Name: protein complex affinity capture from cryomilled mammalian cells
Uploaded: 2016-12-09T13:00:00
Duration: 10 min 37 s
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Nous remercions le Professeur Brian T. Chait pour son précieux conseils, du soutien et de l&#39;accès à MS instrumentation, ainsi que Mme Kelly R. Molloy pour un excellent support technique. Nous remercions Mme Kelly Bare pour le support avec copie édition. Ce travail a été soutenu en partie par des subventions des NIH P41GM109824, P41GM103314 et P50GM107632.

The authors declare that they have no competing financial interests.

Ces trois protocoles fonctionnent en tandem pour (1) préparer des cellules pour l&#39;état solide rupture par cryobroyage, (2) réaliser la rupture dans un broyeur à boulets planétaire, et (3) produire des extraits de poudre de cellule à capture par affinité d&#39;une protéine d&#39;intérêt dans un complexe avec ses interacteurs physiologiques. Beaucoup de différentes techniques de lyse cellulaire existent, y compris les approches mécaniques / physiques employant l&#39; écrasement d&#39; impact, cisaillement, et / ou de pression, ainsi que des approches / enzymatiques chimiques, chacune avec des avantages et des inconvénients 49,50. Chaque chercheur est encouragé à explorer les méthodes les plus appropriées pour leurs analyses, en gardant à l&#39; esprit que toute approche retenue pour la rupture des cellules et l&#39; extraction des protéines est susceptible d&#39;introduire des biais 51,52 nécessitant l&#39; optimisation empirique (discuté ci - dessous). Les méthodes mécaniques peuvent produire la chaleur élevée et / ou des forces de cisaillement qui peut perturber les complexes protéiques. Cryobroyage évite les effets de chauffage en raison de l&#39; emploi LN 2 refroidissement des échantillons pour til durée du processus. Les broyeurs planétaires , on entend compter sur l&#39; impact et de frottement des forces, y compris la contrainte de cisaillement, en tant que composants de particules réduction de la taille 53,54. Les paramètres que nous avons signalé pas observé la dégénérescence des complexes protéiques. En effet , nous avons extrait et récupéré apparemment intacts ~ 50 MDa complexes des pores nucléaires 11 et enzymatiquement rétrotransposons actifs présentant une activité spécifique plus élevée que les préparations employant lyse &#39;doux&#39; à base de détergent 7. Chimiques et / ou des procédés enzymatiques de lyse cellulaire souffrent de la limitation que le contenu de la cellule sont libérés dans une étude in vitro milieu qui favorise la rupture des membranes cellulaires et des macromolécules structurales mais peut ne pas être approprié pour le maintien de l&#39;intégrité du complexe protéique (s ) d&#39;intérêt. Fréquemment, ni les constituants des complexes formés avec la protéine d&#39;intérêt, ni les conditions nécessaires pour stabiliser les complexes sont ciblésconnu à l&#39;avance. Un avantage majeur de broyage à l&#39;état solide est que la rupture et l&#39;extraction sont découplées, ce qui permet un matériau source pour être préparés sans liquide ajouté, stockés (à -80 ° C ou au-dessous), amassé, et commodément récupérés pour l&#39;expérimentation à la demande; par exemple, pour explorer optimisée dans des conditions in vitro pour la capture d&#39; affinité. Les interactions protéiques sont les plus stables à forte concentration 55,56, donc en minimisant le volume de l&#39; agent d&#39; extraction peut être avantageux pour la conservation des interactions physiologiques. D&#39;autre part, il existe des considérations pratiques - les complexes protéiques ne doivent être partagés par les cellules et en une phase aqueuse non visqueuse, exempte d&#39;agrégats insolubles, afin de mélanger les complexes de cibles avec le support d&#39;affinité. En outre, une certaine normalisation et de contrôle sur l&#39;environnement in vitro (pH, concentration en sel, etc.) est nécessaire pour la systématisation et la reproductibilité. Nous constatons que des extraits produced dans la gamme de dilution de 1: 4-1: 9 (w: v) de répondre aux préoccupations pratiques et théoriques, ce qui donne des résultats de qualité. En outre, la proportion optimale de l&#39;extrait cellulaire d&#39;affinité besoins moyens à déterminer. Ceci est fait de manière empirique par titrage des extraits avec des quantités variables de milieu d&#39;affinité et peut avoir des effets détectables sur le rapport signal sur bruit de l&#39;expérience, en outre discuté ci-dessous. Un excellent appauvrissement de la protéine cible est typiquement ≥70% de la fraction soluble de la protéine cible, mais&gt; 90% est souhaitable et peut être obtenue avec un paramétrage minutieux des conditions d&#39;extraction. Beaucoup de ces considérations pratiques sont couvertes en référence 1. perles paramagnétiques sont manipulées en utilisant des aimants néodyme dans un support de tube de microcentrifugation spécialisée, bien que des alternatives maison sont viables. Lorsqu&#39;il est placé dans le support, les perles collect au niveau du côté du tube sous l&#39;influence du champ magnétique. Les solutions peuvent ensuite être retirés sans disturbing les billes. Une limitation du protocole cryobroyage présenté, développé avec le broyeur à boulets planétaire utilisé ici (voir le tableau des matériaux), est qu&#39;une quantité minimale de matériel est nécessaire pour efficacement moulin et récupérer la poudre de cellule en utilisant ce dispositif (&gt; 1 g). De telles quantités peuvent être facilement obtenus avec de nombreux microbes, des lignées cellulaires et des organismes modèles, et peuvent souvent être obtenus avec des tissus excisés des animaux de laboratoire. Cependant, certaines lignées cellulaires peuvent être très difficiles à cultiver dans des tissus d&#39;abondance et d&#39;animaux peuvent être rares. De petites quantités de matière peuvent être comparables broyés en utilisant d&#39;autres dispositifs utilisant des contenants plus petits, bien que potentiellement au détriment de la finesse de la poudre obtenue. En outre, le coût des dispositifs de broyage mécanique peut être prohibitif pour certains laboratoires. Cryobroyage peut être réalisé en utilisant un certain nombre de configurations alternatives 14-19, y compris, plus abordable à la main en utilisant un ravageurle mortier, bien que l&#39;efficacité de la rupture diminue considérablement. les protocoles de capture par affinité sont généralement destinés à une grande efficacité de la lyse des cellules pour faciliter l&#39;extraction maximale de la protéine dans la solution et, par conséquent, le potentiel maximal pour la capture des complexes de protéines cibles. D&#39;autre part, il a été démontré pour la levure dans des extraits d&#39; épissage in vitro que la lyse maximale ne peut pas assimiler à une activité maximale dans biochimique in vitro 57,58. On n&#39;a pas observé de tels problèmes dans les systèmes que nous avons testés jusqu&#39;à présent, et donc ne limitent pas volontairement notre rupture cellulaire lorsque cryobroyage. Néanmoins, cette possibilité devrait garder à l&#39; esprit lors de l&#39; optimisation pour les dosages enzymatiques in vitro. Bien que cryobroyage est une méthode très efficace pour briser les cellules, une quantité limitée de sonication profite souvent la production homogènes extraits de cellules entières à partir de tissus de mammifères, car les agrégats hétérogènes peuvent parfois être observés par une inspection visuelle: généralementdans des conditions d&#39;extraction à l&#39;aide de faible à modérée de sel (100-300 mM) et un détergent non-ionique (0,1-1% v / v) des concentrations. Parce que nous avons observé que la présence de ces agrégats peut réduire le rendement et / ou la qualité de la capture d&#39;affinité ultérieure, nous mettons en œuvre systématiquement sonication pour les disperser (même quand ils ne sont pas observées à l&#39;œil nu). Les agrégats sont compatibles avec des fragments de membranes agglomérées, comparables à ceux rapportés précédemment dans des extraits de cellules de levure 58 fraisées. Sonication est également utilisé dans certains protocoles pour cisailler l&#39;ADN et de libérer des fragments de chromatine en solution, mais