Name: protein complex affinity capture from cryomilled mammalian cells
Uploaded: 2016-12-09T13:00:00
Duration: 10 min 37 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Protein Complex Affinity Capture from Cryomilled Mammalian Cells at JoVE.com

אנו מודים פרופ &#39;בריאן טי חייט עבור ייעוץ, תמיכה שלא יסולא בפז שלו, וגישה למתקני בקרה-מדידה MS, כמו גם גב&#39; קלי ר מולוי לקבלת תמיכה טכנית מעולה. אנו מודים לגב &#39;קלי Bare לתמיכה עם עריכת עותק. עבודה זו נתמכה בחלקה על ידי NIH מענקים P41GM109824, P41GM103314, ו P50GM107632.

The authors declare that they have no competing financial interests.

שלושה פרוטוקולים אלה לעבוד במקביל על מנת (1) להכין תאים עבור שבירה של מצב מוצק על ידי cryomilling, (2) להשיג שבירה בטחנת הכדור פלנטרית, ו (3) לייצר תמציות מתא אבקת זיקה לכידת חלבון של עניין מורכב עם interactors הפיזיולוגי אינו רב. רבות בטכניקות שונות תא תמוגה קיימות, כוללים גישות מכאניות / פיסיות העסקת ריסוק השפעה, גז, ו / או לחץ, כמו גם כימיות / גישות האנזימטית, כל אחד עם יתרונות וחסרונות שונים 49,50. חוקר מעודד כל לחקור שיטות המתאימות ביותר עבור הניתוחים שלהם, תוך התחשבות כי כל גישה שנבחרה שבירת תא מיצוי חלבון צפויה להציג הטיות 51,52 המחייב אופטימיזציה אמפירית (ראה להלן). שיטות מכאניות עלולות לייצר חום גבוה ו / או כוחות גז אשר יכול לשבש קומפלקסי חלבונים. Cryomilling ימנע תופעות חימום מכוח העסקת קירור 2 LN של דגימות עבור tמשך הוא של התהליך. טחנות כדור פלנטריים הם הבינו לסמוך על כוחות השפעת החיכוך, כוללים מאמץ גזירה, כמרכיבים של צמצום גודל חלקיקים 53,54. בהגדרות דיווח לא ראינו ניוון של קומפלקסי חלבונים. אכן יש לנו חילוץ והוציא כנראה פגע ~ 50 מתחמי נקבוביות הגרעין מד&quot;א 11 ו enzymatically רטרוטרנספוזון פעיל מפגין פעילות ספציפית גבוהה יותר מאשר ההכנות העסקת &#39;עדין&#39; מבוסס-דטרגנט תמוגה 7. שיטות כימיות / אנזימטית של תמוגה התא סובלות ההגבלה כי תוכן התא משתחרר לתוך המילייה במבחנה שתומכת שיבוש קרום תא מקרומולקולות מבני אבל לא יכול להיות מתאים תחזוקה של שלמות מורכב החלבון (es ) של עניין. לעתים קרובות, לא המרכיבים של מתחמי הקים עם החלבון של עניין ולא התנאים הדרושים כדי לייצב את מתחמי היעד הםידוע מראש. יתרון עיקרי של כרסום מצב המוצק הוא שבירה והפקה הם זוגיים, המתירים מקור חומר כדי להיות מוכנה ללא נוזל הוסיף, מאוחסן (ב -80 ° C או נמוך יותר), צברה, והוציאה נוח לניסויים על פי דרישה; למשל, לחקור אופטימיזציה בתנאים במבחנה עבור לכידת זיקה. אינטראקציות חלבון יציבות ביותר בריכוז גבוה 55,56, ולכן צמצום היקף extractant יכול להיות יתרון עבור שמירת אינטראקציות פיסיולוגיות. מצד השני, ישנם שיקולים מעשיים - מתחמי החלבון צריכים לעשות כדי להיות למחיצות מתוך התאים לתוך שלב מימי בלתי צמיג, ללא אגרגטים מסיסים, על מנת לערבב את מתחמי היעד עם מדיום הזיקה. יתר על כן, חלק סטנדרטיזציה וביקורת על הסביבה חוץ גופייה (pH, ריכוז מלח, וכו &#39;) דרושות שיטתיות ועל שחזור. אנו מוצאים כי תמציות produced בטווח דילול של 1: 4-1: 9 (w: v) לספק דאגות מעשיות ותיאורטיות, מניב תוצאות איכותיות. בנוסף, שיעור אופטימלי של תמצית התא זיקה לצרכים בינוני שייקבע. הדבר נעשה באופן אמפירי על ידי טיטרציה של תמציות עם כמויות משתנות של מדיום זיקה יכול להיות השפעות לזיהוי על יחס אות לרעש של הניסוי, עוד נדון בהמשך. דלדול מעולה של חלבון המטרה הוא בדרך כלל ≥70% של השבר המסיס של חלבון המטרה, אבל&gt; 90% רצויים ועלולים להיות ברי השגה עם parameterization הזהיר של תנאי חילוץ. שיקולים מעשיים רבים כגון מכוסי התייחסות 1. חרוזי פאראמגנטיים הם מניפולציה באמצעות מגנטי ניאודימיום בבעל צינור מיוחד microcentrifuge, למרות חלופות תוצרת בית הן קיימא. כאשר הניח בתוך מחזיק, חרוזים לאסוף בצד של הצינור תחת השפעת השדה המגנטי. הפתרונות עשויים מכן להסירו מבלי disturbing החרוזים. מגבלה אחת של פרוטוקול cryomilling שהוצג, פותחת עם טחנת כדור פלנטרית משמשת כאן (ראה טבלה של חומרים), הוא כי כמות מינימאלית של חומר נדרשה טחנה ביעילות לשחזר אבקת תא באמצעות המכשיר הזה (&gt; g 1). כמויות כאלה מתקבלות בקלות עם חיידקים רבים, שורות תאים, ואורגניזמים מודל, וגם לעתים קרובות יכולות להיות מושגת עם רקמות הניכרות מן בחיות מעבדה. עם זאת, שורות תאים מסוימות עשויות להיות מאוד קשות לגדול ברקמות שפע בעלי חיים עשויים להיות נדיר. כמויות של חומר קטנים יותר ניתן הסתובבו וזהוב באמצעות מכשירים אחרים ניצול מכולות קטנות יותר, אם כי באופן פוטנציאלי על ההקרבה של עדינות אבקת מושגת. בנוסף, העלות של מכשירי טחינה מכאניים עשויה להיות יקרה מדי עבור מעבדות כמה. ניתן להשיג Cryomilling באמצעות מספר setups אלטרנטיבה 14-19, כולל, רוב משתלם ביד באמצעות הדברהle וטיח, אם כי יעילות שבירה טיפות באופן משמעותי. פרוטוקולים לכידי זיקה בדרך כלל לשאוף יעילות גבוהה של תמוגה תא כדי להקל מיצוי חלבון מקסימלית לתוך פתרון ומכאן, את מרב פוטנציאל עבור לכידתו של קומפלקסי חלבוני היעד. מצד השני, זה הודגם עבור שמרי שחבור במבחנת תמציות כי תמוגה מקסימלי לא יכולה להשוות עם מקסימאלית בפעילות הביוכימית במבחנת 57,58. אנחנו לא הבחנו בעיות כאלה במערכות בדקנו עד כה, ולכן לא בכוונה להגביל שבירת התא שלנו כאשר cryomilling. אף על פי כן, האפשרות הזאת צריכה לזכור בעת ביצוע אופטימיזציה עבור מבחנים במבחנה האנזימטית. למרות cryomilling היא שיטה יעילה מאוד עבור שבירת תאים, כמות מוגבלת של sonication לעתים קרובות הטבות תמציות תא הומוגנית הייצור כולו מרקמות יונקות כי אגרגטים הומוגניות לפעמים יכולים להיות שנצפו על ידי בדיקה ויזואלית: בדרך כללבתנאי חילוץ באמצעות נמוך עד בינוני מלח (100-300 מ&quot;מ) ניקוי שאינו יוני (נ 0.1-1% / v) ריכוזים. מכיוון שאנחנו ציינו כי הנוכחות של אגרגטים אלה יכול להפחית את התשואה ו / או האיכות הלכידה הזיקה הבאה, אנו שגרתי ליישם sonication לפזר אותם (גם כאשר הם לא נצפו בעין בלתי המזוינת). המצרפים עולים בקנה אחד עם