Name: protein complex affinity capture from cryomilled mammalian cells
Uploaded: 2016-12-09T13:00:00
Duration: 10 min 37 s
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Agradecemos al profesor Brian T. Chait por su inestimable asesoramiento, apoyo y acceso a MS instrumentación, así como la Sra. R. Kelly Molloy por su excelente apoyo técnico. Agradecemos a la Sra Kelly descubierto por el apoyo con la edición. Este trabajo fue apoyado en parte por subvenciones del NIH P41GM109824, P41GM103314, y P50GM107632.

The authors declare that they have no competing financial interests.

Estos tres protocolos funcionan en tándem para (1) preparar células para la rotura de estado sólido por cryomilling, (2) lograr la rotura en un molino de bolas planetario, y (3) producir extractos de polvo de la célula a la afinidad de captura de una proteína de interés en el complejo con sus interactores fisiológicas. Existen muchas diferentes técnicas de lisis celular, incluyendo enfoques mecánicos / físicos que emplean la trituración de impacto, cizallamiento, y / o la presión, así como enfoques químicos / enzimáticos, cada uno con diferentes ventajas y desventajas 49,50. Se anima a cada investigador para explorar métodos más adecuados para sus análisis, teniendo en cuenta que es probable que introducir sesgos 51,52 necesitando una optimización empírica (véase más adelante) cualquier enfoque elegido para la rotura de células y la extracción de proteínas. Los métodos mecánicos pueden producir altas temperaturas y / o fuerzas de cizallamiento que puede interrumpir los complejos de proteínas. Cryomilling evita efectos de calentamiento por virtud de emplear LN 2 enfriamiento de muestras para tque la duración del proceso. Molinos de bolas planetarios se entiende que depender de impacto y fricción fuerzas de cizallamiento, como el estrés, como componentes de la reducción del tamaño de partícula 53,54. En la configuración informamos que no hemos observado la degeneración de complejos de proteínas. De hecho, hemos extraído y recuperado aparentemente intactas ~ 50 MDa complejos de poro nuclear y 11 por vía enzimática retrotransposones activos que presentan mayor actividad específica que las preparaciones que emplean lisis a base de detergente &quot;suave&quot; 7. Químicos / métodos enzimáticos de lisis celular sufren de la limitación de que el contenido de la celda se liberan en una vitro medio en el que apoya la alteración de las membranas celulares y macromoléculas estructurales, pero puede no ser adecuado para el mantenimiento de la integridad del complejo de proteína (es ) de interés. Con frecuencia, ni los componentes de los complejos formados con la proteína de interés ni las condiciones necesarias para estabilizar los complejos de destino sonconoce de antemano. Una ventaja importante de la molienda en estado sólido es que la rotura y la extracción se desacoplan, permitiendo al material de origen pueden preparar de forma líquida añadido, almacenan (a -80 ° C o menos), amasaron, y convenientemente recuperados para la experimentación en la demanda; por ejemplo, para explorar optimizada en condiciones in vitro para la captura por afinidad. Interacciones de proteína son más estables a alta concentración 55,56, por lo tanto, reducir al mínimo el volumen de agente de extracción puede ser ventajoso para la conservación de las interacciones fisiológicas. Por otro lado, hay consideraciones prácticas - los complejos de proteínas necesitan ser particionada fuera de las células y en una fase acuosa no viscoso, libre de agregados insolubles, con el fin de mezclarse los complejos diana con el medio de afinidad. Por otra parte, se necesita cierto grado de normalización y control sobre el entorno in vitro (pH, concentración de sales, etc.) para la sistematización y la reproducibilidad. Nos encontramos con que los extractos de produced en el intervalo de dilución de 1: 4-1: 9 (w: v) satisfacer las preocupaciones prácticas y teóricas, produciendo resultados de calidad. Además, la proporción óptima de extracto celular a la afinidad necesidades a medio que se determine. Esto se hace empíricamente mediante titulación de extractos con cantidades variables de medio de afinidad y puede tener efectos detectables en la relación de señal a ruido del experimento, se analiza más adelante. Una excelente agotamiento de la proteína diana es típicamente ≥70% de la fracción soluble de la proteína diana, pero&gt; 90% es deseable y puede ser alcanzable con cuidado parametrización de las condiciones de extracción. Muchos de tales consideraciones prácticas están cubiertos en la referencia 1. perlas paramagnéticas son manipulados usando imanes de neodimio en un soporte para tubos de microcentrífuga especializada, aunque las alternativas caseras son viables. Cuando se coloca dentro del soporte, las perlas se acumulan en el lado del tubo bajo la influencia del campo magnético. Las soluciones pueden entonces ser retirados sin disturbing las perlas. Una limitación del protocolo cryomilling presentado, desarrollado con el molino de bolas planetario se utiliza aquí (véase la Tabla de Materiales), es que se requiere para efectivamente molino de una cantidad mínima de material y recuperar polvo celular utilizando este dispositivo (&gt; 1 g). Tales cantidades se obtienen fácilmente con muchos microbios, líneas celulares, y organismos modelo, y puede también lograrse a menudo con los tejidos extirpados de los animales de laboratorio. Sin embargo, ciertas líneas de células pueden ser muy difíciles de cultivar en los tejidos de abundancia y animales puede ser escasa. Pequeñas cantidades de material pueden ser molidos comparable utilizando otros dispositivos que utilizan recipientes más pequeños, aunque potencialmente en el sacrificio de la finura del polvo obtenido. Además, el costo de los dispositivos mecánicos de molienda puede ser prohibitivo para algunos laboratorios. Cryomilling se puede lograr usando un número de configuraciones alternativas 14-19, incluyendo, más asequible a mano usando una plagaLe y el mortero, aunque la eficiencia de rotura se reduce considerablemente. protocolos de captura por afinidad típicamente