲の最大面積を有しており、100％の真円度パラメータがあります。直線領域はありませんし、0％の真円度パラメータがあります。選択された走化性パラメータにより記載されているように我々は、定量的に測定走化性挙動を示します（ 図2C）。 時空間可視および制御可能なのfMLP刺激下HL60細胞におけるPKD細胞内局在を監視実験系に蛍光標識し、制御可能な化学誘引刺激を適用するための大きな技術的進歩です。歴史的に、我々は細胞応答や行動を観察するために、均質な（とも呼ばれる均一な）刺激または勾配刺激のいずれかを適用しています。しかし、「ブラインド」刺激は、刺激が細胞に到達する方法には、時空間情報を提供していないだけでなく、私たちは刺激が表示されていないという理由だけで、刺激に対する細胞応答のいずれかの「異常」の観測に疑問を投げかけます。我々は以前に、蛍光色素（Alexa594）は、化学誘引物質濃度とMとの間の線形関係を確立するために化学誘引物質を適用することができることを示しています蛍光色素の強度15を onitored。緑色蛍光タンパク質（GFP）、蛍光色素（Alexa594）、透過光の赤色発光の収集構成により、我々は、付着細胞、刺激の適用、及び刺激に対する細胞応答をモニターすることができる（ 図図3（a））。プロテインキナーゼDは、有向細胞遊走9,17に重要な役割を果たしているセリン/スレオニンキナーゼのファミリーです。均一に塗布fMLPで（赤）刺激に応答して、HL60細胞は、GFPタグ化タンパク質キナーゼD1（緑）（ 図3Bおよびムービー2）の強固な膜移行を仲介します。 fMLPの勾配（赤）（ 図4A）では、HL60細胞が活発にリーディングエッジ（ 図4Bおよびムービー3）にPKD1を募集します。リーディングエッジの突起におけるGFPの細胞内局在の密接な比較は（PKD1は、前縁の後部に局在することを示しています図4C）。 <img alt="図1" src="/files/ftp_upload/54511/54511fig1.jpg" /> 図1.セル移動度分析装置は、6同時走化性アッセイまで使用できます。（A）スキームは、6つの独立した走化性アッセイの同時モニタリングのための細胞移動度分析装置のチップの設計を示 ​​します。レッドは、化学誘引物質をウェルに加え示しています。細胞のウェルに（B）HL60細胞の導入化学誘引物質が定常のfMLP勾配を確立するために拡散している。 <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/54511/54511fig1large.jpg" target="_blank">この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。</a> <img alt="図2" src="/files/ftp_upload/54511/54511fig2.jpg" /> HL60細胞を用いた複数の走化性アッセイの図2.同時モニタリング。（ </stro&gt;）モンタージュngのは、細胞の移動度分析装置は勾配の適用後に0と12分の時間で走化性に対するPKD特異的阻害剤の阻害効果を調べるために走化性アッセイの画像を示しています。走化性HL60細胞を、30分間、PKD阻害剤1μMのCID755673で前処理しました。 PKD阻害剤の治療を伴うまたは伴わないHL60細胞をRPMI1640飢え培地または12分間100 nMでのfMLP勾配のいずれかに走化させました。 （B）方式は、トレースHL60細胞の移動経路の長さと形態を示します。総経路長さ、速度、方向、及び真円度などの走化性の（C）定量。 SDが示されている平均±。 n = CID755673処理と無勾配、fMLPの勾配CID755673処理なし、とのfMLPの治療のための10、12、または11、それぞれ。 <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/54511/54511fig2large.jpg" target="_blank">この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。</a> 均一に塗布fMLPの刺激に応答して、PKD1の図3. GPCR媒介強固な膜移行。PKD1-GFP（緑色）の（A）マルチチャンネルのモニタリング、化学誘引物質（1μMのfMLPは赤を0.1μg/ mlの蛍光色素アレクサ594と混合） RPMI 1640培地中の0.2％ゼラチンでコーティングした4wellチャンバーのウェルに付着HL60細胞を同定するため、およびDIC（微分干渉コントラスト）。 =10μmのスケールバー。 （B）モンタージュは均一に塗布fMLPの（赤）PKD1-GFP（緑色）の強固な膜移行を誘導することを示している。 <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/54511/54511fig3large.jpg" target="_blank">この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。</a> <img alt="図4" src="/files/ftp_upload/54511/54511fig4.jpg" /> FigurHL60細胞をchemotaxingにおけるPKD1の電子4.リーディングエッジローカライズ。（A）チャンネルモード取得設定はfMLPの勾配とPKD1の時空間ダイナミクスの可視化を容易にします。で- C、HL60細胞を一過GFPタグPKD1を発現しました。マイクロピペット（DIC）、100 nMのfMLPで（レッド）から生成されたのfMLP勾配を可視化するためには0.1μg/ mlの蛍光色素アレクサ594（B）chemotaxing細胞の先端のPKD1の濃縮された局在と混合しました。 =10μmのスケールバー。 （C）合併画像 ​​はPKD1はHL60細胞における最先端の後部に局在することを示しています。グリーンはPKD1細胞内局在を示しており、DIC画像は、前縁の突出領域を示しています。スケールバー=5μmである。 <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/54511/54511fig4large.jpg" target="_blank">この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。</a>

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Imaging G Protein-coupled Receptor-mediated Chemotaxis and its Signaling Events in Neutrophil-like HL60 Cells

視覚走化性アッセイは、走化性因子媒介方向の細胞遊走を制御する方法、真核細胞のより良い理解のために不可欠です。 1）リアルタイム、複数の走化性アッセイの高解像度の監視、および2）を同時に化学誘引物質勾配を可視化し、好中球様HL60細胞内シグナル伝達事象の時空間ダイナミクス：ここで、我々はのための詳細な方法について説明します。

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Eukaryotic cells sense and move towards a chemoattractant gradient, a cellular process referred as chemotaxis. Chemotaxis plays critical roles in many ...

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