שברי קרום מגובבים, דומים לאלה שדווחו בעבר תמציות מתאי שמרים הסתובבו 58. Sonication משמש גם פרוטוקולים מסוימים גזירה DNA ולשחרר שברי הכרומטין לתוך פתרון, אולם מידת sonication להחיל בפרוטוקול זה לא DNA שבר ניכרת. הזמינות המוגבלת (או העלות הגבוהה) של ליגנד זיקה מעולה או נוגדן נגד חלבון מסוים של עניין עשוי להיות מכשול אחר. מגוון רחב של חומרים כימיים זיקה זמינות מסחרי ניתן למנף כאשר אורגניזם המודל ניתן תיוג גנומית או TRansfection עם וקטורי ביטוי אקטופי, המתירים את הביטוי של חלבונים בעלי עניין כמו התכה-tagged זיקה. עם זאת, בייצור הנוגדנים ונוהגין מגדיל את האפשרות ושניהם נוגדני polyclonal ו חד שבטיים יכולים לבצע מצוין ללכוד יישומי זיקה. שיקולים רבים אלה מכוסים גם ביתר פירוט ביחס 1. דוגמאות איך שיטת תמוגה תא ובחירת בינוני זיקה יכולות להשפיע על תוצאות הן באיור 1. דוגמאות של השפעות שהפעילו extractants השונה ניתן לראות אזכור 1,11,24. בגלל הפרמטרים של הניסוי אלה ואחרים משפיעים על איכות לכידת זיקה, מה שמקשה להפלות FPS, מאגרים של &quot;proteomes חרוז&quot; ו גישות חישוביות לחסל מזהמים שאינם ספציפיים פותחו כדי לסייע בזיהוי FPS 40-43. אף על פי כן, גישות כאלה רק substitאוטה להכנת מדגם אופטימלי עד רמה מסוימת 59. התבוננות שיטות עבודה מומלצות לאופטימיזציה של הניסוי לכידת זיקה אמפירית תספק דגימות באיכות הגבוהה ביותר עבור ניתוחים במורד הזרם, עוד נדון בהמשך. תרגול מיושם בקלות שיכול לשפר טוהר מדגם הוא elution ילידים. elution Native נמצא דווקא בשימוש תכוף להשיג מורכב החלבון המבודד זיקה, ללא פגע, לניסויים נוספים; אבל כפי שהוא לעתים קרובות משפר טוהר המדגם, זה יכול לשמש גם מטעם זה בלבד. עם זאת, כפי שמודגם באיור 1, פאנל II, היכולת של elution יליד לשפר טוהר המדגם יכולה להיות תלויה על טיטרציה מדויק של כמות בינונית זיקה שפע של חלבון המטרה של תמצית התא - כאשר המדיום הוא העולה , paratopes הפנוי רשאי להתיר ההצטברות מחוץ היעד של חלבוני FP נצפים שברי eluted באופן מקורי. באמצעות ריאגנטים הליכים המתוארים כאן, זה hכמו מנסיוננו, התורם הגדול ביותר של FPS לניסויים שלנו הוא החלבון מתויג עצמו הסיר פעם מההקשר של התא החי. (איור. 1.II ו איור. S1). במקרים כאלה, שולטת שורת תאים ההורית שמניבות proteomes רלוונטי בהעדר האנטיגן להן כל ערך מעשי; גם לגבי תג בלבד או ספייק בבקרות שהן ריקות פרט האנטיגן היעד. לכן, בכל פעם המעשית אנו מקיימים I-DIRT 7,38, אשר ישירות מודד את ההצטברות של אינטראקציות חלבון שלאחר תמוגה באמצעות MS כמותית. כאמור בשלב 3.2.7 של הפרוטוקול, נהלי elution היליד ישתנו עם הפרטים של מערכת הזיקה בשימוש. elution Native מושג לרוב על ידי עקירה התחרותית של שסע החלבון מורכב או פרוטאוליטים המתויגים של התג, שחרור במתחם ממדיום הזיקה. מערכות זיקה כמה מורכבות תגי epitope קטנים קיימות, for שבו epitope עצמו זמין כמו פפטיד שימושי עבור elution התחרותי של קומפלקסי חלבונים מתויגים 60. כמו כן, כמה פרוטאזות זמינים לדבוק אתרים מאותו מקור ספציפי במיקום אסטרטגי זיקה מתויג חלבונים היתוך 61. תלוי את הפרטים של מערכות זיקה נבחרו, את ערכת elution המתאימה ניתן לאמץ. באופן כללי, את איכות התוצאות שהתקבלו תושפע באופן משמעותי על ידי איכות הכנת המדגם. חשוב לעבוד בזהירות ובדייקנות בכל שלב ושלב של פרוטוקולים אלה, במהירות האפשרית, תוך שמירה על טיפול ודיוק. מומלץ לעקוב אחר חלוקת החלבון של עניין בכל שלב ושלב כדי להבין את היעילות של כל מניפולציה. לדוגמא: איך שופע הוא החלבון של עניין התא או רקמה מדובר? אולי החלבון נחקר (והמכלולים שלה) יהיה מאתגר לאפיין על ידי המוניספקטרומטריית בשל שפע נמוך. אם מתחמי המטוהרים ניתנים לזיהוי על ידי מכתים חלבון כללי (כ ננוגרם הטווח), ספקטרומטריית מסה עשויה להצליח. אם החלבון של עניין שנתפס ניתן לאבחון רק על ידי מערבי סופג chemiluminescent משופרת רגיש (טווח picogram כ), ספקטרומטריית מסה היא פחות סיכוי להיות יעיל. גם אם החלבון של עניין הוא שופע בתא, איך בשפע נמצא ב תמצית התא מיוצר? האם המחיצה חלבון לפתרון או שמא המטרה היא גלולה? אם האחרון, פתרון חילוץ חדש ניתן המציא שעשויה לשפר את ההתאוששות. לאחר תמצית התא משולבת עם מדיום הזיקה, איך ביעילות הוא החלבון בשבי? האם החלבון אבל מחובר לנצח באמצעות השטיפות הבאות? מה לגבי חלבונים copurifying אחרים? על ידי שמירת aliquot של כל דגימה על צעדים מתאימים לפרוטוקול השאלות הללו ניתן לענות בקלות, בדרך כלל על ידי מערבי סופג נגד החלבון של ענייןאו מכתים חלבון בכלל, אבל מבחני אחרים עשויים גם להיות מתאים. אופטימיזציה כל צעד תשפר את התשואה וטוהרת של מתחמים שנתפסו, אם כי ייתכנו trade-off להתבצע למקסם תכונה זו או אחרת. יישום טיפוסי של לכידת זיקה חוקרת רבים הוא לזהות מועמד interactors vivo עבור מספר קטן של חלבונים בעלי עניין; אלה מועמדים חשופים בדרך כלל אימות על ידי גישות מאונכות in vivo כדי להדגים את המשמעות הביולוגית של interactors הפיסית. לכידת זיקה מועסקת גם על ידי מחקרי תפוקה גבוהה כדי ליצור רשימות של copurifying חלבונים שנצפו על בסיס (כמעט) proteome-רחב, דבר המקל על היקשים חישובית בנוגע משוער מתחמי vivo. דוגמאות רבות של מחקרים כאלה ניתן למצוא בספרות. גישה זו מוותרת אופטימיזציה של התנאי ללכוד עבור כל מטרה שניתן לטובת אדם לחקורמטרות y; ככזה, מתחמי מוסק עצמם בקושי מאוחזרות במלואו ללא פגם טהור מאוד בכל במדגם נתון. במקום זאת, החפיפה חלקית בקומפוזיציות נצפו בין דגימות זיקה שנתפסה ברורים רבים משמשת כבסיס של ההיקשים 42. שתי הגישות לתרום נתונים חשובים להבנתנו של interactome. אף על פי כן, אחד יתרונות גדולים של לכידת זיקה הוא שזה לעתים קרובות מציע את ההזדמנות להשיג את מתחמי שלמים נקיים במיוחד, ובלבד נעשים מאמצים כדי לייעל את ההליך. אנו מאמינים כי העתיד של הגישה טמון בהגדלת הקלות והיעילות של אופטימיזציה של לכידתו של קומפלקסים חלבונים אנדוגניים 11 עבור הערכה מדויקת יותר של מכלול interactors פיזיולוגיים שימוש תכוף יותר ביוכימי נוסף במורד הזרם, enzymological, ומחקרים מבניים, למשל, מפנה 7,9,23.

