Name: protein complex affinity capture from cryomilled mammalian cells
Uploaded: 2016-12-09T13:00:00
Duration: 10 min 37 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Protein Complex Affinity Capture from Cryomilled Mammalian Cells at JoVE.com

हम अपने अमूल्य सलाह, समर्थन, और एमएस इंस्ट्रूमेंटेशन के लिए उत्कृष्ट तकनीकी सहायता के लिए पहुँच है, साथ ही सुश्री केली आर Molloy के लिए प्रोफेसर ब्रायन टी Chait धन्यवाद। हम कॉपी संपादन के साथ समर्थन के लिए सुश्री केली नंगे धन्यवाद। यह काम एनआईएच अनुदान P41GM109824, P41GM103314, और P50GM107632 द्वारा समर्थित किया गया था।

The authors declare that they have no competing financial interests.

A correction was made to: Protein Complex Affinity Capture from Cryomilled Mammalian Cells. The References section has been updated from:
<ol start="29">
	<li>Cristea, I. M., &#38; Chait, B. T. Conjugation of magnetic beads for immunopurification of protein complexes. Cold Spring Harbor Protocols. 2011 (5) (2011).</li>
	<li>Rosenberg, I. M. Electrophoretic Techniques. Protein Analysis and Purification. (4), 63&#8211;117 (2005).</li>
	<li>Ornstein, L. Disc Electrophoresis. I. Background and Theory. Ann N Y Acad Sci. 121 (A2), 321&#8211;349 (1964).</li>
	<li>Davis, B. J. Disc Electrophoresis. II. Method and Application to Human Serum Proteins. Ann N Y Acad Sci. 121, 404&#8211;427 (1964).</li>
	<li>Laemmli, U. K. Cleavage of structural proteins during the assembly of the head of bacteriophage T4. Nature. 227 (5259), 680&#8211;685 (1970).</li>
	<li>Shevchenko, A., Tomas, H., Havlis, J., Olsen, J. V., &#38; Mann, M. In-gel digestion for mass spectrometric characterization of proteins and proteomes. Nature protocols. 1 (6), 2856&#8211;2860 (2006).</li>
	<li>DeGrasse, J. A., Kalkum, M., Krutchinsky, A.N., Padovan, J. C., &#38; Zhang, W. MALDI Sample Preparation. rockefeller.edu at &#60;http://prowl.rockefeller.edu/protocols/in-gel-digestion.html&#62; (2006).</li>
	<li>Lubas, M., Christensen, M. S., et al. Interaction profiling identifies the human nuclear exosome targeting complex. Mol Cell. 43 (4), 624&#8211;637 (2011).</li>
	<li>Tackett, A. J., DeGrasse, J. A., Sekedat, M. D., Oeffinger, M., Rout, M. P., &#38; Chait, B. T. I-DIRT, a general method for distinguishing between specific and nonspecific protein interactions. J Proteome Res. 4 (5), 1752&#8211;1756 (2005).</li>
	<li>Wang, X., &#38; Huang, L. Identifying dynamic interactors of protein complexes by quantitative mass spectrometry. Mol Cell Proteomics. 7 (1), 46&#8211;57 (2008).</li>
	<li>Trinkle-Mulcahy, L., Boulon, S., et al. Identifying specific protein interaction partners using quantitative mass spectrometry and bead proteomes. J Cell Biol. 183 (2), 223&#8211;239 (2008).</li>
	<li>Boulon, S., Ahmad, Y., et al. Establishment of a protein frequency library and its application in the reliable identification of specific protein interaction partners. Mol Cell Proteomics. 9 (5), 861&#8211;879 (2010).</li>
	<li>Armean, I. M., Lilley, K. S., &#38; Trotter, M. W. B. Popular computational methods to assess multiprotein complexes derived from label-free affinity purification and mass spectrometry (AP-MS) experiments. Mol Cell Proteomics. 12 (1), 1&#8211;13 (2013).</li>
	<li>Mellacheruvu, D., Wright, Z., et al. The CRAPome: a contaminant repository for affinity purification-mass spectrometry data. Nat Methods. (2013).</li>
	<li>Cheeseman, I. M., &#38; Desai, A. A combined approach for the localization and tandem affinity purification of protein complexes from metazoans. Sci. STKE 2005 (266), pl1 (2005).</li>
	<li>Goldberg, S. Mechanical/physical methods of cell disruption and tissue homogenization. Methods in Molecular Biology. 424 (Chapter 1), 3&#8211;22 (2008).</li>
	<li>Grabski, A. C. Advances in preparation of biological extracts for protein purification. Methods in Enzymology. 463 (C), 285&#8211;303 (2009).</li>
	<li>Dhabaria, A., Cifani, P., Reed, C., Steen, H., &#38; Kentsis, A. A High-Efficiency Cellular Extraction System for Biological Proteomics. J Proteome Res. 14 (8), 3403&#8211;3408 (2015).</li>
