Name: protein complex affinity capture from cryomilled mammalian cells
Uploaded: 2016-12-09T13:00:00
Duration: 10 min 37 s
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Wir danken Professor Brian T. Chait für seine wertvolle Ratschläge, Unterstützung und Zugang zu MS-Geräten, sowie Ms. Kelly R. Molloy für einen ausgezeichneten technischen Support. Wir danken Frau Kelly Bare für die Unterstützung mit Lektorat. Diese Arbeit wurde teilweise durch NIH Zuschüsse P41GM109824, P41GM103314 und P50GM107632 unterstützt.

The authors declare that they have no competing financial interests.

Diese drei Protokolle arbeiten im Tandem (1) bereiten Zellen für Festkörperbruch durch Cryomahlung, (2) erreichen Bruch in einer Planetenkugelmühle, und (3) erzeugen Extrakte aus Zellpulver capture ein Protein von Interesse in Komplex Affinität seine physiologische Interaktoren. Viele verschiedene Zell - Lyse Techniken existieren, einschließlich der mechanischen / physikalischen Ansätze unter Verwendung von Brech Auswirkungen, Scheren, und / oder Druck, sowie chemische / enzymatische Ansätze, die jeweils mit unterschiedlichen Vor- und Nachteile 49,50. Jeder Ermittler wird ermutigt , Methoden am besten geeignet für ihre Analysen zu erforschen, wenn man bedenkt, dass jeder gewählte Ansatz für Zellbruch und Proteinextraktion ist wahrscheinlich Verzerrungen einzuführen 51,52 erfordert empirische Optimierung (siehe unten). Mechanische Verfahren können hohe Wärme und / oder Scherkräfte erzeugen, die Proteinkomplexe stören können. Cryomahlung vermeidet Erwärmungseffekte durch LN 2 Kühlung der Proben für die t Einsatzer die Dauer des Prozesses. Planetenkugelmühlen verstanden beim Aufprall und Reibungskräfte zu stützen, einschließlich Scherspannung, als Komponenten von Teilchengrößenverringerung 53,54. Bei den Einstellungen berichteten wir haben nicht Degeneration von Proteinkomplexen beobachtet. Tatsächlich haben wir extrahiert und abgerufen anscheinend intakt ~ 50 MDa Kernporenkomplexe 11 und enzymatisch aktiven Retrotransposons ausstellenden höhere spezifische Aktivität als Zubereitungen &quot;sanften&quot; Waschmittel-Lyse - 7 verwendet. Chemische / enzymatische Verfahren der Zelllyse leiden unter der Einschränkung , dass der Inhalt der Zelle in einer in vitro Milieu freigesetzt werden, die die Zerstörung der Zellmembranen und strukturellen Makromoleküle unterstützt , aber nicht für die Aufrechterhaltung der Integrität des Proteinkomplexes (es geeignet sein , ) von Interesse. Häufig weder die Bestandteile der Komplexe mit dem Protein von Interesse gebildet wird, noch die Bedingungen benötigt die Ziel-Komplexe zu stabilisieren sindim voraus bekannt. Ein großer Vorteil von Solid-State-Fräsen ist, dass Bruch und Extraktion entkoppelt sind, Quellenmaterial ermöglicht, frei von zugesetzten Flüssigkeit gelagert (bei -80 ° C oder darunter), angehäuft und bequem abgerufen für On-Demand-Experimente vorbereitet zu sein; zB zu erforschen in vitro Bedingungen für Affinitätseinfangen optimiert. Protein - Wechselwirkungen sind am stabilsten bei hoher Konzentration 55,56, also das Volumen an Extraktionsmittel minimiert werden können zur Konservierung von physiologischen Wechselwirkungen vorteilhaft sein. Auf der anderen Seite gibt es praktische Erwägungen - die Proteinkomplexe aus den Zellen aufgetrennt werden müssen und in eine nicht-viskosen wäßrigen Phase, frei von unlöslichen Aggregaten, um die Ziel-Komplexe mit dem Affinitätsmedium zu mischen. Darüber hinaus einige Standardisierung und Kontrolle über die in vitro - Umgebung (pH, Salzkonzentration, etc.) ist für Systematisierung und Reproduzierbarkeit benötigt. Wir finden, dass Extrakte produced im Verdünnungsbereich von 1: 4-1: 9 (w: v) erfüllen praktische und theoretische Anliegen, qualitativ hochwertige Ergebnisse liefert. Zusätzlich Extrakt der optimale Anteil von Zellmedium Bedürfnisse Affinität zu bestimmen. Dies wird empirisch durch Titration von Extrakten mit unterschiedlichen Mengen an Affinitätsmedium durchgeführt und nachweisbaren Wirkungen auf das Signal-zu-Rausch-Verhältnis des Experiments haben kann, weiter unten diskutiert. Eine ausgezeichnete Abreicherung des Zielproteins ist typischerweise ≥70% der löslichen Fraktion des Zielproteins, aber&gt; 90% ist wünschenswert und kann bei sorgfältiger Parametrisierung der Extraktionsbedingungen erreichbar sein. Viele solche praktischen Erwägungen sind in Bezug auf die 1 abgedeckt. Paramagnetische Perlen werden unter Verwendung von Neodym-Magneten in einem spezialisierten Mikrorohrhalter manipuliert, obwohl hausgemachte Alternativen lebensfähig sind. Wenn innerhalb des Halters angeordnet ist, sammeln Perlen an der Seite des Rohrs unter dem Einfluß des Magnetfeldes. Die Lösungen können dann ohne di entfernt werdenstörendes, die Perlen. Eine Einschränkung des präsentierten Kryomahlen Protokoll, entwickelt mit der Planetenkugelmühle verwendet hier (siehe Tabelle of Materials), ist , dass eine minimale Menge an Material benötigt wird , um effektiv Mühle und erholen Zellpulver mit diesem Gerät (&gt; 1 g). Solche Mengen sind leicht mit vielen Mikroben, Zelllinien und Modellorganismen, und auch oft mit Gewebe von Versuchstieren ausgeschnitten erreicht werden. Jedoch können bestimmte Zelllinien sehr schwierig sein, in Hülle und Fülle und tierischen Geweben wachsen kann knapp werden. Kleinere Mengen von Material vergleichbar ist mit anderen Geräten verwendet kleinere Behälter gefräst, auch wenn er möglicherweise auf das Opfer des Pulverfeinheit erreicht. Darüber hinaus werden die Kosten für die mechanischen Mahlvorrichtungen können unerschwinglich teuer für einige Laboratorien. Kryomahlen kann 14-19, einschließlich die meisten affordably von Hand mit einem Schädling unter Verwendung einer Anzahl von alternativen Konfigurationen erreicht werdenle und Mörtel, obwohl Brucheffizienz erheblich sinkt. Affinitätseinfang Protokolle zielen typischerweise für eine hohe Effizienz der Zelllyse maximale Proteinextraktion in die Lösung zu erleichtern, und somit die maximale Potenzial zur Erfassung der Zielproteinkomplexen. Auf der anderen Seite ist es für die Hefe in vitro Spleißen nachgewiesen Extrakte , die maximale Lyse nicht mit maximal in vitro biochemische Aktivität 57,58 gleichsetzen kann. Wir haben solche Probleme nicht in den Systemen beobachteten wir bisher getestet haben, und deshalb nicht einschränken gezielt unsere Zellbruch, wenn Cryomahlung. Dennoch sollte diese