A correction was made to: Protein Complex Affinity Capture from Cryomilled Mammalian Cells. The References section has been updated from:
<ol start="29">
	<li>Cristea, I. M., &#38; Chait, B. T. Conjugation of magnetic beads for immunopurification of protein complexes. Cold Spring Harbor Protocols. 2011 (5) (2011).</li>
	<li>Rosenberg, I. M. Electrophoretic Techniques. Protein Analysis and Purification. (4), 63&#8211;117 (2005).</li>
	<li>Ornstein, L. Disc Electrophoresis. I. Background and Theory. Ann N Y Acad Sci. 121 (A2), 321&#8211;349 (1964).</li>
	<li>Davis, B. J. Disc Electrophoresis. II. Method and Application to Human Serum Proteins. Ann N Y Acad Sci. 121, 404&#8211;427 (1964).</li>
	<li>Laemmli, U. K. Cleavage of structural proteins during the assembly of the head of bacteriophage T4. Nature. 227 (5259), 680&#8211;685 (1970).</li>
	<li>Shevchenko, A., Tomas, H., Havlis, J., Olsen, J. V., &#38; Mann, M. In-gel digestion for mass spectrometric characterization of proteins and proteomes. Nature protocols. 1 (6), 2856&#8211;2860 (2006).</li>
	<li>DeGrasse, J. A., Kalkum, M., Krutchinsky, A.N., Padovan, J. C., &#38; Zhang, W. MALDI Sample Preparation. rockefeller.edu at &#60;http://prowl.rockefeller.edu/protocols/in-gel-digestion.html&#62; (2006).</li>
	<li>Lubas, M., Christensen, M. S., et al. Interaction profiling identifies the human nuclear exosome targeting complex. Mol Cell. 43 (4), 624&#8211;637 (2011).</li>
	<li>Tackett, A. J., DeGrasse, J. A., Sekedat, M. D., Oeffinger, M., Rout, M. P., &#38; Chait, B. T. I-DIRT, a general method for distinguishing between specific and nonspecific protein interactions. J Proteome Res. 4 (5), 1752&#8211;1756 (2005).</li>
	<li>Wang, X., &#38; Huang, L. Identifying dynamic interactors of protein complexes by quantitative mass spectrometry. Mol Cell Proteomics. 7 (1), 46&#8211;57 (2008).</li>
	<li>Trinkle-Mulcahy, L., Boulon, S., et al. Identifying specific protein interaction partners using quantitative mass spectrometry and bead proteomes. J Cell Biol. 183 (2), 223&#8211;239 (2008).</li>
	<li>Boulon, S., Ahmad, Y., et al. Establishment of a protein frequency library and its application in the reliable identification of specific protein interaction partners. Mol Cell Proteomics. 9 (5), 861&#8211;879 (2010).</li>
	<li>Armean, I. M., Lilley, K. S., &#38; Trotter, M. W. B. Popular computational methods to assess multiprotein complexes derived from label-free affinity purification and mass spectrometry (AP-MS) experiments. Mol Cell Proteomics. 12 (1), 1&#8211;13 (2013).</li>
	<li>Mellacheruvu, D., Wright, Z., et al. The CRAPome: a contaminant repository for affinity purification-mass spectrometry data. Nat Methods. (2013).</li>
	<li>Cheeseman, I. M., &#38; Desai, A. A combined approach for the localization and tandem affinity purification of protein complexes from metazoans. Sci. STKE 2005 (266), pl1 (2005).</li>
	<li>Goldberg, S. Mechanical/physical methods of cell disruption and tissue homogenization. Methods in Molecular Biology. 424 (Chapter 1), 3&#8211;22 (2008).</li>
	<li>Grabski, A. C. Advances in preparation of biological extracts for protein purification. Methods in Enzymology. 463 (C), 285&#8211;303 (2009).</li>
	<li>Dhabaria, A., Cifani, P., Reed, C., Steen, H., &#38; Kentsis, A. A High-Efficiency Cellular Extraction System for Biological Proteomics. J Proteome Res. 14 (8), 3403&#8211;3408 (2015).</li>
	<li>Glatter, T., Ahrn&#233;, E., &#38; Schmidt, A. Comparison of Different Sample Preparation Protocols Reveals Lysis Buffer-Specific Extraction Biases in Gram-Negative Bacteria and Human Cells. J Proteome Res. 15 (2), 679 (2016).</li>
	<li>Zhao, Q.-Q., Yamada, S., &#38; Jimbo, G. The Mechanism and Grinding Limit of Planetary Ball Milling. KONA. 7, 29&#8211;36 (1989).</li>
	<li>Sheng-Yong, L., Qiong-Jing, M., Zheng, P., Xiao-Dong, L., &#38; Jian-Hua, Y. Simulation of ball motion and energy transfer in a planetary ball mill. Chinese Phys. B 21 (7), 078201 (2012).</li>
	<li>Fulton, A. B. How crowded is the cytoplasm? Cell. 30 (2), 345&#8211;347 (1982).</li>
	<li>Ellis, R. J. Macromolecular crowding: obvious but underappreciated. Trends Biochem Sci. 26 (10), 597&#8211;604 (2001).</li>
	<li>Kalkum, M. Using the Retsch MM301 Ball Mill for Cryogenic Disruption of Yeast Cells. 2 City of Hope, (2003).</li>
	<li>Staley, J. Making Whole Cell Extract of Saccharomyces cerevisiae cells using the Retsch MM301 Ball Mill. Retsch GmbH: (2005).</li>
	<li>Bell, A. W., Nilsson, T., Kearney, R. E., &#38; Bergeron, J. J. M. The protein microscope: Incorporating mass spectrometry into cell biology. Nat Methods. 4 (10), 783&#8211;784 (2007).</li>
	<li>Zhao, X., Li, G., &#38; Liang, S. Several affinity tags commonly used in chromatographic purification. J Anal Methods Chem. 2013 (1), 581093&#8211;8 (2013).</li>
	<li>Waugh, D. S. An overview of enzymatic reagents for the removal of affinity tags. 80 (2), 283&#8211;293 (2011).</li>
	<li>Williams, R. J., &#38; Lyman, C. M. A neutral buffered standard for hydrogen ion work and accurate titrations which can be prepared in one minute. J Am Chem Soc. 54 (5), 1911&#8211;1912 (1932).</li>
	<li>Johnson, M. Detergents: Triton X-100, Tween-20, and More. labome.com. 3 (163) (2013).</li>
	<li>Deppert, W. R., &#38; Luka&#265;in, R. Buffers and Additives. Journal of Chromatography Library. 61 (C), 839&#8211;862 (1999).</li>
	<li>Ugwu, S. O., &#38; Apte, S. P. The Effect of Buffers on Protein Conformational Stability. Pharmaceutical Technology. 28 (3), 86&#8211;108 (2004).</li>
	<li>Linke, D. Detergents: an overview. Methods in Enzymology. 463 (34), 603&#8211;617 (2009).</li>
	<li>Zhang, J. Protein-Protein Interactions in Salt Solutions. Protein-Protein Interactions Computational and Experimental Tools. (18), 359&#8211;376 (2012).</li>
</ol>
to:
<ol start="29">
	<li>Ball Mills - Guidelines for sample amount and ball charge. 1&#8211;3at &#60;http://www.retsch.com/products/milling/ball-mills/planetary-ball-mill-pm-100/information-downloads/&#62; Retsch GmbH (2014).</li>
	<li>Cristea, I. M., &#38; Chait, B. T. Conjugation of magnetic beads for immunopurification of protein complexes. Cold Spring Harbor Protocols. 2011 (5) (2011).</li>
	<li>Rosenberg, I. M. Electrophoretic Techniques. Protein Analysis and Purification. (4), 63&#8211;117 (2005).</li>
	<li>Ornstein, L. Disc Electrophoresis. I. Background and Theory. Ann N Y Acad Sci. 121 (A2), 321&#8211;349 (1964).</li>
	<li>Davis, B. J. Disc Electrophoresis. II. Method and Application to Human Serum Proteins. Ann N Y Acad Sci. 121, 404&#8211;427 (1964).</li>
	<li>Laemmli, U. K. Cleavage of structural proteins during the assembly of the head of bacteriophage T4. Nature. 227 (5259), 680&#8211;685 (1970).</li>
	<li>Shevchenko, A., Tomas, H., Havlis, J., Olsen, J. V., &#38; Mann, M. In-gel digestion for mass spectrometric characterization of proteins and proteomes. Nature protocols. 1 (6), 2856&#8211;2860 (2006).</li>
	<li>DeGrasse, J. A., Kalkum, M., Krutchinsky, A.N., Padovan, J. C., &#38; Zhang, W. MALDI Sample Preparation. rockefeller.edu at &#60;http://prowl.rockefeller.edu/protocols/in-gel-digestion.html&#62; (2006).</li>
	<li>Lubas, M., Christensen, M. S., et al. Interaction profiling identifies the human nuclear exosome targeting complex. Mol Cell. 43 (4), 624&#8211;637 (2011).</li>
	<li>Tackett, A. J., DeGrasse, J. A., Sekedat, M. D., Oeffinger, M., Rout, M. P., &#38; Chait, B. T. I-DIRT, a general method for distinguishing between specific and nonspecific protein interactions. J Proteome Res. 4 (5), 1752&#8211;1756 (2005).</li>
	<li>Wang, X., &#38; Huang, L. Identifying dynamic interactors of protein complexes by quantitative mass spectrometry. Mol Cell Proteomics. 7 (1), 46&#8211;57 (2008).</li>
	<li>Trinkle-Mulcahy, L., Boulon, S., et al. Identifying specific protein interaction partners using quantitative mass spectrometry and bead proteomes. J Cell Biol. 183 (2), 223&#8211;239 (2008).</li>
	<li>Boulon, S., Ahmad, Y., et al. Establishment of a protein frequency library and its application in the reliable identification of specific protein interaction partners. Mol Cell Proteomics. 9 (5), 861&#8211;879 (2010).</li>
	<li>Armean, I. M., Lilley, K. S., &#38; Trotter, M. W. B. Popular computational methods to assess multiprotein complexes derived from label-free affinity purification and mass spectrometry (AP-MS) experiments. Mol Cell Proteomics. 12 (1), 1&#8211;13 (2013).</li>
	<li>Mellacheruvu, D., Wright, Z., et al. The CRAPome: a contaminant repository for affinity purification-mass spectrometry data. Nat Methods. (2013).</li>
	<li>Cheeseman, I. M., &#38; Desai, A. A combined approach for the localization and tandem affinity purification of protein complexes from metazoans. Sci. STKE 2005 (266), pl1 (2005).</li>
	<li>Deppert, W. R., &#38; Luka&#265;in, R. Buffers and Additives. Journal of Chromatography Library. 61 (C), 839&#8211;862 (1999).</li>
	<li>Ugwu, S. O., &#38; Apte, S. P. The Effect of Buffers on Protein Conformational Stability. Pharmaceutical Technology. 28 (3), 86&#8211;108 (2004).</li>
	<li>Linke, D. Detergents: an overview. Methods in Enzymology. 463 (34), 603&#8211;617 (2009).</li>
	<li>Zhang, J. Protein-Protein Interactions in Salt Solutions. Protein-Protein Interactions Computational and Experimental Tools. (18), 359&#8211;376 (2012).</li>
	<li>Goldberg, S. Mechanical/physical methods of cell disruption and tissue homogenization. Methods in Molecular Biology. 424 (Chapter 1), 3&#8211;22 (2008).</li>
	<li>Grabski, A. C. Advances in preparation of biological extracts for protein purification. Methods in Enzymology. 463 (C), 285&#8211;303 (2009).</li>
	<li>Dhabaria, A., Cifani, P., Reed, C., Steen, H., &#38; Kentsis, A. A High-Efficiency Cellular Extraction System for Biological Proteomics. J Proteome Res. 14 (8), 3403&#8211;3408 (2015).</li>
	<li>Glatter, T., Ahrn&#233;, E., &#38; Schmidt, A. Comparison of Different Sample Preparation Protocols Reveals Lysis Buffer-Specific Extraction Biases in Gram-Negative Bacteria and Human Cells. J Proteome Res. 15 (2), 679 (2016).</li>
	<li>Zhao, Q.-Q., Yamada, S., &#38; Jimbo, G. The Mechanism and Grinding Limit of Planetary Ball Milling. KONA. 7, 29&#8211;36 (1989).</li>
	<li>Sheng-Yong, L., Qiong-Jing, M., Zheng, P., Xiao-Dong, L., &#38; Jian-Hua, Y. Simulation of ball motion and energy transfer in a planetary ball mill. Chinese Phys. B 21 (7), 078201 (2012).</li>
	<li>Fulton, A. B. How crowded is the cytoplasm? Cell. 30 (2), 345&#8211;347 (1982).</li>
	<li>Ellis, R. J. Macromolecular crowding: obvious but underappreciated. Trends Biochem Sci. 26 (10), 597&#8211;604 (2001).</li>
	<li>Kalkum, M. Using the Retsch MM301 Ball Mill for Cryogenic Disruption of Yeast Cells. 2 City of Hope, (2003).</li>
	<li>Staley, J. Making Whole Cell Extract of Saccharomyces cerevisiae cells using the Retsch MM301 Ball Mill. Retsch GmbH: (2005).</li>
	<li>Bell, A. W., Nilsson, T., Kearney, R. E., &#38; Bergeron, J. J. M. The protein microscope: Incorporating mass spectrometry into cell biology. Nat Methods. 4 (10), 783&#8211;784 (2007).</li>
	<li>Zhao, X., Li, G., &#38; Liang, S. Several affinity tags commonly used in chromatographic purification. J Anal Methods Chem. 2013 (1), 581093&#8211;8 (2013).</li>
	<li>Waugh, D. S. An overview of enzymatic reagents for the removal of affinity tags. 80 (2), 283&#8211;293 (2011).</li>
</ol>