apuntan a una alta eficiencia de la lisis celular para facilitar la extracción máxima de proteína en la solución y por lo tanto, el potencial máximo para la captura de los complejos de proteína diana. Por otro lado, se ha demostrado para la levadura en el empalme vitro extractos que la lisis máxima no puede equiparar con máxima en la actividad bioquímica vitro 57,58. No hemos observado este tipo de problemas en los sistemas que hemos probado hasta ahora, y por lo tanto no limitan a propósito de nuestra ruptura celular cuando cryomilling. Sin embargo, esta posibilidad debe tenerse en cuenta cuando se optimizan para los ensayos enzimáticos in vitro. Aunque cryomilling es un método muy eficaz para romper las células, una cantidad limitada de sonicación a menudo beneficia a los de producción de extractos de células enteras homogéneas de tejidos de mamíferos ya que los agregados no homogéneas a veces pueden observarse por inspección visual: típicamenteen condiciones de extracción usando baja en sal (100 a 300 mM) y un detergente no iónico (0,1 a 1% v / v) concentraciones a moderada. Debido a que se observó que la presencia de estos agregados puede reducir el rendimiento y / o calidad de la captura por afinidad posterior, de manera rutinaria en práctica sonicación para dispersar ellos (incluso cuando no se observan a simple vista). Los agregados son consistentes con fragmentos de membrana aglomerados, comparables a los reportados previamente en extractos de células de levadura molidas 58. La sonicación también se utiliza en algunos protocolos para cizallar el ADN y liberar fragmentos de cromatina en la solución, sin embargo, el grado de la sonicación aplicado en este protocolo no hace apreciablemente fragmento de ADN. La disponibilidad limitada (o el alto coste) de un excelente ligando de afinidad o anticuerpo contra la proteína particular de interés puede ser otro impedimento. Una amplia gama de reactivos de afinidad disponibles en el mercado puede ser aprovechada cuando el organismo modelo es susceptible de etiquetado genómico o transfection con vectores de expresión ectópicos, que permiten la expresión de proteínas de interés como fusiones de afinidad de etiquetado. Sin embargo, la producción de anticuerpos personalizados se ha convertido en cada vez más factible y ambos anticuerpos policlonales y monoclonales puede realizar de manera excelente en aplicaciones de captura de afinidad. Estas muchas consideraciones también se tratan en mayor detalle en la referencia 1. Ejemplos de cómo el método de la lisis celular y la elección de medio de afinidad pueden afectar los resultados se ilustran en la Figura 1. Ejemplos de efectos ejercidos por diferentes agentes de extracción se pueden ver en las referencias 1,11,24. Debido a estos y otros parámetros experimentales afectan a la calidad de la captura por afinidad, por lo que es difícil discriminar los PM, y los repositorios de proteomas &quot;talón&quot; y métodos de cálculo para eliminar los contaminantes no específicos han sido desarrollados para ayudar en la identificación de los MF 40-43. Sin embargo, tales enfoques sólo substitUTE para la preparación de la muestra óptima en un grado limitado 59. La observación de las mejores prácticas y empíricamente optimizar el experimento de captura por afinidad proporcionará las muestras de la más alta calidad para los análisis posteriores, se analiza más adelante. Una práctica fácil de implementar que puede mejorar la pureza de la muestra es de elución nativa. elución nativo se usa con mayor frecuencia para obtener el aislado complejo de proteínas de afinidad, intacto, para la experimentación adicional; pero ya que con frecuencia mejora la pureza de la muestra, puede también ser utilizado sólo por esta razón. Sin embargo, como se demuestra en la Figura 1, el panel II, la capacidad de elución nativo para mejorar la pureza de la muestra puede depender de una valoración precisa de la cantidad de medio de afinidad a la abundancia de la proteína diana en el extracto celular - cuando el medio se encuentra en exceso , paratopes desocupadas pueden permitir la acumulación fuera del objetivo de las proteínas de PF observables en las fracciones eluidas de forma nativa. Utilizando los reactivos y procedimientos descritos aquí, hcomo nuestra experiencia, la única gran colaborador de los programas marco de nuestros experimentos es la propia proteína de la etiqueta una vez retirado del contexto de la célula viva. (Fig. 1.II y la Fig. S1). En tales casos, los controles de la línea de células parentales que producen proteomas irrelevantes en ausencia del antígeno no tienen ningún valor práctico; Lo mismo sucede con la etiqueta de sólo o espiga-en los controles que están desprovistos de cualquier cosa menos el antígeno diana. Por lo tanto, siempre que sea práctico ponemos en práctica I-SUCIEDAD 7,38, que mide directamente la acumulación de post-lisis interacciones de proteínas utilizando MS cuantitativos. Como se mencionó en el paso 3.2.7 del protocolo, los procedimientos para la elución nativa variarán con los detalles del sistema de afinidad utilizada. elución nativo se consigue con mayor frecuencia por desplazamiento competitivo de la proteína marcada de escisión proteolítica compleja o de la etiqueta, la liberación del complejo desde el medio de afinidad. Existen varios sistemas de afinidad que comprenden etiquetas de epítopo pequeñas, for que el epítopo en sí está disponible como péptido útil para la elución competitiva de complejos de proteínas etiquetadas 60. Del mismo modo, varias proteasas están disponibles para escindir específicamente sitios afines colocados estratégicamente en la afinidad etiquetados proteínas de fusión 61. Dependiendo de las características específicas de los sistemas de afinidad elegidos, el esquema de elución apropiado pueda ser adoptado. En general, la calidad de los resultados obtenidos se verá afectada de manera significativa por la calidad de la preparación de la muestra. Es importante trabajar con cuidado y precisión a través de cada paso de estos protocolos, y lo más rápidamente posible, manteniendo cuidado y precisión. Es aconsejable realizar