Möglichkeit berücksichtigt werden , wenn für die in vitro enzymatische Tests zu optimieren. Obwohl Kryomahlen ein hochwirksames Verfahren zum Brechen von Zellen ist, profitiert eine begrenzte Menge an Beschallung oft die Herstellungs homogenen Gesamtzellextrakten aus Säugetiergeweben, weil inhomogenen Aggregate manchmal durch visuelle Untersuchung beobachtet werden kann: typischerweisein Extraktionsbedingungen unter Verwendung von geringen Salz (100-300 mM) und nicht-ionisches Detergens (0,1 bis 1% v / v) -Konzentrationen zu moderieren. Da wir festgestellt, daß die Anwesenheit dieser Aggregate kann die Ausbeute und / oder Qualität der nachfolgenden Affinitätseinfangen reduzieren, setzen wir routinemßig Beschallung sie zu dispergieren (selbst wenn sie nicht mit dem bloßen Auge beobachtet). Die Aggregate sind konsistent mit agglomerierten Membranfragmenten, vergleichbar mit den vorher in Extrakten aus gemahlenen Hefezellen 58 berichtet. Beschallen wird auch in einigen Protokollen verwendet, um DNA zu scheren und Chromatin-Fragmente in die Lösung freisetzen, aber der Grad der Beschallung in diesem Protokoll angewandt nicht merklich Fragment DNA. Die begrenzte Verfügbarkeit (oder die hohen Kosten) eines ausgezeichneten Affinitätsligand oder Antikörper gegen das jeweilige Protein von Interesse kann ein weiteres Hindernis sein. Eine Vielzahl von im Handel erhältlichen Affinitätsreagentien genutzt werden kann, wenn das Modellorganismus genomische Tagging oder tr zugänglich istansfection mit ektopischer Expressionsvektoren, die Expression von Proteinen von Interesse als Affinitäts getaggt Fusionen ermöglicht. Allerdings hat sich die Produktion von kundenspezifischen Antikörpern zunehmend möglich und sowohl polyklonale als auch monoklonale Antikörper lassen sich hervorragend in Affinität Capture-Anwendungen auszuführen. Diese vielen Überlegungen werden auch in grßerem Detail in Bezug auf 1 behandelt. Beispiele, wie die Zell - Lyse - Methode und die Wahl der Affinitätsmedium können die Ergebnisse beeinflussen , sind in Abbildung 1 dargestellt. Beispiele von verschiedenen Extraktionsmitteln ausgeübten Effekte können in Referenzen 1,11,24 erkennbar. Da diese und andere experimentelle Parameter die Qualität der Affinitätseinfangen beeinflussen, was es schwierig macht FPs zu unterscheiden, Repositories von &quot;Perle Proteome&quot; und rechnerische Ansätze zur Beseitigung nicht-spezifische Verunreinigungen wurden bei der Identifizierung von FPs 40-43 zu unterstützen , entwickelt. Dennoch solche Ansätze nur substitute für eine optimale Probenvorbereitung in begrenztem Umfang 59. Best Practices Beobachtung und Optimierung empirisch die Affinität Capture Experiment wird die höchste Qualität Proben für die Downstream-Analysen liefern, weiter unten diskutiert. Eine leicht implementiert Praxis, die Reinheit der Probe verbessern kann, ist, nativen Elution. Einheimische Elution wird am häufigsten zu erhalten, die Affinität isolierten Proteinkomplex, intakt, für weitere Experimente verwendet; aber wie es häufig Probenreinheit verbessert, kann sie auch aus diesem Grund allein verwendet werden. Wie jedoch II in 1, Panel demonstriert, in dem Zellextrakt auf einer genauen Titration der Menge der Affinitätsmedium der Fülle des Zielproteins hängt die Fähigkeit der nativen Elution Probenreinheit verbessern kann - wenn das Medium im Überschuss nicht besetzte Paratope kann die off-Target-Anreicherung von FP-Proteine ​​beobachtet werden in den nativ eluierten Fraktionen ermöglichen. Mit den Reagenzien und Verfahren hier beschrieben, es hwie unsere Erfahrung, dass die größte einzelne Beiträger von FPs unseren Experimenten ist das markierte Protein selbst einmal aus dem Kontext der lebenden Zelle entfernt. (Fig. 1 Abschnitt II und Fig. S1). In solchen Fällen Elternzelllinie Kontrollen, die irrelevant Proteome in Abwesenheit des Antigens ergeben sind ohne praktischen Wert; ebenfalls für Tag-only oder Spike-in Kontrollen, aber das Zielantigen frei von irgendetwas sind. Deshalb, wenn praktisch wir I-DIRT 7,38, zu implementieren , die direkt um die Ansammlung von post-Lyse Protein - Wechselwirkungen mit quantitativen MS misst. Als 3.2.7 des Protokolls in Schritt erwähnt, Verfahren für native Elution wird verwendet, um mit den Details der Affinität System variieren. Nativer Elution wird am häufigsten durch kompetitive Verdrängung des markierten Proteinkomplex oder proteolytische Spaltung des Tags, die Freigabe des Komplexes aus dem Affinitätsmedium erreicht. Mehrere Affinität Systeme von kleinen Epitop-Tags enthalten existieren, for , die das Epitop selbst ist nützlich für kompetitive Elution der markierten Proteinkomplexe 60 als Peptid erhältlich. Ebenso sind mehrere Proteasen zur Verfügung , um spezifisch verwandtes Websites markierten Fusionsproteine 61 strategisch in Affinität platziert spalten. In Abhängigkeit von den Besonderheiten der ausgewählten Affinität Systemen kann die geeignete Elution Schema übernommen werden. Im Allgemeinen erhalten die Qualität der Ergebnisse maßgeblich von der Qualität der Probenvorbereitung erheblich belastet werden. Es ist wichtig, sorgfältig und präzise durch die einzelnen Schritte dieser Protokolle zu arbeiten, und so schnell wie möglich, während Sorgfalt und Präzision. Es empfiehlt sich, die Aufteilung des Proteins von Interesse durch die einzelnen Schritte zu verfolgen, die Effizienz jeder Manipulation zu verstehen. Zum Beispiel: wie reichlich ist das Protein von Interesse in der Zelle oder eines Gewebes in Frage? Vielleicht ist das Protein untersucht (und seine Komplexe) wird eine Herausforderung sein Massen zu charakterisierenSpektrometrie aufgrund geringer Menge. Wenn die gereinigten Komplexe nachweisbar durch die allgemeine Proteinfärbung sind (etwa Nanogramm-Bereich) ist die Massenspektrometrie wahrscheinlich erfolgreich zu sein. Wenn das aufgenommene Protein von Interesse kann nur durch empfindliche verstärkten chemolumineszenten Western Blot (etwa Picogramm-Bereich) erfasst werden kann, ist die Massenspektrometrie weniger wahrscheinlich, um wirksam zu sein. Selbst wenn das Protein von Interesse in der Zelle reichlich vorhanden ist, wie reichlich ist es in der Zellextrakts? Hat das Protein Partition zu der Lösung, oder ist es im Pellet? Wenn letzteres kann eine neue Extraktionslösung entwickelt werden, dass die Erholung verbessern können. Sobald der Zellextrakt mit dem Affinitätsmedium kombiniert wird, wie effektiv