le degré de sonication appliqué dans ce protocole ne pas sensiblement fragment d&#39;ADN. La disponibilité limitée (ou le coût élevé) d&#39;un excellent ligand d&#39;affinité ou de l&#39;anticorps contre la protéine d&#39;intérêt particulier peuvent être un autre obstacle. Un large éventail de disponibles dans le commerce des réactifs d&#39;affinité peut être mis à profit lorsque l&#39;organisme modèle se prête à l&#39;étiquetage génomique ou transfection avec des vecteurs d&#39;expression ectopique, permettant l&#39;expression de protéines d&#39;intérêt sous forme de fusion par affinité étiquetée. Cependant, la production d&#39;anticorps sur mesure est devenu de plus en plus réalisable et les anticorps polyclonaux et monoclonaux peuvent excellentes performances dans les applications de capture par affinité. Ces nombreuses considérations sont également couverts de façon plus détaillée en référence 1. Des exemples de la façon dont la méthode de la lyse cellulaire et le choix du milieu d&#39; affinité peuvent affecter les résultats sont illustrés sur la figure 1. Des exemples d&#39;effets exercés par les différents agents d&#39; extraction peuvent être vus dans les références 1,11,24. Parce que ces et d&#39; autres paramètres expérimentaux affectent la qualité de la capture d&#39;affinité, ce qui rend difficile de discriminer ips, les référentiels de &quot;protéomes de perles» et des approches computationnelles pour éliminer les contaminants non-spécifiques ont été développés pour aider à identifier MF 40-43. Néanmoins, ces approches ne substitute pour la préparation optimale de l&#39; échantillon à un degré limité 59. Observer les meilleures pratiques et l&#39;optimisation de l&#39;expérience empirique de capture d&#39;affinité fournira les échantillons de haute qualité pour des analyses en aval, en outre discuté ci-dessous. Une pratique facilement mis en œuvre qui peut améliorer la pureté échantillon est élution native. élution native est le plus fréquemment utilisé pour obtenir le isolé complexe protéique d&#39;affinité, intacte, pour une expérimentation plus poussée; mais il améliore souvent la pureté de l&#39;échantillon, il peut également être utilisé pour cette seule raison. Cependant, comme le montre la figure 1, le panneau II, la capacité d&#39;élution native pour améliorer la pureté échantillon peut dépendre d&#39;un dosage précis de la quantité de milieu d&#39; affinité pour l&#39;abondance de la protéine cible dans l&#39;extrait cellulaire - lorsque le milieu est en excès , paratopes inoccupées peuvent permettre l&#39;accumulation hors cible de protéines FP observables dans les fractions éluées nativement. En utilisant les réactifs et les procédures décrites ici, il hcomme cela a été notre expérience que le plus grand contributeur de MF à nos expériences est la protéine marquée se fois retiré du contexte de la cellule vivante. (Fig. 1.II et Fig. S1). Dans de tels cas, les contrôles de lignées cellulaires parentales qui donnent protéomes non pertinentes en l&#39;absence de l&#39;antigène ne sont d&#39;aucune valeur pratique; De même pour la balise seule ou pic dans les contrôles qui sont dépourvues de tout sauf l&#39;antigène cible. Par conséquent, chaque fois que nous mettons en œuvre pratique I-DIRT 7,38, qui mesure directement l&#39;accumulation des interactions protéiques post-lyse en utilisant MS quantitatives. Comme mentionné dans l&#39;étape 3.2.7 du protocole, les procédures d&#39;élution native varieront selon les détails du système d&#39;affinité utilisé. élution natif est le plus souvent réalisée par déplacement compétitif de la protéine marquée clivage protéolytique complexe ou de l&#39;étiquette, la libération du complexe à partir du milieu d&#39;affinité. Plusieurs systèmes d&#39;affinité comprenant des petites étiquettes d&#39;épitopes existent, for laquelle l&#39;épitope lui - même est disponible en tant que peptide utile pour l&#39; élution compétitive des complexes protéiques étiquetés 60. De même, plusieurs protéases sont disponibles pour cliver spécifiquement des sites parentes placés stratégiquement dans affinité tagged protéines de fusion 61. Selon les spécificités des systèmes d&#39;affinité choisis, le système d&#39;élution approprié pourrait être adopté. En règle générale, la qualité des résultats obtenus sera considérablement affectée par la qualité de la préparation de l&#39;échantillon. Il est important de travailler avec soin et précision à chaque étape de ces protocoles, et aussi rapidement que possible tout en maintenant soin et précision. Il est conseillé de suivre la répartition de la protéine d&#39;intérêt dans chaque étape de comprendre l&#39;efficacité de chaque manipulation. Par exemple: comment abondante est la protéine d&#39;intérêt dans la cellule ou le tissu en question? Peut-être la protéine à l&#39;étude (et ses complexes) sera difficile à caractériser en masseSpectrométrie en raison de la faible abondance. Si les complexes purifiés sont détectables par coloration générale des protéines (environ nanogrammes gamme), la spectrométrie de masse est susceptible de réussir. Si la protéine capturée d&#39;intérêt ne peut être détectée par western blot sensible chimioluminescent renforcé (environ de gamme picogramme), la spectrométrie de masse est moins susceptible d&#39;être efficace. Même si la protéine d&#39;intérêt est abondant dans la cellule, la façon dont elle est abondante dans l&#39;extrait cellulaire produite? Est-ce que la partition de la protéine à la solution ou est-il dans le culot? Si celui-ci, une nouvelle solution d&#39;extraction peut être mis au point qui peut améliorer la récupération. Une fois que l&#39;extrait cellulaire est combiné avec le milieu d&#39;affinité, dans quelle mesure la protéine est capturée? Est-ce que la protéine reste lié par les lavages suivants? Qu&#39;en est-il d&#39;autres protéines copurifying? En enregistrant une aliquote de chaque échantillon à des étapes appropriées du protocole ces questions peuvent facilement répondre, typiquement par western blot contre la protéine d&#39;intérêtou la coloration des protéines en général, mais d&#39;autres dosages peuvent également être appropriés. Optimisation de chaque étape permettra d&#39;améliorer le rendement et la pureté des complexes capturés, mais il peut y avoir un compromis à faire pour maximiser un attribut ou l&#39;autre. Une application typique de capture par affinité pour de nombreux chercheurs est d&#39;identifier le candidat dans interacteurs vivo pour un petit nombre de protéines d&#39;intérêt; ces candidats sont fréquemment soumis à la validation par des approches orthogonales in vivo pour démontrer l&#39;importance biologique des interacteurs physiques. Capture d&#39; affinité est également utilisé par des études à haut débit pour générer des listes de copurifying protéines observées sur une base (presque) protéomique à l&#39; échelle, ce qui facilite les inférences de calcul concernant putative dans les complexes in vivo. De nombreux exemples de telles études peuvent être trouvées dans la littérature. Cette approche renonce à l&#39;optimisation des conditions de capture pour une cible donnée en faveur de l&#39;homme à explorerles cibles y; Par conséquent, les complexes eux-mêmes sont inférés rarement récupéré intact et très pur dans un échantillon donné. Au contraire, les chevauchements partiels dans les compositions observées entre les nombreux échantillons d&#39;affinité capturés distincts sont utilisés comme base des conclusions 42. Les deux approches fournissent des données précieuses à notre compréhension de l&#39;interactome. Néanmoins, l&#39;un des principaux avantages de capture par affinité est qu&#39;il ne propose souvent la possibilité d&#39;obtenir les complexes intacts et hautement purifiée, à condition que des efforts sont faits pour optimiser la procédure. Nous croyons que l&#39;avenir de l&#39;approche réside dans l&#39; augmentation de la facilité et l&#39; efficacité de l&#39; optimisation de la capture des complexes de protéines endogènes 11, pour une évaluation plus précise de la gamme des interacteurs physiologiques et une utilisation plus fréquente dans plus biochimique aval, enzymologiques et études structurales, par exemple, fait référence à 7,9,23.

