Name: protein complex affinity capture from cryomilled mammalian cells
Uploaded: 2016-12-09T13:00:00
Duration: 10 min 37 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Protein Complex Affinity Capture from Cryomilled Mammalian Cells at JoVE.com

Vi takker professor Brian T. Chait for hans uvurderlige råd, støtte og adgang til MS instrumentering, samt Ms Kelly R. Molloy for fremragende teknisk support. Vi takker Ms Kelly Bare for støtte med kopi redigering. Dette arbejde blev støttet delvist af NIH tilskud P41GM109824, P41GM103314, og P50GM107632.

1. Cell Høst og frysning <ol><li> Grow 1-8 g cellemateriale anvendelse af de passende dyrkningsbetingelser for cellelinjen af interesse 25,26. Denne protokol er optimeret til op til 8 gram celler (~ 10 9 celler), modificerede fra referencer 19,27,28. Typisk ~ kan fås 5 g HEK-293 eller HeLa-celler fra otte 500 cm2 dyrkningsplader dyrket til ~ 90% sammenflydning. ADVARSEL: Disse protokoller anvender flydende nitrogen (LN 2), der kan forårsage alvorlige kryogene forbrændinger. Don beskyttelsesbeklædning og forholdsregler motion passende håndtering. </li><li> Hæld vækstmediet (affald) i et stort bægerglas. </li><li> Placer dyrkningsskålen på is i en stor rektangulær is pan. </li><li> Der tilsættes 20 ml iskold 1x phosphatpufret saltvand (PBS) til dyrkningsskålen og frigivelse af cellerne fra skålen ved hjælp af en stor celleskraber; overføre cellerne til et 50 ml rør, præ-afkølet på is; holde røret på is. NOTE: For alle celle håndtering trin bruger en elektro-pipette indstillet til &quot;lav&quot; og 25 ml pipetter for at undgå overdreven forskydning af celler under transfer manipulationer. Arranger 50 ml indsamling rør og 1x PBS i en ice bucket før indledningen af ​​proceduren. </li><li> Tilføj yderligere 10 ml iskold 1x PBS til samme skålen. Indsamle de resterende celler og overføre dem til 50 ml rør. </li><li> Gentag for hver ret; cellesuspensioner fra forskellige retter kan kombineres for at reducere prøvenummer og plastaffald. BEMÆRK: Da cellerne selv ikke vil udgøre en stor del af den mængde suspension, kan tre plader værd cellesuspension kombineres i to 50 ml rør. Fordi 50 ml rør faktisk holde mere end det nominelle volumen, kan otte plader typisk spredt over fem sådanne rør. </li><li> Centrifuger i 5 minutter ved 1.000 xg, 4 ° C. </li><li> Forsigtigt hæld supernatanten. Resuspender hver pellet i 10 ml iskold 1x PBS. Konsolidere resuspended pellets, op til 5 pr 50 ml rør, for at reducere antal stikprøver. </li><li> Centrifuger i 5 minutter ved 1.000 xg, 4 ° C. </li><li> Forsigtigt hæld supernatanten. Pellet resuspenderes i 10 ml iskold 1x PBS </li><li> Fjern stemplet fra en 20 ml sprøjte og sæt den til side. Cap dysen af ​​sprøjten og overføre cellesuspensionen til den. </li><li> Placer sprøjten i en 50 ml rør og centrifugeres i 5 minutter ved 1.000 xg, 4 ° C. </li><li> Aspirer supernatanten med en fin spids pipette fastgjort til en vakuum fælde ordning indtil lige det øverste lag af celler begynder at blive suget op. Dette resulterer i en våd cellepellet. </li><li> Tag hætten af sprøjten, indsætte stemplet og drypper cellerne direkte i en stor plastik bæger fyldt med LN 2, holdes i en LN 2 bad i en Styrofoam boks. Tvang kaster de resterende celler fra sprøjten. </li><li> Overfør de frosne celler til 50 ml rør ved at hælde. Løst låg på rørene for at tillade overskydende LN2 til at fordampe; holde them natten over ved -80 ° C. Spænd caps fuldt næste dag. Det frosne celle kan opbevares på denne måde ved -80 ° C indtil cryomilling. BEMÆRK: Du må ikke stramt lukke rørene før alle de LN 2 har synligt fordampet, ellers for højt tryk kan forårsage røret til at eksplodere. Lukker ikke rørene efter LN2 er forsvundet, kan resultere i akkumulering af frost på celler materiale, tilsætning af overskud af vand vægt og effektivt at reducere protein koncentration efter formaling. </li></ol> 2. Kryogene Forstyrrelse af frosne celler BEMÆRK: Alle værktøjer til fræsning og manipulationer bør være præ-kølet med LN 2. En lille karaffel vil være behov for tilsætning af LN2 inden i glasset og til at hælde LN2 over toppen af det lukkede fræsning krukke. En hjemmelavet værktøj er vist i henvisning 19. Kryogene handsker vil være behov for at håndtere LN2 afkølede formalingsapparat. formalingenjar låg anvendes her (se tabel of Materials) typisk skib med en gummipakning installeret; dette vil skal udskiftes med en kommercielt tilgængelig Teflon låg pakning til pålideligt udføre følgende protokol. På grund pres fra gasformig N2 kan bygge op til høje niveauer i krukken under fræsning, anbefaler vi at installere en kommercielt tilgængelig 5 bar / 500 kPa tryk ventil som et sikkerhedsnet release sikkerhedsforanstaltning 28. <ol><li> Fjern celle perler fra -80 ° C opbevaring og holde i et 50 ml rør holder i en LN 2 bad. </li><li> Pre-køle 50 ml krukke, to 20 mm kugler, og låget i en ren rektangulær ice bucket indeholdende LN2. Pre-køle polytetrafluorethylen (PTFE) isolator, hvis ved hjælp af en; enten et sæt pucke (Se reference 27), eller en muffe-og-puck (se figur 2). Pre-køling er færdig, når den voldelige kogning af LN 2 beroliger. </li><li> Set passende modvægt påmølle. BEMÆRK: Denne vil være lig med massen af ​​krukken, jar låg, formalingskuglerne der anvendes, og mængden af ​​celler, hvormed krukken. Hvis der anvendes nogen PTFE isolatorer, bør deres masse også inkluderes. Vi foreslår, at optage masserne af krukken, låget og kugler (og deres samlede masse, herunder eventuel isolator anvendt) på forhånd og optage dem på en oplysende ark lagret nær møllen. </li><li> Med pincet, placere to forud afkølet 20 mm fræsning bolde og de frosne celler inden i forkølede fræsning krukke. Bemærk: På grund af små tab af materiale på glasset og bolden overflader under fræsning, procentdelen af ​​genvundne materiale stiger som massen af ​​celler formalet stiger. Ved den beskrevne metode, materielle tab er meget beskedne, at være på rækkefølgen af ​​~ 0,3 g våd celle vægt (WCW). Producentens retningslinjer angiver den maksimale prøvevolumen indlæst bør være ~ 1/3 af krukke volumen. 29. Det samlede volumen af kuglerne bør være ~ 1/3 og remaining ~ 1/3 ledig plads er til fri bevægelighed for boldene. </li><li> Tilføj LN 2 til krukken op til ~ ½ fuld, placere låget på krukken og overføre samlingen til møllen. BEMÆRK: Installer først den valgte isolator hvis du bruger en. </li><li> Spænd samlingen på plads og udføre tre cyklusser af fræsning bruger følgende program: 400 rpm, 3 min, omvendt rotation hvert minut, ingen interval pause. Afkøl formaling krukke med LN2 i mellem hver cyklus. BEMÆRK: Under fræsning af en særskilt clunking støj genereres som kuglerne kolliderer i krukken i planeternes bevægelse. Hvis disse lyde ikke bliver hørt, er fræsning ikke forekommer. Afslut fræsecyklus, tæller ikke denne cyklus, flytte krukken samling tilbage til LN 2 og undersøge indholdet af krukken. Sikre ingen is har dannet og hvis det har, chip den væk fra jar vægge med en forafkølet spatel. Begynd igen fra trin 2.5. Hvis du bruger ingen isolator eller isolator pucke, flytte krukken samling tilbage til LN <sub&gt; 2 mellem cykler for at re-cool og tilføje LN 2 til ~ ½ fuld hver gang. LN2 tilføjet vil fordampe inden krukken som temperaturen af krukken stiger under formaling. Dette resulterer i trykopbygning i krukken. Derfor, når frakobling af krukken fra møllen, frigive klemmen meget langsomt. Hvis klemmen er frigivet hurtigt, kan celle pulver flygte med hurtigt trykfald. En langsom frigivelse af klemmen tillader trykket at slippe ud af krukken i en blid, kontrolleret måde, og forhindrer tab af cellemateriale. Den blide udslip af gasformige N2 kan ofte høres hvislende som klemmen langsomt frigives - dette er normalt. Hvis der anvendes en muffe-og-puck isolator, kan krukken samling efterlades i møllen og LN2 tilsat til isolatoren / jar samling in situ. </li><li> Flyt krukke tilbage til LN 2, og lad hvile et øjeblik for at køle af. Hvis der anvendes en muffe-og-puck isolator, kan krukken fjernes fra muffen wed hjælp af to spatler, giver gearing på begge sider. Når glasset hviler i LN2, forsigtigt fjerne låget, fjerne kuglerne med pincet, og overføre pulveret til en forud afkølet 50 ml glas med en forafkølet spatel. Tilføjelse af en lille LN 2 til den åbne krukke / pulver kan bidrage til at fjerne pulver, der caked på kuglerne, før du fjerner dem. BEMÆRK: Når krukken er blevet åbnet, tilsættes en lille mængde LN 2 til det, før du fjerner boldene. Dette vil bidrage til at inddrive pulver caked på overfladerne. Cell pulver bør holdes ved -80 ° C eller derunder, indtil brug. Det er vores erfaring, kan celle pulver opbevares på denne måde, i det væsentlige på ubestemt tid, uden at påvirke ydeevnen. </li></ol> 3. affinitetsindfangning af proteinkomplekser fra celleekstrakter BEMÆRK: Følgende protokol implementerer affinitet medier består af en affinitetsligand, lokkemad eller antistof, som interagerer med proteinet af