erfasst das Protein? Hat das Protein bleiben durch nachfolgende Wäschen gebunden? Was ist mit anderen copurifying Proteine? Durch die Einsparung eines aliquoten jeder Probe an geeigneten Schritte des Protokolls diese Fragen leicht beantwortet werden können, in der Regel mittels Western Blot gegen das Protein von Interesseoder allgemeine Proteinfärbung, aber auch andere Assays können ebenfalls geeignet sein. jeder Schritt der Optimierung wird die Ausbeute und Reinheit der aufgenommenen Komplexe verbessern, obwohl es ein Kompromiß sein kann, in die Maximierung einer Eigenschaft oder der anderen durchgeführt werden. Eine typische Anwendung von Affinitätseinfangen für viele Forscher ist Kandidat in vivo - Inter für eine kleine Anzahl von Proteinen von Interesse zu identifizieren; Diese Kandidaten werden üblicherweise zur Validierung durch orthogonale Ansätze in vivo unterzogen , die biologische Bedeutung der physikalischen Interaktionspartner zu demonstrieren. Affinitätseinfang wird auch durch Hochdurchsatz - Studien eingesetzt zu erzeugen Listen von Proteinen copurifying auf einem (fast) Proteom weit beobachtet, die Erleichterung Rechen Schlüsse mutmaßlichen über in vivo - Komplexen. Zahlreiche Beispiele für solche Studien können in der Literatur gefunden werden. Dieser Ansatz verzichtet auf die Optimierung der Bedingungen der Aufnahme für einen bestimmten Ziel zugunsten der Erforschung der Menschy Ziele; Als solche sind die abgeleiteten Komplexe sich selten vollständig intakt und hochreine in jeder gegebenen Probe entnommen. Vielmehr werden als Grundlage der Schlussfolgerungen 42 verwendet die Teil Überschneidungen in Zusammensetzungen zwischen zahlreichen deutlichen Affinitäts erfassten Proben beobachtet. Beide Ansätze beitragen wertvolle Daten zu unserem Verständnis des Interaktom. Dennoch ist ein großer Vorteil der Affinitätseinfang, dass es häufig die Möglichkeit anbietet, die Komplexe intakt und hoch gereinigter zu erhalten, vorausgesetzt, dass die Bemühungen das Verfahren zu optimieren, hergestellt werden. Wir glauben , dass die Zukunft des Ansatzes liegt die Leichtigkeit und Effizienz zu optimieren , um die Erfassung von endogenen Proteinkomplexe 11, für eine genauere Beurteilung der Skala der physiologischen Interaktoren und häufigere Verwendung in weiteren nachgelagerten biochemischen, enzymologischer und strukturelle Untersuchungen bei der Steigerung, zB verweist 7,9,23.

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	<li>Cristea, I. M., &#38; Chait, B. T. Conjugation of magnetic beads for immunopurification of protein complexes. Cold Spring Harbor Protocols. 2011 (5) (2011).</li>
	<li>Rosenberg, I. M. Electrophoretic Techniques. Protein Analysis and Purification. (4), 63&#8211;117 (2005).</li>
	<li>Ornstein, L. Disc Electrophoresis. I. Background and Theory. Ann N Y Acad Sci. 121 (A2), 321&#8211;349 (1964).</li>
	<li>Davis, B. J. Disc Electrophoresis. II. Method and Application to Human Serum Proteins. Ann N Y Acad Sci. 121, 404&#8211;427 (1964).</li>
	<li>Laemmli, U. K. Cleavage of structural proteins during the assembly of the head of bacteriophage T4. Nature. 227 (5259), 680&#8211;685 (1970).</li>
	<li>Shevchenko, A., Tomas, H., Havlis, J., Olsen, J. V., &#38; Mann, M. In-gel digestion for mass spectrometric characterization of proteins and proteomes. Nature protocols. 1 (6), 2856&#8211;2860 (2006).</li>
	<li>DeGrasse, J. A., Kalkum, M., Krutchinsky, A.N., Padovan, J. C., &#38; Zhang, W. MALDI Sample Preparation. rockefeller.edu at &#60;http://prowl.rockefeller.edu/protocols/in-gel-digestion.html&#62; (2006).</li>
	<li>Lubas, M., Christensen, M. S., et al. Interaction profiling identifies the human nuclear exosome targeting complex. Mol Cell. 43 (4), 624&#8211;637 (2011).</li>
	<li>Tackett, A. J., DeGrasse, J. A., Sekedat, M. D., Oeffinger, M., Rout, M. P., &#38; Chait, B. T. I-DIRT, a general method for distinguishing between specific and nonspecific protein interactions. J Proteome Res. 4 (5), 1752&#8211;1756 (2005).</li>
	<li>Wang, X., &#38; Huang, L. Identifying dynamic interactors of protein complexes by quantitative mass spectrometry. Mol Cell Proteomics. 7 (1), 46&#8211;57 (2008).</li>
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	<li>Boulon, S., Ahmad, Y., et al. Establishment of a protein frequency library and its application in the reliable identification of specific protein interaction partners. Mol Cell Proteomics. 9 (5), 861&#8211;879 (2010).</li>
	<li>Armean, I. M., Lilley, K. S., &#38; Trotter, M. W. B. Popular computational methods to assess multiprotein complexes derived from label-free affinity purification and mass spectrometry (AP-MS) experiments. Mol Cell Proteomics. 12 (1), 1&#8211;13 (2013).</li>
	<li>Mellacheruvu, D., Wright, Z., et al. The CRAPome: a contaminant repository for affinity purification-mass spectrometry data. Nat Methods. (2013).</li>
	<li>Cheeseman, I. M., &#38; Desai, A. A combined approach for the localization and tandem affinity purification of protein complexes from metazoans. Sci. STKE 2005 (266), pl1 (2005).</li>
	<li>Goldberg, S. Mechanical/physical methods of cell disruption and tissue homogenization. Methods in Molecular Biology. 424 (Chapter 1), 3&#8211;22 (2008).</li>
	<li>Grabski, A. C. Advances in preparation of biological extracts for protein purification. Methods in Enzymology. 463 (C), 285&#8211;303 (2009).</li>
	<li>Dhabaria, A., Cifani, P., Reed, C., Steen, H., &#38; Kentsis, A. A High-Efficiency Cellular Extraction System for Biological Proteomics. J Proteome Res. 14 (8), 3403&#8211;3408 (2015).</li>
	<li>Glatter, T., Ahrn&#233;, E., &#38; Schmidt, A. Comparison of Different Sample Preparation Protocols Reveals Lysis Buffer-Specific Extraction Biases in Gram-Negative Bacteria and Human Cells. J Proteome Res. 15 (2), 679 (2016).</li>
	<li>Zhao, Q.-Q., Yamada, S., &#38; Jimbo, G. The Mechanism and Grinding Limit of Planetary Ball Milling. KONA. 7, 29&#8211;36 (1989).</li>
	<li>Sheng-Yong, L., Qiong-Jing, M., Zheng, P., Xiao-Dong, L., &#38; Jian-Hua, Y. Simulation of ball motion and energy transfer in a planetary ball mill. Chinese Phys. B 21 (7), 078201 (2012).</li>
	<li>Fulton, A. B. How crowded is the cytoplasm? Cell. 30 (2), 345&#8211;347 (1982).</li>
	<li>Ellis, R. J. Macromolecular crowding: obvious but underappreciated. Trends Biochem Sci. 26 (10), 597&#8211;604 (2001).</li>
	<li>Kalkum, M. Using the Retsch MM301 Ball Mill for Cryogenic Disruption of Yeast Cells. 2 City of Hope, (2003).</li>