A correction was made to: Protein Complex Affinity Capture from Cryomilled Mammalian Cells. The References section has been updated.

Erratum: Protein Complex Affinity Capture from Cryomilled Mammalian Cells

יישום טיפוסי של שיטות העבודה שהוצגה בפניה הוא לייצב ולקבל תשואה וטוהרת גבוהות של קומפלקסי חלבונים אנדוגניים עניין לאפיון interactomic 1. מובן כי רשתות דינמיות של שני המתחמים ביציבות ויוצר באורח זמני הקשורים macromolecular, בעיקר המורכבים של חלבונים, לתזמר תהליכים תאיים 2,3. אמנם יש גישות ניסיוניות רבות לזיהוי אינטראקציות בין חלבונים, לכידת זיקה היא בין השיטות בשימוש הנרחבות ביותר עבור בידוד לנתח קומפלקסי חלבונים פיסיולוגיים 4-6. יתר על כן, טכניקה זו יש את היתרון של מניב מתחמי macromolecular כישויות פיזיות, לא רק כנקודות הנתונים מתוך לקריאה; לתועלתו, המתחמים שהושגו ניתן אפוא לשמש שורה של ביוכימיים במורד נוסף, אנזימטי, מבחנים מבניים 7-9. הפרוטוקולים שהוצגו פותחו כמענה לצורך למפות proteiרשתות אינטראקציה n-חלבון ולאפיין מתחמי macromolecular בתפקידים שלהם כמו מולקולות מפעיל של ביולוגיה של התא. הם מפורטים ביחס ויישומם בתאי יונקים הגדלים בתרבית רקמה, אך חלו גם על מגוון רחב של דגימות ביולוגיות הנתונות tweaks ספציפי למערכת המתאימה. ההיסטוריה של לכידת זיקה מותחת בחזרה בתחילת המאה עשרים עם הניסויים כרומטוגרפיה immunoaffinity הראשונים - דומה למה שמכונה בדרך כלל בימינו כמו immunoprecipitation (IP) - המופיע בספרות על ידי 1950 המוקדמים. השימוש המרכזי של הטכניקה פיתוח נוסף באמצעות תורו של המאה הזו ועד 10-13 הנוכחי. תאים שונים ומחקרים ביולוגיים מולקולריים יש ניצלה שבירים מכאנית של תאים על ידי כרסום בקירור במשך לפחות בארבעים השנים האחרונות 14-19; והפרדות מולקולריות ניצול (סופר) חרוזי פאראמגנטיים יש BECשת נפוץ יותר ויותר במהלך שני העשורים האחרונים 20. שילוב טכנולוגיות שונות אלה שמש כדי לשפר את תוצאות בסינרגיה שניתן להשיג בניסויים לכידים זיקת חלבון מורכבת 1, כפי שמעיד גוף נרחב של עבודות שתיכתבנה על ידי עצם וקהילת המחקר הרחבה יותר 7,9,11,18,19,21 -23. תוצאות תמיכה מוצגות באיור 1. אוסף של אזהרות ושיקולים החלים על ביצוע ניסויים לכידת זיקה אפקטיבית ניתן למצוא התייחסות 1. בדרך כלל גישה זו היא המתאימה ביותר כדי: (I) לקטלג את interactors של חלבון של עניין, כלומר, להשתמש ספקטרומטריית חלבון מסה (MS) כדי לזהות חלבונים copurifying עד כה לא ידוע (ניתוח גישוש); (II) assay עבור נוכחות של שותף מתנגשות מסוים, כלומר, להשתמש ב- MS או כתם המערבי כדי לזהות חלבון מסוים או קבוצה מוגבלת של חלבונים חשוד בteract עם החלבון של עניין (בדיקת השערות); או (III) להכין קומפלקסי חלבונים מורכבים באופן אנדוגני המכילים את החלבון של עניין למחקר נוסף על ידי טכניקות נוספות (בדיקות preparative). לפני יציאת משטר ניסיוני לכידת זיקה הוא בהחלט הכרחי כדי להיות מגיב זיקה באיכות גבוהה כי נקשר לחלבון היעד, בדרך כלל נוגדן IP-מוסמכות נגד חלבון מטרת יליד הריבית או נגד תג המצורף חלבון היתוך. זה גם קריטי יש בשיטות של הודעה ניסיונית במקום: מכתים חלבון כללי (כגון כחול Coomassie, Sypro רובי, או כסף, SDS-PAGE הבא), מערבי סופגים, וחלבון של טרשת נפוצה כל נפוץ בשילוב עם לכידת זיקה 1. הפרוטוקולים שהוצגו לנצל חרוזים מגנטיים מצומדות נוגדן כמדיום זיקה. בעוד הפונקציה של מדיום הזיקה ניתן תוקף בתחילה בבדיקות לנצל כמה פרמטרים ניסיוניים, כדילהשיג את התוצאות הטובות ביותר כל ניסוי צריך להיות מותאם באופן אמפירי 1,11,24. הפרוטוקולים מופרדים לשלושה שלבים ייחודיים: (1) הכנת חומר תא קפוא; (2) תא שביר על ידי כרסום מצב מוצק בטמפרטורת קריוגני; ו (3) מיצוי חלבון ו לכידת זיקה באמצעות חרוזים פאראמגנטיים מצמידים נוגדנים.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="1304">
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:567px;">Growth media &#38; cell culturing implements</td>
			<td style="width:172px;"></td>
			<td style="width:164px;"></td>
			<td style="width:403px;">For producing frozen cells (I)</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">500 cm^2 culture dishes</td>
			<td style="width:172px;">Corning</td>
			<td>431110</td>
			<td>For producing frozen cells (I)</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Large beaker (1-2L)</td>
			<td style="width:172px;"></td>
			<td></td>
			<td>For producing frozen cells (I)</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Rectangular ice pan&#160;</td>
			<td>Fisher Scientific&#160;</td>
			<td>13-900-747</td>
			<td>For producing frozen cells (I), &#38; cryomilling (II)</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Phosphate buffered saline (PBS)</td>
			<td style="width:172px;"></td>
			<td style="width:164px;"></td>
			<td>For producing frozen cells (I)</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Large cell scrapers</td>
			<td>Fisher Scientific&#160;</td>
			<td>08-100-242</td>
			<td>For producing frozen cells (I)</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Liquid nitrogen&#160;</td>
			<td style="width:172px;"></td>
			<td style="width:164px;"></td>
			<td>For producing frozen cells (I), cryomilling (II), &#38; affinity capture (III)</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:567px;">50 ml conical tubes</td>
			<td>Corning</td>
			<td>352098</td>
			<td>For producing frozen cells (I), &#38; cryomilling (II)</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">20 ml Luer lock syringe</td>
			<td style="width:172px;"></td>
			<td style="width:164px;"></td>
			<td>For producing frozen cells (I)</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Leur lock syringe caps</td>
			<td>www.dymax.com</td>
			<td>T11182</td>
			<td>For producing frozen cells (I)</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Refrigerated centrifuge</td>
			<td style="width:172px;"></td>
			<td style="width:164px;"></td>
			<td>For producing frozen cells (I)</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">50 ml tube rack, 4 position</td>
			<td style="width:172px;"></td>
			<td style="width:164px;"></td>
			<td>For producing frozen cells (I), cryomilling (II), &#38; affinity capture (III)</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Styrofoam box</td>
			<td style="width:172px;"></td>
			<td style="width:164px;"></td>
			<td>For producing frozen cells (I), cryomilling (II), &#38; affinity capture (III)</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Planetary ball mill, PM 100&#160;</td>
			<td>Retsch</td>
			<td>20.540.0001&#160;</td>
			<td>For cryomilling (II)</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Stainless steel milling jar, 50 ml&#160;</td>
			<td>Retsch</td>
			<td>01.462.0149</td>
			<td>For cryomilling (II)</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Stainless steel milling balls, 20 mm &#216;&#160;</td>
			<td>Retsch</td>
			<td>05.368.0062</td>
			<td>For cryomilling (II)</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Lid gasket: PFA encapsulated spring energized seal, 2.62 mm 44.63 mm&#160;&#160;</td>
			<td style="width:172px;">www.marcorubber.com</td>
			<td>T1044-2.62x44.63</td>
			<td>For cryomilling (II)</td>
		</tr>
		<tr height="26">
			<td height="26" style="height:26px;">mini-LN2 decanter</td>
			<td style="width:172px;">homemade</td>
			<td style="width:164px;">see Ref 19</td>
			<td>For cryomilling (II)</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">250 ml PTFE jar insulator (optional)</td>
			<td style="width:172px;">Retsch</td>
			<td style="width:164px;">custom order</td>
			<td>For cryomilling (II)</td>
		</tr>
		<tr height="41">
			<td height="41" style="height:41px;">PTFE puck insulator (optional)</td>
			<td style="width:172px;">homemade</td>
			<td style="width:164px;">The Rockefeller University</td>
			<td>For cryomilling (II); can be produced by The Rockefeller University High Energy Physics Instrument Shop, or design blueprints provided, upon request.</td>
		</tr>
		<tr height="41">
			<td height="41" style="height:41px;">5 bar/500 KPA pressure relief valve (optional)</td>
			<td style="width:172px;">http://www.leeimh.com/</td>
			<td style="width:164px;">558 series check valve</td>
			<td>For cryomilling (II)</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:567px;">1.5 - 2 ml microfuge tubes</td>
			<td style="width:172px;"></td>
			<td style="width:164px;"></td>
			<td>For affinity capture (III)</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:567px;">Extractant</td>
			<td style="width:172px;"></td>
			<td style="width:164px;"></td>
			<td>For affinity capture (III)</td>
		</tr>
		<tr height="41">
			<td height="41" style="height:41px;width:567px;">cOmplete EDTA free protease inhibitor cocktail tablets</td>
			<td style="width:172px;">Roche Applied Science</td>
			<td style="width:164px;">11873580001</td>
			<td style="width:403px;">For affinity capture (III)</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:567px;">Vortex mixer</td>
			<td style="width:172px;"></td>
			<td style="width:164px;"></td>
			<td>For affinity capture (III)</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:567px;">Ice bucket</td>
			<td style="width:172px;"></td>
			<td style="width:164px;"></td>
			<td>For affinity capture (III)</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:567px;">Microtip sonicator, Q700</td>
			<td style="width:172px;">Qsonica</td>
			<td style="width:164px;">Q700</td>
			<td>For affinity capture (III)</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">low intensity 1/16&#8221; microtip probe</td>
			<td style="width:172px;">Qsonica</td>
			<td style="width:164px;">4717</td>
			<td>For affinity capture (III)</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:567px;">Bench-top refrigerated microcentrifuge</td>
			<td style="width:172px;"></td>
			<td style="width:164px;"></td>
			<td>For affinity capture (III)</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:567px;">Dynabeads M-270 Epoxy</td>
			<td style="width:172px;">Thermo Fisher</td>
			<td style="width:164px;">14302D</td>
			<td>For affinity capture (III)</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:567px;">Antibody or affinity ligand coupled to Dynabeads</td>
			<td style="width:172px;">homemade</td>
			<td style="width:164px;"></td>
			<td>For affinity capture (III); see reference 19</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:567px;">Sample rotator&#160;</td>
			<td style="width:172px;"></td>
			<td style="width:164px;"></td>
			<td>For affinity capture (III)</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:567px;">Neodymium magnet</td>
			<td style="width:172px;">Life Technologies</td>
			<td style="width:164px;">123-21D&#160;</td>
			<td>For affinity capture (III)</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:567px;">SDS-PAGE sample buffer (no reducing agent)</td>
			<td style="width:172px;"></td>
			<td style="width:164px;"></td>
			<td>For affinity capture (III)</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:567px;">DTT</td>
			<td style="width:172px;"></td>
			<td style="width:164px;"></td>
			<td>For affinity capture (III)</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:567px;">SDS-PAGE system</td>
			<td style="width:172px;"></td>
			<td style="width:164px;"></td>
			<td>For affinity capture (III)</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:567px;">SDS-polyacrylamide gel</td>
			<td style="width:172px;"></td>
			<td style="width:164px;"></td>
			<td>For affinity capture (III)</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:567px;">Protein Stain</td>
			<td style="width:172px;"></td>
			<td style="width:164px;"></td>
			<td>For affinity capture (III)</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