	<li>Glatter, T., Ahrn&#233;, E., &#38; Schmidt, A. Comparison of Different Sample Preparation Protocols Reveals Lysis Buffer-Specific Extraction Biases in Gram-Negative Bacteria and Human Cells. J Proteome Res. 15 (2), 679 (2016).</li>
	<li>Zhao, Q.-Q., Yamada, S., &#38; Jimbo, G. The Mechanism and Grinding Limit of Planetary Ball Milling. KONA. 7, 29&#8211;36 (1989).</li>
	<li>Sheng-Yong, L., Qiong-Jing, M., Zheng, P., Xiao-Dong, L., &#38; Jian-Hua, Y. Simulation of ball motion and energy transfer in a planetary ball mill. Chinese Phys. B 21 (7), 078201 (2012).</li>
	<li>Fulton, A. B. How crowded is the cytoplasm? Cell. 30 (2), 345&#8211;347 (1982).</li>
	<li>Ellis, R. J. Macromolecular crowding: obvious but underappreciated. Trends Biochem Sci. 26 (10), 597&#8211;604 (2001).</li>
	<li>Kalkum, M. Using the Retsch MM301 Ball Mill for Cryogenic Disruption of Yeast Cells. 2 City of Hope, (2003).</li>
	<li>Staley, J. Making Whole Cell Extract of Saccharomyces cerevisiae cells using the Retsch MM301 Ball Mill. Retsch GmbH: (2005).</li>
	<li>Bell, A. W., Nilsson, T., Kearney, R. E., &#38; Bergeron, J. J. M. The protein microscope: Incorporating mass spectrometry into cell biology. Nat Methods. 4 (10), 783&#8211;784 (2007).</li>
	<li>Zhao, X., Li, G., &#38; Liang, S. Several affinity tags commonly used in chromatographic purification. J Anal Methods Chem. 2013 (1), 581093&#8211;8 (2013).</li>
	<li>Waugh, D. S. An overview of enzymatic reagents for the removal of affinity tags. 80 (2), 283&#8211;293 (2011).</li>
	<li>Williams, R. J., &#38; Lyman, C. M. A neutral buffered standard for hydrogen ion work and accurate titrations which can be prepared in one minute. J Am Chem Soc. 54 (5), 1911&#8211;1912 (1932).</li>
	<li>Johnson, M. Detergents: Triton X-100, Tween-20, and More. labome.com. 3 (163) (2013).</li>
	<li>Deppert, W. R., &#38; Luka&#265;in, R. Buffers and Additives. Journal of Chromatography Library. 61 (C), 839&#8211;862 (1999).</li>
	<li>Ugwu, S. O., &#38; Apte, S. P. The Effect of Buffers on Protein Conformational Stability. Pharmaceutical Technology. 28 (3), 86&#8211;108 (2004).</li>
	<li>Linke, D. Detergents: an overview. Methods in Enzymology. 463 (34), 603&#8211;617 (2009).</li>
	<li>Zhang, J. Protein-Protein Interactions in Salt Solutions. Protein-Protein Interactions Computational and Experimental Tools. (18), 359&#8211;376 (2012).</li>
</ol>
to:
<ol start="29">
	<li>Ball Mills - Guidelines for sample amount and ball charge. 1&#8211;3at &#60;http://www.retsch.com/products/milling/ball-mills/planetary-ball-mill-pm-100/information-downloads/&#62; Retsch GmbH (2014).</li>
	<li>Cristea, I. M., &#38; Chait, B. T. Conjugation of magnetic beads for immunopurification of protein complexes. Cold Spring Harbor Protocols. 2011 (5) (2011).</li>
	<li>Rosenberg, I. M. Electrophoretic Techniques. Protein Analysis and Purification. (4), 63&#8211;117 (2005).</li>
	<li>Ornstein, L. Disc Electrophoresis. I. Background and Theory. Ann N Y Acad Sci. 121 (A2), 321&#8211;349 (1964).</li>
	<li>Davis, B. J. Disc Electrophoresis. II. Method and Application to Human Serum Proteins. Ann N Y Acad Sci. 121, 404&#8211;427 (1964).</li>
	<li>Laemmli, U. K. Cleavage of structural proteins during the assembly of the head of bacteriophage T4. Nature. 227 (5259), 680&#8211;685 (1970).</li>
	<li>Shevchenko, A., Tomas, H., Havlis, J., Olsen, J. V., &#38; Mann, M. In-gel digestion for mass spectrometric characterization of proteins and proteomes. Nature protocols. 1 (6), 2856&#8211;2860 (2006).</li>
	<li>DeGrasse, J. A., Kalkum, M., Krutchinsky, A.N., Padovan, J. C., &#38; Zhang, W. MALDI Sample Preparation. rockefeller.edu at &#60;http://prowl.rockefeller.edu/protocols/in-gel-digestion.html&#62; (2006).</li>
	<li>Lubas, M., Christensen, M. S., et al. Interaction profiling identifies the human nuclear exosome targeting complex. Mol Cell. 43 (4), 624&#8211;637 (2011).</li>