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<ol start="29">
	<li>Cristea, I. M., &#38; Chait, B. T. Conjugation of magnetic beads for immunopurification of protein complexes. Cold Spring Harbor Protocols. 2011 (5) (2011).</li>
	<li>Rosenberg, I. M. Electrophoretic Techniques. Protein Analysis and Purification. (4), 63&#8211;117 (2005).</li>
	<li>Ornstein, L. Disc Electrophoresis. I. Background and Theory. Ann N Y Acad Sci. 121 (A2), 321&#8211;349 (1964).</li>
	<li>Davis, B. J. Disc Electrophoresis. II. Method and Application to Human Serum Proteins. Ann N Y Acad Sci. 121, 404&#8211;427 (1964).</li>
	<li>Laemmli, U. K. Cleavage of structural proteins during the assembly of the head of bacteriophage T4. Nature. 227 (5259), 680&#8211;685 (1970).</li>
	<li>Shevchenko, A., Tomas, H., Havlis, J., Olsen, J. V., &#38; Mann, M. In-gel digestion for mass spectrometric characterization of proteins and proteomes. Nature protocols. 1 (6), 2856&#8211;2860 (2006).</li>
	<li>DeGrasse, J. A., Kalkum, M., Krutchinsky, A.N., Padovan, J. C., &#38; Zhang, W. MALDI Sample Preparation. rockefeller.edu at &#60;http://prowl.rockefeller.edu/protocols/in-gel-digestion.html&#62; (2006).</li>
	<li>Lubas, M., Christensen, M. S., et al. Interaction profiling identifies the human nuclear exosome targeting complex. Mol Cell. 43 (4), 624&#8211;637 (2011).</li>
	<li>Tackett, A. J., DeGrasse, J. A., Sekedat, M. D., Oeffinger, M., Rout, M. P., &#38; Chait, B. T. I-DIRT, a general method for distinguishing between specific and nonspecific protein interactions. J Proteome Res. 4 (5), 1752&#8211;1756 (2005).</li>
	<li>Wang, X., &#38; Huang, L. Identifying dynamic interactors of protein complexes by quantitative mass spectrometry. Mol Cell Proteomics. 7 (1), 46&#8211;57 (2008).</li>
	<li>Trinkle-Mulcahy, L., Boulon, S., et al. Identifying specific protein interaction partners using quantitative mass spectrometry and bead proteomes. J Cell Biol. 183 (2), 223&#8211;239 (2008).</li>
	<li>Boulon, S., Ahmad, Y., et al. Establishment of a protein frequency library and its application in the reliable identification of specific protein interaction partners. Mol Cell Proteomics. 9 (5), 861&#8211;879 (2010).</li>
	<li>Armean, I. M., Lilley, K. S., &#38; Trotter, M. W. B. Popular computational methods to assess multiprotein complexes derived from label-free affinity purification and mass spectrometry (AP-MS) experiments. Mol Cell Proteomics. 12 (1), 1&#8211;13 (2013).</li>
	<li>Mellacheruvu, D., Wright, Z., et al. The CRAPome: a contaminant repository for affinity purification-mass spectrometry data. Nat Methods. (2013).</li>
	<li>Cheeseman, I. M., &#38; Desai, A. A combined approach for the localization and tandem affinity purification of protein complexes from metazoans. Sci. STKE 2005 (266), pl1 (2005).</li>
	<li>Goldberg, S. Mechanical/physical methods of cell disruption and tissue homogenization. Methods in Molecular Biology. 424 (Chapter 1), 3&#8211;22 (2008).</li>
	<li>Grabski, A. C. Advances in preparation of biological extracts for protein purification. Methods in Enzymology. 463 (C), 285&#8211;303 (2009).</li>
	<li>Dhabaria, A., Cifani, P., Reed, C., Steen, H., &#38; Kentsis, A. A High-Efficiency Cellular Extraction System for Biological Proteomics. J Proteome Res. 14 (8), 3403&#8211;3408 (2015).</li>
	<li>Glatter, T., Ahrn&#233;, E., &#38; Schmidt, A. Comparison of Different Sample Preparation Protocols Reveals Lysis Buffer-Specific Extraction Biases in Gram-Negative Bacteria and Human Cells. J Proteome Res. 15 (2), 679 (2016).</li>
	<li>Zhao, Q.-Q., Yamada, S., &#38; Jimbo, G. The Mechanism and Grinding Limit of Planetary Ball Milling. KONA. 7, 29&#8211;36 (1989).</li>
	<li>Sheng-Yong, L., Qiong-Jing, M., Zheng, P., Xiao-Dong, L., &#38; Jian-Hua, Y. Simulation of ball motion and energy transfer in a planetary ball mill. Chinese Phys. B 21 (7), 078201 (2012).</li>
	<li>Fulton, A. B. How crowded is the cytoplasm? Cell. 30 (2), 345&#8211;347 (1982).</li>
	<li>Ellis, R. J. Macromolecular crowding: obvious but underappreciated. Trends Biochem Sci. 26 (10), 597&#8211;604 (2001).</li>
	<li>Kalkum, M. Using the Retsch MM301 Ball Mill for Cryogenic Disruption of Yeast Cells. 2 City of Hope, (2003).</li>
	<li>Staley, J. Making Whole Cell Extract of Saccharomyces cerevisiae cells using the Retsch MM301 Ball Mill. Retsch GmbH: (2005).</li>
	<li>Bell, A. W., Nilsson, T., Kearney, R. E., &#38; Bergeron, J. J. M. The protein microscope: Incorporating mass spectrometry into cell biology. Nat Methods. 4 (10), 783&#8211;784 (2007).</li>
	<li>Zhao, X., Li, G., &#38; Liang, S. Several affinity tags commonly used in chromatographic purification. J Anal Methods Chem. 2013 (1), 581093&#8211;8 (2013).</li>
	<li>Waugh, D. S. An overview of enzymatic reagents for the removal of affinity tags. 80 (2), 283&#8211;293 (2011).</li>
	<li>Williams, R. J., &#38; Lyman, C. M. A neutral buffered standard for hydrogen ion work and accurate titrations which can be prepared in one minute. J Am Chem Soc. 54 (5), 1911&#8211;1912 (1932).</li>
	<li>Johnson, M. Detergents: Triton X-100, Tween-20, and More. labome.com. 3 (163) (2013).</li>
	<li>Deppert, W. R., &#38; Luka&#265;in, R. Buffers and Additives. Journal of Chromatography Library. 61 (C), 839&#8211;862 (1999).</li>
	<li>Ugwu, S. O., &#38; Apte, S. P. The Effect of Buffers on Protein Conformational Stability. Pharmaceutical Technology. 28 (3), 86&#8211;108 (2004).</li>
	<li>Linke, D. Detergents: an overview. Methods in Enzymology. 463 (34), 603&#8211;617 (2009).</li>
	<li>Zhang, J. Protein-Protein Interactions in Salt Solutions. Protein-Protein Interactions Computational and Experimental Tools. (18), 359&#8211;376 (2012).</li>
</ol>
to:
<ol start="29">
	<li>Ball Mills - Guidelines for sample amount and ball charge. 1&#8211;3at &#60;http://www.retsch.com/products/milling/ball-mills/planetary-ball-mill-pm-100/information-downloads/&#62; Retsch GmbH (2014).</li>
	<li>Cristea, I. M., &#38; Chait, B. T. Conjugation of magnetic beads for immunopurification of protein complexes. Cold Spring Harbor Protocols. 2011 (5) (2011).</li>
	<li>Rosenberg, I. M. Electrophoretic Techniques. Protein Analysis and Purification. (4), 63&#8211;117 (2005).</li>
	<li>Ornstein, L. Disc Electrophoresis. I. Background and Theory. Ann N Y Acad Sci. 121 (A2), 321&#8211;349 (1964).</li>
	<li>Davis, B. J. Disc Electrophoresis. II. Method and Application to Human Serum Proteins. Ann N Y Acad Sci. 121, 404&#8211;427 (1964).</li>
	<li>Laemmli, U. K. Cleavage of structural proteins during the assembly of the head of bacteriophage T4. Nature. 227 (5259), 680&#8211;685 (1970).</li>