un seguimiento de la partición de la proteína de interés a través de cada paso para entender la eficiencia de cada manipulación. Por ejemplo: ¿cómo abundante es la proteína de interés en la célula o tejido en cuestión? Tal vez la proteína en estudio (y sus complejos) será difícil de caracterizar en masaespectrometría debido a la baja abundancia. Si los complejos purificados son detectables mediante tinción de proteínas en general (aproximadamente nanogramos gama), espectrometría de masas es probable que tenga éxito. Si la proteína capturado de interés sólo se puede detectar mediante transferencia sensible mejorado quimioluminiscente Western (aproximadamente gama picogramos), espectrometría de masas es menos probable que sea eficaz. Incluso si la proteína de interés es abundante en la célula, cómo es abundante que en el extracto celular producida? ¿La partición de la proteína a la solución o se trata en el pellet? En este último caso, una nueva solución de extracción se puede diseñar que pueden mejorar la recuperación. Una vez que el extracto celular se combina con el medio de afinidad, la eficacia de capturar la proteína? ¿La proteína siguen vinculados a través de lavados posteriores? ¿Qué pasa con otras proteínas copurifying? Al guardar una alícuota de cada muestra en las etapas apropiadas del protocolo de estas preguntas pueden ser contestadas con facilidad, por lo general por el Western Blot contra la proteína de interéso tinción de proteínas en general, pero otros ensayos también pueden ser adecuados. La optimización de cada paso será mejorar el rendimiento y la pureza de los complejos capturados, aunque puede haber una compensación que se hizo en la maximización de un atributo o la otra. Una aplicación típica de captura por afinidad para muchos investigadores es identificar candidato en interactores in vivo para un pequeño número de proteínas de interés; estos candidatos son sometidos comúnmente a la validación por enfoques ortogonales in vivo para demostrar la importancia biológica de los interactores físicas. Captura por afinidad también se emplea en los estudios de alto rendimiento para generar listas de copurifying proteínas observadas de forma (casi) todo el proteoma, facilitando inferencias relativas putativo computacionales complejos en vivo. Numerosos ejemplos de tales estudios se pueden encontrar en la literatura. Este enfoque renuncia a la optimización de las condiciones de captura para cualquier diana dada a favor de exploración del hombreobjetivos de Y; Como tales, los complejos inferidos mismos están rara vez recuperado completamente intacto y altamente pura en cualquier muestra dada. Más bien, las superposiciones parciales en composiciones observadas entre numerosas muestras de afinidad-capturado distintas se utilizan como base de las inferencias 42. Ambos enfoques aportan datos valiosos para nuestra comprensión de la interactoma. Sin embargo, una ventaja importante de captura por afinidad es que con frecuencia ofrecen la oportunidad de obtener los complejos intactos y altamente purificada, a condición de que se hagan esfuerzos para optimizar el procedimiento. Creemos que el futuro del enfoque radica en el aumento de la facilidad y eficacia de la optimización de la captura de complejos de proteínas endógenas 11, para una evaluación más precisa de la gama de interactores fisiológicas y un uso más frecuente en más bioquímica aguas abajo, enzymological, y estudios estructurales, por ejemplo, hace referencia a 7,9,23.

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	<li>Cristea, I. M., &#38; Chait, B. T. Conjugation of magnetic beads for immunopurification of protein complexes. Cold Spring Harbor Protocols. 2011 (5) (2011).</li>
	<li>Rosenberg, I. M. Electrophoretic Techniques. Protein Analysis and Purification. (4), 63&#8211;117 (2005).</li>
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	<li>Mellacheruvu, D., Wright, Z., et al. The CRAPome: a contaminant repository for affinity purification-mass spectrometry data. Nat Methods. (2013).</li>
	<li>Cheeseman, I. M., &#38; Desai, A. A combined approach for the localization and tandem affinity purification of protein complexes from metazoans. Sci. STKE 2005 (266), pl1 (2005).</li>
	<li>Goldberg, S. Mechanical/physical methods of cell disruption and tissue homogenization. Methods in Molecular Biology. 424 (Chapter 1), 3&#8211;22 (2008).</li>
	<li>Grabski, A. C. Advances in preparation of biological extracts for protein purification. Methods in Enzymology. 463 (C), 285&#8211;303 (2009).</li>
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	<li>Glatter, T., Ahrn&#233;, E., &#38; Schmidt, A. Comparison of Different Sample Preparation Protocols Reveals Lysis Buffer-Specific Extraction Biases in Gram-Negative Bacteria and Human Cells. J Proteome Res. 15 (2), 679 (2016).</li>
	<li>Zhao, Q.-Q., Yamada, S., &#38; Jimbo, G. The Mechanism and Grinding Limit of Planetary Ball Milling. KONA. 7, 29&#8211;36 (1989).</li>
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	<li>Fulton, A. B. How crowded is the cytoplasm? Cell. 30 (2), 345&#8211;347 (1982).</li>
	<li>Ellis, R. J. Macromolecular crowding: obvious but underappreciated. Trends Biochem Sci. 26 (10), 597&#8211;604 (2001).</li>
	<li>Kalkum, M. Using the Retsch MM301 Ball Mill for Cryogenic Disruption of Yeast Cells. 2 City of Hope, (2003).</li>
	<li>Staley, J. Making Whole Cell Extract of Saccharomyces cerevisiae cells using the Retsch MM301 Ball Mill. Retsch GmbH: (2005).</li>
	<li>Bell, A. W., Nilsson, T., Kearney, R. E., &#38; Bergeron, J. J. M. The protein microscope: Incorporating mass spectrometry into cell biology. Nat Methods. 4 (10), 783&#8211;784 (2007).</li>
	<li>Zhao, X., Li, G., &#38; Liang, S. Several affinity tags commonly used in chromatographic purification. J Anal Methods Chem. 2013 (1), 581093&#8211;8 (2013).</li>
	<li>Waugh, D. S. An overview of enzymatic reagents for the removal of affinity tags. 80 (2), 283&#8211;293 (2011).</li>
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	<li>Deppert, W. R., &#38; Luka&#265;in, R. Buffers and Additives. Journal of Chromatography Library. 61 (C), 839&#8211;862 (1999).</li>