interesse, coupled at micron skala paramagnetiske perler. Disse kan fremstilles in-house 19,30, ved anvendelse af kommercielt tilgængelige kits, eller købes som færdige reagenser. <ol><li> Celleekstrakt Fremstilling BEMÆRK: Ved håndtering celle pulver, husk at bruge redskaber og rør for-kølet med LN 2. Rør indeholdende cellen pulver bør altid holdes på LN 2, når de ikke ved -80 ° C. Placer 50 ml rør (r) indeholdende celle pulver i et rør rack, i en Styrofoam beholder med LN2. <ol><li> Der afvejes 100 mg af celle pulver i et 1,5 eller 2 ml mikrofugerør. BEMÆRK: Vi har observeret, at denne mængde af celler er et godt udgangspunkt, der typisk vil give target protein i snesevis til hundredvis af nanogram spænder efter affinitet capture for en moderat udtrykt protein (~ 50 kDa masse, til stede på tusindvis af kopier pr celle), formodning udvinding og fange virkningsgrader målet er ≳70%. Sådanne udbytter giver direkte visualization af den oprensede fraktion ved SDS-PAGE og protein-farvning. </li><li> Tare analysevægt med den tomme mikrofugerør. Dispensere celle pulver i et rør under anvendelse af en LN2 afkølet ske eller spatel. Tjek massen af ​​pulveret dispenseres i røret på den analytiske balance. BEMÆRK: For at lette afvejning af celle pulvere kan små volumenmaalere skeer anvendes. Disse har vist sig at give reproducerbare resultater (Se reference 19). Vi har fundet de bedste resultater ved hjælp af skruelåg eller &quot;safe-lock &#39;mikrocentrifugerør. Pres fra fordampning LN 2, der kan komme ind rørene kan forårsage standard mikrocentrifugerør til pop åben under efterfølgende opvarmning lige før tilsætning af ekstraktionsopløsningen - potentielt resulterer i tab af prøven. </li><li> Åben tuben (eller løsne skruelåg) med celle pulver og lad stå ved stuetemperatur i 1 min. Dette vil frigøre trykket inde i røret og forhindre den umiddelbare nedfrysning af ekstraktionenopløsning ved tilsætning til pulveret. Ingen optøning observeres i løbet af denne 1 min inkubation. </li><li> Tilføj 400 pi ekstraktionsmiddel suppleret med proteasehæmmere og vortex kortvarigt, derefter holde på is, mens du fortsætter til trin 3.1.5. Prøverne bør holdes på is mellem alle efterfølgende manipulationer indtil eluering. BEMÆRK: Den bedste sammensætning ekstraktionsmidlet vil afhænge af proteinkomplekset (r), der skal oprenses. Nogle generelle vejledning findes i tabel 1, og de understøttende referencer. </li><li> Brug en mikrospids ultralydsapparat at give prøven en kort lavenergi puls til at sprede eventuelle aggregater. (Ultra) soniker med 4 pulser (2 sek hver, 2 A, ca. 15-20 J af den samlede energi). BEMÆRK: vortexbehandling dispenserer cellen pulver i ekstraktionsmidlet, men afhængigt af opløsningen karakter, kan nogle aggregater iagttages. Vi har fundet, at sprede disse aggregater giver det bedste udbytte under efterfølgende affinitet fange. En kort microtip sonikation nemt spreder disse aggregater. Løsningen skal vises halvgennemsigtigt men homogen, uden åbenlyse aggregater. Vandbad sonikatorer tendens til at være for lav effekt til effektivt sprede sådanne aggregater uden væsentlig længere prøvehåndtering gange, men kan være egnet med passende indstillinger. </li><li> Ekstraktet klares ved centrifugering (f.eks, 20.000 xg, 10 min, 4 ° C). BEMÆRK: En portion af den klarede celleekstrakt kan gemmes til sammenligning med indholdet af pelleten, post-affinitetsindfangning supernatant, og de opnået efter eluering fra affinitetsmediet fraktioner for at bestemme effektiviteten af ​​ekstraktion og opsamling af målproteinet fx ved Western blot (se diskussion). </li><li> Fjern supernatanten (klarede ekstrakt) og fortsæt til affinitet fange. BEMÆRK: Pelleten kan genekstraheret i SDS-PAGE prøvepåsætningsbuffer ved 70 ° C for at bestemme graden af ​​frigivelse af målproteinet dnder den indledende ikke-denaturering udvinding ved sammenligning med ekstrakt opnået i trin 3.1.6. </li></ol></li><li> affinitetsindfangning <ol><li> Forvask den magnetiske affinitetsmedium. Dette kan gøres mens celleekstrakter bliver centrifugeret. </li><li> Placer røret (rørene) på magneten. Perlerne vil akkumulere på den side af røret inden for få sekunder, hvilket tillader oplagring opløsningen, der skal fjernes. </li><li> Der tilsættes 500 pi ekstraktionsopløsning til perler. Kort vortex mix ved middel hastighed (tilstrækkeligt til at resuspendere). Puls-spinde rørene i en mini-centrifuge for at opsamle alle indhold til bunden. Dermed sikrer minimale fremførsel af løsninger. Rørene anbringes på magneten og opsug opløsningen. BEMÆRK: Magnetiske medier med særpræg er tilgængelige fra en bred vifte af kommercielle leverandører. Resultaterne kan variere afhængigt af disse karakteristika, herunder perlestørrelse, ensartethed, overfladebelægning, og antistof kobling kemi. Side-by-side forsøg i din ansøgning anbefales før afvikling på et valg reagens. </li><li> Indled affinitet capture ved at overføre den klarede celle ekstrakt til en 1,5-2,0 ml rør indeholdende kortvarigt forvasket affinitet medium og vortex for at resuspendere. </li><li> Inkuber i 30 minutter ved 4 ° C med kontinuerlig forsigtig blanding på en rotator hjul; perlerne skal forblive suspenderet i hele inkubationen. </li><li> Puls-spinde rørene i en mini-centrifuge for at opsamle alle indholdet til bunden af ​​røret. Aspirer supernatanten og vask af perlerne tre gange med 1 ml kold ekstraktion opløsning som beskrevet i trin 3.2.3. Anbring glassene på magneten. Fjern opløsningen. Fortsæt for at tilføje den næste løsning og gentage. Under 2. vask, overføre perler og vaskeopløsningen sammen til et frisk mikrofugerør ved pipettering. Dette reducerer prøveforurening, ved punktet for eluering ved stikprøver proteiner adsorberet på væggene af røret, der anvendes til inkubation med than celleekstrakt. Efter den 3. vask, bør perlerne være puls-spundet kortvarigt i en mini-centrifuge for at opsamle alle indhold til bunden. Placer røret tilbage på magneten, og fjern eventuelt resterende væske. Dette tillader fjernelse af de sidste par ul løsning før eluering, sikrer de eluerede prøver vil have ensartede mængder. Det sikrer også elueringen vil være effektivt, som elueringsopløsningen ikke vil blive fortyndet ved resterende vask; sådanne rester kan også bidrage til salt effekter og ændre migrationen af ​​proteiner i SDS-PAGE (se nedenfor). BEMÆRK: En prøve af post-bindende supernatant kan gemmes til sammenligning med den klarede ekstrakt frembragt i 3.1.6. ved Western blot. Resultatet vil indikere graden af ​​nedbrydning af målproteinet fra celleekstrakten. </li><li> Eluere i enten en nativ eller denaturerende måde; overveje den strategi bedst for downstream program 1. BEMÆRK: Detaljerne i native eluering Strategies vil afhænge af den anvendte affinitetsmærket (se diskussionen). For de fleste brugere, denaturerende eluering med SDS-PAGE-prøvebuffer efterfulgt af analyse af prøven ved SDS-PAGE med proteinfarvning 31, vil være den mest praktiske oprindelige fremgangsmåde. BEMÆRK: Sammensætningen af ​​prøven buffer vil afhænge af elektroforese systemet, der anvendes. Mange laboratorier afgive deres egne Tris-glycin-geler, der gør brug af diskontinuerlig elektroforese og Laemmli buffersystemet 32-34. En fælles prøvebuffer opskrift (1x) indbefatter: 10% (vægt / volumen) sucrose, 50 mM DTT, 2% (vægt / volumen) SDS, 62,5 mM Tris-CI pH 8,8, 0,0004% (vægt / volumen) bromphenolblåt 31 . Vi foreslår, at forberede en 1,1 x bestand, der udelader DTT. 1/10 bør tilføjes mængden på 500 mM DTT til prøven før SDS-PAGE (se nedenfor). Mange kommercielt tilgængelige SDS-PAGE-systemer er også tilgængelige; disse kan omfatte anlægsspecifikke prøve buffere. </li><li> Tilføj SDS-PAGE-prøvebuffer uden reduktionsmiddel (for at mindske frigivelsenaf antistofkæder fra perlerne) og inkuberes i 5-10 minutter ved stuetemperatur med omrøring. BEMÆRK: Denne vil forstyrre fleste affinitetsbaserede interaktioner, frigivelse af de indfangede proteiner i supernatanten. Mere vedvarende interaktioner kan drage fordel af forhøjet temperatur til frigivelse (typisk 70 ° C er tilstrækkelig). </li><li> Saml og gem supernatanten. Prøver kan fryses ved -20 ° C i korte opbevaring (et par dage) eller -80 ° C til langtidslagring, indtil der ønskes analyse. </li><li> Emne prøverne til SDS-PAGE efterfulgt af protein farvning ved hjælp af standard teknikker 31. MS kan anvendes til at karakterisere prøven sammensætning 1. Individuelle proteinbånd kan udskæres til identifikation eller hele prøven kan karakteriseres på en enkelt analyse ved elektroforese af prøven kun kortvarigt (4-6 mm ind i gelen) og behandling af alle proteinerne i prøven sammen som en &quot;gel prop. &#39; BEMÆRK: Tilføj DTT før InitiaTing elektroforese. Hvis planlægning at gå videre til MS, kan prøverne være alkylerede efter elektroforese 35; Det er imidlertid ofte mere praktisk at alkylat før elektroforese 36. </li></ol></li></ol>

The authors declare that they have no competing financial interests.