protein complex affinity capture from cryomilled mammalian cells

לכידת זיקה היא טכניקה יעילה לבידוד קומפלקסי חלבונים אנדוגניים למחקר נוסף. הפועל בשיתוף עם נוגדן, הטכניקה הזו גם הוא מכונה לעתים קרובות כמו immunoprecipitation. ניתן ליישם לכידת זיקה ב בקנה מידה הספסל בהקשר תפוקה גבוהה. כאשר מצמידים עם ספקטרומטריית מסה חלבון, לכידת זיקה הוכיחה להיות סוס עבודה של ניתוח interactome. אמנם יש דרכים רבות פוטנציאל לבצע את הצעדים הרבים המעורבים, הפרוטוקולים הבאים ליישם השיטות המועדפות שלנו. שתי תכונות הם ייחודיות: שימוש אבקת תא cryomilled לייצר תמציות תא, וחרוזי פאראמגנטיים מצמידים נוגדנים כמדיום הזיקה. במקרים רבים, השגנו תוצאות טובות לאלו שהושגו עם שיטות לכידות זיקה קונבנציונליות יותר. Cryomilling ימנע בעיות רבות הקשורות עם צורות אחרות של שבירת תא. הוא מספק שביר ביותר של החומר, תוך הימנעות denatבעיות uration הקשורים חימום או הקצפה. זה שומר על מעלה ריכוז חלבון הילידים עד כדי מיצוי, מקלי דיסוציאציה macromolecular. זה מקטין את זמן חילוץ חלבונים לבלות בתמיסה, הגבלת פעילות אנזימטית מזיקה, והוא עשוי להפחית את הספיחה הלא הספציפית של חלבונים על ידי מדיום הזיקה. מיקרון בקנה מידת מדיה מגנטית זיקה הפכה יותר רגילה לאורך השנים האחרונות, החלפה ויותר agarose- המסורתי מבוססת מדיה Sepharose. יתרונות עיקריים של מדיה מגנטית כוללים בדרך כלל חלבון ספיחה שאינה ספציפית נמוכה; אין גבול הדרת גודל בגלל מורכבות חלבון המחייב מתרחש על פני השטח החרוזים ולא בתוך הנקבוביות; וקלות מניפולציה וטיפול באמצעות מגנטים.