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	<li>Linke, D. Detergents: an overview. Methods in Enzymology. 463 (34), 603&#8211;617 (2009).</li>
	<li>Zhang, J. Protein-Protein Interactions in Salt Solutions. Protein-Protein Interactions Computational and Experimental Tools. (18), 359&#8211;376 (2012).</li>
</ol>
to:
<ol start="29">
	<li>Ball Mills - Guidelines for sample amount and ball charge. 1&#8211;3at &#60;http://www.retsch.com/products/milling/ball-mills/planetary-ball-mill-pm-100/information-downloads/&#62; Retsch GmbH (2014).</li>
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	<li>Linke, D. Detergents: an overview. Methods in Enzymology. 463 (34), 603&#8211;617 (2009).</li>
	<li>Zhang, J. Protein-Protein Interactions in Salt Solutions. Protein-Protein Interactions Computational and Experimental Tools. (18), 359&#8211;376 (2012).</li>
	<li>Goldberg, S. Mechanical/physical methods of cell disruption and tissue homogenization. Methods in Molecular Biology. 424 (Chapter 1), 3&#8211;22 (2008).</li>
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	<li>Zhao, Q.-Q., Yamada, S., &#38; Jimbo, G. The Mechanism and Grinding Limit of Planetary Ball Milling. KONA. 7, 29&#8211;36 (1989).</li>
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Erratum: Protein Complex Affinity Capture from Cryomilled Mammalian Cells

Una aplicación típica de los procedimientos presentados es estabilizar y obtener un alto rendimiento y la pureza de los complejos de proteínas endógenas de interés para la caracterización interactomic 1. Se entiende que las redes dinámicas de ambos complejos macromoleculares asociados de forma estable y transitoriamente, principalmente compuesto de proteínas, orquestan procesos celulares 2,3. Si bien hay muchos enfoques experimentales para identificar interacciones proteína-proteína, la captura por afinidad es uno de los métodos más utilizados para el aislamiento y la disección de los complejos de proteínas fisiológicas 4-6. Además, esta técnica tiene la ventaja de producir los complejos macromoleculares como entidades físicas, no sólo como puntos de datos en una lectura; Ventajosamente, los complejos obtenidos de este modo pueden ser utilizados en una serie de bioquímica adicional aguas abajo, enzimáticos y ensayos estructurales 7-9. Los protocolos presentados se han desarrollado en respuesta a la necesidad de asignar proteilas redes de interacción de proteínas-n y caracterizar los complejos macromoleculares en su papel de las moléculas efectoras de la biología celular. Son detallada con respecto a su aplicación a las células de mamífero cultivadas en cultivo de tejidos, pero son igualmente aplicables a una amplia gama de muestras biológicas dadas ajustes específicos del sistema adecuadas. La historia de la captura por afinidad se remonta a principios del siglo XX con los primeros experimentos de cromatografía de inmunoafinidad - parecido a lo que comúnmente se denomina hoy en día como la inmunoprecipitación (IP) - aparecer en la literatura por la década de 1950. Uso generalizado de la técnica de desarrollarse mediante el cambio de siglo hasta la actualidad 10-13. Celular diverso y estudios de biología molecular han utilizado la rotura mecánica de las células mediante la molienda a temperaturas criogénicas durante al menos los últimos cuarenta años 14-19; y las separaciones moleculares que utilizan (super) perlas paramagnéticas tienen become cada vez más común en las últimas dos décadas 20. La combinación de estas diferentes tecnologías ha servido para mejorar sinérgicamente los resultados que se pueden obtener en los experimentos de la proteína compleja de captura por afinidad 1, como se evidencia por un extenso cuerpo de trabajo producido por nosotros mismos y la comunidad de investigación más amplio 7,9,11,18,19,21 -23. Resultados de apoyo se presentan en la Figura 1. Una colección de advertencias y consideraciones aplicables a la ejecución de experimentos de captura de afinidad eficaces se puede encontrar en la referencia 1. Normalmente, este enfoque es más adecuado para: (I) catalogar los interactores de una proteína de interés, es decir, utilizar la proteína espectrometría de masas (MS) para identificar proteínas copurifying hasta ahora desconocidos (análisis exploratorio); Ensayo (II) para la presencia de una interacción socio particular, es decir, el uso de MS o de transferencia de Western para detectar una proteína en particular o un conjunto limitado de proteínas se sospecha que eninteractúan con la proteína de interés (prueba de hipótesis); o (III) preparar complejos de proteína endógena ensamblados que contienen la proteína de interés para su estudio mediante técnicas adicionales (estudio diagnóstico preparativa). Antes de embarcarse en un régimen experimental de captura por afinidad es absolutamente indispensable contar con un reactivo de afinidad de alta calidad que se une a la proteína diana, típicamente un anticuerpo IP-competente contra la proteína diana nativo de interés o en contra de una etiqueta anexada a una proteína de fusión. También es fundamental contar con métodos apropiados de lectura experimental en su lugar: tinción de proteínas en general (como el azul de Coomassie, Sypro Ruby, o plata, después de SDS-PAGE), Western Blot, y la proteína de la EM son comúnmente utilizados en conjunción con la captura por afinidad 1. Los protocolos presentados utilizan perlas magnéticas conjugados de anticuerpos como el medio de afinidad. Mientras que la función del medio de afinidad inicialmente puede ser validado en ensayos que utilizan unos parámetros experimentales, aobtener los mejores resultados de cada experimento debe ser empíricamente optimizado 1,11,24. Los protocolos se dividen en tres fases distintivas: (1) la preparación de material celular congelado; (2) rotura celular por molienda en estado sólido a temperatura criogénica; y (3) la extracción de proteínas y la captura de afinidad utilizando perlas paramagnéticas de anticuerpos acoplados.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="1304">
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:567px;">Growth media &#38; cell culturing implements</td>