	<li>Shevchenko, A., Tomas, H., Havlis, J., Olsen, J. V., &#38; Mann, M. In-gel digestion for mass spectrometric characterization of proteins and proteomes. Nature protocols. 1 (6), 2856&#8211;2860 (2006).</li>
	<li>DeGrasse, J. A., Kalkum, M., Krutchinsky, A.N., Padovan, J. C., &#38; Zhang, W. MALDI Sample Preparation. rockefeller.edu at &#60;http://prowl.rockefeller.edu/protocols/in-gel-digestion.html&#62; (2006).</li>
	<li>Lubas, M., Christensen, M. S., et al. Interaction profiling identifies the human nuclear exosome targeting complex. Mol Cell. 43 (4), 624&#8211;637 (2011).</li>
	<li>Tackett, A. J., DeGrasse, J. A., Sekedat, M. D., Oeffinger, M., Rout, M. P., &#38; Chait, B. T. I-DIRT, a general method for distinguishing between specific and nonspecific protein interactions. J Proteome Res. 4 (5), 1752&#8211;1756 (2005).</li>
	<li>Wang, X., &#38; Huang, L. Identifying dynamic interactors of protein complexes by quantitative mass spectrometry. Mol Cell Proteomics. 7 (1), 46&#8211;57 (2008).</li>
	<li>Trinkle-Mulcahy, L., Boulon, S., et al. Identifying specific protein interaction partners using quantitative mass spectrometry and bead proteomes. J Cell Biol. 183 (2), 223&#8211;239 (2008).</li>
	<li>Boulon, S., Ahmad, Y., et al. Establishment of a protein frequency library and its application in the reliable identification of specific protein interaction partners. Mol Cell Proteomics. 9 (5), 861&#8211;879 (2010).</li>
	<li>Armean, I. M., Lilley, K. S., &#38; Trotter, M. W. B. Popular computational methods to assess multiprotein complexes derived from label-free affinity purification and mass spectrometry (AP-MS) experiments. Mol Cell Proteomics. 12 (1), 1&#8211;13 (2013).</li>
	<li>Mellacheruvu, D., Wright, Z., et al. The CRAPome: a contaminant repository for affinity purification-mass spectrometry data. Nat Methods. (2013).</li>
	<li>Cheeseman, I. M., &#38; Desai, A. A combined approach for the localization and tandem affinity purification of protein complexes from metazoans. Sci. STKE 2005 (266), pl1 (2005).</li>
	<li>Deppert, W. R., &#38; Luka&#265;in, R. Buffers and Additives. Journal of Chromatography Library. 61 (C), 839&#8211;862 (1999).</li>
	<li>Ugwu, S. O., &#38; Apte, S. P. The Effect of Buffers on Protein Conformational Stability. Pharmaceutical Technology. 28 (3), 86&#8211;108 (2004).</li>
	<li>Linke, D. Detergents: an overview. Methods in Enzymology. 463 (34), 603&#8211;617 (2009).</li>
	<li>Zhang, J. Protein-Protein Interactions in Salt Solutions. Protein-Protein Interactions Computational and Experimental Tools. (18), 359&#8211;376 (2012).</li>
	<li>Goldberg, S. Mechanical/physical methods of cell disruption and tissue homogenization. Methods in Molecular Biology. 424 (Chapter 1), 3&#8211;22 (2008).</li>
	<li>Grabski, A. C. Advances in preparation of biological extracts for protein purification. Methods in Enzymology. 463 (C), 285&#8211;303 (2009).</li>
	<li>Dhabaria, A., Cifani, P., Reed, C., Steen, H., &#38; Kentsis, A. A High-Efficiency Cellular Extraction System for Biological Proteomics. J Proteome Res. 14 (8), 3403&#8211;3408 (2015).</li>
	<li>Glatter, T., Ahrn&#233;, E., &#38; Schmidt, A. Comparison of Different Sample Preparation Protocols Reveals Lysis Buffer-Specific Extraction Biases in Gram-Negative Bacteria and Human Cells. J Proteome Res. 15 (2), 679 (2016).</li>
	<li>Zhao, Q.-Q., Yamada, S., &#38; Jimbo, G. The Mechanism and Grinding Limit of Planetary Ball Milling. KONA. 7, 29&#8211;36 (1989).</li>
	<li>Sheng-Yong, L., Qiong-Jing, M., Zheng, P., Xiao-Dong, L., &#38; Jian-Hua, Y. Simulation of ball motion and energy transfer in a planetary ball mill. Chinese Phys. B 21 (7), 078201 (2012).</li>
	<li>Fulton, A. B. How crowded is the cytoplasm? Cell. 30 (2), 345&#8211;347 (1982).</li>
	<li>Ellis, R. J. Macromolecular crowding: obvious but underappreciated. Trends Biochem Sci. 26 (10), 597&#8211;604 (2001).</li>
	<li>Kalkum, M. Using the Retsch MM301 Ball Mill for Cryogenic Disruption of Yeast Cells. 2 City of Hope, (2003).</li>
	<li>Staley, J. Making Whole Cell Extract of Saccharomyces cerevisiae cells using the Retsch MM301 Ball Mill. Retsch GmbH: (2005).</li>
	<li>Bell, A. W., Nilsson, T., Kearney, R. E., &#38; Bergeron, J. J. M. The protein microscope: Incorporating mass spectrometry into cell biology. Nat Methods. 4 (10), 783&#8211;784 (2007).</li>
	<li>Zhao, X., Li, G., &#38; Liang, S. Several affinity tags commonly used in chromatographic purification. J Anal Methods Chem. 2013 (1), 581093&#8211;8 (2013).</li>
	<li>Waugh, D. S. An overview of enzymatic reagents for the removal of affinity tags. 80 (2), 283&#8211;293 (2011).</li>
</ol>

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Erratum: Protein Complex Affinity Capture from Cryomilled Mammalian Cells

Une application typique des procédures présentées est de stabiliser et d&#39; obtenir un rendement élevé et la pureté des complexes de protéines endogènes d&#39;intérêt pour la caractérisation interactomic 1. Il est entendu que les réseaux dynamiques des deux complexes macromoléculaires de manière stable et transitoire associées, principalement constituées de protéines, d&#39; orchestrer les processus cellulaires 2,3. Bien qu&#39;il existe de nombreuses approches expérimentales pour l&#39; identification des interactions protéine-protéine, la capture d&#39; affinité est parmi les méthodes les plus utilisées pour isoler et disséquer des complexes de protéines physiologiques 4-6. De plus, cette technique a l&#39;avantage de donner les complexes macromoléculaires comme des entités physiques, et pas seulement en tant que points de données dans une lecture; Avantageusement, les complexes obtenus peuvent donc être utilisés dans une multitude de biochimiques supplémentaires en aval, enzymatiques et les essais structuraux 7-9. Les protocoles présentés ont été mis au point en réponse à la nécessité de la carte proteiréseaux d&#39;interaction n-protéine et de caractériser des complexes macromoléculaires dans leurs rôles en tant que les molécules effectrices de la biologie cellulaire. Ils sont détaillés en ce qui concerne leur application à des cellules de mammifères cultivées dans une culture tissulaire, mais sont également applicables à un large éventail d&#39;échantillons biologiques donnés tweaks spécifiques au système appropriés. L&#39;histoire de la capture par affinité remonte au début du XXe siècle avec les premières expériences de chromatographie d&#39;immunoaffinité - ressemblant à ce que l&#39;on appelle communément de nos jours comme immunoprécipitation (IP) - apparaissant dans la littérature au début des années 1950. Utilisation