איור 1, לוח הקלט ממחיש כי cryomilling וחרוזים מגנטיים יכולים לעבוד יחד כדי לשפר את איכות המדגם. לוחות IA-C להוכיח כי החומר המרכיב את המדיום מסיס המשמש ללכידת זיקה יכול להשפיע על proteome התאושש 19. החלבון של עניין, phosphatase אלקליין חיידקי FLAG-מתויג מטוהרים (BAP), היה זינק לתוך תמציות תאים אנושיים. BAP אינה צפויה אינטראקציה ספציפית עם copurify חלבונים אנושיים. החתימה של חלבונים copurifying, נשפט על ידי SDS-PAGE ו Coomassie מכתים, מגוונים בהתאם המדיום בשימוש. מיקרון בקנה מידת חרוזים מגנטיים הראו את הפרופיל הנקי, מה שמעיד על רמה נמוכה יחסית של חלבון ספיחה הלא ספציפית. מזהה פאנלים ו- IE להמחיש כי שיטת תמוגה התא יכול גם להשפיע על proteome התאושש. בדוגמה בתנאי, תסביך חלבון אנדוגני (למשנהו מורכבים 37), היה נתון captu זיקהמחדש מתא cyromilled או sonicated תמציות 19. פחות מזהמים גבוהה המוניות נצפו כאשר תמצית התא הופקה מ אבקת תא cryomilled. אתגר בעת השימוש לכיד זיקה ללמוד קומפלקסי חלבונים אנדוגניים הוא שזה עלול להיות קשה להפלות interactors הפיזיולוגי בתום הלב של החלבון של עניין מן התוצאות חיוביות שגויות (FPS). FPS יכול לנבוע ממקורות רבים, כוללים ספיחה הלא ספציפית כדי צינורות וכלי, מדיום הזיקה, ליגנד הנוגדן או זיקה, ו / או לחלבון של העניין עצמו. כתוצאה מכך, מאמץ משמעותי חייב להיות מוקדש אופטימיזציה של תהליך הצילום. הגילוי של FPS עדיין מהווה אתגר מרכזי עבורו מספר רב של כלים שונים פותח, כולל ניסוי 38-40 חישובית גישות 41-43, כל אחד עם יתרונות וחסרונות שונים. בניסויים שלנו אנחנו קודם לכן ציינו דפוס של Fחלבון P כריכה המתקבל לאחר הדגירה של מדיום מגנטי α-FLAG עם תמציות תאים בלתי מבוקרים, כי היה נבדל הדפוס שהושג בנוכחות-tagged חלבוני 3xFLAG. יתר על כן, FPS אלה יוכל להשתחרר מן המדיום ידי הדגירה עם 3xFLAG פפטיד 7. תצפית זו עולה בקנה אחד עם אופורטוניסטים עקדת FPS אל paratope-FLAG α בהעדר של epitope מאותו מקור. הבנת מהות רקע FP זה חשוב מאחר ומחקרים רבים להשתמש &quot;שורת תא הורית מתויגת כביקורת מדומה עבור לכידת זיקה; בקרות אלו עשויות להיות ראויים לקבוע את הספציפיות של אינטראקציות עם החלבון המתויג. כדי לקבוע את רקע כריכה שנתרמה על ידי בינוני הזיקה שלנו כאשר paratopes נוגדן תפוס או לא, ערכנו ניסויים לכידי זיקה מדומה באמצעות מדיום מגנטי-FLAG α ותמציות תא HEK 293T (לא חלבון מתויג הביע) בנוכחות או בהעדר 3xFLAGספייק בפפטיד. התוצאות מוצגות באיור 1, פאנל II. בקצרה, בינוני מגנטי-FLAG α הודגר תמציות התא (של ≳10 מ&quot;ג / החלבון הכולל מ&quot;ל) המכיל 500 mM NaCl ו 1% v / v טריטון X-100 ב 20 מ&quot;מ HEPES-Na pH 7.4 למשך 30 דקות. המדיום הודגר אז עם 1 מ&quot;ג / מ&quot;ל ​​פפטיד 3xFLAG לעקור כל החלבונים תחרותי מאוגד paratope α-FLAG מקורי או עם חיץ מדגם SDS-PAGE כדי להשיג elution denaturing. בנוסף, את אותו הניסוי בוצע כאשר תמציות התא היו מתובל 1 מיקרוגרם / מ&quot;ל ​​ו -10 מיקרוגרם / מ&quot;ל ​​של הפפטיד 3xFLAG. כל שברי eluted היו נתוני SDS-PAGE ו מכתים כסף. הבחנו כי בהעדר epitope מאותו המקור שלה, בינוני α-FLAG אין ללכוד ברמה לגילוי של חלבוני רקע שניתן eluted עם פפטיד 3xFLAG - בדוגמא שמספקת איור 1-II, זן דומיננטי נצפה בין 37 ו 50 kDa. דפוס eluted עםSDS-PAGE חיץ המדגם היה דומה, עם מינים בולטים נוספים. עם זאת, בנוכחות פפטיד 1 מיקרוגרם / מ&quot;ל ​​3xFLAG, FP מחייב למדיום זיקה חוסל אל מתחת לרמה של איתור לא נצפתה באחד משני שברים elution יליד או denaturing. תוצאה זו מרמזת כי paratopes נוגדן הפנוי יכול להיות מופקר בהעדר epitope מאותו המקור שלהם התרומה משמעותית proteome שהושג במהלך לכידת זיקה אפילו עבור נוגדנים נקשרים epitope שלהם זיקה גבוהה, כמו במקרה של M2 3xFLAG / α-FLAG צִמוּד. כמו כן suggestd כי תנאים מחמירים מאוד באמצעות מלח גבוה, לעתים קרובות נבחר כדי להמתיק את הלא ספציפי מחייב, עלולים להיות לא יעילים בהעדר אינטראקצית אנטיגן / הנוגדן. כדי ומעקב ביצע לנו ניתוח כולל ניסוי דומה על ידי SDS-PAGE וכן כמותית MS (איור. S1). של 347 חלבונים לכמת, צפינו שכל חלבון למעט אחד (דיסקו שוואשיעור מאוד = 1%; S1 טבלה) היה קשור עם חלבון הפיתיון מתויג 3xFLAG לעומת פפטיד 3xFLAG ממוסמר מדגם שליטה. תוצאות אלו מצביעות כי בניסויים שלנו הרוב המכריע של חלבונים ציינו צפויים לשתף לטהר עם החלבון המתויג או מחוץ יעד תוצרי לוואי של paratopes α-FLAG הפנוי. מניסיוננו, אות לרעש גבוהה בתוצאות לכידות זיקה מודגמות ב SDS-PAGE ו מכתים חלבון ידי דפוס דיסקרטי של להקות חדות, שופעות בערך stoichiometric כמו גם מיעוט מכתים רקע מלהקות חוורים אחרות; לדוגמא רבה של עיקרון זה ניתן לראות התייחסות 11. המניע באמצעות מבודד PTFE (אשר מומלץ) כאשר cryomilling היא להפחית את קצב ההתחממות של צנצנת במהלך טחינה, להקטין את נטל קירור LN 2 חזר במהלך תהליך הטחינה, ולהפחית את מידת קרחהיווצרות בצנצנת. זה הופך לפשוט יותר ביצועי כרסום עקביים מקל על הטיפול של אבקת התא. מבודדת דוגמא ניתן למצוא התייחסות 27 (pucks) ו מתואר באיור 2, להלן (שרוול-ו-דיסקוס). <img alt="איור 1" src="/files/ftp_upload/54518/54518fig1.jpg" /> איור 1: בחר נציג תוצאות. (I) פאנל זה כבר שונה מההתייחסות 19. Coomassie כחול מוכתם ג&#39;ל SDS-polyacrylamide. (משמאל) חרוזים מגנטי מיקרון בקנה מידה להיראות נמוכים מחוץ יעד מחייב מאשר תקשורת agarose המבוסס. (א) חרוזים מגנטיים; (ב) agarose המסורתית; (C) ברזל ספוג (מגנטי) agarose; כל מצמידים נוגדנים נגד FLAG M2 ו המשמש ללכידת phosphatase אלקליין חיידקי FLAG-מתויג (BAP; שכותרתו) זינק לתוך תמציות המיוצר מתאי cryomilled HEK-293. purifications Agarose המבוססהראה רמות גבוהות יותר של ספיחה שאינה ספציפית (להקות תווית). (מימין) תמציות מיוצרות מתאי cryomilled הלה מפגינים ספיחה מחוץ היעד תחתונה על חרוזים מגנטיים מצמיד נוגדנים מאלה המיוצרים על ידי sonication כאשר נעשה שימוש כדי לטהר תסביך חלבון אנדוגני. LAP-tagged 44 RBM7 