	<li>Tackett, A. J., DeGrasse, J. A., Sekedat, M. D., Oeffinger, M., Rout, M. P., &#38; Chait, B. T. I-DIRT, a general method for distinguishing between specific and nonspecific protein interactions. J Proteome Res. 4 (5), 1752&#8211;1756 (2005).</li>
	<li>Wang, X., &#38; Huang, L. Identifying dynamic interactors of protein complexes by quantitative mass spectrometry. Mol Cell Proteomics. 7 (1), 46&#8211;57 (2008).</li>
	<li>Trinkle-Mulcahy, L., Boulon, S., et al. Identifying specific protein interaction partners using quantitative mass spectrometry and bead proteomes. J Cell Biol. 183 (2), 223&#8211;239 (2008).</li>
	<li>Boulon, S., Ahmad, Y., et al. Establishment of a protein frequency library and its application in the reliable identification of specific protein interaction partners. Mol Cell Proteomics. 9 (5), 861&#8211;879 (2010).</li>
	<li>Armean, I. M., Lilley, K. S., &#38; Trotter, M. W. B. Popular computational methods to assess multiprotein complexes derived from label-free affinity purification and mass spectrometry (AP-MS) experiments. Mol Cell Proteomics. 12 (1), 1&#8211;13 (2013).</li>
	<li>Mellacheruvu, D., Wright, Z., et al. The CRAPome: a contaminant repository for affinity purification-mass spectrometry data. Nat Methods. (2013).</li>
	<li>Cheeseman, I. M., &#38; Desai, A. A combined approach for the localization and tandem affinity purification of protein complexes from metazoans. Sci. STKE 2005 (266), pl1 (2005).</li>
	<li>Deppert, W. R., &#38; Luka&#265;in, R. Buffers and Additives. Journal of Chromatography Library. 61 (C), 839&#8211;862 (1999).</li>
	<li>Ugwu, S. O., &#38; Apte, S. P. The Effect of Buffers on Protein Conformational Stability. Pharmaceutical Technology. 28 (3), 86&#8211;108 (2004).</li>
	<li>Linke, D. Detergents: an overview. Methods in Enzymology. 463 (34), 603&#8211;617 (2009).</li>
	<li>Zhang, J. Protein-Protein Interactions in Salt Solutions. Protein-Protein Interactions Computational and Experimental Tools. (18), 359&#8211;376 (2012).</li>
	<li>Goldberg, S. Mechanical/physical methods of cell disruption and tissue homogenization. Methods in Molecular Biology. 424 (Chapter 1), 3&#8211;22 (2008).</li>
	<li>Grabski, A. C. Advances in preparation of biological extracts for protein purification. Methods in Enzymology. 463 (C), 285&#8211;303 (2009).</li>
	<li>Dhabaria, A., Cifani, P., Reed, C., Steen, H., &#38; Kentsis, A. A High-Efficiency Cellular Extraction System for Biological Proteomics. J Proteome Res. 14 (8), 3403&#8211;3408 (2015).</li>
	<li>Glatter, T., Ahrn&#233;, E., &#38; Schmidt, A. Comparison of Different Sample Preparation Protocols Reveals Lysis Buffer-Specific Extraction Biases in Gram-Negative Bacteria and Human Cells. J Proteome Res. 15 (2), 679 (2016).</li>
	<li>Zhao, Q.-Q., Yamada, S., &#38; Jimbo, G. The Mechanism and Grinding Limit of Planetary Ball Milling. KONA. 7, 29&#8211;36 (1989).</li>
	<li>Sheng-Yong, L., Qiong-Jing, M., Zheng, P., Xiao-Dong, L., &#38; Jian-Hua, Y. Simulation of ball motion and energy transfer in a planetary ball mill. Chinese Phys. B 21 (7), 078201 (2012).</li>
	<li>Fulton, A. B. How crowded is the cytoplasm? Cell. 30 (2), 345&#8211;347 (1982).</li>
	<li>Ellis, R. J. Macromolecular crowding: obvious but underappreciated. Trends Biochem Sci. 26 (10), 597&#8211;604 (2001).</li>
	<li>Kalkum, M. Using the Retsch MM301 Ball Mill for Cryogenic Disruption of Yeast Cells. 2 City of Hope, (2003).</li>
	<li>Staley, J. Making Whole Cell Extract of Saccharomyces cerevisiae cells using the Retsch MM301 Ball Mill. Retsch GmbH: (2005).</li>
	<li>Bell, A. W., Nilsson, T., Kearney, R. E., &#38; Bergeron, J. J. M. The protein microscope: Incorporating mass spectrometry into cell biology. Nat Methods. 4 (10), 783&#8211;784 (2007).</li>
	<li>Zhao, X., Li, G., &#38; Liang, S. Several affinity tags commonly used in chromatographic purification. J Anal Methods Chem. 2013 (1), 581093&#8211;8 (2013).</li>
	<li>Waugh, D. S. An overview of enzymatic reagents for the removal of affinity tags. 80 (2), 283&#8211;293 (2011).</li>
</ol>