Mainstream de la technique développée davantage à travers le tour de ce siècle à nos 10-13. Cellulaire Diverse et des études de biologie moléculaire ont utilisé la rupture mécanique des cellules par broyage à des températures cryogéniques pour au moins les quarante dernières années 14-19; et les séparations moléculaires utilisant (super) billes paramagnétiques ont become plus en plus fréquent au cours des deux dernières décennies 20. La combinaison de ces différentes technologies a permis d&#39;améliorer de manière synergique les résultats qui peuvent être obtenus dans des expériences complexes de protéines de capture d&#39;affinité 1, comme en témoigne un vaste corpus de travail produit par nous - mêmes et la communauté de recherche plus large 7,9,11,18,19,21 -23. Les résultats sont présentés à l&#39; appui de la figure 1. Une collection de mises en garde et les considérations applicables à l&#39; exécution des expériences efficaces de capture par affinité peut être trouvée dans la référence 1. En général , cette approche est la plus appropriée pour: (I) catalogue interacteurs d&#39;une protéine d&#39;intérêt, à savoir, utiliser des protéines par spectrométrie de masse (MS) pour identifier les protéines copurifying jusqu&#39;alors inconnues (analyse exploratoire); (II) analyse pour la présence d&#39;un partenaire interagissant particulier, à savoir, utiliser MS ou western blot pour détecter une protéine particulière ou un ensemble limité de protéines soupçonnées dansinteragissent avec la protéine d&#39;intérêt (de tests d&#39;hypothèses); ou (III) préparer des complexes protéiques contenant assemblés de manière endogène la protéine d&#39;intérêt pour une étude plus approfondie par des techniques supplémentaires (bonne évaluation préparative). Avant de se lancer dans un régime expérimental de capture par affinité, il est absolument essentiel d&#39;avoir un réactif d&#39;affinité de haute qualité qui se lie à la protéine cible, généralement un anticorps IP-compétent contre la protéine cible native d&#39;intérêt ou contre une étiquette jointe à une protéine de fusion. Il est également essentiel de disposer de méthodes appropriées de lecture expérimentale en place: la coloration générale des protéines (comme le bleu de Coomassie, Sypro Ruby, ou d&#39;argent, après SDS-PAGE), western blot, et de protéines MS sont tous couramment utilisés en conjonction avec capture par affinité 1. Les protocoles présentés utilisent des billes magnétiques conjuguées anticorps comme milieu d&#39;affinité. Alors que la fonction du support d&#39;affinité peut d&#39;abord être validé dans des tests qui utilisent certains paramètres expérimentaux, afin deobtenir les meilleurs résultats de chaque expérience doit être empiriquement optimisé 1,11,24. Les protocoles sont séparés en trois phases distinctes: (1) la préparation du matériel cellulaire congelée; (2) cellules de rupture par solide mouture de l&#39;état à température cryogénique; et (3) l&#39;extraction des protéines et la capture d&#39;affinité en utilisant des billes paramagnétiques anticorps couplé.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="1304">
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:567px;">Growth media &#38; cell culturing implements</td>
			<td style="width:172px;"></td>
			<td style="width:164px;"></td>
			<td style="width:403px;">For producing frozen cells (I)</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">500 cm^2 culture dishes</td>
			<td style="width:172px;">Corning</td>
			<td>431110</td>
			<td>For producing frozen cells (I)</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Large beaker (1-2L)</td>
			<td style="width:172px;"></td>
			<td></td>
			<td>For producing frozen cells (I)</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Rectangular ice pan&#160;</td>
			<td>Fisher Scientific&#160;</td>
			<td>13-900-747</td>
			<td>For producing frozen cells (I), &#38; cryomilling (II)</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Phosphate buffered saline (PBS)</td>
			<td style="width:172px;"></td>
			<td style="width:164px;"></td>
			<td>For producing frozen cells (I)</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Large cell scrapers</td>
			<td>Fisher Scientific&#160;</td>
			<td>08-100-242</td>
			<td>For producing frozen cells (I)</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Liquid nitrogen&#160;</td>
			<td style="width:172px;"></td>
			<td style="width:164px;"></td>
			<td>For producing frozen cells (I), cryomilling (II), &#38; affinity capture (III)</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:567px;">50 ml conical tubes</td>
			<td>Corning</td>
			<td>352098</td>
			<td>For producing frozen cells (I), &#38; cryomilling (II)</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">20 ml Luer lock syringe</td>
			<td style="width:172px;"></td>
			<td style="width:164px;"></td>
			<td>For producing frozen cells (I)</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Leur lock syringe caps</td>
			<td>www.dymax.com</td>
			<td>T11182</td>
			<td>For producing frozen cells (I)</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Refrigerated centrifuge</td>
			<td style="width:172px;"></td>
			<td style="width:164px;"></td>
			<td>For producing frozen cells (I)</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">50 ml tube rack, 4 position</td>
			<td style="width:172px;"></td>
			<td style="width:164px;"></td>
			<td>For producing frozen cells (I), cryomilling (II), &#38; affinity capture (III)</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Styrofoam box</td>
			<td style="width:172px;"></td>
			<td style="width:164px;"></td>
			<td>For producing frozen cells (I), cryomilling (II), &#38; affinity capture (III)</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Planetary ball mill, PM 100&#160;</td>
			<td>Retsch</td>
			<td>20.540.0001&#160;</td>
			<td>For cryomilling (II)</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Stainless steel milling jar, 50 ml&#160;</td>
			<td>Retsch</td>
			<td>01.462.0149</td>
			<td>For cryomilling (II)</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Stainless steel milling balls, 20 mm &#216;&#160;</td>
			<td>Retsch</td>
			<td>05.368.0062</td>
			<td>For cryomilling (II)</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Lid gasket: PFA encapsulated spring energized seal, 2.62 mm 44.63 mm&#160;&#160;</td>
			<td style="width:172px;">www.marcorubber.com</td>
			<td>T1044-2.62x44.63</td>
			<td>For cryomilling (II)</td>
		</tr>
		<tr height="26">
			<td height="26" style="height:26px;">mini-LN2 decanter</td>
			<td style="width:172px;">homemade</td>