Disse tre protokoller arbejder i tandem til (1) forberede celler til solid state brud ved cryomilling, (2) at opnå brud i en planetarisk kuglemølle, og (3) frembringe ekstrakter fra celle pulver til affinitetsindfangning et protein af interesse i kompleks med dets fysiologiske interaktionskandidater. Der findes mange forskellige celle lysis teknikker, herunder mekaniske / fysiske tilgange beskæftiger knusende effekt, klipning, og / eller tryk, samt kemiske / enzymatiske tilgange, hver med forskellige fordele og ulemper 49,50. Hver investigator opfordres til at udforske metoder mest egnede til deres analyser, at holde sig for øje, at alle valgte metode for celle brud og protein udvinding sandsynligvis indføre skævheder 51,52 nødvendiggør empirisk optimering (omtalt nedenfor). Mekaniske metoder kan producere høj varme og / eller forskydningskræfter, som kan forstyrre protein-komplekser. Cryomilling undgår opvarmning effekter i kraft af at ansætte LN 2 køling af prøver til than varigheden af ​​processen. Planetary kuglemøller forstås til at stole på effekt og friktionskræfter, herunder forskydningsspænding, som dele af partikelstørrelse reduktion 53,54. Ved indstillingerne rapporterede vi har ikke observeret degeneration af proteinkomplekser. Vi har faktisk udvindes og hentet tilsyneladende intakte ~ 50 MDA nukleare pore komplekser 11 og enzymatisk aktive retrotransposons udviser højere specifik aktivitet end præparater beskæftiger &#39;blid&#39; rengøringsmiddel-baserede lyse 7. Kemiske / enzymatiske metoder til cellelyse lider den begrænsning, at indholdet af cellen frigives i et in vitro miljø, der støtter sprængning af cellemembraner og strukturelle makromolekyler men kan ikke være egnet til opretholdelse af integriteten af proteinkomplekset (es ) af interesse. Ofte, hverken bestanddelene af komplekserne dannet med proteinet af interesse eller betingelserne nødvendige for at stabilisere mål-komplekser erkendt på forhånd. En stor fordel ved solid-state fræsning er, at brud og udvinding er frakoblet, tillader kildemateriale at være forberedt fri af tilsat væske, lagret (ved -80 ° C eller derunder), samlet, og bekvemt hentes til on-demand eksperimenter; fx, udforske til optimeret in vitro betingelser for affinitet fange. Protein-interaktioner er mest stabile ved høj koncentration 55,56, derfor minimere mængden af ekstraktionsmiddel kan være fordelagtigt for at bevare fysiologiske interaktioner. På den anden side er der praktiske overvejelser - proteinkomplekserne behøver at blive delt ud af cellerne og ind i en ikke-viskøs vandfase, fri for uopløselige aggregater, med henblik på at blande de mål-komplekser med affinitetsmediet. Desuden er der behov vis standardisering og kontrol over in vitro miljø (pH, saltkoncentration, etc.) til systematisering og reproducerbarhed. Vi finder, at ekstrakter produced i fortynding på 1: 4-1: 9 (w: v) opfylde praktiske og teoretiske problemer, giver resultater af høj kvalitet. For endvidere at den optimale andel af celleekstrakt til affinitetsmediet behov bestemmes. Dette gøres empirisk ved titrering af ekstrakter med varierende mængder af affinitetsmedium og kan have påviselige virkninger på signal-til-støj-forholdet af eksperimentet yderligere nedenfor. En fremragende udtømning af målproteinet er typisk ≥70% af den opløselige fraktion af målproteinet, men&gt; 90% er ønskelig og vil kunne opnås med omhyggelig parametrering af ekstraktionsbetingelserne. Mange sådanne praktiske overvejelser er dækket i reference 1. Paramagnetiske kugler manipuleres ved hjælp neodym magneter i en specialiseret mikrocentrifugerør holder, selvom hjemmelavede alternativer er levedygtige. Når det placeres i holderen, perler samles på siden af ​​røret under indflydelse af det magnetiske felt. Opløsninger kan derefter fjernes uden disturbing perlerne. En begrænsning af den præsenterede cryomilling protokol, udviklet med det planetariske kuglemølle bruges her (se tabel of Materials), er, at et minimum af materiale er påkrævet for effektivt mølle og genvinde celle pulver ved hjælp af denne enhed (&gt; 1 g). Sådanne mængder kan let opnås med mange mikrober, cellelinjer og modelorganismer, og kan også ofte opnås med væv udskåret fra laboratoriedyr. Dog kan visse cellelinjer være meget vanskelige at dyrke i overflod og animalske væv, kan være sparsomme. Mindre mængder af materiale kan sammenligneligt formales ved hjælp af andre enheder anvender mindre beholdere, selv kan blive offer af pulveret finhed opnået. Endvidere kan omkostningerne til mekaniske formalingsanordninger være uoverkommeligt dyrt for laboratorier. Cryomilling kan opnås ved anvendelse af en række alternative opstillinger 14-19, herunder, mest billigt i hånden ved hjælp et skadedyrle og mørtel, selv om brud effektivitet falder betydeligt. Affinitetsindfangning protokoller sigter typisk for en høj effektivitet af cellelysis for at lette maksimal protein ekstraktion i opløsning og dermed maksimal potentiale for indfangning af målproteinet komplekser. På den anden side er det blevet påvist for gær in vitro splejsning ekstrakter at maksimal lysis ikke kan sidestille med maksimal in vitro biokemisk aktivitet 57,58. Vi har ikke observeret sådanne problemer i de systemer, vi har testet indtil nu, og derfor ikke bevidst begrænse vores cellebrud når cryomilling. Ikke desto mindre bør denne mulighed tages i betragtning, når du optimerer for in vitro enzymatiske assays. Selvom cryomilling er en meget effektiv metode til at bryde celler, en begrænset mængde af lydbehandling ofte gavner produktionen homogene helcelleekstrakter fra pattedyrvæv fordi inhomogene aggregater tider kan observeres ved visuel inspektion: typiski ekstraktionsbetingelser anvendelse af lav til moderat salt (100-300 mM) og ikke-ionisk detergent (0,1-1% v / v) koncentrationer. Fordi vi observeret, at tilstedeværelsen af ​​disse aggregater kan reducere udbyttet og / eller kvaliteten af ​​den efterfølgende affinitet capture, vi rutinemæssigt implementere sonikering for at dispergere dem (selv når de ikke er observeret med det blotte øje). Aggregaterne er i overensstemmelse med agglomererede membran fragmenter, svarende til dem, der tidligere er rapporteret i ekstrakter fra fræsede gærceller 58. Lydbehandling bruges også i nogle protokoller for forskydning DNA og befri kromatin fragmenter i opløsning, men graden af ​​lydbehandling anvendt i denne protokol omfatter ikke mærkbart fragment DNA. Den begrænsede tilgængelighed (eller de høje omkostninger) af en fremragende affinitetsligand eller antistof mod det bestemte protein af interesse kan være en anden hindring. En bred vifte af kommercielt tilgængelige affinitet reagenser kan udnyttes når modellen organisme er modtagelig for genomisk tagging eller transfection med ektopiske ekspressionsvektorer, der tillader ekspression af proteiner af interesse som affinitetsmærkede fusionerne. Imidlertid er produktionen af ​​tilpassede antistoffer bliver stadig mere realistisk og begge polyklonale og monoklonale antistoffer kan udføre udmærket i capture applikationer affinitet. Disse mange overvejelser er også omfattet nærmere i reference 1. Eksempler på, hvordan cellelyse fremgangsmåde og valg af affinitetsmedium kan påvirke Resultaterne er illustreret i figur 1. Eksempler på effekter, der udøves af forskellige ekstraktionsmidler kan ses i referencer 1,11,24. Fordi disse og andre eksperimentelle parametre påvirker kvaliteten af affiniteten indfangning, hvilket gør det vanskeligt at skelne RP&#39;er, at lagre af &quot;vulst proteomer&quot; og beregningsmæssige metoder fjerne ikke-specifikke forurenende stoffer er blevet udviklet til at hjælpe med at identificere RP&#39;er 40-43. Ikke desto mindre, kun sådanne tilgange substitute for optimal prøveforberedelse i begrænset omfang 59. Observation af bedste praksis og empirisk optimere affinitet capture forsøget vil give den højeste prøver kvalitet for downstream analyser yderligere diskuteret nedenfor. En let gennemføres praksis, der kan forbedre prøve renhed er hjemmehørende eluering. Native eluering Oftest anvendes til at opnå affinitet isolerede protein kompleks, intakt, med henblik på yderligere forsøg; men som det ofte øger prøve renhed, det kan også anvendes alene af den grund. Men som vist i figur 1, felt II, kan evnen hos nativt eluering at forbedre prøven renhed afhænge af en nøjagtig titrering af mængden af affinitetsmedium til overflod af målproteinet i celleekstrakten - når mediet er i overskud , ubesatte paratoper kan tillade off-target ophobning af FP proteiner observerbare i oprindeligt eluerede fraktioner. Anvendelse af reagenserne og fremgangsmåderne beskrevet her, det hsom været vores erfaring, at den største enkeltstående bidragyder af rammeprogrammerne til vores eksperimenter er den mærkede protein selv engang fjernet fra rammerne af den levende celle. (Fig. 1, del II og fig. S1). I sådanne tilfælde parentale cellelinje kontroller, der giver irrelevante proteomer i fravær af antigenet er uden praktisk værdi; ligeledes for tag-only eller spike-in kontroller, der er blottet for alt andet end målantigenet. Derfor, når praktisk vi gennemfører I-DIRT 7,38, som direkte måler akkumuleringen af efter lyse proteininteraktioner ved anvendelse af kvantitative MS. Som nævnt i trin 3.2.7 af protokollen, vil procedurerne for indfødte eluering variere med detaljerne i affinitet, der anvendes. Native eluering er mest almindeligt opnås ved kompetitiv fortrængning af den mærkede protein-kompleks eller proteolytisk spaltning af fragmentet, frigive komplekset fra affinitetsmediet. Adskillige affinitet systemer bestående af små epitopmærker eksisterer, for som epitopen selv er tilgængelig som peptid nyttig til kompetitiv eluering af taggede proteinkomplekser 60. Ligeledes flere proteaser er tilgængelige til specifikt at spalte beslægtede sites strategisk placeret i affinitetsmærkede fusionsproteiner 61. Afhængigt af detaljerne i de valgte affinitet systemer, kan vedtages en passende eluering ordningen. Almindeligvis vil kvaliteten af ​​de opnåede resultater blive væsentligt påvirket af kvaliteten af ​​præparatet prøven. Det er vigtigt at arbejde omhyggeligt og præcist gennem hvert trin af disse protokoller, og så hurtigt som muligt og samtidig opretholde omhu og præcision. Det er tilrådeligt at spore opdeling af proteinet af interesse gennem hvert trin for at forstå effektiviteten af ​​hver manipulation. For eksempel: hvordan rigelige er proteinet af interesse i cellen eller vævet pågældende? Måske proteinet under undersøgelse (og dets komplekser) vil være en udfordring at karakterisere i massespektrometri på grund af lav overflod. Hvis de rensede komplekser er påviselige ved almindelig protein-farvning (ca. nanogram rækkevidde), massespektrometri er tilbøjelige til at lykkes. Hvis der kun kan detekteres det indfangede protein af interesse ved følsomme forstærket kemiluminescerende western blotting (ca. picogram), massespektrometri er mindre tilbøjelige til at være effektive. Selv hvis proteinet af interesse er rigeligt i cellen, hvor rigelige er det i cellen ekstrakt fremstillet? Er det protein partition til løsningen, eller er det i pillen? Hvis sidstnævnte, kan en ny udsugningsløsning udtænkes, der kan forbedre inddrivelsen. Når celleekstrakt kombineres med affinitet medium, hvor effektivt proteinet indfanges? Er proteinet forbliver bundet gennem efterfølgende vaske? Hvad med andre copurifying proteiner? Ved at gemme en portion af hver prøve på passende trin i protokollen disse spørgsmål let kan besvares, typisk ved western blotting mod proteinet af interesseeller generel proteinfarvning, men andre assays kan også være egnede. Optimering hvert trin vil forøge udbyttet og renheden af ​​tilfangetagne komplekser, selvom der kan være en afvejning, der skal foretages i maksimering én attribut eller det andet. En typisk anvendelse af affinitetsindfangning for mange forskere er at identificere kandidat in vivo interaktionskandidater for et lille antal proteiner af interesse; disse kandidater er almindeligt udsat for validering af ortogonale tilgange in vivo for at demonstrere den biologiske betydning af de fysiske interaktionskandidater. Affinity capture også ansat af high-throughput undersøgelser for at generere lister over copurifying proteiner observeret på en (næsten) proteom-plan, letter beregningsmæssige slutninger vedrørende formodede in vivo-komplekser. Talrige eksempler på sådanne undersøgelser kan findes i litteraturen. Denne tilgang afkald optimering af betingelserne for fangst for enhver given mål til fordel for at udforske mandy mål; Som sådan er den udledte komplekser selv er sjældent hentes helt intakt og meget rent i en given prøve. , De partielle overlapninger i kompositioner observeret mellem mange forskellige affinitet-erobrede prøver anvendes Snarere som grundlag for de slutninger 42. Begge tilgange bidrager værdifulde data til vores forståelse af interactome. Ikke desto mindre er en stor fordel af affinitet capture er, at det ofte ikke giver mulighed for at opnå komplekserne intakt og højt oprenset, forudsat at der gøres en indsats for at optimere proceduren. Vi mener, at fremtiden for tilgang ligger i at øge den lethed og effektivitet optimering erobringen af endogene protein komplekser 11, for mere præcis vurdering af viften af fysiologiske interaktionskandidater og mere hyppig brug i længere nedstrøms biokemiske, enzymologisk og strukturelle studier, fx referencer 7,9,23.