	<li>Staley, J. Making Whole Cell Extract of Saccharomyces cerevisiae cells using the Retsch MM301 Ball Mill. Retsch GmbH: (2005).</li>
	<li>Bell, A. W., Nilsson, T., Kearney, R. E., &#38; Bergeron, J. J. M. The protein microscope: Incorporating mass spectrometry into cell biology. Nat Methods. 4 (10), 783&#8211;784 (2007).</li>
	<li>Zhao, X., Li, G., &#38; Liang, S. Several affinity tags commonly used in chromatographic purification. J Anal Methods Chem. 2013 (1), 581093&#8211;8 (2013).</li>
	<li>Waugh, D. S. An overview of enzymatic reagents for the removal of affinity tags. 80 (2), 283&#8211;293 (2011).</li>
	<li>Williams, R. J., &#38; Lyman, C. M. A neutral buffered standard for hydrogen ion work and accurate titrations which can be prepared in one minute. J Am Chem Soc. 54 (5), 1911&#8211;1912 (1932).</li>
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	<li>Deppert, W. R., &#38; Luka&#265;in, R. Buffers and Additives. Journal of Chromatography Library. 61 (C), 839&#8211;862 (1999).</li>
	<li>Ugwu, S. O., &#38; Apte, S. P. The Effect of Buffers on Protein Conformational Stability. Pharmaceutical Technology. 28 (3), 86&#8211;108 (2004).</li>
	<li>Linke, D. Detergents: an overview. Methods in Enzymology. 463 (34), 603&#8211;617 (2009).</li>
	<li>Zhang, J. Protein-Protein Interactions in Salt Solutions. Protein-Protein Interactions Computational and Experimental Tools. (18), 359&#8211;376 (2012).</li>
</ol>
to:
<ol start="29">
	<li>Ball Mills - Guidelines for sample amount and ball charge. 1&#8211;3at &#60;http://www.retsch.com/products/milling/ball-mills/planetary-ball-mill-pm-100/information-downloads/&#62; Retsch GmbH (2014).</li>
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	<li>Deppert, W. R., &#38; Luka&#265;in, R. Buffers and Additives. Journal of Chromatography Library. 61 (C), 839&#8211;862 (1999).</li>
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	<li>Linke, D. Detergents: an overview. Methods in Enzymology. 463 (34), 603&#8211;617 (2009).</li>
	<li>Zhang, J. Protein-Protein Interactions in Salt Solutions. Protein-Protein Interactions Computational and Experimental Tools. (18), 359&#8211;376 (2012).</li>
	<li>Goldberg, S. Mechanical/physical methods of cell disruption and tissue homogenization. Methods in Molecular Biology. 424 (Chapter 1), 3&#8211;22 (2008).</li>
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	<li>Zhao, Q.-Q., Yamada, S., &#38; Jimbo, G. The Mechanism and Grinding Limit of Planetary Ball Milling. KONA. 7, 29&#8211;36 (1989).</li>
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Erratum: Protein Complex Affinity Capture from Cryomilled Mammalian Cells

Eine typische Anwendung der vorgestellten Verfahren ist zu stabilisieren und eine hohe Ausbeute und Reinheit des endogenen Proteinkomplexe von Interesse für interactomic Charakterisierung 1 erhalten. Es versteht sich, dass die dynamische Netzwerke beider stabil und transient makromolekularen Komplexen verbunden sind , die hauptsächlich aus Proteinen besteht, zelluläre Prozesse 2,3 orchestriert. Zwar gibt es viele experimentelle Ansätze zur Identifizierung von Protein-Protein - Wechselwirkungen sind, ist Affinitätseinfangen unter den am häufigsten verwendeten Methoden zur Isolierung und physiologischen Proteinkomplexe 4-6 sezieren. Darüber hinaus hat diese Technik den Vorteil, die makromolekulare Komplexe als physikalische Einheiten ergibt, nicht nur als Datenpunkte in einem Auslese; Vorteilhafterweise können die erhaltenen Komplexe somit in einer Vielzahl von zusätzlichen nachgeschalteten biochemischer, enzymatischer und strukturelle Assays 7-9 verwendet werden. Die vorgestellten Protokolle wurden in Reaktion auf die Notwendigkeit entwickelt abzubilden protein-Protein-Interaktionsnetze und makromolekulare Komplexe in ihrer Rolle als die Effektormoleküle der Zellbiologie charakterisieren. Sie sind detailliert in Bezug auf ihre Anwendung auf Säugetierzellen in Gewebekultur gezüchtet, sind jedoch gleichermaßen anwendbar auf einen weiten Bereich von biologischen Proben bei entsprechender systemspezifische Optimierungen. Die Geschichte der Affinitätseinfangen reicht zurück bis in den frühen zwanzigsten Jahrhunderts mit den ersten Immunaffinitätschromatographie Experimente - ähnlich, was man gemeinhin als Immunpräzipitation (IP) zu heute bezeichnet wird - von den frühen 1950er Jahren in der Literatur erscheinen. Mainstream Einsatz der Technik weiter durch die Jahrhundertwende der vorliegenden 10-13 entwickelt. Diverse Zell- und molekularbiologische Untersuchungen wurden durch Mahlen bei kryogenen Temperaturen zumindest in den letzten vierzig Jahren 14-19 mechanischen Bruch der Zellen verwendet werden ; und molekulare Trennungen unter Verwendung von (Super) paramagnetischen Perlen haben become immer häufiger in den letzten zwei Jahrzehnten 20. Die Kombination dieser unterschiedlichen Technologien hat dazu gedient , um synergistisch die Ergebnisse zu verbessern , die mit 1 in Proteinkomplex Affinitätseinfangen Experimente erhalten werden können, wie dies durch einen umfangreichen Werk von uns selbst und der breiteren Forschungsgemeinschaft produziert belegt 7,9,11,18,19,21 -23. Stütz Ergebnisse sind in Abbildung 1 dargestellt. Eine Sammlung von Einschränkungen und Überlegungen für effektive Affinitätseinfangen Experimente ausführen können in Bezug auf die 1 gefunden werden. Typischerweise ist dieser Ansatz am besten geeignet: (I) die Interaktionspartner eines Proteins von Interesse katalogisieren, dh Protein - Massenspektrometrie (MS) verwenden bisher unbekannte copurifying Proteine (explorative Analyse) zu identifizieren; (II) Assay auf das Vorhandensein eines bestimmten Wechselwirkungspartner, dh verwenden MS oder Western blot ein bestimmtes Protein oder begrenzten Satz von Proteinen in Verdacht nachzuweisenagieren mit dem Protein von Interesse (Hypothesentests); oder (III) vorbereiten endogen montiert Proteinkomplexe, die das Protein von Interesse für eine weitere Studie durch zusätzliche Techniken (präparative Aufarbeitung) enthält. Bevor Sie sich auf eine Affinitätsabfang-experimentelle Regime ist es absolut wichtig, eine qualitativ hochwertige Affinitätsreagens zu haben, die an das Zielprotein bindet, in der Regel eine IP-kompetenten Antikörper gegen das native interessierende Zielprotein oder gegen einen Tag zu einem Fusionsprotein angehängt. Es ist auch wichtig, geeignete Methoden der experimentellen Auslese an Ort und Stelle haben: allgemeine Proteinfärbung (wie Coomassie-Blau, Sypro Ruby oder Silber, nach SDS-PAGE), Western Blot und Protein-MS sind alle häufig in Verbindung mit Affinität Capture verwendet 1. Die vorgestellten Protokolle verwenden Antikörper konjugierten magnetischen Kügelchen als Affinitätsmedium. Während die Funktion des Affinitätsmedium kann zunächst in Tests validiert werden, die einige experimentelle Parameter nutzen, umerhalten die besten Ergebnisse sollte jedes Experiment empirisch 1,11,24 optimiert werden. Die Protokolle sind in drei unterscheidenden Phasen getrennt: (1) Herstellung von gefrorenen Zellmaterial; (2) Zellbruch durch Festkörper-Fräsen bei kryogenen Temperatur; und (3) Proteinextraktion und Affinitätseinfangen unter Verwendung von Antikörper-gekoppelten paramagnetischen Kügelchen.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="1304">