היה זיקה שנתפסו באמצעות חרוזים מגנטיים מצמידים נוגדנים אנטי GFP polyclonal לטהר את 19,37 מורכבים הבא (D) חלץ המופק אבקת cryomilled; (E) תמציות המיוצר על ידי sonication של תאים שלמים. הפס השחור האנכי מדגיש אזור של הג&#39;ל שבו interactors הלא ספציפית מסה גבוהה הם נצפו להיות מועשרים במדגם שהכין sonication. החיצים השחורים הצביעו על interactors הספציפי הצפוי (שכותרתו). להקות ציינו ~ 50 kDa במסלולי D ו- E הן המיוחס שרשרות כבדות הלמה IgG. (II) כסף מוכתם ג&#39;ל SDS-polyacrylamide. (Std.) לכידת זיקה מדומה שבוצעה על HEK-293T תא התמציות באופן הסטנדרטי. לאחר לכידת, elution של החומר כבול הושג באמצעות (N) elution הלא denaturing עם 1 מ&quot;ג / מ&quot;ל ​​3xFLAG פפטיד או (ד) denaturing elution במאגר מדגם SDS-PAGE; (PB 1) כפי Std. אבל הפפטיד 3xFLAG נכלל פתרון החילוץ ב מיליליטר 1 מיקרוגרם / לחסום את paratopes-FLAG α על מדיום הזיקה; (PB 10) כמו PB 1 אך בנוכחות של 10 מיקרוגרם / מ&quot;ל ​​פפטיד 3xFLAG. IgG הקשורות להקות פפטיד 3xFLAG מסומנים. <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/54518/54518fig1large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.</a> <img alt="איור 2" src="/files/ftp_upload/54518/54518fig2.jpg" /> איור 2: שרוול-ו-דיסקוס מבודד PTFE. צנצנת PTFE 250 מ&quot;ל מוצג (1). צנצנת טחינה נירוסטה 50 מ&quot;ל (2) מתאים בתוך הצנצנת PTFE (3) ומספקתהזדמנות לעזוב את צנצנת הטחינה המותקנת בתוך הטחנה בין מחזורי. דיסקוס מבודד PTFE עליון (2) משמש בין ההרכבה מהדק ואת מכסה הצנצנת. כדי לקרר את הרכבת הצנצנת מבודדת מותקן (3), LN 2 הוא הוסיף ישירות לתוך הגוף של המבודד, המקיף את הצנצנת. המחזור הבא של טחינה יכול להיות יזם אז. <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/54518/54518fig2large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.</a> <table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always" style=";text-align:right;direction:rtl"><tbody><tr><td> מֵגִיב </td><td> ריכוז מוצע </td><td> הערות </td></tr><tr><td> נתרן כלורי </td><td> 0.1-0.5 M </td><td> ריכוזים גבוהים (&gt; 300 מ&quot;מ) נוטים לשפר את המיצוי של חלבון הכולל ולשמור רקע נמוך, אך הוא עשוי להתפשט משם כמה היתר יציב אחרתשחקנים. ריכוזים מתחת 150 מ&quot;מ אינם בדרך כלל יעיל להפחתת הלא ספציפית רקע. </td></tr><tr><td> אמוניום אצטט </td><td> 0.2-2 M </td><td> מלח, מורכב משני מאגרים, כי תשואות פתרון pH ניטראלי 57. ריכוזים גבוהים יותר לייצב כמה קומפלקסים חלבונים. פתרונות חומציים יכולים לנבוע ישנות, מניות גבישים מאוחסנות כראוי על חשבון הפסד אמוניה. אין חיץ או מלחים pH נוסף נדרש extractants המכיל אמוניום יצטט. ניתן לשלב עם NaCl לווסת התוצאות שהתקבלו. </td></tr><tr><td> Tween 20 </td><td> 0.1% v / v </td><td> חומר ניקוי שאינו יוני 58; בדרך כלל בשילוב עם NaCl. </td></tr><tr><td> טריטון X-100 </td><td> נ 0.5-1% / v </td><td> חומר ניקוי שאינו יוני 58; בדרך כלל בשילוב עם או NaCl או NH 4 CH 3 CO 2 H </td></tr><tr><td> בחורים </td><td> 5 מ&quot;מ </td><td> חומר ניקוי zwitterionic 58 &lt;/ Sup&gt;; בדרך כלל בשילוב עם NaCl. </td></tr><tr><td> Sarkosyl </td><td> 1 מ&quot;מ </td><td> חומר ניקוי anionic 58 מפחיתת רקע ויכול לערטל רכיבים מורכבים יציבים, פוטנציאל חושף קישוריות בינארי; בדרך כלל בשילוב עם NaCl. </td></tr><tr><td rowspan="2"> טריס-Cl </td><td> 20 מ&quot;מ </td><td rowspan="2"> PK א &#39;8.8 ב 4 ° C, 8.1 במהירות של 25 ° C. </td></tr><tr><td> (PH 8.0) </td></tr><tr><td rowspan="2"> HEPES-Na </td><td> 20 מ&quot;מ </td><td rowspan="2"> PK א &#39;7.8 ב 4 ° C, 7.5 במהירות של 25 ° C. NaOH או KOH המשמש איזון pH תלוי מלח (למשל, NaCl, KCl, או CH 3 CO 2 K) המשמשים extractant. </td></tr><tr><td> (PH 7.4) </td></tr></tbody></table> טבלה 1: כמה הציע ריאגנטים שימושי לטיהור קומפלקסים חלבונים. l טבלה זוists כמה ריאגנטים שמצאנו שימושי עבור קומפלקסי חלבונים לטיהור מ שורות תאים אנושיות, עם ריכוז עובדים שהציע. ניסוח extractant טיפוסי מכיל חיץ pH, מלח, וחומר ניקוי 1,11,24,45-48. השיטה המומלצת היא לזהות את השילוב המורכב לפחות של ריאגנטים כי מניב את התוצאה הרצויה. <img alt="איור S1" src="/files/ftp_upload/54518/54518figS1.jpg" /> S1 איור: מערבבים לאחר טיהור (של מיפוי) ניתוח SILAC של תוצאות חיוביות שגויות. I. סכמטי תרשים: בניסוי זה 3xFLAG מתויג ORF2p קומפלקסים חלבונים (לידי ביטוי מתוך pLD401) היו מטוהרים מן כבד-הראש ו שכותרתו אור HEK-293T תאים 7, בהתאמה. התמצית תא שכותרתו האור ומשובץ פפטיד 3xFLAG למנוע לכידת הזיקה של ORF2p 3xFLAG מתויג על ידי עיכוב תחרותי; זה לא צפוי לחסום את הכריכה של חלבונים שעלולים להתרחש-ספציפי שאינוקאלי עם המדיום המגנטי או המבנים הלא paratopic של הנוגדן. לאחר elution מן החרוזים המגנטיים, הדגימות הכבדות וקלות היו טיהור פוסט מעורבת ונותח על ידי כמותית MS (MAP-SILAC 39) כדי לקבוע את החלק היחסי של חלבונים הקשורים מדגם או; פרט מתודולוגיים נוסף ממוקם בטבלה S1. II. כסף מוכתם ג&#39;ל הממחיש כי חומרי האור וכבדים שכותרתו להניב תוצאות דומות (השווה L עם H), וכי הטיהור שנערכה בנוכחות של ספייק-ב 3xFLAG (LI) חלה עיכוב תחרותי. להלן, תקע המוכתם ג&#39;ל Coomassie הכחול G-250 מורכב של H המעורב ושברי LI, לפני ניתוח proteomic מבוסס ג&#39;ל, כמתואר בטבלה S1. <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/54518/54518figS1large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי להוריד גרסה גדולה יותר של דמות זו.</a> לוח S1:MAP-SILAC. גיליון זה כולל את הנתונים שהתקבלו על ביצוע ניסוי MAP-SILAC המתואר בתרשים S1. <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/54518/Table_S1.xlsx" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי להוריד את הטבלה.</a>