A correction was made to: Protein Complex Affinity Capture from Cryomilled Mammalian Cells. The References section has been updated from:
<ol start="29">
	<li>Cristea, I. M., &#38; Chait, B. T. Conjugation of magnetic beads for immunopurification of protein complexes. Cold Spring Harbor Protocols. 2011 (5) (2011).</li>
	<li>Rosenberg, I. M. Electrophoretic Techniques. Protein Analysis and Purification. (4), 63&#8211;117 (2005).</li>
	<li>Ornstein, L. Disc Electrophoresis. I. Background and Theory. Ann N Y Acad Sci. 121 (A2), 321&#8211;349 (1964).</li>
	<li>Davis, B. J. Disc Electrophoresis. II. Method and Application to Human Serum Proteins. Ann N Y Acad Sci. 121, 404&#8211;427 (1964).</li>
	<li>Laemmli, U. K. Cleavage of structural proteins during the assembly of the head of bacteriophage T4. Nature. 227 (5259), 680&#8211;685 (1970).</li>
	<li>Shevchenko, A., Tomas, H., Havlis, J., Olsen, J. V., &#38; Mann, M. In-gel digestion for mass spectrometric characterization of proteins and proteomes. Nature protocols. 1 (6), 2856&#8211;2860 (2006).</li>
	<li>DeGrasse, J. A., Kalkum, M., Krutchinsky, A.N., Padovan, J. C., &#38; Zhang, W. MALDI Sample Preparation. rockefeller.edu at &#60;http://prowl.rockefeller.edu/protocols/in-gel-digestion.html&#62; (2006).</li>
	<li>Lubas, M., Christensen, M. S., et al. Interaction profiling identifies the human nuclear exosome targeting complex. Mol Cell. 43 (4), 624&#8211;637 (2011).</li>
	<li>Tackett, A. J., DeGrasse, J. A., Sekedat, M. D., Oeffinger, M., Rout, M. P., &#38; Chait, B. T. I-DIRT, a general method for distinguishing between specific and nonspecific protein interactions. J Proteome Res. 4 (5), 1752&#8211;1756 (2005).</li>
	<li>Wang, X., &#38; Huang, L. Identifying dynamic interactors of protein complexes by quantitative mass spectrometry. Mol Cell Proteomics. 7 (1), 46&#8211;57 (2008).</li>
	<li>Trinkle-Mulcahy, L., Boulon, S., et al. Identifying specific protein interaction partners using quantitative mass spectrometry and bead proteomes. J Cell Biol. 183 (2), 223&#8211;239 (2008).</li>
	<li>Boulon, S., Ahmad, Y., et al. Establishment of a protein frequency library and its application in the reliable identification of specific protein interaction partners. Mol Cell Proteomics. 9 (5), 861&#8211;879 (2010).</li>
	<li>Armean, I. M., Lilley, K. S., &#38; Trotter, M. W. B. Popular computational methods to assess multiprotein complexes derived from label-free affinity purification and mass spectrometry (AP-MS) experiments. Mol Cell Proteomics. 12 (1), 1&#8211;13 (2013).</li>
	<li>Mellacheruvu, D., Wright, Z., et al. The CRAPome: a contaminant repository for affinity purification-mass spectrometry data. Nat Methods. (2013).</li>
	<li>Cheeseman, I. M., &#38; Desai, A. A combined approach for the localization and tandem affinity purification of protein complexes from metazoans. Sci. STKE 2005 (266), pl1 (2005).</li>
	<li>Goldberg, S. Mechanical/physical methods of cell disruption and tissue homogenization. Methods in Molecular Biology. 424 (Chapter 1), 3&#8211;22 (2008).</li>
	<li>Grabski, A. C. Advances in preparation of biological extracts for protein purification. Methods in Enzymology. 463 (C), 285&#8211;303 (2009).</li>
	<li>Dhabaria, A., Cifani, P., Reed, C., Steen, H., &#38; Kentsis, A. A High-Efficiency Cellular Extraction System for Biological Proteomics. J Proteome Res. 14 (8), 3403&#8211;3408 (2015).</li>
	<li>Glatter, T., Ahrn&#233;, E., &#38; Schmidt, A. Comparison of Different Sample Preparation Protocols Reveals Lysis Buffer-Specific Extraction Biases in Gram-Negative Bacteria and Human Cells. J Proteome Res. 15 (2), 679 (2016).</li>
	<li>Zhao, Q.-Q., Yamada, S., &#38; Jimbo, G. The Mechanism and Grinding Limit of Planetary Ball Milling. KONA. 7, 29&#8211;36 (1989).</li>
	<li>Sheng-Yong, L., Qiong-Jing, M., Zheng, P., Xiao-Dong, L., &#38; Jian-Hua, Y. Simulation of ball motion and energy transfer in a planetary ball mill. Chinese Phys. B 21 (7), 078201 (2012).</li>
	<li>Fulton, A. B. How crowded is the cytoplasm? Cell. 30 (2), 345&#8211;347 (1982).</li>
	<li>Ellis, R. J. Macromolecular crowding: obvious but underappreciated. Trends Biochem Sci. 26 (10), 597&#8211;604 (2001).</li>
	<li>Kalkum, M. Using the Retsch MM301 Ball Mill for Cryogenic Disruption of Yeast Cells. 2 City of Hope, (2003).</li>
	<li>Staley, J. Making Whole Cell Extract of Saccharomyces cerevisiae cells using the Retsch MM301 Ball Mill. Retsch GmbH: (2005).</li>
	<li>Bell, A. W., Nilsson, T., Kearney, R. E., &#38; Bergeron, J. J. M. The protein microscope: Incorporating mass spectrometry into cell biology. Nat Methods. 4 (10), 783&#8211;784 (2007).</li>
	<li>Zhao, X., Li, G., &#38; Liang, S. Several affinity tags commonly used in chromatographic purification. J Anal Methods Chem. 2013 (1), 581093&#8211;8 (2013).</li>
	<li>Waugh, D. S. An overview of enzymatic reagents for the removal of affinity tags. 80 (2), 283&#8211;293 (2011).</li>
	<li>Williams, R. J., &#38; Lyman, C. M. A neutral buffered standard for hydrogen ion work and accurate titrations which can be prepared in one minute. J Am Chem Soc. 54 (5), 1911&#8211;1912 (1932).</li>
	<li>Johnson, M. Detergents: Triton X-100, Tween-20, and More. labome.com. 3 (163) (2013).</li>
	<li>Deppert, W. R., &#38; Luka&#265;in, R. Buffers and Additives. Journal of Chromatography Library. 61 (C), 839&#8211;862 (1999).</li>
	<li>Ugwu, S. O., &#38; Apte, S. P. The Effect of Buffers on Protein Conformational Stability. Pharmaceutical Technology. 28 (3), 86&#8211;108 (2004).</li>
	<li>Linke, D. Detergents: an overview. Methods in Enzymology. 463 (34), 603&#8211;617 (2009).</li>
	<li>Zhang, J. Protein-Protein Interactions in Salt Solutions. Protein-Protein Interactions Computational and Experimental Tools. (18), 359&#8211;376 (2012).</li>
</ol>
to:
<ol start="29">
	<li>Ball Mills - Guidelines for sample amount and ball charge. 1&#8211;3at &#60;http://www.retsch.com/products/milling/ball-mills/planetary-ball-mill-pm-100/information-downloads/&#62; Retsch GmbH (2014).</li>
	<li>Cristea, I. M., &#38; Chait, B. T. Conjugation of magnetic beads for immunopurification of protein complexes. Cold Spring Harbor Protocols. 2011 (5) (2011).</li>
	<li>Rosenberg, I. M. Electrophoretic Techniques. Protein Analysis and Purification. (4), 63&#8211;117 (2005).</li>
	<li>Ornstein, L. Disc Electrophoresis. I. Background and Theory. Ann N Y Acad Sci. 121 (A2), 321&#8211;349 (1964).</li>
	<li>Davis, B. J. Disc Electrophoresis. II. Method and Application to Human Serum Proteins. Ann N Y Acad Sci. 121, 404&#8211;427 (1964).</li>
	<li>Laemmli, U. K. Cleavage of structural proteins during the assembly of the head of bacteriophage T4. Nature. 227 (5259), 680&#8211;685 (1970).</li>
	<li>Shevchenko, A., Tomas, H., Havlis, J., Olsen, J. V., &#38; Mann, M. In-gel digestion for mass spectrometric characterization of proteins and proteomes. Nature protocols. 1 (6), 2856&#8211;2860 (2006).</li>
	<li>DeGrasse, J. A., Kalkum, M., Krutchinsky, A.N., Padovan, J. C., &#38; Zhang, W. MALDI Sample Preparation. rockefeller.edu at &#60;http://prowl.rockefeller.edu/protocols/in-gel-digestion.html&#62; (2006).</li>
	<li>Lubas, M., Christensen, M. S., et al. Interaction profiling identifies the human nuclear exosome targeting complex. Mol Cell. 43 (4), 624&#8211;637 (2011).</li>
	<li>Tackett, A. J., DeGrasse, J. A., Sekedat, M. D., Oeffinger, M., Rout, M. P., &#38; Chait, B. T. I-DIRT, a general method for distinguishing between specific and nonspecific protein interactions. J Proteome Res. 4 (5), 1752&#8211;1756 (2005).</li>
	<li>Wang, X., &#38; Huang, L. Identifying dynamic interactors of protein complexes by quantitative mass spectrometry. Mol Cell Proteomics. 7 (1), 46&#8211;57 (2008).</li>
	<li>Trinkle-Mulcahy, L., Boulon, S., et al. Identifying specific protein interaction partners using quantitative mass spectrometry and bead proteomes. J Cell Biol. 183 (2), 223&#8211;239 (2008).</li>
	<li>Boulon, S., Ahmad, Y., et al. Establishment of a protein frequency library and its application in the reliable identification of specific protein interaction partners. Mol Cell Proteomics. 9 (5), 861&#8211;879 (2010).</li>
	<li>Armean, I. M., Lilley, K. S., &#38; Trotter, M. W. B. Popular computational methods to assess multiprotein complexes derived from label-free affinity purification and mass spectrometry (AP-MS) experiments. Mol Cell Proteomics. 12 (1), 1&#8211;13 (2013).</li>
	<li>Mellacheruvu, D., Wright, Z., et al. The CRAPome: a contaminant repository for affinity purification-mass spectrometry data. Nat Methods. (2013).</li>
	<li>Cheeseman, I. M., &#38; Desai, A. A combined approach for the localization and tandem affinity purification of protein complexes from metazoans. Sci. STKE 2005 (266), pl1 (2005).</li>
	<li>Deppert, W. R., &#38; Luka&#265;in, R. Buffers and Additives. Journal of Chromatography Library. 61 (C), 839&#8211;862 (1999).</li>
	<li>Ugwu, S. O., &#38; Apte, S. P. The Effect of Buffers on Protein Conformational Stability. Pharmaceutical Technology. 28 (3), 86&#8211;108 (2004).</li>
	<li>Linke, D. Detergents: an overview. Methods in Enzymology. 463 (34), 603&#8211;617 (2009).</li>
	<li>Zhang, J. Protein-Protein Interactions in Salt Solutions. Protein-Protein Interactions Computational and Experimental Tools. (18), 359&#8211;376 (2012).</li>
	<li>Goldberg, S. Mechanical/physical methods of cell disruption and tissue homogenization. Methods in Molecular Biology. 424 (Chapter 1), 3&#8211;22 (2008).</li>
	<li>Grabski, A. C. Advances in preparation of biological extracts for protein purification. Methods in Enzymology. 463 (C), 285&#8211;303 (2009).</li>
	<li>Dhabaria, A., Cifani, P., Reed, C., Steen, H., &#38; Kentsis, A. A High-Efficiency Cellular Extraction System for Biological Proteomics. J Proteome Res. 14 (8), 3403&#8211;3408 (2015).</li>
	<li>Glatter, T., Ahrn&#233;, E., &#38; Schmidt, A. Comparison of Different Sample Preparation Protocols Reveals Lysis Buffer-Specific Extraction Biases in Gram-Negative Bacteria and Human Cells. J Proteome Res. 15 (2), 679 (2016).</li>
	<li>Zhao, Q.-Q., Yamada, S., &#38; Jimbo, G. The Mechanism and Grinding Limit of Planetary Ball Milling. KONA. 7, 29&#8211;36 (1989).</li>
	<li>Sheng-Yong, L., Qiong-Jing, M., Zheng, P., Xiao-Dong, L., &#38; Jian-Hua, Y. Simulation of ball motion and energy transfer in a planetary ball mill. Chinese Phys. B 21 (7), 078201 (2012).</li>
	<li>Fulton, A. B. How crowded is the cytoplasm? Cell. 30 (2), 345&#8211;347 (1982).</li>
	<li>Ellis, R. J. Macromolecular crowding: obvious but underappreciated. Trends Biochem Sci. 26 (10), 597&#8211;604 (2001).</li>
	<li>Kalkum, M. Using the Retsch MM301 Ball Mill for Cryogenic Disruption of Yeast Cells. 2 City of Hope, (2003).</li>
	<li>Staley, J. Making Whole Cell Extract of Saccharomyces cerevisiae cells using the Retsch MM301 Ball Mill. Retsch GmbH: (2005).</li>
	<li>Bell, A. W., Nilsson, T., Kearney, R. E., &#38; Bergeron, J. J. M. The protein microscope: Incorporating mass spectrometry into cell biology. Nat Methods. 4 (10), 783&#8211;784 (2007).</li>
	<li>Zhao, X., Li, G., &#38; Liang, S. Several affinity tags commonly used in chromatographic purification. J Anal Methods Chem. 2013 (1), 581093&#8211;8 (2013).</li>
	<li>Waugh, D. S. An overview of enzymatic reagents for the removal of affinity tags. 80 (2), 283&#8211;293 (2011).</li>
</ol>