A correction was made to: Protein Complex Affinity Capture from Cryomilled Mammalian Cells. The References section has been updated.

Erratum: Protein Complex Affinity Capture from Cryomilled Mammalian Cells

प्रस्तुत प्रक्रियाओं का एक विशिष्ट आवेदन interactomic लक्षण वर्णन 1 के लिए स्थिर और एक उच्च उपज और ब्याज की अंतर्जात प्रोटीन परिसरों की पवित्रता को प्राप्त करने के लिए है। समझा जाता है कि दोनों stably और क्षणिक जुड़े macromolecular परिसर, मुख्यतः प्रोटीन के शामिल के गतिशील नेटवर्क, सेलुलर प्रक्रियाओं 2,3 आर्केस्ट्रा। जबकि वहाँ प्रोटीन, प्रोटीन बातचीत की पहचान करने के लिए कई प्रयोगात्मक दृष्टिकोण हैं, संबंध कब्जा अलग और शारीरिक प्रोटीन परिसरों 4-6 विदारक के लिए सबसे व्यापक रूप से इस्तेमाल किया तरीकों में से एक है। इसके अलावा, इस तकनीक को न सिर्फ एक पढ़ने के लिए बाहर में डेटा बिंदुओं के रूप में भौतिक संस्थाओं, के रूप में macromolecular परिसर उपज का लाभ दिया है; हितकर, प्राप्त परिसरों इस प्रकार अतिरिक्त बहाव के जैव रासायनिक, एंजाइमी, और संरचनात्मक assays 7-9 की मेजबानी में इस्तेमाल किया जा सकता है। प्रस्तुत प्रोटोकॉल protei नक्शा करने के लिए जरूरत के जवाब में विकसित किया गया हैn, प्रोटीन बातचीत नेटवर्क और कोशिका जीव विज्ञान के प्रेरक अणुओं के रूप में उनकी भूमिकाओं में macromolecular परिसर की विशेषताएँ। वे ऊतक संस्कृति में विकसित स्तनधारी कोशिकाओं के लिए उनके आवेदन के संबंध में विस्तृत रहे हैं, लेकिन उचित प्रणाली विशेष तोड़ मरोड़ दिया जैविक नमूने की एक विस्तृत श्रृंखला के लिए समान रूप से लागू होते हैं। संबंध कब्जा का इतिहास बीसवीं सदी के शुरू करने के लिए पहली immunoaffinity क्रोमैटोग्राफी प्रयोगों के साथ फैला है - जैसी है जो आमतौर पर आजकल कहा जाता है immunoprecipitation के रूप में (आईपी) - 1950 के दशक से साहित्य में दिखाई दे। तकनीक की मुख्यधारा के उपयोग के आगे उपस्थित 10-13 के लिए इस सदी के अंत के माध्यम से विकसित की है। विविध सेल और आणविक जैविक अध्ययन में कम से कम पिछले चालीस वर्षों 14-19 के लिए क्रायोजेनिक तापमान पर मिलिंग द्वारा कोशिकाओं के यांत्रिक टूटना का उपयोग किया है; और आणविक (सुपर) समचुंबक मोती का उपयोग विभाजन बीईसी हैome पिछले दो दशकों में 20 से अधिक तेजी से सामान्य। इन विभिन्न प्रौद्योगिकियों के संयोजन के रूप में काम खुद के द्वारा उत्पादित की एक व्यापक शरीर और व्यापक अनुसंधान समुदाय इसका सबूत है, synergistically परिणाम है कि प्रोटीन जटिल संबंध कब्जा प्रयोगों 1 में प्राप्त किया जा सकता सुधार करने के लिए सेवा की है 7,9,11,18,19,21 -23। सहायक परिणाम चित्रा 1 में प्रस्तुत कर रहे हैं। निरंतर और प्रभावी संबंध कब्जा प्रयोगों को क्रियान्वित करने के लिए लागू विचारों की एक संग्रह संदर्भ 1 में पाया जा सकता है। आमतौर पर इस दृष्टिकोण के लिए सबसे उपयुक्त है: (i) ब्याज की एक प्रोटीन की interactors सूची है, यानी, प्रोटीन मास स्पेक्ट्रोमेट्री (एमएस) का उपयोग अब तक अज्ञात copurifying प्रोटीन (खोजपूर्ण विश्लेषण) की पहचान करने के लिए; (द्वितीय) के लिए एक विशेष बातचीत साथी की उपस्थिति के लिए परख, यानी, एमएस या पश्चिमी धब्बा का उपयोग करने के संदिग्ध एक विशेष प्रोटीन या प्रोटीन के सीमित सेट का पता लगाने केब्याज (परिकल्पना परीक्षण) के प्रोटीन के साथ teract; या (iii) endogenously इकट्ठे प्रोटीन अतिरिक्त तकनीक से आगे के अध्ययन (प्रारंभिक workup) के लिए ब्याज की प्रोटीन युक्त परिसरों तैयार करते हैं। एक आकर्षण कब्जा प्रयोगात्मक शासन पर तैयार कर पहले यह एक उच्च गुणवत्ता आत्मीयता के अभिकर्मक कि लक्ष्य प्रोटीन, या ब्याज के मूल लक्ष्य प्रोटीन के खिलाफ एक और टैग को एक संलयन प्रोटीन के साथ संलग्न के खिलाफ आम तौर पर एक आईपी सक्षम एंटीबॉडी को बांधता है करने के लिए जरूरी है। सामान्य प्रोटीन धुंधला हो जाना, पश्चिमी सोख्ता, और प्रोटीन एमएस (जैसे Coomassie नीले, Sypro रूबी, या चांदी, निम्नलिखित एसडीएस पृष्ठ के रूप में) सभी आमतौर संबंध कब्जा के साथ संयोजन के रूप में इस्तेमाल कर रहे हैं: यह भी जगह में प्रयोगात्मक readout के उचित तरीकों के लिए महत्वपूर्ण है 1। प्रस्तुत प्रोटोकॉल आत्मीयता के माध्यम के रूप में एंटीबॉडी संयुग्मित चुंबकीय मोतियों का उपयोग। आत्मीयता के माध्यम के समारोह शुरू करने के लिए, परीक्षण है कि कुछ प्रयोगात्मक मापदंडों का उपयोग में मान्य किया जा सकता हैसबसे अच्छा परिणाम एक प्रयोग के अनुभव से 1,11,24 अनुकूलित किया जाना चाहिए प्राप्त करते हैं। प्रोटोकॉल तीन विशिष्ट चरणों में विभाजित हैं: (1) जमे हुए सेल सामग्री की तैयारी; (2) क्रायोजेनिक तापमान पर ठोस राज्य मिलिंग द्वारा सेल टूटना; और (3) प्रोटीन निकासी और आत्मीयता कब्जा एंटीबॉडी युग्मित समचुंबक मोती का उपयोग कर।