Watch this Scientific Journal Video about Protein Complex Affinity Capture from Cryomilled Mammalian Cells at JoVE.com

Protein Complex Affinity Capture from Cryomilled Mammalian Cells

כאן אנו מתארים פרוטוקולים לשבש בתאי יונקים ידי כרסום מצב מוצק בטמפרטורה קריוגני, לייצר תמצית התא מן אבקת התא וכתוצאה מכך, ולבודד קומפלקסים חלבונים של עניין על ידי לכידת זיקה על חרוזים פאראמגנטיים בקנה מידה מיקרון מצמידים נוגדנים.

לכידת חלבון זיקה מורכבת מ בתאי יונקי Cryomilled

Affinity capture is an effective technique for isolating endogenous protein complexes for further study. When used in conjunction with an antibody, this ...

Research

JoVE Journal

Biochemistry

Tandem Affinity Purification of Protein Complexes from Eukaryotic Cells

טיהור טנדם זיקה של קומפלקסי חלבונים מתאים איקריוטיים

The purification of active protein-protein and protein-nucleic acid complexes is crucial for the characterization of enzymatic activities and de novo ...

Resolving Affinity Purified Protein Complexes by Blue Native PAGE and Protein Correlation Profiling

פתרון מתחמי פרוטאין טהור זיקה לפי דף Native הכחול פרופיל מתאם חלבון

Most proteins act in association with others; hence, it is crucial to characterize these functional units in order to fully understand biological ...

mRNA Interactome Capture from Plant Protoplasts

MRNA Interactome ללכוד מן Protoplasts הצמח

RNA-binding proteins (RBPs) determine the fates of RNAs. They participate in all RNA biogenesis pathways and especially contribute to post-transcriptional ...

Biochemical and Structural Characterization of the Carbohydrate Transport Substrate-binding-protein SP0092

אפיון הביוכימי ומבניים של SP0092 המצע-מחייב-חלבון פחמימות תחבורה

Development of new antimicrobials and vaccines for Streptococcus pneumoniae (pneumococcus) are necessary to halt the rapid rise in multiple resistant ...

Toeprinting Analysis of Translation Initiation Complex Formation on Mammalian mRNAs

ניתוח Toeprinting של תרגום חניכה היווצרות מורכבות על יונקים mRNAs

Translation initiation is the rate-limiting step of protein synthesis and represents a key point at which cells regulate their protein output. Regulation ...

2 in 1: One-step Affinity Purification for the Parallel Analysis of Protein-Protein and Protein-Metabolite Complexes

2 ב 1: בשלב אחד טיהור זיקה לניתוח מקבילים של חלבון, מתחמי חלבון-מטבוליט

Cellular processes are regulated by interactions between biological molecules such as proteins, metabolites, and nucleic acids. While the investigation of ...

Translating Ribosome Affinity Purification (TRAP) for RNA Isolation from Endothelial Cells In Vivo

Translating Ribosome Affinity Purification TRAP for RNA Isolation from Endothelial Cells In Vivo

תרגום הריבוכמה אהדה לטיהור (מלכודת) לבידוד רנ א מתאי האנדותל בvivo

Many studies have been limited to using in vitro cellular assays and whole tissues or isolating of specific cell types from animals for in vitro analysis ...

Activated Cross-linked Agarose for the Rapid Development of Affinity Chromatography Resins - Antibody Capture as a Case Study

הופעל מקושרת צולבת מקושרת לפיתוח מהיר של שרפים כרומטוגרפיה של אהדה-לכידת נוגדן כמחקר מקרה

The purification of monoclonal antibodies (mAbs) is commonly achieved by Protein A affinity chromatography, which can account for up to 25% of the overall ...

Detection of Protein S-Acylation using Acyl-Resin Assisted Capture

זיהוי חלבון S-אכלציה באמצעות לכידת הסיוע Acylation-שרף

Protein S-acylation, also referred to as S-palmitoylation, is a reversible post-translational modification of cysteine residues with long-chain fatty ...

Purification of Ubiquitinated p53 Proteins from Mammalian Cells

טיהור של חלבוני p53 הנמצאים בכל מקום מתאי יונקים

Ubiquitination is a type of posttranslational modification that regulates not only the stability but also the localization and function of a substrate ...