A correction was made to: Protein Complex Affinity Capture from Cryomilled Mammalian Cells. The References section has been updated.

Erratum: Protein Complex Affinity Capture from Cryomilled Mammalian Cells

En typisk anvendelse af de præsenterede procedurer er at stabilisere og opnå et højt udbytte og renhed af endogent protein komplekser af interesse for interactomic karakterisering 1. Det er underforstået, at dynamiske netværk af både stabilt og forbigående tilknyttede makromolekylære komplekser, hovedsageligt består af proteiner, iscenesætte cellulære processer 2,3. Mens der er mange eksperimentelle metoder til identifikation af protein-protein interaktioner, affinitetsindfangning er blandt de mest anvendte fremgangsmåder til isolering og dissekere fysiologiske proteinkomplekser 4-6. Desuden er denne teknik har den fordel, hvilket gav de makromolekylære komplekser som fysiske entiteter, ikke blot som datapunkter i en read-out; Med fordel kan de opnåede komplekser således anvendes i en lang række yderligere downstream biokemiske, enzymatiske og strukturelle assays 7-9. De præsenterede protokoller er blevet udviklet som reaktion på behovet for at kortlægge Protein-protein interaktion netværk og karakterisere makromolekylære komplekser i deres roller som effektor molekyler af cellebiologi. De er detaljeret med hensyn til deres anvendelse på pattedyrsceller dyrket i vævskultur, men er lige så anvendelig til en bred vifte af biologiske prøver givet passende systemspecifikke tweaks. Historien om affinitetsindfangning strækker sig tilbage til begyndelsen af ​​det tyvende århundrede med de første immunaffinitetskromatografi eksperimenter - ligner det, der almindeligvis omtales i dag som immunpræcipitering (IP) - optræder i litteraturen fra begyndelsen af ​​1950&#39;erne. Mainstream brug af teknikken videreudviklet gennem begyndelsen af dette århundrede til i dag 10-13. Diverse celle og molekylærbiologiske undersøgelser har udnyttet mekanisk brud af celler ved formaling ved kryogene temperaturer i mindst de sidste fyrre år 14-19; og molekylære separationer udnytte (super) paramagnetiske perler har becogle mere og mere almindeligt i de sidste to årtier 20. Ved at kombinere disse forskellige teknologier har tjent til synergistisk forbedre resultaterne, der kan opnås i proteinkompleks affinitet capture eksperimenter 1, som det fremgår af en omfattende arbejde produceret af os selv og det bredere samfund forskning 7,9,11,18,19,21 -23. Understøttende Resultaterne er vist i figur 1. En samling af forbehold og overvejelser, der gælder for udførelse af effektive affinitet capture eksperimenter kan findes i reference 1. Typisk denne fremgangsmåde er mest hensigtsmæssigt at: (I) katalogisere interaktionskandidater af et protein af interesse, dvs bruge protein massespektrometri (MS) til at identificere hidtil ukendte copurifying proteiner (sonderende analyse); (II) assay for tilstedeværelsen af en bestemt interagerende partner, dvs. bruger MS eller western blot at detektere et bestemt protein eller begrænset sæt af proteiner formodes at ispiller sammen med proteinet af interesse (hypotesetest); eller (III) forberede endogent samles proteinkomplekser indeholdende proteinet af interesse til yderligere undersøgelse af yderligere teknikker (præparativ oparbejdning). Før der iværksættes en affinitet capture eksperimentel regime er det absolut nødvendigt at have en høj kvalitet affinitetsreagens, som binder til målproteinet, typisk en IP-kompetent antistof mod det native målprotein af interesse eller mod et tag bundet til et fusionsprotein. Det er også vigtigt at have passende metoder til eksperimentel udlæsning på plads: generel protein farvning (såsom Coomassie blå, SYPRO Ruby, eller sølv, efter SDS-PAGE), western blotting, og protein MS er alle almindeligt anvendt i forbindelse med affinitet capture 1. De præsenterede protokoller udnytte antistof-konjugerede magnetiske perler som affinitetsmediet. Medens funktionen af ​​affinitetsmediet oprindeligt kan valideres i tests, der udnytter få eksperimentelle parametre, tilopnå de bedste resultater hver forsøget bør empirisk optimeret 1,11,24. Protokollerne er adskilt i tre markante faser: (1) udarbejdelse af frosne cellemateriale; (2) cellebrud ved fast tilstand fræsning ved kryogen temperatur; og (3) protein-ekstraktion og affinitetsindfangning under anvendelse af antistof-koblede paramagnetiske perler.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="1304">
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:567px;">Growth media &#38; cell culturing implements</td>
			<td style="width:172px;"></td>
			<td style="width:164px;"></td>
			<td style="width:403px;">For producing frozen cells (I)</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">500 cm^2 culture dishes</td>
			<td style="width:172px;">Corning</td>
			<td>431110</td>
			<td>For producing frozen cells (I)</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Large beaker (1-2L)</td>
			<td style="width:172px;"></td>
			<td></td>
			<td>For producing frozen cells (I)</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Rectangular ice pan&#160;</td>
			<td>Fisher Scientific&#160;</td>
			<td>13-900-747</td>
			<td>For producing frozen cells (I), &#38; cryomilling (II)</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Phosphate buffered saline (PBS)</td>
			<td style="width:172px;"></td>
			<td style="width:164px;"></td>
			<td>For producing frozen cells (I)</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Large cell scrapers</td>
			<td>Fisher Scientific&#160;</td>
			<td>08-100-242</td>
			<td>For producing frozen cells (I)</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Liquid nitrogen&#160;</td>
			<td style="width:172px;"></td>
			<td style="width:164px;"></td>
			<td>For producing frozen cells (I), cryomilling (II), &#38; affinity capture (III)</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:567px;">50 ml conical tubes</td>
			<td>Corning</td>
			<td>352098</td>
			<td>For producing frozen cells (I), &#38; cryomilling (II)</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">20 ml Luer lock syringe</td>
			<td style="width:172px;"></td>
			<td style="width:164px;"></td>
			<td>For producing frozen cells (I)</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Leur lock syringe caps</td>
			<td>www.dymax.com</td>
			<td>T11182</td>
			<td>For producing frozen cells (I)</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Refrigerated centrifuge</td>
			<td style="width:172px;"></td>
			<td style="width:164px;"></td>
			<td>For producing frozen cells (I)</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">50 ml tube rack, 4 position</td>
			<td style="width:172px;"></td>
			<td style="width:164px;"></td>
			<td>For producing frozen cells (I), cryomilling (II), &#38; affinity capture (III)</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Styrofoam box</td>
			<td style="width:172px;"></td>
			<td style="width:164px;"></td>
			<td>For producing frozen cells (I), cryomilling (II), &#38; affinity capture (III)</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Planetary ball mill, PM 100&#160;</td>
			<td>Retsch</td>
			<td>20.540.0001&#160;</td>
			<td>For cryomilling (II)</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Stainless steel milling jar, 50 ml&#160;</td>
			<td>Retsch</td>
			<td>01.462.0149</td>
			<td>For cryomilling (II)</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Stainless steel milling balls, 20 mm &#216;&#160;</td>
			<td>Retsch</td>
			<td>05.368.0062</td>
			<td>For cryomilling (II)</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Lid gasket: PFA encapsulated spring energized seal, 2.62 mm 44.63 mm&#160;&#160;</td>
			<td style="width:172px;">www.marcorubber.com</td>
			<td>T1044-2.62x44.63</td>
			<td>For cryomilling (II)</td>
		</tr>
		<tr height="26">
			<td height="26" style="height:26px;">mini-LN2 decanter</td>
			<td style="width:172px;">homemade</td>
			<td style="width:164px;">see Ref 19</td>
			<td>For cryomilling (II)</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">250 ml PTFE jar insulator (optional)</td>
			<td style="width:172px;">Retsch</td>
			<td style="width:164px;">custom order</td>
			<td>For cryomilling (II)</td>
		</tr>
		<tr height="41">
			<td height="41" style="height:41px;">PTFE puck insulator (optional)</td>
			<td style="width:172px;">homemade</td>
			<td style="width:164px;">The Rockefeller University</td>
			<td>For cryomilling (II); can be produced by The Rockefeller University High Energy Physics Instrument Shop, or design blueprints provided, upon request.</td>
		</tr>
		<tr height="41">
			<td height="41" style="height:41px;">5 bar/500 KPA pressure relief valve (optional)</td>
			<td style="width:172px;">http://www.leeimh.com/</td>
			<td style="width:164px;">558 series check valve</td>
			<td>For cryomilling (II)</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:567px;">1.5 - 2 ml microfuge tubes</td>
			<td style="width:172px;"></td>
			<td style="width:164px;"></td>
			<td>For affinity capture (III)</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:567px;">Extractant</td>
			<td style="width:172px;"></td>
			<td style="width:164px;"></td>
			<td>For affinity capture (III)</td>
		</tr>
		<tr height="41">
			<td height="41" style="height:41px;width:567px;">cOmplete EDTA free protease inhibitor cocktail tablets</td>
			<td style="width:172px;">Roche Applied Science</td>
			<td style="width:164px;">11873580001</td>
			<td style="width:403px;">For affinity capture (III)</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:567px;">Vortex mixer</td>
			<td style="width:172px;"></td>
			<td style="width:164px;"></td>
			<td>For affinity capture (III)</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:567px;">Ice bucket</td>
			<td style="width:172px;"></td>
			<td style="width:164px;"></td>
			<td>For affinity capture (III)</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:567px;">Microtip sonicator, Q700</td>
			<td style="width:172px;">Qsonica</td>
			<td style="width:164px;">Q700</td>
			<td>For affinity capture (III)</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">low intensity 1/16&#8221; microtip probe</td>
			<td style="width:172px;">Qsonica</td>
			<td style="width:164px;">4717</td>
			<td>For affinity capture (III)</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:567px;">Bench-top refrigerated microcentrifuge</td>
			<td style="width:172px;"></td>
			<td style="width:164px;"></td>
			<td>For affinity capture (III)</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:567px;">Dynabeads M-270 Epoxy</td>
			<td style="width:172px;">Thermo Fisher</td>
			<td style="width:164px;">14302D</td>
			<td>For affinity capture (III)</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:567px;">Antibody or affinity ligand coupled to Dynabeads</td>
			<td style="width:172px;">homemade</td>
			<td style="width:164px;"></td>
			<td>For affinity capture (III); see reference 19</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:567px;">Sample rotator&#160;</td>
			<td style="width:172px;"></td>
			<td style="width:164px;"></td>
			<td>For affinity capture (III)</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:567px;">Neodymium magnet</td>
			<td style="width:172px;">Life Technologies</td>
			<td style="width:164px;">123-21D&#160;</td>
			<td>For affinity capture (III)</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:567px;">SDS-PAGE sample buffer (no reducing agent)</td>
			<td style="width:172px;"></td>
			<td style="width:164px;"></td>
			<td>For affinity capture (III)</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:567px;">DTT</td>
			<td style="width:172px;"></td>
			<td style="width:164px;"></td>
			<td>For affinity capture (III)</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:567px;">SDS-PAGE system</td>
			<td style="width:172px;"></td>
			<td style="width:164px;"></td>
			<td>For affinity capture (III)</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:567px;">SDS-polyacrylamide gel</td>
			<td style="width:172px;"></td>
			<td style="width:164px;"></td>
			<td>For affinity capture (III)</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:567px;">Protein Stain</td>
			<td style="width:172px;"></td>
			<td style="width:164px;"></td>
			<td>For affinity capture (III)</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