			<td style="width:164px;">see Ref 19</td>
			<td>For cryomilling (II)</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">250 ml PTFE jar insulator (optional)</td>
			<td style="width:172px;">Retsch</td>
			<td style="width:164px;">custom order</td>
			<td>For cryomilling (II)</td>
		</tr>
		<tr height="41">
			<td height="41" style="height:41px;">PTFE puck insulator (optional)</td>
			<td style="width:172px;">homemade</td>
			<td style="width:164px;">The Rockefeller University</td>
			<td>For cryomilling (II); can be produced by The Rockefeller University High Energy Physics Instrument Shop, or design blueprints provided, upon request.</td>
		</tr>
		<tr height="41">
			<td height="41" style="height:41px;">5 bar/500 KPA pressure relief valve (optional)</td>
			<td style="width:172px;">http://www.leeimh.com/</td>
			<td style="width:164px;">558 series check valve</td>
			<td>For cryomilling (II)</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:567px;">1.5 - 2 ml microfuge tubes</td>
			<td style="width:172px;"></td>
			<td style="width:164px;"></td>
			<td>For affinity capture (III)</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:567px;">Extractant</td>
			<td style="width:172px;"></td>
			<td style="width:164px;"></td>
			<td>For affinity capture (III)</td>
		</tr>
		<tr height="41">
			<td height="41" style="height:41px;width:567px;">cOmplete EDTA free protease inhibitor cocktail tablets</td>
			<td style="width:172px;">Roche Applied Science</td>
			<td style="width:164px;">11873580001</td>
			<td style="width:403px;">For affinity capture (III)</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:567px;">Vortex mixer</td>
			<td style="width:172px;"></td>
			<td style="width:164px;"></td>
			<td>For affinity capture (III)</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:567px;">Ice bucket</td>
			<td style="width:172px;"></td>
			<td style="width:164px;"></td>
			<td>For affinity capture (III)</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:567px;">Microtip sonicator, Q700</td>
			<td style="width:172px;">Qsonica</td>
			<td style="width:164px;">Q700</td>
			<td>For affinity capture (III)</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">low intensity 1/16&#8221; microtip probe</td>
			<td style="width:172px;">Qsonica</td>
			<td style="width:164px;">4717</td>
			<td>For affinity capture (III)</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:567px;">Bench-top refrigerated microcentrifuge</td>
			<td style="width:172px;"></td>
			<td style="width:164px;"></td>
			<td>For affinity capture (III)</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:567px;">Dynabeads M-270 Epoxy</td>
			<td style="width:172px;">Thermo Fisher</td>
			<td style="width:164px;">14302D</td>
			<td>For affinity capture (III)</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:567px;">Antibody or affinity ligand coupled to Dynabeads</td>
			<td style="width:172px;">homemade</td>
			<td style="width:164px;"></td>
			<td>For affinity capture (III); see reference 19</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:567px;">Sample rotator&#160;</td>
			<td style="width:172px;"></td>
			<td style="width:164px;"></td>
			<td>For affinity capture (III)</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:567px;">Neodymium magnet</td>
			<td style="width:172px;">Life Technologies</td>
			<td style="width:164px;">123-21D&#160;</td>
			<td>For affinity capture (III)</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:567px;">SDS-PAGE sample buffer (no reducing agent)</td>
			<td style="width:172px;"></td>
			<td style="width:164px;"></td>
			<td>For affinity capture (III)</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:567px;">DTT</td>
			<td style="width:172px;"></td>
			<td style="width:164px;"></td>
			<td>For affinity capture (III)</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:567px;">SDS-PAGE system</td>
			<td style="width:172px;"></td>
			<td style="width:164px;"></td>
			<td>For affinity capture (III)</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:567px;">SDS-polyacrylamide gel</td>
			<td style="width:172px;"></td>
			<td style="width:164px;"></td>
			<td>For affinity capture (III)</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:567px;">Protein Stain</td>
			<td style="width:172px;"></td>
			<td style="width:164px;"></td>
			<td>For affinity capture (III)</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

protein complex affinity capture from cryomilled mammalian cells

capture d&#39;affinité est une technique efficace pour isoler des complexes de protéines endogènes pour complément d&#39;étude. Lorsqu&#39;il est utilisé conjointement avec un anticorps, cette technique est également souvent appelé immunoprécipitation. capture par affinité peut être appliquée dans un banc échelle et dans un contexte de haut débit. Lorsque couplée à la spectrométrie de masse de protéines, capture par affinité est avérée être un bourreau de travail d&#39;analyse de interactome. Bien qu&#39;il existe potentiellement de nombreuses façons d&#39;exécuter les nombreuses étapes, les protocoles suivants mettent en œuvre nos méthodes favorisées. Deux traits distinctifs sont: l&#39;utilisation d&#39;une poudre de cellules cryomilled pour produire des extraits cellulaires et les billes paramagnétiques anticorps couplé comme milieu d&#39;affinité. Dans de nombreux cas, nous avons obtenu des résultats supérieurs à ceux obtenus avec d&#39;autres méthodes classiques de capture par affinité. Cryobroyage évite de nombreux problèmes associés à d&#39;autres formes de rupture des cellules. Il fournit une rupture efficace de la matière, tout en évitant denatles questions de URÉE associés au chauffage ou moussage. Il conserve la protéine native concentration jusqu&#39;au point d&#39;extraction, atténuant la dissociation macromoléculaire. Il réduit le temps des protéines extraites passent en solution, ce qui limite les activités enzymatiques délétères, et il peut réduire l&#39;adsorption non spécifique des protéines par le support d&#39;affinité. médias d&#39;affinité magnétique Micron-échelle sont devenus plus courants au cours des dernières années, en remplacement de plus en plus la agarose- traditionnelle et les médias basés sur Sepharose. Les principaux avantages de supports magnétiques comprennent généralement plus faible adsorption des protéines non-spécifique; aucune limite d&#39;exclusion de taille, car la liaison complexe protéique se produit sur la surface de la bille plutôt qu&#39;à l&#39;intérieur des pores; et la facilité de manipulation et de manutention à l&#39;aide d&#39;aimants.