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="1304">
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:567px;">Growth media &#38; cell culturing implements</td>
			<td style="width:172px;"></td>
			<td style="width:164px;"></td>
			<td style="width:403px;">For producing frozen cells (I)</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">500 cm^2 culture dishes</td>
			<td style="width:172px;">Corning</td>
			<td>431110</td>
			<td>For producing frozen cells (I)</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Large beaker (1-2L)</td>
			<td style="width:172px;"></td>
			<td></td>
			<td>For producing frozen cells (I)</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Rectangular ice pan&#160;</td>
			<td>Fisher Scientific&#160;</td>
			<td>13-900-747</td>
			<td>For producing frozen cells (I), &#38; cryomilling (II)</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Phosphate buffered saline (PBS)</td>
			<td style="width:172px;"></td>
			<td style="width:164px;"></td>
			<td>For producing frozen cells (I)</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Large cell scrapers</td>
			<td>Fisher Scientific&#160;</td>
			<td>08-100-242</td>
			<td>For producing frozen cells (I)</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Liquid nitrogen&#160;</td>
			<td style="width:172px;"></td>
			<td style="width:164px;"></td>
			<td>For producing frozen cells (I), cryomilling (II), &#38; affinity capture (III)</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:567px;">50 ml conical tubes</td>
			<td>Corning</td>
			<td>352098</td>
			<td>For producing frozen cells (I), &#38; cryomilling (II)</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">20 ml Luer lock syringe</td>
			<td style="width:172px;"></td>
			<td style="width:164px;"></td>
			<td>For producing frozen cells (I)</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Leur lock syringe caps</td>
			<td>www.dymax.com</td>
			<td>T11182</td>
			<td>For producing frozen cells (I)</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Refrigerated centrifuge</td>
			<td style="width:172px;"></td>
			<td style="width:164px;"></td>
			<td>For producing frozen cells (I)</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">50 ml tube rack, 4 position</td>
			<td style="width:172px;"></td>
			<td style="width:164px;"></td>
			<td>For producing frozen cells (I), cryomilling (II), &#38; affinity capture (III)</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Styrofoam box</td>
			<td style="width:172px;"></td>
			<td style="width:164px;"></td>
			<td>For producing frozen cells (I), cryomilling (II), &#38; affinity capture (III)</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Planetary ball mill, PM 100&#160;</td>
			<td>Retsch</td>
			<td>20.540.0001&#160;</td>
			<td>For cryomilling (II)</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Stainless steel milling jar, 50 ml&#160;</td>
			<td>Retsch</td>
			<td>01.462.0149</td>
			<td>For cryomilling (II)</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Stainless steel milling balls, 20 mm &#216;&#160;</td>
			<td>Retsch</td>
			<td>05.368.0062</td>
			<td>For cryomilling (II)</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Lid gasket: PFA encapsulated spring energized seal, 2.62 mm 44.63 mm&#160;&#160;</td>
			<td style="width:172px;">www.marcorubber.com</td>
			<td>T1044-2.62x44.63</td>
			<td>For cryomilling (II)</td>
		</tr>
		<tr height="26">
			<td height="26" style="height:26px;">mini-LN2 decanter</td>
			<td style="width:172px;">homemade</td>
			<td style="width:164px;">see Ref 19</td>
			<td>For cryomilling (II)</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">250 ml PTFE jar insulator (optional)</td>
			<td style="width:172px;">Retsch</td>
			<td style="width:164px;">custom order</td>
			<td>For cryomilling (II)</td>
		</tr>
		<tr height="41">
			<td height="41" style="height:41px;">PTFE puck insulator (optional)</td>
			<td style="width:172px;">homemade</td>