protein complex affinity capture from cryomilled mammalian cells

Affinitetsindfangning er en effektiv teknik til isolering af endogent protein komplekser til yderligere undersøgelse. Når det bruges sammen med et antistof, er denne teknik også hyppigt omtalt som immunoudfældning. Affinitetsindfangning kan anvendes i en bench-skala og i en high-throughput sammenhæng. Når kombineret med protein massespektrometri, har affinitetsindfangning vist sig at være en arbejdshest af interactome analyse. Selvom der er potentielt mange måder at udføre de mange trin involveret, følgende protokoller implementere vores begunstigede metoder. To funktioner er karakteristisk: anvendelse af cryomilled celle pulver til frembringelse af celleekstrakter, og antistofbaserede koblet paramagnetiske kugler som affinitetsmediet. I mange tilfælde har vi opnået overlegne resultater med dem opnået med mere konventionelle affinitet capture praksis. Cryomilling undgår talrige problemer forbundet med andre former for cellebrud. Det giver effektiv brydning af materialet, og samtidig undgå denatguration spørgsmål i forbindelse med opvarmning eller opskumning. Det bevarer det native protein koncentration på op til punktet af ekstraktion og afbøde makromolekylære dissociation. Det reducerer den tid ekstraherede proteiner tilbringer i opløsning, hvilket begrænser skadelige enzymatiske aktiviteter, og det kan reducere den ikke-specifikke adsorption af proteiner ved affinitetsmediet. Micron skala magnetiske affinitet medier er blevet mere almindeligt i de sidste adskillige år, i stigende grad erstatter den traditionelle agarose- og Sepharose-baserede medier. Primære fordele ved magnetiske medier indbefatter typisk lavere uspecifik proteinadsorption; ingen grænse størrelseseksklusion fordi proteinkompleks binding forekommer på perlen overflade snarere end i porerne; og let manipulation og håndtering ved hjælp af magneter.

Figur 1, panel jeg illustrerer, at cryomilling og magnetiske perler kan arbejde sammen om at forbedre prøven kvalitet. Paneler IA-C viser, at det materiale, der omfatter den uopløselige medium, der anvendes til affinitetsindfangning kan påvirke den genvundne proteom 19. Proteinet af interesse, oprenset FLAG-mærket bakteriel alkalisk phosphatase (BAP) blev tilsat til humane celleekstrakter. BAP forventes ikke at specifikt at interagere med og copurify humane proteiner. Underskrivelsen af ​​copurifying proteiner, bedømt af SDS-PAGE og Coomassie-farvning, varierede afhængigt af det medie, der anvendes. Micron målestok magnetiske perler viste den reneste profil, hvilket indikerer et relativt lavt niveau af ikke-specifik proteinadsorption. Paneler ID og IE illustrerer, at fremgangsmåden til cellelysis også kan påvirke den genvundne proteom. I eksemplet billede, et endogent protein-kompleks (NEXT kompleks 37), blev underkastet affinitet capture fra cyromilled eller sonikeret celleekstrakter 19. blev observeret færre høje masse kontaminanter når cellen ekstrakt blev fremstillet fra cryomilled celle pulver. En udfordring ved brug affinitetsindfangning at studere endogene proteinkomplekser er, at det kan være vanskeligt at skelne bona fide fysiologiske interaktionskandidater af proteinet af interesse fra falske positive (RP). RP&#39;er kan opstå fra mange kilder, herunder ikke-specifik adsorption til rør og fartøjer, affinitetsmediet, antistoffet eller affinitetsliganden, og / eller til proteinet af interesse selv. Som et resultat, skal afsættes betydelig indsats for at optimere capture processen. Påvisningen af rammeprogrammerne fortsat en central udfordring for hvilke der er udviklet en lang række forskellige værktøjer, herunder eksperimentel 38-40 og beregningsmæssige tilgange 41-43, hver med forskellige fordele og ulemper. I vores egne eksperimenter, vi tidligere bemærket et mønster af FP-protein binding, opnået efter inkubering af α-FLAG magnetisk medium med kontrol celleekstrakter, der var forskellig fra den, der opnås i nærvær af 3xFLAG-mærkede proteiner. Endvidere kunne disse rammeprogrammer frigøres fra mediet ved inkubation med 3xFLAG peptid 7. Denne observation er i overensstemmelse med opportunistisk binding af rammeprogrammerne til α-FLAG paratop i fravær af den beslægtede epitop. At forstå karakteren af ​​denne FP baggrund er vigtigt, da mange undersøgelser bruger et ukodet &#39;parental cellelinje &quot;som en mock kontrol for affinitetsindfangning; disse kontroller kan derfor være uhensigtsmæssigt at bestemme specificiteten af ​​interaktioner med mærkede protein. For at bestemme baggrunden binding bidrager med vores affinitetsmedium når antistof-paratoper er besat eller ej, gennemførte vi mock Affinitetsindfangning eksperimenter under anvendelse af α-FLAG magnetisk medium og HEK 293T celleekstrakter (ingen mærkede protein udtrykt) i nærvær eller fravær af en 3xFLAGpeptid spike-in. Resultaterne er vist i figur 1, felt II. Kort fortalt blev α-FLAG magnetisk medium inkuberet i celleekstrakter (af ≳10 mg / ml totalt protein) indeholdende 500 mM NaCl og 1% v / v Triton X-100 i 20 mM HEPES-Na, pH 7,4 i 30 minutter. Mediet blev derefter inkuberet med 1 mg / ml 3xFLAG peptid til kompetitivt fortrænge eventuelle proteiner bundet til α-FLAG paratop nativt eller med SDS-PAGE-prøvebuffer for at opnå en denaturerende eluering. Endvidere blev det samme forsøg udføres, når celleekstrakterne fik tilsat 1 ug / ml og 10 pg / ml 3xFLAG peptid. Alle de eluerede fraktioner blev underkastet SDS-PAGE og sølvfarvning. Vi observerede, at i mangel af dens beslægtede epitop, er α-FLAG medium fange påvises indhold af baggrunden proteiner, der kan elueres med 3xFLAG peptid - i eksemplet fra Figur 1-II, blev der observeret en dominerende arter på mellem 37 og 50 kDa. Mønsteret elueret medSDS-PAGE-prøvebuffer var sammenlignelig med supplerende fremtrædende arter. Men i nærværelse af 1 ug / ml 3xFLAG peptid, FP-binding til affiniteten mediet blev fjernet til under niveauet for påvisning og blev ikke observeret hverken i de native eller denaturerende elueringsfraktioner. Dette resultat antyder, at ubesatte antistof-paratoper kan være promiskuøs i fravær af deres beslægtede epitop og bidrager væsentligt til proteom opnået under affinitetsindfangning selv for antistoffer, som binder deres epitop ved høj affinitet, som det er tilfældet for 3xFLAG / α-FLAG M2 parring. Det suggestd også, at meget stringente betingelser ved hjælp af høj-salt, ofte valgt at afbøde ikke-specifik binding, kan være ineffektive i fravær af antigen / antistof-interaktionen. Som opfølgning udførte vi en lignende eksperiment herunder analyse ved SDS-PAGE såvel som kvantitativ MS (fig. S1). Af de 347 proteiner kvantificeret, observerede vi, at hver protein gemme til en (falsk discomeget sats = 1%; Tabel S1) blev associeret med 3xFLAG-mærkede bait-protein sammenlignet med en 3xFLAG peptid spiked kontrolprøve. Disse resultater viser, at det overvældende flertal af proteiner observeret i vores eksperimenter sandsynligvis co-rense med mærkede protein eller er off-target biprodukter af ubesatte α-FLAG paratoper. Det er vores erfaring, er høje signal-til-støj affinitet capture resultater eksemplificeret i SDS-PAGE og protein farvning af en diskret mønster af skarpe, rigelige og omtrent støkiometriske bands samt en mangel på baggrund farvning fra andre svagere bands; talrige eksempel på dette princip kan desuden ses i reference 11. Motivet for at bruge en PTFE isolator (hvilket