Figure 1, panneau I montre que cryobroyage et des billes magnétiques peuvent travailler ensemble pour améliorer la qualité de l&#39; échantillon. Panneaux IA-C montrent que le matériau comprenant le milieu insoluble utilisé pour la capture d&#39;affinité peut affecter le protéome récupéré 19. La protéine d&#39;intérêt, purifié étiquetée FLAG phosphatase alcaline bactérienne (BAP), a été enrichi dans des extraits de cellules humaines. PAB ne devrait pas interagir spécifiquement avec les protéines humaines et copurify. La signature de protéines copurifying, jugées par SDS-PAGE et coloration de Coomassie, variait en fonction du support utilisé. des billes magnétiques Micron-échelle ont montré le profil le plus propre, ce qui indique un niveau d&#39;adsorption des protéines non spécifique relativement faible. Panneaux ID et IE montrent que la méthode de la lyse cellulaire peut également affecter le protéome récupéré. Dans l&#39;exemple fourni, un complexe d&#39; une protéine endogène (NEXT complexe 37), est soumis à une affinité capture de la cellule cyromilled ou soniqué extraits 19. Moins de contaminants de masse élevées ont été observées lors de l&#39;extrait cellulaire a été produite à partir de poudre de cellule cryomilled. Un défi lors de l&#39;utilisation capture par affinité pour étudier des complexes de protéines endogènes est qu&#39;il peut être difficile de distinguer bona fide interacteurs physiologiques de la protéine d&#39;intérêt à partir de faux positifs (PC). MF peut provenir de nombreuses sources, y compris l&#39;adsorption non spécifique sur les tubes et les vaisseaux, le milieu d&#39;affinité, le ligand d&#39;affinité ou un anticorps, et / ou pour la protéine d&#39;intérêt lui-même. Par conséquent, des efforts importants doivent être consacrés à l&#39;optimisation du processus de capture. La détection des MF reste un défi central pour lequel un grand nombre de différents outils ont été développés, y compris expérimentale 38-40 et computationnelle approches 41-43, chacune avec des avantages et des inconvénients. Dans nos propres expériences, nous avons déjà noté un modèle de FP la liaison aux protéines, obtenu après incubation du support magnétique α-FLAG avec des extraits cellulaires de contrôle, qui était distinct du motif obtenu en présence de protéines 3xFLAG-marquées. En outre, ces PCR pourraient être libérés dans le milieu par une incubation avec un peptide 3xFLAG 7. Cette observation est cohérente avec la liaison opportuniste de MF au paratope α-FLAG en l&#39;absence de l&#39;épitope apparenté. Comprendre la nature de ce FP fond est important puisque de nombreuses études utilisent une «lignée cellulaire parentale &#39;untagged comme un contrôle simulé pour la capture d&#39;affinité; ces contrôles peuvent donc inapproprié de déterminer la spécificité des interactions avec la protéine marquée. Pour déterminer la liaison de fond contribué par notre milieu d&#39;affinité lorsque paratopes anticorps sont occupés ou non, nous avons effectué des simulations d&#39;expériences de capture par affinité en utilisant un milieu α-FLAG magnétique et des extraits de cellules HEK 293T (aucune protéine marquée exprimée) en présence ou en l&#39;absence d&#39;un 3xFLAGpeptide spike-in. Les résultats sont présentés sur la figure 1, tableau II. En bref, le milieu magnétique α-FLAG a été mis en incubation dans des extraits cellulaires (de ≳10 mg / ml de protéine totale) contenant 500 mM de NaCl et 1% v / v de Triton X-100 dans 20 mM de HEPES-Na, pH 7,4 pendant 30 minutes. Le milieu a été ensuite mis en incubation avec 1 mg / ml de peptide à déplacer 3xFLAG manière compétitive toutes les protéines liées au paratope α-FLAG natif ou avec un tampon d&#39;échantillon SDS-PAGE pour obtenir une élution dénaturant. Par ailleurs, la même expérience a été réalisée lorsque les extraits cellulaires ont été mélangés avec 1 ug / ml et 10 pg / ml de peptide 3xFLAG. Toutes les fractions éluées ont été soumises à une SDS-PAGE et coloration à l&#39;argent. Nous avons observé qu&#39;en l&#39;absence de son epitope apparenté, le milieu α-FLAG ne saisit un niveau détectable de protéines de fond qui peut être élue avec 3xFLAG peptide - dans l&#39;exemple donné par la figure 1-II, une espèce dominante a été observée à entre 37 et 50 kDa. Le motif en éluant avectampon d&#39;échantillon SDS-PAGE était comparable, avec des espèces de premier plan supplémentaires. Cependant, en présence de 1 pg / ml de peptide 3xFLAG, la liaison FP sur le support d&#39;affinité a été éliminée au-dessous du niveau de détection et n&#39;a pas été observé ni dans les fractions d&#39;élution natives ou dénaturantes. Ce résultat suggère que paratopes anticorps inoccupées peuvent être la promiscuité en l&#39;absence de leur épitope apparenté et contribuent de manière significative au protéome obtenu lors de la capture d&#39;affinité même pour des anticorps qui se lient leur épitope à haute affinité, comme cela est le cas pour le 3xFLAG / α-FLAG M2 appariement. Il a également suggestd que des conditions très strictes en utilisant haute teneur en sel, souvent choisi pour atténuer la liaison non spécifique, peuvent être inefficaces en l&#39;absence de l&#39;interaction antigène / anticorps. Pour le suivi nous avons effectué une expérience similaire , y compris l&#39; analyse par SDS-PAGE ainsi que quantitative MS (Fig. S1). Sur les 347 protéines quantifiées, nous avons observé que toutes les protéines sauf pour une (fausse discothèquetaux très = 1%; Tableau S1) est associée à la protéine appât 3xFLAG étiquetée par rapport à un peptide 3xFLAG dopés échantillon témoin. Ces résultats indiquent que, dans nos expériences, l&#39;écrasante majorité des protéines observées sont susceptibles de co-purifient avec la protéine marquée ou sont hors cible des sous-produits de inoccupées paratopes α-FLAG. Dans notre expérience, des résultats élevés signal-bruit d&#39;affinité capture sont illustrées dans SDS-PAGE et coloration des protéines par un motif discret de bandes vives, abondantes et à peu près stoechiométriques ainsi qu&#39;un manque de coloration de fond des autres groupes plus faibles; de nombreux exemple de ce principe peut être vu dans la référence 11. Le motif de l&#39; utilisation d&#39; un isolant en PTFE ( ce qui est recommandé) lorsque cryobroyage est de réduire le taux de réchauffement du pot pendant le broyage, d&#39; atténuer la charge de la répétition LN 2 refroidissement pendant le processus d&#39;usinage, et de réduire le degré de glaceformation dans le bocal. Ceci facilite l&#39;exécution de fraisage constante et facilite la manipulation de la poudre cellulaire. Exemple isolateurs peuvent être trouvés dans la référence 27 (rondelles) et représentées sur la figure 2 ci-dessous (manchon et-puck). <img alt="Figure 1" src="/files/ftp_upload/54518/54518fig1.jpg" /> Figure 1: Sélectionnez résultats représentatifs. (I) Ce panneau a été modifié par la référence 19. Coloré au bleu de Coomassie du gel de polyacrylamide-SDS. perles (GAUCHE) Micron échelle magnétique montrent inférieure hors-cible de liaison que les médias d&#39;agarose-base. (A) des billes magnétiques; (B) agarose traditionnel; (C) le fer imprégné (magnétique) agarose; couplés chacun à des anticorps anti-FLAG M2 et utilisé pour capturer la phosphatase alcaline bactérienne FLAG-tagged (BAP, étiquetés) dopés dans des