			<td style="width:164px;">The Rockefeller University</td>
			<td>For cryomilling (II); can be produced by The Rockefeller University High Energy Physics Instrument Shop, or design blueprints provided, upon request.</td>
		</tr>
		<tr height="41">
			<td height="41" style="height:41px;">5 bar/500 KPA pressure relief valve (optional)</td>
			<td style="width:172px;">http://www.leeimh.com/</td>
			<td style="width:164px;">558 series check valve</td>
			<td>For cryomilling (II)</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:567px;">1.5 - 2 ml microfuge tubes</td>
			<td style="width:172px;"></td>
			<td style="width:164px;"></td>
			<td>For affinity capture (III)</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:567px;">Extractant</td>
			<td style="width:172px;"></td>
			<td style="width:164px;"></td>
			<td>For affinity capture (III)</td>
		</tr>
		<tr height="41">
			<td height="41" style="height:41px;width:567px;">cOmplete EDTA free protease inhibitor cocktail tablets</td>
			<td style="width:172px;">Roche Applied Science</td>
			<td style="width:164px;">11873580001</td>
			<td style="width:403px;">For affinity capture (III)</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:567px;">Vortex mixer</td>
			<td style="width:172px;"></td>
			<td style="width:164px;"></td>
			<td>For affinity capture (III)</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:567px;">Ice bucket</td>
			<td style="width:172px;"></td>
			<td style="width:164px;"></td>
			<td>For affinity capture (III)</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:567px;">Microtip sonicator, Q700</td>
			<td style="width:172px;">Qsonica</td>
			<td style="width:164px;">Q700</td>
			<td>For affinity capture (III)</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">low intensity 1/16&#8221; microtip probe</td>
			<td style="width:172px;">Qsonica</td>
			<td style="width:164px;">4717</td>
			<td>For affinity capture (III)</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:567px;">Bench-top refrigerated microcentrifuge</td>
			<td style="width:172px;"></td>
			<td style="width:164px;"></td>
			<td>For affinity capture (III)</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:567px;">Dynabeads M-270 Epoxy</td>
			<td style="width:172px;">Thermo Fisher</td>
			<td style="width:164px;">14302D</td>
			<td>For affinity capture (III)</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:567px;">Antibody or affinity ligand coupled to Dynabeads</td>
			<td style="width:172px;">homemade</td>
			<td style="width:164px;"></td>
			<td>For affinity capture (III); see reference 19</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:567px;">Sample rotator&#160;</td>
			<td style="width:172px;"></td>
			<td style="width:164px;"></td>
			<td>For affinity capture (III)</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:567px;">Neodymium magnet</td>
			<td style="width:172px;">Life Technologies</td>
			<td style="width:164px;">123-21D&#160;</td>
			<td>For affinity capture (III)</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:567px;">SDS-PAGE sample buffer (no reducing agent)</td>
			<td style="width:172px;"></td>
			<td style="width:164px;"></td>
			<td>For affinity capture (III)</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:567px;">DTT</td>
			<td style="width:172px;"></td>
			<td style="width:164px;"></td>
			<td>For affinity capture (III)</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:567px;">SDS-PAGE system</td>
			<td style="width:172px;"></td>
			<td style="width:164px;"></td>
			<td>For affinity capture (III)</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:567px;">SDS-polyacrylamide gel</td>
			<td style="width:172px;"></td>
			<td style="width:164px;"></td>
			<td>For affinity capture (III)</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:567px;">Protein Stain</td>
			<td style="width:172px;"></td>
			<td style="width:164px;"></td>
			<td>For affinity capture (III)</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