			<td style="width:172px;"></td>
			<td style="width:164px;"></td>
			<td style="width:403px;">For producing frozen cells (I)</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">500 cm^2 culture dishes</td>
			<td style="width:172px;">Corning</td>
			<td>431110</td>
			<td>For producing frozen cells (I)</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Large beaker (1-2L)</td>
			<td style="width:172px;"></td>
			<td></td>
			<td>For producing frozen cells (I)</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Rectangular ice pan&#160;</td>
			<td>Fisher Scientific&#160;</td>
			<td>13-900-747</td>
			<td>For producing frozen cells (I), &#38; cryomilling (II)</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Phosphate buffered saline (PBS)</td>
			<td style="width:172px;"></td>
			<td style="width:164px;"></td>
			<td>For producing frozen cells (I)</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Large cell scrapers</td>
			<td>Fisher Scientific&#160;</td>
			<td>08-100-242</td>
			<td>For producing frozen cells (I)</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Liquid nitrogen&#160;</td>
			<td style="width:172px;"></td>
			<td style="width:164px;"></td>
			<td>For producing frozen cells (I), cryomilling (II), &#38; affinity capture (III)</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:567px;">50 ml conical tubes</td>
			<td>Corning</td>
			<td>352098</td>
			<td>For producing frozen cells (I), &#38; cryomilling (II)</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">20 ml Luer lock syringe</td>
			<td style="width:172px;"></td>
			<td style="width:164px;"></td>
			<td>For producing frozen cells (I)</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Leur lock syringe caps</td>
			<td>www.dymax.com</td>
			<td>T11182</td>
			<td>For producing frozen cells (I)</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Refrigerated centrifuge</td>
			<td style="width:172px;"></td>
			<td style="width:164px;"></td>
			<td>For producing frozen cells (I)</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">50 ml tube rack, 4 position</td>
			<td style="width:172px;"></td>
			<td style="width:164px;"></td>
			<td>For producing frozen cells (I), cryomilling (II), &#38; affinity capture (III)</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Styrofoam box</td>
			<td style="width:172px;"></td>
			<td style="width:164px;"></td>
			<td>For producing frozen cells (I), cryomilling (II), &#38; affinity capture (III)</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Planetary ball mill, PM 100&#160;</td>
			<td>Retsch</td>
			<td>20.540.0001&#160;</td>
			<td>For cryomilling (II)</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Stainless steel milling jar, 50 ml&#160;</td>
			<td>Retsch</td>
			<td>01.462.0149</td>
			<td>For cryomilling (II)</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Stainless steel milling balls, 20 mm &#216;&#160;</td>
			<td>Retsch</td>
			<td>05.368.0062</td>
			<td>For cryomilling (II)</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Lid gasket: PFA encapsulated spring energized seal, 2.62 mm 44.63 mm&#160;&#160;</td>
			<td style="width:172px;">www.marcorubber.com</td>
			<td>T1044-2.62x44.63</td>
			<td>For cryomilling (II)</td>
		</tr>
		<tr height="26">
			<td height="26" style="height:26px;">mini-LN2 decanter</td>
			<td style="width:172px;">homemade</td>
			<td style="width:164px;">see Ref 19</td>
			<td>For cryomilling (II)</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">250 ml PTFE jar insulator (optional)</td>
			<td style="width:172px;">Retsch</td>
			<td style="width:164px;">custom order</td>
			<td>For cryomilling (II)</td>
		</tr>
		<tr height="41">
			<td height="41" style="height:41px;">PTFE puck insulator (optional)</td>
			<td style="width:172px;">homemade</td>
			<td style="width:164px;">The Rockefeller University</td>
			<td>For cryomilling (II); can be produced by The Rockefeller University High Energy Physics Instrument Shop, or design blueprints provided, upon request.</td>
		</tr>
		<tr height="41">
			<td height="41" style="height:41px;">5 bar/500 KPA pressure relief valve (optional)</td>
			<td style="width:172px;">http://www.leeimh.com/</td>
			<td style="width:164px;">558 series check valve</td>
			<td>For cryomilling (II)</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:567px;">1.5 - 2 ml microfuge tubes</td>
			<td style="width:172px;"></td>
			<td style="width:164px;"></td>
			<td>For affinity capture (III)</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:567px;">Extractant</td>
			<td style="width:172px;"></td>
			<td style="width:164px;"></td>
			<td>For affinity capture (III)</td>
		</tr>
		<tr height="41">
			<td height="41" style="height:41px;width:567px;">cOmplete EDTA free protease inhibitor cocktail tablets</td>
			<td style="width:172px;">Roche Applied Science</td>
			<td style="width:164px;">11873580001</td>
			<td style="width:403px;">For affinity capture (III)</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:567px;">Vortex mixer</td>
			<td style="width:172px;"></td>
			<td style="width:164px;"></td>
			<td>For affinity capture (III)</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:567px;">Ice bucket</td>
			<td style="width:172px;"></td>
			<td style="width:164px;"></td>
			<td>For affinity capture (III)</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:567px;">Microtip sonicator, Q700</td>
			<td style="width:172px;">Qsonica</td>
			<td style="width:164px;">Q700</td>
			<td>For affinity capture (III)</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">low intensity 1/16&#8221; microtip probe</td>
			<td style="width:172px;">Qsonica</td>
			<td style="width:164px;">4717</td>
			<td>For affinity capture (III)</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:567px;">Bench-top refrigerated microcentrifuge</td>
			<td style="width:172px;"></td>
			<td style="width:164px;"></td>
			<td>For affinity capture (III)</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:567px;">Dynabeads M-270 Epoxy</td>
			<td style="width:172px;">Thermo Fisher</td>