extraits produits à partir de cryomilled cellules HEK-293. purifications à base d&#39;agaroseont montré des niveaux plus élevés d&#39;adsorption non spécifique (bandes non marquées). (à droite) produites à partir d&#39;extraits de cellules HeLa cryomilled présentent une faible adsorption hors cible sur des billes magnétiques d&#39;anticorps couplés à celles produites par traitement par ultrasons lorsqu&#39;il est utilisé pour purifier un complexe de protéine endogène. LAP-tagged 44 RBM7 a été capturé par affinité en utilisant des billes magnétiques couplées à des anticorps anti-GFP polyclonaux pour purifier le complexe SUIVANTE 19,37 (D) extrait produit à partir de poudre cryomilled; (E) des extraits produits par sonication des cellules intactes. La barre verticale noire met en évidence une région du gel où les hautes interacteurs non spécifiques de masse sont observées pour être enrichi dans l&#39;échantillon préparé par sonication. Les flèches noires indiquent interacteurs spécifiques attendus (étiquetés). Les bandes observées ~ 50 kDa dans les voies D et E sont imputables à llama IgG chaînes lourdes. (II) colorés à l&#39; argent sur gel SDS-polyacrylamide. (Std.) Une capture d&#39;affinité maquette réalisée sur HEK-293T extraits cellulaires de façon standard. Après la capture, l&#39;élution du matériau lié a été obtenue par (N) non dénaturant élution avec 1 mg / ml de peptide ou 3xFLAG (D) dénaturant élution dans un tampon d&#39;échantillon SDS-PAGE; (PB 1) Std. mais le peptide 3xFLAG a été inclus dans la solution d&#39;extraction à 1 pg / ml pour bloquer les paratopes α-FLAG sur le support d&#39;affinité; (PB 10) PB 1, mais en présence de 10 pg / ml 3xFLAG peptide. bandes IgG liées et 3xFLAG peptide sont marqués. <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/54518/54518fig1large.jpg" target="_blank">S&#39;il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.</a> <img alt="Figure 2" src="/files/ftp_upload/54518/54518fig2.jpg" /> Figure 2: manches et-rondelle PTFE isolant. Une fiole de 250 ml en PTFE est représenté (1). Une inoxydable pot de broyage en acier de 50 ml (2) correspond à l&#39; intérieur du pot de PTFE (3) et fournit lapossibilité de laisser le pot de broyage installé à l&#39;intérieur de l&#39;usine entre les cycles. Une rondelle en PTFE isolante supérieure (2) est utilisé entre l&#39;ensemble de pince et le couvercle du bocal. Refroidir le récipient et l&#39; isolant installé ensemble (3), LN 2 est ajouté directement dans le corps de l&#39;isolateur, qui entoure le pot. Le prochain cycle de fraisage peut alors être lancé. <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/54518/54518fig2large.jpg" target="_blank">S&#39;il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.</a> <table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody><tr><td> Réactif </td><td> Concentration suggérée </td><td> Remarques </td></tr><tr><td> Chlorure de sodium </td><td> 0,1-0,5 M </td><td> Des concentrations élevées (&gt; 300 mM) ont tendance à améliorer l&#39;extraction des protéines totales et de garder fond faible, mais peut dépouiller un certain inter ailleurs stableacteurs. Les concentrations inférieures à 150 mM ne sont généralement pas efficaces pour réduire la fond non spécifique. </td></tr><tr><td> L&#39;acétate d&#39;ammonium </td><td> 0,2-2 M </td><td> Un sel, composé de deux tampons, qui donne une solution de pH neutre 57. Des concentrations plus élevées de stabiliser des complexes protéiques. Des solutions acides peuvent résulter de vieux, les stocks cristallins mal entreposés à cause de la perte d&#39;ammoniac. Aucun tampon supplémentaire du pH ou de sels sont nécessaires extractants contenant de l&#39;acétate d&#39;ammonium. Peut être combiné avec NaCl pour moduler les résultats obtenus. </td></tr><tr><td> Tween 20 </td><td> 0,1% v / v </td><td> Un détergent non-ionique 58; typiquement combiné avec du NaCl. </td></tr><tr><td> Triton X-100 </td><td> 0,5 à 1% v / v </td><td> Un détergent non-ionique 58; généralement combiné avec soit NaCl ou NH 4 CH 3 CO 2 H </td></tr><tr><td> CHAPS </td><td> 5 mM </td><td> Un détergent zwitterionique 58 &lt;/ Sup&gt;; typiquement combiné avec du NaCl. </td></tr><tr><td> Sarkosyl </td><td> 1 mM </td><td> Un détergent anionique 58 qui réduit de fond et peut dépouiller des composants complexes stables, potentiellement révélant la connectivité binaire; typiquement combiné avec du NaCl. </td></tr><tr><td rowspan="2"> Tris-Ci </td><td> 20 mM, </td><td rowspan="2"> pK a de 8,8 à 4 ° C, 8,1 à 25 ° C. </td></tr><tr><td> (PH 8,0) </td></tr><tr><td rowspan="2"> Na-HEPES </td><td> 20 mM, </td><td rowspan="2"> pK a de 7,8 à 4 ° C, 7,5 à 25 ° C. NaOH ou KOH utilisé pour le pH équilibration en fonction du sel (par exemple NaCl, KCl ou CH 3 CO 2 K) utilisé dans l&#39;agent d&#39; extraction. </td></tr><tr><td> (PH 7,4) </td></tr></tbody></table> Tableau 1: Quelques proposé des réactifs utiles pour la purification de complexes protéiques. Ce tableau lists certains réactifs que nous avons trouvé utile pour des complexes de protéines de purification de lignées cellulaires humaines, avec des concentrations de travail proposées. Une formulation typique contient l&#39; agent d&#39; extraction un tampon de pH, un sel et un détergent 1,11,24,45-48. La meilleure pratique consiste à identifier la combinaison moins complexe de réactifs qui donne le résultat désiré. <img alt="Figure S1" src="/files/ftp_upload/54518/54518figS1.jpg" /> Figure S1: Mélanger Après analyse Purification (MAP-) de SILAC de faux positifs. I. Schéma: Dans cette expérience 3xFLAG-tagged complexes protéiques ORF2p (exprimées à partir de pLD401) ont été purifiés à partir de cellules grosses que les petites étiquetés HEK-293T 7, respectivement. L&#39;extrait cellulaire de lumière marquée a été ensemencé avec 3xFLAG peptide pour empêcher la capture par affinité de l&#39;ORF2p 3xFLAG étiquetée par inhibition compétitive; cela ne devrait pas bloquer la liaison de protéines qui peuvent se produire non spécifiCally avec le support magnétique ou les structures non-paratopiques de l&#39;anticorps. Après élution à partir des billes magnétiques, les échantillons lourdes et légères ont été post-épuration mixte et analysé par MS quantitative (MAP SILAC 39) pour déterminer la fraction de protéines associées à chaque échantillon; plus en détail méthodologique situé dans le tableau S1. II. Argent gel coloré illustrant que les matériaux légers et lourds marqués donnent des résultats comparables (comparer avec L H), et que la purification réalisée en présence du 3xFLAG spike-in (LI) a été inhibée de façon compétitive. Ci - dessous, un G-250 bouchon de gel coloré au bleu de Coomassie constitué de H mixtes et fractions LI, avant l&#39;analyse protéomique à base de gel, comme décrit dans le tableau S1. <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/54518/54518figS1large.jpg" target="_blank">S&#39;il vous plaît cliquer ici pour télécharger une version plus grande de cette figure.</a> Tableau S1:MAP-SILAC. Cette feuille contient les données obtenues lors de l&#39; exécution de l&#39;expérience MAP-SILAC décrit à la figure S1. <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/54518/Table_S1.xlsx" target="_blank">S&#39;il vous plaît cliquer ici pour télécharger ce tableau.</a>

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