protein complex affinity capture from cryomilled mammalian cells

संबंध कब्जा आगे के अध्ययन के लिए अंतर्जात प्रोटीन परिसरों को अलग-थलग करने के लिए एक प्रभावी तकनीक है। जब एक एंटीबॉडी के साथ संयोजन के रूप में प्रयोग किया जाता है, इस तकनीक को भी बार बार करने के लिए immunoprecipitation के रूप में जाना जाता है। संबंध कब्जा एक बेंच पैमाने में और एक उच्च throughput संदर्भ में लागू किया जा सकता है। जब प्रोटीन मास स्पेक्ट्रोमेट्री के साथ मिलकर संबंध कब्जा interactome विश्लेषण का एक workhorse साबित हो गया है। हालांकि वहाँ कई शामिल कदम पर अमल करने के लिए संभावित कई तरीके हैं, निम्नलिखित प्रोटोकॉल हमारे इष्ट तरीकों को लागू करने। दो सुविधाओं विशिष्ट हैं: cryomilled सेल पाउडर का उपयोग आत्मीयता के माध्यम के रूप में सेल के अर्क, और एंटीबॉडी युग्मित समचुंबक मोती उत्पादन के लिए। कई मामलों में, हम और अधिक परंपरागत संबंध कब्जा प्रथाओं के साथ प्राप्त उन लोगों के लिए बेहतर परिणाम प्राप्त किया है। Cryomilling सेल टूटना के अन्य रूपों के साथ जुड़े कई समस्याओं से बचा जाता है। यह सामग्री के कुशल टूटना प्रदान करता है, जबकि denat परहेजuration हीटिंग या झाग के साथ जुड़े मुद्दों। यह निकासी की बात करने के लिए मूल निवासी प्रोटीन एकाग्रता को बरकरार रखे हुए है, macromolecular हदबंदी को कम। यह समय निकाले प्रोटीन समाधान में खर्च करते हैं, हानिकारक enzymatic गतिविधियों को सीमित करने को कम कर देता है, और यह आत्मीयता के माध्यम से प्रोटीन की गैर विशिष्ट सोखना कम कर सकते हैं। माइक्रोन पैमाने चुंबकीय आकर्षण मीडिया में पिछले कई वर्षों से अधिक आम हो गए हैं, तेजी से पारंपरिक agarose- और Sepharose आधारित मीडिया की जगह ले। चुंबकीय मीडिया का प्राथमिक लाभ आम तौर पर कम गैर विशिष्ट प्रोटीन सोखना शामिल हैं; कोई आकार अपवर्जन सीमा नहीं है क्योंकि प्रोटीन जटिल बाध्यकारी नहीं बल्कि pores के भीतर से मनका सतह पर होता है; और और गड़बड़ी की आसानी निपटने चुंबक का उपयोग।

Watch this Scientific Journal Video about Protein Complex Affinity Capture from Cryomilled Mammalian Cells at JoVE.com