			<td style="width:164px;">14302D</td>
			<td>For affinity capture (III)</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:567px;">Antibody or affinity ligand coupled to Dynabeads</td>
			<td style="width:172px;">homemade</td>
			<td style="width:164px;"></td>
			<td>For affinity capture (III); see reference 19</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:567px;">Sample rotator&#160;</td>
			<td style="width:172px;"></td>
			<td style="width:164px;"></td>
			<td>For affinity capture (III)</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:567px;">Neodymium magnet</td>
			<td style="width:172px;">Life Technologies</td>
			<td style="width:164px;">123-21D&#160;</td>
			<td>For affinity capture (III)</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:567px;">SDS-PAGE sample buffer (no reducing agent)</td>
			<td style="width:172px;"></td>
			<td style="width:164px;"></td>
			<td>For affinity capture (III)</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:567px;">DTT</td>
			<td style="width:172px;"></td>
			<td style="width:164px;"></td>
			<td>For affinity capture (III)</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:567px;">SDS-PAGE system</td>
			<td style="width:172px;"></td>
			<td style="width:164px;"></td>
			<td>For affinity capture (III)</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:567px;">SDS-polyacrylamide gel</td>
			<td style="width:172px;"></td>
			<td style="width:164px;"></td>
			<td>For affinity capture (III)</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:567px;">Protein Stain</td>
			<td style="width:172px;"></td>
			<td style="width:164px;"></td>
			<td>For affinity capture (III)</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

protein complex affinity capture from cryomilled mammalian cells

captura por afinidad es una técnica eficaz para aislar los complejos de proteínas endógenas en estudio. Cuando se utiliza en conjunción con un anticuerpo, esta técnica también se refiere con frecuencia como inmunoprecipitación. captura por afinidad se puede aplicar en un a escala de banco y en un contexto de alto rendimiento. Cuando se combina con la espectrometría de masas de proteínas, de captura por afinidad ha demostrado ser un caballo de batalla de análisis interactome. Aunque hay potencialmente muchas maneras de ejecutar los numerosos pasos a seguir, los siguientes protocolos implementan nuestros métodos favorecidos. Dos características son distintivos: el uso de polvo de células cryomilled para producir extractos de células y perlas paramagnéticas de anticuerpos acoplados como el medio de afinidad. En muchos casos, se han obtenido resultados superiores a los obtenidos con las prácticas de captura de afinidad más convencionales. Cryomilling evita numerosos problemas asociados con otras formas de rotura celular. Proporciona rotura eficiente del material, evitando al mismo tiempo denatURACIÓN problemas asociados con el calentamiento o la formación de espuma. Conserva la proteína nativa concentración hasta el punto de extracción, la mitigación de la disociación macromolecular. Se reduce el tiempo de proteínas extraídas pasan en solución, lo que limita las actividades enzimáticas deletéreos, y puede reducir la adsorción no específica de proteínas por medio de afinidad. medios de afinidad magnética a escala micrométrica se han convertido en algo común en los últimos años, reemplazando cada vez más la agarose- tradicional y los medios de comunicación basados ​​en Sepharose. Los beneficios primarios de medios magnéticos incluyen la adsorción de proteínas no específica generalmente más bajos; hay un límite de exclusión de tamaño debido a la unión de proteínas complejas se produce en la superficie del grano en lugar de dentro de los poros; y la facilidad de manipulación y el manejo de uso de imanes.

La Figura 1, panel de E ilustra que cryomilling y perlas magnéticas pueden trabajar juntos para mejorar la calidad de la muestra. Paneles IA-C demuestran que el material que comprende el medio insoluble utilizado para la captura por afinidad puede afectar el proteoma recuperado 19. La proteína de interés, la fosfatasa alcalina bacteriana purificada marcada con FLAG (BAP), se añadieron en extractos de células humanas. BAP no se espera que interactuar específicamente con y copurifican proteínas humanas. La firma de proteínas copurifying, a juzgar por SDS-PAGE y tinción de Coomassie, varió en función del medio utilizado. perlas magnéticas Micron escala mostraron el perfil más limpio, lo que indica un nivel relativamente bajo de la adsorción de proteínas no específicas. Paneles de ID y IE ilustran que el método de lisis celular también puede afectar el proteoma recuperado. En el ejemplo proporcionado, un complejo de proteína endógena (el siguiente complejo 37), se sometió a captu afinidadre de células cyromilled o sonicado extractos 19. Se observaron menos contaminantes de masas de alta cuando el extracto de células se produce a partir de células en polvo cryomilled. Un reto al usar captura por afinidad para estudiar los complejos de proteínas endógenas es que puede ser difícil discriminar interactores fisiológicas de buena fe de la proteína de interés de falsos positivos (fps). MF puede surgir de muchas fuentes, incluyendo la adsorción no específica a los tubos y los vasos, el medio de afinidad, el ligando anticuerpo o de afinidad, y / o a la proteína de interés en sí. Como resultado, el esfuerzo significativo se debe dedicar a la optimización del proceso de captura. La detección de PM sigue siendo un desafío central para el que se han desarrollado un gran número de diferentes herramientas, incluyendo experimental y computacional 38-40 41-43 se acerca, cada uno con diferentes ventajas y desventajas. En nuestros propios experimentos hemos observado previamente un patrón de Fproteína P unión, obtenida después de la incubación de α-FLAG medio magnético con extractos de células de control, que era distinta de la patrón obtenido en presencia de proteínas etiquetadas-3xFLAG. Además, estos programas marco podrían ser liberados a partir del medio de incubación con 3xFLAG péptido 7. Esta observación es consistente con la