anbefales), når cryomilling er at reducere antallet af opvarmning af krukken under fræsning, mindske byrden af gentagne LN 2 afkøling under mølleriprocessen, og reducere graden af isdannelse i krukken. Dette letter ensartet formaling ydeevne og letter håndteringen af ​​cellen pulver. Eksempel isolatorer kan findes i henvisning 27 (pucke) og afbildet i figur 2 nedenfor (muffe-and-puck). <img alt="figur 1" src="/files/ftp_upload/54518/54518fig1.jpg" /> Figur 1: Vælg Repræsentative resultater. (I) Dette panel har været ændret siden henvisning 19. Coomassie Blue farvet SDS-polyacrylamidgel. (VENSTRE) Micron-skala magnetiske perler viser lavere off-target binding end agarose-baserede medier. (A) magnetiske perler; (B) traditionel agarose; (C) jern imprægneret (magnetisk) agarose; hver koblet til anti-FLAG M2-antistoffer og anvendes til at indfange FLAG-mærket bakteriel alkalisk phosphatase (BAP, mærket) tilsat til ekstrakter fremstillet af cryomilled HEK-293-celler. Agarose-baserede oprensningerviste højere niveauer af ikke-specifik adsorption (umærkede bånd). (Højre) Ekstrakter fremstillet af cryomilled HeLa-celler udviser lavere off-target adsorption efter antistof-koblede magnetiske perler gange end de ved lydbehandling, når de anvendes til at oprense et endogent protein-kompleks. LAP-mærket 44 RBM7 blev affinitet taget med magnetiske perler koblet til polyklonale anti-GFP antistoffer til at rense NÆSTE kompleks 19,37 (D) ekstrakt fremstillet af cryomilled pulver; (E) ekstrakter fremstillet ved lydbehandling af intakte celler. Den lodrette sorte bjælke fremhæver en region af gelen, hvor der iagttages et stort mass uspecifikke interaktionskandidater, der skal beriges i prøven fremstillet ved lydbehandling. De sorte pile angivet de forventede specifikke interaktionskandidater (mærket). Bands observerede ~ 50 kDa i bane D og E kan tilskrives llama IgG tunge kæder. (II) Sølvfarvet SDS-polyacrylamidgel. (Std.) En mock affinitetsindfangning udført på HEK-293T-celle ekstrakter i den almindelige måde. Efter indfangning, blev eluering af det bundne materiale opnås via (N) ikke-denaturerende eluering med 1 mg / ml 3xFLAG peptid eller (D) denaturering eluering i SDS-PAGE-prøvebuffer; (PB 1) som Std. men 3xFLAG peptid blev inkluderet i ekstraktionsopløsningen ved 1 ug / ml til at blokere α-FLAG paratoper på affiniteten medium; (PB 10) PB 1, men i nærvær af 10 pg / ml 3xFLAG peptid. IgG-relaterede bands og 3xFLAG peptid mærkes. <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/54518/54518fig1large.jpg" target="_blank">Klik her for at se en større version af dette tal.</a> <img alt="Figur 2" src="/files/ftp_upload/54518/54518fig2.jpg" /> Figur 2: Sleeve-og-puck PTFE isolator. En 250 ml PTFE krukke vises (1). En 50 ml rustfri stål fræsning krukke (2) tilpasser indersiden af PTFE jar (3) og tilvejebringermulighed for at forlade formaling jar installeret i møllen mellem cyklusserne. En øvre PTFE isolator puck (2) anvendes mellem klemme montering og krukke låg. At afkøle den installerede krukken og isolator samling (3), er LN2 tilsættes direkte ind i kroppen af isolatoren, der omgiver krukken. Den næste cyklus af formaling kan derefter initieres. <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/54518/54518fig2large.jpg" target="_blank">Klik her for at se en større version af dette tal.</a> <table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody><tr><td> Reagens </td><td> foreslået Koncentration </td><td> Noter </td></tr><tr><td> Natriumchlorid </td><td> 0,1-0,5 M </td><td> Høje koncentrationer (&gt; 300 mM) har tendens til at forbedre udvindingen af ​​total protein og holde baggrunden lav, men kan strimler væk nogle ellers stabil interaktører. Koncentrationer under 150 mM er typisk ikke effektiv til at reducere ikke-specifik baggrund. </td></tr><tr><td> ammoniumacetat </td><td> 0,2-2 M </td><td> Et salt, der består af to puffere, der giver en neutral pH opløsning 57. Højere koncentrationer stabilisere nogle proteinkomplekser. Sure opløsninger kan skyldes gamle, forkert gemt krystallinske bestande på grund af ammoniak tab. Ingen yderligere pH-buffer eller salte er påkrævet i ekstraktionsmidler indeholdende ammoniumacetat. Kan kombineres med NaCl at modulere opnåede resultater. </td></tr><tr><td> Tween 20 </td><td> 0,1% v / v </td><td> Et ikke-ionisk detergent 58; kombineres typisk med NaCl. </td></tr><tr><td> Triton X-100 </td><td> 0,5-1% v / v </td><td> Et ikke-ionisk detergent 58; typisk kombineret med enten NaCl eller NH4 CH3 CO2H </td></tr><tr><td> CHAPS </td><td> 5 mM </td><td> En zwitterionisk detergent 58 &lt;/ Sup&gt;; kombineres typisk med NaCl. </td></tr><tr><td> Sarkosyl </td><td> 1 mM </td><td> En anionisk detergent 58, som reducerer baggrundsstøj og kan strip off stabile komplekse komponenter, potentielt afsløre binære tilslutning; kombineres typisk med NaCl. </td></tr><tr><td rowspan="2"> Tris-CI </td><td> 20 mM </td><td rowspan="2"> pKa på 8,8 ved 4 ° C, 8,1 ved 25 ° C. </td></tr><tr><td> (PH 8,0) </td></tr><tr><td rowspan="2"> HEPES-Na </td><td> 20 mM </td><td rowspan="2"> pKa på 7,8 ved 4 ° C, 7,5 ved 25 ° C. NaOH eller KOH, der anvendes til pH ækvilibrering afhængigt af salt (f.eks NaCI, KCI, eller CH3 CO 2 K) anvendt i ekstraktionsmidlet. </td></tr><tr><td> (PH 7,4) </td></tr></tbody></table> Tabel 1: Et par foreslået reagenser anvendelige til oprensning af protein-komplekser. Denne tabel lister nogle reagenser vi har fundet nyttige til rensning af protein komplekser fra humane cellelinjer, med foreslåede arbejder koncentrationer. En typisk ekstraktionsmiddel formulering indeholder en pH-puffer, et salt og et detergent 1,11,24,45-48. Bedste praksis er at identificere den mindste sammensat blanding af reagenser, der giver det ønskede resultat. <img alt="Figur S1" src="/files/ftp_upload/54518/54518figS1.jpg" /> Figur S1: Bland efter rensning (MAP-) SILAC analyse af falske positiver. I. skematisk diagram: I dette eksperiment 3xFLAG-mærkede ORF2p proteinkomplekser (udtrykt fra pLD401) blev oprenset fra tunge og lette mærket HEK-293T celler 7 hhv. Lyset mærket celleekstrakt blev tilsat 3xFLAG peptid for at forhindre affinitetsindfangning af 3xFLAG-taggede ORF2p ved kompetitiv inhibering; Dette forventes ikke at blokere bindingen af ​​proteiner, der kan opstå ikke-specitisk med den magnetiske medium eller de ikke-paratopiske strukturer af antistoffet. Efter eluering fra de magnetiske perler, de tunge og lette prøver blev blandet post-rensning og analyseret ved kvantitativ MS (MAP-SILAC 39) for at bestemme den del af proteiner associeret med enten prøve; yderligere metodologisk detalje ligger i tabel S1. II. Sølvfarvede gel, der illustrerer, at de lette og tunge mærkede materialer opnåelse sammenlignelige resultater (sammenlign L med H), og at oprensningen udføres i nærvær af 3xFLAG spike-in (LI) blev kompetitivt inhiberet. Nedenfor, en Coomassie Blue G-250 farvede gel prop bestående af den blandede H og LI fraktioner, før gel-baserede proteomisk analyse, som beskrevet i tabel S1. <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/54518/54518figS1large.jpg" target="_blank">Klik her for at downloade en større version af dette tal.</a> Tabel S1:MAP-SILAC. Dette ark indeholder de data, der er opnået ved udførelse af den i figur S1 MAP-SILAC eksperiment. <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/54518/Table_S1.xlsx" target="_blank">Klik her for at downloade denne tabel.</a>