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:567px;">Growth media &#38; cell culturing implements</td>
			<td style="width:172px;"></td>
			<td style="width:164px;"></td>
			<td style="width:403px;">For producing frozen cells (I)</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">500 cm^2 culture dishes</td>
			<td style="width:172px;">Corning</td>
			<td>431110</td>
			<td>For producing frozen cells (I)</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Large beaker (1-2L)</td>
			<td style="width:172px;"></td>
			<td></td>
			<td>For producing frozen cells (I)</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Rectangular ice pan&#160;</td>
			<td>Fisher Scientific&#160;</td>
			<td>13-900-747</td>
			<td>For producing frozen cells (I), &#38; cryomilling (II)</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Phosphate buffered saline (PBS)</td>
			<td style="width:172px;"></td>
			<td style="width:164px;"></td>
			<td>For producing frozen cells (I)</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Large cell scrapers</td>
			<td>Fisher Scientific&#160;</td>
			<td>08-100-242</td>
			<td>For producing frozen cells (I)</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Liquid nitrogen&#160;</td>
			<td style="width:172px;"></td>
			<td style="width:164px;"></td>
			<td>For producing frozen cells (I), cryomilling (II), &#38; affinity capture (III)</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:567px;">50 ml conical tubes</td>
			<td>Corning</td>
			<td>352098</td>
			<td>For producing frozen cells (I), &#38; cryomilling (II)</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">20 ml Luer lock syringe</td>
			<td style="width:172px;"></td>
			<td style="width:164px;"></td>
			<td>For producing frozen cells (I)</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Leur lock syringe caps</td>
			<td>www.dymax.com</td>
			<td>T11182</td>
			<td>For producing frozen cells (I)</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Refrigerated centrifuge</td>
			<td style="width:172px;"></td>
			<td style="width:164px;"></td>
			<td>For producing frozen cells (I)</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">50 ml tube rack, 4 position</td>
			<td style="width:172px;"></td>
			<td style="width:164px;"></td>
			<td>For producing frozen cells (I), cryomilling (II), &#38; affinity capture (III)</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Styrofoam box</td>
			<td style="width:172px;"></td>
			<td style="width:164px;"></td>
			<td>For producing frozen cells (I), cryomilling (II), &#38; affinity capture (III)</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Planetary ball mill, PM 100&#160;</td>
			<td>Retsch</td>
			<td>20.540.0001&#160;</td>
			<td>For cryomilling (II)</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Stainless steel milling jar, 50 ml&#160;</td>
			<td>Retsch</td>
			<td>01.462.0149</td>
			<td>For cryomilling (II)</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Stainless steel milling balls, 20 mm &#216;&#160;</td>
			<td>Retsch</td>
			<td>05.368.0062</td>
			<td>For cryomilling (II)</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Lid gasket: PFA encapsulated spring energized seal, 2.62 mm 44.63 mm&#160;&#160;</td>
			<td style="width:172px;">www.marcorubber.com</td>
			<td>T1044-2.62x44.63</td>
			<td>For cryomilling (II)</td>
		</tr>
		<tr height="26">
			<td height="26" style="height:26px;">mini-LN2 decanter</td>
			<td style="width:172px;">homemade</td>
			<td style="width:164px;">see Ref 19</td>
			<td>For cryomilling (II)</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">250 ml PTFE jar insulator (optional)</td>
			<td style="width:172px;">Retsch</td>
			<td style="width:164px;">custom order</td>
			<td>For cryomilling (II)</td>
		</tr>
		<tr height="41">
			<td height="41" style="height:41px;">PTFE puck insulator (optional)</td>
			<td style="width:172px;">homemade</td>
			<td style="width:164px;">The Rockefeller University</td>
			<td>For cryomilling (II); can be produced by The Rockefeller University High Energy Physics Instrument Shop, or design blueprints provided, upon request.</td>
		</tr>
		<tr height="41">
			<td height="41" style="height:41px;">5 bar/500 KPA pressure relief valve (optional)</td>
			<td style="width:172px;">http://www.leeimh.com/</td>
			<td style="width:164px;">558 series check valve</td>
			<td>For cryomilling (II)</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:567px;">1.5 - 2 ml microfuge tubes</td>
			<td style="width:172px;"></td>
			<td style="width:164px;"></td>
			<td>For affinity capture (III)</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:567px;">Extractant</td>
			<td style="width:172px;"></td>
			<td style="width:164px;"></td>
			<td>For affinity capture (III)</td>
		</tr>
		<tr height="41">
			<td height="41" style="height:41px;width:567px;">cOmplete EDTA free protease inhibitor cocktail tablets</td>
			<td style="width:172px;">Roche Applied Science</td>
			<td style="width:164px;">11873580001</td>
			<td style="width:403px;">For affinity capture (III)</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:567px;">Vortex mixer</td>
			<td style="width:172px;"></td>
			<td style="width:164px;"></td>
			<td>For affinity capture (III)</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:567px;">Ice bucket</td>
			<td style="width:172px;"></td>
			<td style="width:164px;"></td>
			<td>For affinity capture (III)</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:567px;">Microtip sonicator, Q700</td>