Protein Complex Affinity Capture from Cryomilled Mammalian Cells

यहाँ हम एक क्रायोजेनिक तापमान पर ठोस राज्य मिलिंग द्वारा स्तनधारी कोशिकाओं को बाधित जिसके परिणामस्वरूप सेल पाउडर से एक सेल निकालने का उत्पादन, और एंटीबॉडी मिलकर माइक्रोन पैमाने समचुंबक मोती पर संबंध कब्जा द्वारा ब्याज की प्रोटीन परिसरों को अलग करने के लिए प्रोटोकॉल का वर्णन है।

Cryomilled स्तनधारी कोशिकाओं से प्रोटीन जटिल संबंध कब्जा

Affinity capture is an effective technique for isolating endogenous protein complexes for further study. When used in conjunction with an antibody, this ...

Research

JoVE Journal

Biochemistry

Tandem Affinity Purification of Protein Complexes from Eukaryotic Cells

कोशिकाओं से मिलकर प्रोटीन परिसरों की आत्मीयता शुद्धि

The purification of active protein-protein and protein-nucleic acid complexes is crucial for the characterization of enzymatic activities and de novo ...

Resolving Affinity Purified Protein Complexes by Blue Native PAGE and Protein Correlation Profiling

ब्लू मूल निवासी पृष्ठ और प्रोटीन सहसंबंध रूपरेखा द्वारा समानता शुद्ध प्रोटीन परिसरों का समाधान करना

Most proteins act in association with others; hence, it is crucial to characterize these functional units in order to fully understand biological ...

mRNA Interactome Capture from Plant Protoplasts

MRNA संयंत्र Protoplasts से इंटरैक्टियम कैद

RNA-binding proteins (RBPs) determine the fates of RNAs. They participate in all RNA biogenesis pathways and especially contribute to post-transcriptional ...

Biochemical and Structural Characterization of the Carbohydrate Transport Substrate-binding-protein SP0092

जैव रासायनिक और कार्बोहाइड्रेट परिवहन सब्सट्रेट-बाध्यकारी-प्रोटीन SP0092 के संरचनात्मक लक्षण वर्णन

Development of new antimicrobials and vaccines for Streptococcus pneumoniae (pneumococcus) are necessary to halt the rapid rise in multiple resistant ...

Toeprinting Analysis of Translation Initiation Complex Formation on Mammalian mRNAs

स्तनधारी mRNAs पर अनुवाद दीक्षा परिसर गठन का Toeprinting विश्लेषण

Translation initiation is the rate-limiting step of protein synthesis and represents a key point at which cells regulate their protein output. Regulation ...

2 in 1: One-step Affinity Purification for the Parallel Analysis of Protein-Protein and Protein-Metabolite Complexes

2 में 1: प्रोटीन और प्रोटीन-Metabolite परिसरों के समानांतर विश्लेषण के लिए एक कदम संबध शुद्धि

Cellular processes are regulated by interactions between biological molecules such as proteins, metabolites, and nucleic acids. While the investigation of ...

Translating Ribosome Affinity Purification (TRAP) for RNA Isolation from Endothelial Cells In Vivo

Translating Ribosome Affinity Purification TRAP for RNA Isolation from Endothelial Cells In Vivo

वीवो में एंडोथेलियल सेल से आरएनए अलगाव के लिए रिबोसोम एफ़िनिटी शुद्धि (टीआरईआरई) का अनुवाद

Many studies have been limited to using in vitro cellular assays and whole tissues or isolating of specific cell types from animals for in vitro analysis ...

Activated Cross-linked Agarose for the Rapid Development of Affinity Chromatography Resins - Antibody Capture as a Case Study

एफ़िनिटी क्रोमैटोग्राफी रेजिन के तीव्र विकास के लिए सक्रिय क्रॉस-लिंक्ड अगारोस - एक केस स्टडी के रूप में एंटीबॉडी कैप्चर

The purification of monoclonal antibodies (mAbs) is commonly achieved by Protein A affinity chromatography, which can account for up to 25% of the overall ...

Detection of Protein S-Acylation using Acyl-Resin Assisted Capture

Acyl-राल सहायता प्राप्त कब्जा का उपयोग कर प्रोटीन एस-Acylation का पता लगाने

Protein S-acylation, also referred to as S-palmitoylation, is a reversible post-translational modification of cysteine residues with long-chain fatty ...

Purification of Ubiquitinated p53 Proteins from Mammalian Cells

स्तनधारी कोशिकाओं से यूबिकिटिनेटेड पी 53 प्रोटीन का शुद्धिकरण

Ubiquitination is a type of posttranslational modification that regulates not only the stability but also the localization and function of a substrate ...