Watch this Scientific Journal Video about Protein Complex Affinity Capture from Cryomilled Mammalian Cells at JoVE.com

Protein Complex Affinity Capture from Cryomilled Mammalian Cells

Her beskriver vi protokoller til at forstyrre pattedyrceller ved solid-state fræsning ved en kryogen temperatur, producerer en celle ekstrakt fra den resulterende celle pulver, og isolere protein komplekser af interesse ved affinitetsindfangning på antistof-koblede micron skala paramagnetiske perler.

Protein Complex Affinity Capture fra Cryomilled pattedyrsceller

Affinity capture is an effective technique for isolating endogenous protein complexes for further study. When used in conjunction with an antibody, this ...

Research

JoVE Journal

Biochemistry

Tandem Affinity Purification of Protein Complexes from Eukaryotic Cells

Tandem affinitetsoprensning af proteinkomplekser fra eukaryote celler

The purification of active protein-protein and protein-nucleic acid complexes is crucial for the characterization of enzymatic activities and de novo ...

Resolving Affinity Purified Protein Complexes by Blue Native PAGE and Protein Correlation Profiling

Løsning affinitetsrensede proteinkomplekser ved Blå Native PAGE og protein Korrelation Profilering

Most proteins act in association with others; hence, it is crucial to characterize these functional units in order to fully understand biological ...

mRNA Interactome Capture from Plant Protoplasts

MRNA Interactome Capture fra Plant Protoplasts

RNA-binding proteins (RBPs) determine the fates of RNAs. They participate in all RNA biogenesis pathways and especially contribute to post-transcriptional ...

Biochemical and Structural Characterization of the Carbohydrate Transport Substrate-binding-protein SP0092

Biokemiske og strukturel karakterisering af kulhydrat Transport substrat-bindende-protein SP0092

Development of new antimicrobials and vaccines for Streptococcus pneumoniae (pneumococcus) are necessary to halt the rapid rise in multiple resistant ...

Toeprinting Analysis of Translation Initiation Complex Formation on Mammalian mRNAs

Toeprinting analyse af oversættelse indledningen kompleks dannelse på pattedyr mRNAs

Translation initiation is the rate-limiting step of protein synthesis and represents a key point at which cells regulate their protein output. Regulation ...

2 in 1: One-step Affinity Purification for the Parallel Analysis of Protein-Protein and Protein-Metabolite Complexes

2 i 1: et-trins affinitet rensning for den parallelle analyse af Protein-Protein og Protein-metabolit komplekser

Cellular processes are regulated by interactions between biological molecules such as proteins, metabolites, and nucleic acids. While the investigation of ...

Translating Ribosome Affinity Purification (TRAP) for RNA Isolation from Endothelial Cells In Vivo

Translating Ribosome Affinity Purification TRAP for RNA Isolation from Endothelial Cells In Vivo

Oversættelse af Ribosome affinitets rensning (TRAP) for RNA-isolation fra endotelceller in vivo

Many studies have been limited to using in vitro cellular assays and whole tissues or isolating of specific cell types from animals for in vitro analysis ...

Activated Cross-linked Agarose for the Rapid Development of Affinity Chromatography Resins - Antibody Capture as a Case Study

Aktiveret tvær kædet Agopstået for den hurtige udvikling af affinitets kromatografi harpiks-antistof opsamling som et casestudie

The purification of monoclonal antibodies (mAbs) is commonly achieved by Protein A affinity chromatography, which can account for up to 25% of the overall ...

Detection of Protein S-Acylation using Acyl-Resin Assisted Capture

Påvisning af Protein S-Acylation ved hjælp af Acyl-Resin Assisted Capture

Protein S-acylation, also referred to as S-palmitoylation, is a reversible post-translational modification of cysteine residues with long-chain fatty ...

Purification of Ubiquitinated p53 Proteins from Mammalian Cells

Oprensning af allestedsnærværende p53-proteiner fra pattedyrceller

Ubiquitination is a type of posttranslational modification that regulates not only the stability but also the localization and function of a substrate ...