			<td style="width:172px;">Qsonica</td>
			<td style="width:164px;">Q700</td>
			<td>For affinity capture (III)</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">low intensity 1/16&#8221; microtip probe</td>
			<td style="width:172px;">Qsonica</td>
			<td style="width:164px;">4717</td>
			<td>For affinity capture (III)</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:567px;">Bench-top refrigerated microcentrifuge</td>
			<td style="width:172px;"></td>
			<td style="width:164px;"></td>
			<td>For affinity capture (III)</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:567px;">Dynabeads M-270 Epoxy</td>
			<td style="width:172px;">Thermo Fisher</td>
			<td style="width:164px;">14302D</td>
			<td>For affinity capture (III)</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:567px;">Antibody or affinity ligand coupled to Dynabeads</td>
			<td style="width:172px;">homemade</td>
			<td style="width:164px;"></td>
			<td>For affinity capture (III); see reference 19</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:567px;">Sample rotator&#160;</td>
			<td style="width:172px;"></td>
			<td style="width:164px;"></td>
			<td>For affinity capture (III)</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:567px;">Neodymium magnet</td>
			<td style="width:172px;">Life Technologies</td>
			<td style="width:164px;">123-21D&#160;</td>
			<td>For affinity capture (III)</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:567px;">SDS-PAGE sample buffer (no reducing agent)</td>
			<td style="width:172px;"></td>
			<td style="width:164px;"></td>
			<td>For affinity capture (III)</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:567px;">DTT</td>
			<td style="width:172px;"></td>
			<td style="width:164px;"></td>
			<td>For affinity capture (III)</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:567px;">SDS-PAGE system</td>
			<td style="width:172px;"></td>
			<td style="width:164px;"></td>
			<td>For affinity capture (III)</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:567px;">SDS-polyacrylamide gel</td>
			<td style="width:172px;"></td>
			<td style="width:164px;"></td>
			<td>For affinity capture (III)</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:567px;">Protein Stain</td>
			<td style="width:172px;"></td>
			<td style="width:164px;"></td>
			<td>For affinity capture (III)</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

protein complex affinity capture from cryomilled mammalian cells

Affinitätseinfang ist eine wirksame Technik für die endogene Proteinkomplexe für die weitere Untersuchung zu isolieren. Wenn sie in Verbindung mit einem Antikörper verwendet wird, wird diese Technik auch als Immunpräzipitation häufig bezeichnet. Affinitätseinfangen in einer Labormaßstab und in einer Hochdurchsatz-Rahmen angewendet werden. Wenn sie mit Protein-Massenspektrometrie gekoppelt, Affinitätseinfangen hat sich als Zugpferd der Interaktom Analyse. Obwohl es möglicherweise viele Möglichkeiten gibt, beteiligt die zahlreichen Schritte auszuführen, implementieren die folgenden Protokolle unsere bevorzugte Methoden. Zwei Merkmale sind unverwechselbar: die Verwendung von cryomilled Zell Pulver Zellextrakten zu produzieren, und Antikörper-gekoppelten paramagnetischen Kügelchen als Affinitätsmedium. In vielen Fällen haben wir überlegene Ergebnisse zu denen mit konventionelleren Affinitätseinfangen Verfahren erhalten wurde. Kryomahlen vermeidet zahlreiche mit anderen Formen von Zellbruch verbundenen Probleme. Es sorgt für eine effiziente Bruch des Materials bei gleichzeitiger Vermeidung denatration Probleme mit Heizung oder Schäumen verbunden. Es behält die native Proteinkonzentration bis zu dem Punkt der Extraktion, makromolekulare Dissoziation zu mildern. Es reduziert die Zeit extrahierten Proteine ​​in Lösung zu verbringen, schädliche enzymatischen Aktivitäten zu begrenzen, und es kann die nicht-spezifische Adsorption von Proteinen durch das Affinitätsmedium zu reduzieren. Micron-Skala magnetischen Affinitätsmedien haben mehr alltäglich in den letzten Jahren geworden, immer mehr die traditionellen Agarose- ersetzt und Sepharose-basierte Medien. Primäre Vorteile von magnetischen Medien umfassen typischerweise geringere nicht-spezifische Protein-Adsorption; keine Größenausschlussgrenze, da Protein-Komplex tritt eher auf der Oberfläche der Kügelchen Bindung als in den Poren; und eine einfache Manipulation und Handhabung mit Hilfe von Magneten.

Abbildung 1, Tafel I zeigt , dass Kryomahlen und magnetische Kügelchen können zusammen Probenqualität weiter zu verbessern. Paneele IA-C zeigen , daß das Material des unlöslichen Medium für den Affinitätseinfang verwendet , umfassend 19 des wiedergewonnenen Proteom beeinflussen können. Das Protein von Interesse, gereinigter FLAG-markiertes bakterieller alkalischer Phosphatase (BAP), wurde in menschlichen Zellextrakten versetzt. BAP wird erwartet, dass nicht speziell zur Interaktion und menschliche Proteine ​​copurify. Die Signatur copurifying Proteine, beurteilt durch SDS-PAGE und Coomassie-Färbung, variiert je nach dem verwendeten Medium. Micron Maßstab magnetischen Kügelchen zeigte die sauberste Profil, mit einem relativ niedrigen Niveau der unspezifischen Proteinadsorption hindeutet. Platten-ID und IE zeigen, daß das Verfahren der Zelllyse auch die zurückgewonnene Proteom beeinflussen können. In dem gegebenen Beispiel ist ein endogenes Protein - Komplex (der NEXT - Komplex 37), wurde Affinität captu ausgesetztre von cyromilled oder beschallte Zellextrakten 19. Weniger hohe Massen Verunreinigungen wurden beobachtet, wenn der Zellextrakt aus cryomilled Zellpulver hergestellt wurde. Eine Herausforderung bei der Affinität Capture mit endogenen Proteinkomplexen zu untersuchen ist, dass es schwierig sein kann, bona fide physiologischen Interaktoren des Proteins von Interesse von False Positives (RP) zu unterscheiden. FPs können aus vielen Quellen entstehen, einschließlich der nicht-spezifischen Adsorption an Rohren und Behältern, die Affinitätsmedium, dem Antikörper oder Affinitätsliganden, und / oder an das Protein von Interesse selbst. Als Ergebnis müssen erhebliche Anstrengungen zur Optimierung der Erfassungsprozess gewidmet. Der Nachweis von FPs bleibt eine zentrale Herausforderung für die eine große Anzahl von unterschiedlichen Werkzeugen entwickelt wurden, einschließlich experimenteller 38-40 und rechnerische