unión oportunista de los programas marco para el paratopo α-FLAG en ausencia del epítopo cognado. La comprensión de la naturaleza de este fondo FP es importante, ya que muchos estudios utilizan una &quot;línea celular parental&quot; no etiquetado como un falso control de captura por afinidad; Por lo tanto, estos controles pueden ser inapropiados para determinar la especificidad de las interacciones con la proteína marcada. Para determinar la unión de fondo aportada por nuestro medio de afinidad cuando están ocupados paratopes de anticuerpos o no, se realizó experimentos de captura de afinidad utilizando simulacros de α-FLAG medio magnético y extractos de células HEK 293T (sin proteína etiquetada expresada) en presencia o ausencia de un 3xFLAGpéptido espiga-en. Los resultados se muestran en la Figura 1, el panel II. Brevemente, medio magnético α-FLAG se incubó en extractos de células (de ≳10 mg / ml de proteína total) que contiene NaCl 500 mM y 1% v / v Triton X-100 en 20 mM HEPES-Na pH 7,4 durante 30 min. El medio se incubó con 1 mg de péptido / ml 3xFLAG para desplazar competitivamente cualquier proteínas unidas a la paratopo α-FLAG nativa o con tampón de muestra SDS-PAGE para lograr una elución de desnaturalización. Además, el mismo experimento se llevó a cabo cuando los extractos celulares se enriquecieron con 1 mg / ml y 10 g / ml de péptido 3xFLAG. Todas las fracciones eluidas se sometieron a SDS-PAGE y tinción con plata. Hemos observado que, en ausencia de su epítopo cognado, medio α-FLAG capta un nivel detectable de proteínas de fondo que se pueden eluir con el péptido 3xFLAG - en el ejemplo proporcionado en la figura 1-II, se observó una especie dominante en entre 37 y 50 kDa. El patrón se eluyó contampón de muestra SDS-PAGE fue comparable, con especies más importantes adicionales. Sin embargo, en presencia de péptido / ml 3xFLAG 1 g, FP unión al medio de afinidad se eliminó por debajo del nivel de detección y no se observó en cualquiera de las fracciones de elución nativas o de desnaturalización. Este resultado sugiere que paratopes anticuerpos desocupadas pueden ser promiscuos en ausencia de su epítopo cognado y contribuyen significativamente a la proteoma obtenido durante la captura de afinidad incluso para anticuerpos que se unen a su epítopo en alta afinidad, como es el caso para el 3xFLAG / α-FLAG M2 emparejamiento. También suggestd que condiciones muy estrictas utilizando alta concentración de sal, a menudo elegido para mitigar la unión no específica, pueden ser ineficaces en ausencia de la interacción antígeno / anticuerpo. Para el seguimiento se realiza un experimento que incluye análisis similar por SDS-PAGE, así como cuantitativa MS (Fig. S1). De las 347 proteínas cuantificadas, se observó que todas las proteínas a excepción de una (falsa discotecamuy tasa = 1%; Tabla S1) se asoció con la proteína cebo-etiquetados 3xFLAG en comparación con un péptido 3xFLAG claveteado muestra de control. Estos resultados indican que en nuestros experimentos la inmensa mayoría de las proteínas observadas es probable que co-purificar con la proteína marcada o son desviado subproductos de paratopes α-FLAG no ocupadas. En nuestra experiencia, los altos resultados de la captura por afinidad señal-ruido se ejemplifican en SDS-PAGE y tinción de proteínas por un patrón discreto de bandas nítidas, más o menos abundantes y estequiométricos así como una escasez de tinción de fondo de otras bandas más débiles; numerosos ejemplo de este principio se puede ver en referencia 11. El motivo para el uso de un aislante de PTFE (que se recomienda) cuando cryomilling es reducir la tasa de calentamiento de la jarra durante la molienda, mitigar la carga de la repetida LN 2 de enfriamiento durante el proceso de molienda, y reducir el grado de hielola formación en el frasco. Esto facilita el rendimiento de molienda consistente y facilita el manejo del polvo celular. Ejemplo aisladores se pueden encontrar en la referencia 27 (discos) y representan en la Figura 2, por debajo de (manga-and-puck). <img alt="Figura 1" src="/files/ftp_upload/54518/54518fig1.jpg" /> Figura 1: Seleccionar resultados representativos. (I) Este panel ha sido modificado a partir de 19 de referencia. Azul de Coomassie manchado gel de SDS-poliacrilamida. perlas (IZQUIERDA) a escala micrométrica magnética muestran menor fuera de objetivo vinculante de los medios de comunicación basados ​​en la agarosa. (A) perlas magnéticas; (B) de agarosa tradicional; (C) de hierro impregnada (magnética) de agarosa; cada uno acoplado a anticuerpos anti-FLAG M2 y se usa para capturar la fosfatasa alcalina bacteriana marcada con FLAG (BAP; marcado) claveteado en extractos producidos a partir de células HEK-293 cryomilled. purificaciones basadas en agarosamostraron mayores niveles de adsorción no específica (bandas sin etiqueta). Extractos (derecha) producidos a partir de células HeLa cryomilled exhiben adsorción fuera del objetivo más bajo sobre perlas magnéticas de anticuerpos acoplados a que las producidas por sonicación cuando se utiliza para purificar un complejo de proteína endógena. LAP-tagged 44 RBM7 fue capturado por afinidad usando perlas magnéticas acopladas a anticuerpos anti-GFP policlonales para purificar el complejo SIGUIENTE 19,37 (D) extracto producido a partir de polvo cryomilled; (E) los extractos producidos por sonicación de las células intactas. La barra vertical negro destaca una región del gel donde se observan altos interactores no específicos de masas para ser enriquecido en la muestra preparada por sonicación. Las flechas negras indican los interactores específicos esperados (etiquetados). Bandas observadas ~ 50 kDa en los carriles D y E son atribuibles a llama IgG cadenas pesadas. (II) teñido con plata en gel de SDS-poliacrilamida. (Std.) Un simulacro de captura por afinidad lleva a cabo en células HEK-293células T extrae de la manera estándar. Después de la captura, la elución del material unido se logra a través de (N) no desnaturalizante elución con 1 mg / ml de péptido 3xFLAG o (D) la desnaturalización de elución en tampón de muestra SDS-PAGE; (PB 1) como Std. pero el péptido 3xFLAG se