Ansätze 41-43, die jeweils mit unterschiedlichen Vor- und Nachteile. In eigenen Versuchen stellten wir fest, die zuvor ein Muster von FP Proteinbindung, erhalten nach Inkubation von α-FLAG magnetisches Medium mit Kontroll-Zellextrakten, war, daß die sich von dem Muster in Gegenwart erhaltenen 3xFLAG-markierte Proteine. Darüber hinaus könnten diese FPs aus dem Medium durch die Inkubation mit Peptid 3xFLAG 7 freigegeben. Diese Beobachtung ist konsistent mit opportunistischen Bindung von FPs an die α-FLAG Paratop in Abwesenheit des verwandtes Epitop. die Natur dieser FP Hintergrund zu verstehen, ist wichtig, da viele Studien unmarkiert &quot;Elternzelllinie&quot; als Scheinkontrolle für Affinitätseinfangen verwenden; Diese Kontrollen können daher nicht angemessen sein, um die Spezifität der Wechselwirkung mit dem markierten Protein zu bestimmen. Um den Hintergrund zu bestimmen, die Bindung von unseren Affinitätsmedium beigetragen, wenn Antikörper Paratope besetzt sind oder nicht, durchgeführt wir mock Affinitätseinfangen Experimenten unter Verwendung von α-FLAG magnetischen Medium und HEK 293T-Zellextrakte (kein tagged Protein exprimiert) in Gegenwart oder Abwesenheit eines 3xFLAGPeptid-Spike-in. Die Ergebnisse sind in Abbildung 1, Tafel II gezeigt. Kurz gesagt, wurde für 30 min in Zellextrakten (von ≳10 mg / ml Gesamtprotein), enthaltend 500 mM NaCl und 1% v / v Triton X-100 in 20 mM HEPES-Na, pH 7,4, inkubiert magnetischen Medium α-FLAG. Das Medium wurde dann mit 1 mg / ml 3xFLAG Peptid inkubiert, um kompetitiv alle Proteine ​​an die α-FLAG Paratop nativ oder mit SDS-PAGE-Probenpuffer gebunden verdrängen eine denaturierende Elution zu erreichen. Zusätzlich wurde das gleiche Experiment durchgeführt, wenn die Zellextrakte mit 1 ug / ml und 10 ug / ml Peptid 3xFLAG versetzt wurden. Alle eluierten Fraktionen wurden auf SDS-PAGE und Silberfärbung unterzogen. Wir beobachteten , dass in Abwesenheit von seinem verwandten Epitops, α-FLAG Medium eine detektierbare Pegel des Hintergrundproteine nicht erfassen , die mit 3xFLAG Peptid eluiert werden kann - in der durch Fig versehen Beispiel 1-II, eine dominante Spezies wurde bei zwischen 37 beobachtet und 50 kDa. Das Muster eluiert mitSDS-PAGE-Probenpuffer war vergleichbar mit zusätzlichen prominent Arten. Jedoch in Gegenwart von 1 &amp; mgr; g / ml Peptid 3xFLAG, FP an die Affinitätsbindungsmedium wurde unterhalb der Nachweisgrenze eliminiert und wurde in entweder den nativen oder denaturierenden Elutionsfraktionen nicht beobachtet. Dieses Ergebnis legt nahe, dass unbesetztes Antikörper Paratope während Affinitätseinfangen auch auf Antikörper, erhalten in Abwesenheit ihres zugehörigen Epitop und tragen wesentlich zur Proteom promiskuitiv, die ihre Epitop mit hoher Affinität binden, wie es der Fall für die 3xFLAG ist / α-FLAG M2 Paarung. Es suggestd auch, dass sehr stringenten Bedingungen mit hohem Salz verwenden, häufig gewählten unspezifische Bindung zu verringern, kann in Abwesenheit des Antigen / Antikörper-Wechselwirkung unwirksam. Follow-up wir ein ähnliches Experiment einschließlich der Analyse durch SDS-PAGE sowie quantitative MS (Abb. S1) durchgeführt. Von den 347 Proteinen quantifiziert, beobachteten wir, dass jedes Protein für eine (falsche Disco sparensehr Rate = 1%; Tabelle S1) wurde mit dem 3xFLAG-markierten Köderprotein assoziiert im Vergleich zu einer 3xFLAG Peptid Kontrollprobe versetzt. Diese Ergebnisse zeigen, dass in unseren Experimenten die überwältigende Mehrheit der Proteine ​​beobachtet, wahrscheinlich zusammen reinigen mit dem markierten Protein oder sind off-target Nebenprodukte der unbesetztes α-FLAG Paratope. Unserer Erfahrung nach hohen Signal-zu-Rausch-Affinitätsabfang-Ergebnisse sind in der SDS-PAGE und Proteinfärbung durch eine diskrete Muster von scharfen, reichlich und in etwa stöchiometrischen Bands sowie eine geringe Menge von Hintergrundfärbung von anderen blasser Bands exemplifiziert; zahlreiche Beispiel dieses Prinzips kann in Referenz 11 gesehen werden. Das Motiv für einen PTFE - Isolator mit (was empfohlen wird) , wenn Cryomahlung ist die Rate der Erwärmung des Glases während des Mahlens zu reduzieren, während des Mahlvorgangs die Last der wiederholten LN 2 Kühlung minimieren und reduzieren den Grad der EisBildung in den Topf. Dies erleichtert konsistente Mahlleistung und erleichtert die Handhabung des Zell Pulver. Beispiel Isolatoren können in Referenz 27 (Pucks) und dargestellt in Figur 2 unten (hülsen and-Puck) gefunden werden. <img alt="Abbildung 1" src="/files/ftp_upload/54518/54518fig1.jpg" /> Abbildung 1: Repräsentative Ergebnisse auswählen. (I) Dieses Panel wurde von Referenz 19 modifiziert. Coomassie Blau gefärbtes SDS-Polyacrylamidgel. (LINKS) Micron-Skala magnetische Kügelchen zeigen unteren Off-Target-Bindung als Agarose-basierte Medien. (A) magnetische Kügelchen; (B) traditionelle Agarose; (C) Eisen imprägniert (magnetisch) Agarose; jeweils mit anti-FLAG M2-Antikörper und verwendet FLAG-getaggten bakterieller alkalischer Phosphatase zu erfassen (BAP; gekennzeichnet) versetzt in Extrakten hergestellt aus cryomilled HEK-293-Zellen. Agarose-basierte purificationszeigten höhere unspezifische Adsorption (unmarkiertes Bänder). (RIGHT) Auszüge aus cryomilled HeLa-Zellen hergestellt werden, zeigen geringere Off-Target-Adsorption auf Antikörper-gekoppelten magnetischen Kügelchen als die durch Beschallung hergestellt, wenn verwendet, um ein endogenes Protein-Komplex zu reinigen. LAP-markierte 44 RBM7 wurde unter Verwendung der Affinität magnetische Kügelchen gekoppelt polyklonalen Anti-GFP - Antikörper erfasst die NEXT - Komplex 19,37 (D) zu reinigen von cryomilled Pulver - Extrakt; (E) Extrakte durch Beschallung von intakten Zellen. Die vertikale schwarze Balken hebt einen Bereich des Gels, wo eine hohe Masse nicht-spezifischen Interaktionspartner beobachtet werden in der Probe durch Beschallung hergestellt angereichert werden. Die schwarzen Pfeile die erwarteten spezifischen Interaktionspartner angezeigt (markiert). Bands beobachtet ~ 50 kDa in den Spuren D und E zu Lama IgG schweren Ketten zurückzuführen. (II) Silbergefärbtes SDS-Polyacrylamid - Gel. (Std.) Ein Mock Affinitätseinfangen erfolgt auf HEK-293T-Zellextrakten in üblicher Weise. Nach Erfassung, Elution des gebundenen Materials wurde mittels (N) nicht denaturierenden Elution mit 1 mg / ml 3xFLAG Peptid oder (D) Denaturieren Elution in SDS-PAGE-Probenpuffer gelöst; (PB 1) als Std. aber die 3xFLAG Peptid wurde in der Extraktionslösung bei 1 &amp; mgr; g / ml enthalten die α-FLAG Paratope auf dem Affinitätsmedium zu blockieren; (PB 10) als PB1, jedoch in Gegenwart von 10 ug / ml Peptid 3xFLAG. IgG-bezogenen Bands und 3xFLAG Peptid markiert sind. <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/54518/54518fig1large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier</a> , um <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/54518/54518fig1large.jpg" target="_blank">eine größere Version dieser Figur zu sehen.</a> <img alt="Figur 2" src="/files/ftp_upload/54518/54518fig2.jpg" /> Abbildung 2: PTFE - Isolator Sleeve-and-Puck. Ein 250 ml - PTFE Gefäß wird (1) gezeigt. Ein 50 ml - Edelstahl - Fräsen Glas (2) passt in der PTFE - Glas (3) und stellt dieGelegenheit, das Fräsen Glas in der Mühle zwischen den Zyklen installiert zu verlassen. Ein oberer PTFE - Isolator Puck (2) zwischen der Klemmvorrichtung und der Behälterdeckel verwendet. Direkt in den Körper des Isolators Um die installierten Glas und Isolatoranordnung abkühlen (3), LN 2 zugegeben, das Gefäß umgibt. Der nächste Zyklus des Mahlens kann dann eingeleitet werden. <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/54518/54518fig2large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier</a> , um <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/54518/54518fig2large.jpg" target="_blank">eine größere Version dieser Figur zu sehen.</a> <table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody><tr><td> Reagens </td><td> Empfohlene Konzentration </td><td> Notizen </td></tr><tr><td> Kochsalz </td><td> 0,1-0,5 M </td><td> Hohe Konzentrationen (&gt; 300 mM) neigen dazu, Extraktion des Gesamtproteins zu verbessern und Hintergrund gering zu halten, können aber eine ansonsten stabile inter abstreifenAkteure. Konzentrationen unter 150 mM sind typischerweise nicht wirksam bei nicht-spezifischen Hintergrund zu reduzieren. </td></tr><tr><td> Ammoniumacetat </td><td> 0,2-2 M </td><td> Ein Salz, bestehend aus zwei Puffern, das ergibt einen neutralen pH - Lösung 57. Höhere Konzentrationen stabilisieren einige Proteinkomplexe. Saure Lösungen können aus alten, unsachgemäß gelagert kristallinen Bestände aufgrund von Ammoniakverlust zur Folge haben. Kein zusätzlicher pH-Puffer oder Salze werden in Extraktionsmittel enthält, Ammoniumacetat erforderlich. Kann mit NaCl kombiniert werden, erhalten zu modulieren Ergebnisse. </td></tr><tr><td> Tween 20 </td><td> 0,1% v / v </td><td> Ein nicht-ionisches Detergens 58; typischerweise mit NaCl kombiniert. </td></tr><tr><td> Triton X-100 </td><td> 0,5-1% v / v </td><td> Ein nicht-ionisches Detergens 58; typischerweise mit entweder NaCl oder NH kombiniert 4 CH 3 CO 2 H </td></tr><tr><td> CHAPS </td><td> 5 mM </td><td> Ein zwitterionisches Waschmittel 58 &lt;/ Sup&gt;; typischerweise mit NaCl kombiniert. </td></tr><tr><td> Sarkosyl </td><td> 1 mM </td><td> Eine anionische Reinigungsmittel 58, der Hintergrund reduziert und kann eine stabile komplexe Bauteile abzustreifen, möglicherweise binäre Konnektivität enthüllt; typischerweise mit NaCl kombiniert. </td></tr><tr><td rowspan="2"> Tris-Cl </td><td> 20 mM </td><td rowspan="2"> pK a von 8,8 bei 4 ° C, 8,1 bei 25 ° C. </td></tr><tr><td> (PH 8,0) </td></tr><tr><td rowspan="2"> HEPES-Na </td><td> 20 mM </td><td rowspan="2"> pK a von 7,8 bei 4 ° C, von 7,5 bei 25 ° C. NaOH oder KOH verwendet für pH Äquilibrierung in Abhängigkeit von dem Salz (beispielsweise NaCl, KCl oder CH 3 CO 2 K) in dem Extraktionsmittel verwendet. </td></tr><tr><td> (PH 7,4) </td></tr></tbody></table> Tabelle 1: Einige vorgeschlagen Reagenzien , die für Proteinkomplexe zu reinigen. Diese Tabelle lists einige Reagenzien wir zur Reinigung von Proteinkomplexen nützlich aus menschlichen Zelllinien, mit den vorgeschlagenen Arbeitskonzentrationen gefunden. Eine typische Formulierung enthält Extraktionsmittel einen pH - Puffer, ein Salz und ein Detergens 1,11,24,45-48. Am günstigsten ist es die am wenigsten komplexe Kombination von Reagenzien zu identifizieren, die das gewünschte Ergebnis liefert. <img alt="Abbildung S1" src="/files/ftp_upload/54518/54518figS1.jpg" /> Abbildung S1: Mischen Sie nach der Reinigung (MAP-) SILAC Analyse von False Positives. I. Schematische Darstellung: In diesem Experiment 3xFLAG-markierte ORF2p Proteinkomplexe (von pLD401 ausgedrückt) wurden gereinigt von Schwer- und Leicht markierten HEK-293T - Zellen 7. Das Licht markierte Zellextrakt wurde mit 3xFLAG Peptid gespickt Affinität Erfassung des 3xFLAG-markierten ORF2p durch kompetitive Hemmung zu verhindern; dies wird nicht erwartet, dass die Bindung von Proteinen zu blockieren, die nicht-spezifi auftreten kanntisch mit dem magnetischen Medium oder den nicht paratopischen Strukturen des Antikörpers. Nach der Elution von den magnetischen Kügelchen, waren die schweren und leichten Proben gemischt Nachreinigung und analysiert durch quantitative MS (MAP-SILAC 39) den Anteil von Proteinen zu bestimmen , entweder mit Probe verbunden sind ; weitere methodische Detail befindet sich in der Tabelle S1. II. Silber gefärbtes Gel veranschaulicht, dass die Leicht- und Schwer markierten Materialien ergeben vergleichbare Ergebnisse (vergleiche mit L H), und daß die Reinigung in Gegenwart des spike in 3xFLAG durchgeführt (LI) war kompetitiv gehemmt. Im Folgenden wird ein Coomassie Blue G-250 gefärbtes Gel Topfen , bestehend aus dem gemischten H und LI Fraktionen vor Gelbasis Proteomanalyse, wie in Tabelle S1 beschrieben. <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/54518/54518figS1large.jpg" target="_blank">Bitte hier klicken</a> , um <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/54518/54518figS1large.jpg" target="_blank">eine größere Version dieser Figur zum Download</a> bereit <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/54518/54518figS1large.jpg" target="_blank">.</a> Tabelle S1:MAP-SILAC. Dieses Blatt enthält die erhaltenen Daten bei der Ausführung des MAP-SILAC Experiment in Abbildung S1 beschrieben. <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/54518/Table_S1.xlsx" target="_blank">Bitte klicken Sie hier</a> , um <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/54518/Table_S1.xlsx" target="_blank">diese Tabelle zum Download</a> bereit <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/54518/Table_S1.xlsx" target="_blank">.</a>

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