incluyó en la solución de extracción a 1 g / ml para bloquear los paratopes α-FLAG en el medio de afinidad; (PB 10) como PB 1 pero en presencia de péptido / ml 3xFLAG 10 g. bandas relacionadas con IgG y péptido 3xFLAG están etiquetados. <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/54518/54518fig1large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a> <img alt="Figura 2" src="/files/ftp_upload/54518/54518fig2.jpg" /> Figura 2: manga-y-disco de PTFE aislante. Se muestra un frasco de 250 ml de PTFE (1). Un matraz de 50 mL de molienda de acero inoxidable (2) se ajusta dentro de la jarra de PTFE (3) y proporciona laoportunidad de dejar la jarra de molienda instalada dentro de la fábrica entre los ciclos. Un disco de PTFE aislante superior (2) se utiliza entre el conjunto de abrazadera y la tapa del frasco. Para enfriar el conjunto de frasco y aislante instalado (3), se añade LN 2 directamente en el cuerpo del aislador, que rodea el frasco. El siguiente ciclo de fresado entonces puede ser iniciado. <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/54518/54518fig2large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a> <table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody><tr><td> Reactivo </td><td> Concentración sugerida </td><td> notas </td></tr><tr><td> Cloruro de sodio </td><td> 0,1-0,5 M </td><td> Las concentraciones elevadas (&gt; 300 mm) tienden a mejorar la extracción de proteínas totales y mantener los antecedentes escasas, pueden despojar alguna entre lo demás estableactores. Las concentraciones por debajo de 150 mM no son típicamente eficaces en la reducción de fondo no específica. </td></tr><tr><td> Acetato de amonio </td><td> 0,2-2 M </td><td> Una sal, que consiste en dos tampones, que produce una solución de pH neutro 57. Las concentraciones más altas estabilizar algunos complejos de proteínas. Las soluciones ácidas pueden ser el resultado de las poblaciones cristalinas antiguas, almacenados de manera inadecuada a causa de la pérdida de amoníaco. No se requiere ningún tapón, o sales de pH adicional en extractantes que contienen acetato de amonio. Puede combinarse con NaCl para modular los resultados obtenidos. </td></tr><tr><td> Tween 20 </td><td> 0,1% v / v </td><td> Un detergente no iónico 58; típicamente combinada con NaCl. </td></tr><tr><td> Triton X-100 </td><td> 0,5-1% v / v </td><td> Un detergente no iónico 58; normalmente en combinación con cualquiera de NaCl o NH 4 CH 3 CO 2 H </td></tr><tr><td> CHAPS </td><td> 5 mM </td><td> Un detergente bipolar 58 &lt;/ Sup&gt;; típicamente combinada con NaCl. </td></tr><tr><td> Sarkosyl </td><td> 1 mM </td><td> Un detergente aniónico 58 que reduce el fondo y la delantera de componentes complejos estables, lo que podría revelar la conectividad binaria; típicamente combinada con NaCl. </td></tr><tr><td rowspan="2"> Tris-Cl </td><td> 20 mM </td><td rowspan="2"> pKa de 8,8 a 4 ° C, 8,1 a 25 ° C. </td></tr><tr><td> (PH 8,0) </td></tr><tr><td rowspan="2"> HEPES-Na </td><td> 20 mM </td><td rowspan="2"> pKa de 7,8 a 4 ° C, 7,5 a 25 ° C. NaOH o KOH utilizada para el equilibrio de pH en función de la sal (por ejemplo, NaCl, KCl, o CH 3 CO 2 K) se utiliza en el agente de extracción. </td></tr><tr><td> (PH 7,4) </td></tr></tbody></table> Tabla 1: A pocos sugerido reactivos útiles para la purificación de complejos de proteínas. Esta tabla lTSI algunos reactivos que hemos encontrado útiles para la purificación de complejos de proteínas a partir de líneas celulares humanas, con concentraciones de trabajo sugeridas. Una formulación típica de extracción contiene un tampón de pH, una sal, y un detergente 1,11,24,45-48. La mejor práctica es identificar la combinación compleja de menos reactivos que produce el resultado deseado. <img alt="Figura S1" src="/files/ftp_upload/54518/54518figS1.jpg" /> Figura S1: Mezclar Tras el análisis de Purificación (MAP) SILAC de falsos positivos. I. Diagrama esquemático: En este experimento 3xFLAG-tagged complejos de proteínas ORF2p (expresadas a partir de pLD401) fueron purificadas a partir de células HEK-293T pesada y marcado de luz 7, respectivamente. El extracto celular luz marcada se enriquece con péptido 3xFLAG para evitar la captura por afinidad de la ORF2p 3xFLAG-etiquetados por la inhibición competitiva; no se espera para bloquear la unión de proteínas que pueden producirse no específicamente con el medio magnético o las estructuras no paratópicas del anticuerpo. Después de la elución de las perlas magnéticas, las muestras pesadas y ligeras eran post-purificación de mezclado y se analizó por MS cuantitativa (MAP-SILAC 39) para determinar la fracción de proteínas asociadas con ninguna de las muestras; más detalles metodológicos situada en la Tabla S1. II. Plata gel manchado que ilustra que los materiales de la luz y marcado pesados ​​producen resultados comparables (comparar con L H), y que la purificación llevada a cabo en la presencia de la espiga-en 3xFLAG (LI) fue competitivamente inhibida. A continuación, un G-250 enchufe gel teñido con azul de Coomassie que consiste en el mezclado y H fracciones Li, antes del análisis proteómico a base de gel, como se describe en la Tabla S1. <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/54518/54518figS1large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para descargar una versión más grande de esta figura.</a> Tabla S1:MAP-SILAC. Esta hoja contiene los datos obtenidos tras la ejecución del experimento MAP-SILAC se describe en la figura S1. <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/54518/Table_S1.xlsx" target="_blank">Por favor, haga clic aquí para descargar la tabla.</a>

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Protein Complex Affinity Capture from Cryomilled Mammalian Cells

Aquí se describe protocolos para romper las células de mamíferos por molienda en estado sólido a una temperatura criogénica, producir un extracto celular a partir del polvo de células resultante, y aislar los complejos de proteínas de interés por captura de afinidad sobre perlas paramagnéticas a escala micrométrica de anticuerpos acoplados.

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