Name: protein complex affinity capture from cryomilled mammalian cells
Uploaded: 2016-12-09T13:00:00
Duration: 10 min 37 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Protein Complex Affinity Capture from Cryomilled Mammalian Cells at JoVE.com

Vi tackar professor Brian T. Chait för hans ovärderliga råd, stöd och tillgång till MS instrumentering, samt Ms Kelly R. Molloy för utmärkt teknisk support. Vi tackar Ms Kelly Bare för stöd med kopia redigering. Detta arbete stöddes delvis av NIH bidrag P41GM109824, P41GM103314 och P50GM107632.

1. Cell Skörd och frysning <ol><li> Växa 1-8 g av cellmaterial med användning av lämpliga odlingsbetingelser för cellinjen av intresse 25,26. Detta protokoll är optimerad för upp till 8 gram av celler (~ 10 9 celler), modifierade genom referenser 19,27,28. Typiskt, ~ 5 g HEK-293 eller HeLa-celler kan erhållas från åtta 500 cm 2 odlingsplattor vuxit till ~ 90% konfluens. VARNING: Dessa protokoll använder flytande kväve (LN 2), som kan orsaka allvarliga kryogeniska brännskador. Don skyddskläder och motion lämplig försiktighetsåtgärder. </li><li> Häll av tillväxtmediet (avfall) i en stor bägare. </li><li> Placera kulturen skålen på is i en stor rektangulär is pan. </li><li> Tillsätt 20 ml iskall 1x Fosfatbuffrad saltlösning (PBS) till odlingsskålen och frigöra cellerna från skålen med hjälp av en stor cellskrapa; överföra cellerna till en 50 ml rör, för-kyld på is; hålla röret på is. NOTERA: För alla cellhanteringssteg använder en elektro pipett inställd på &quot;låg&quot; och 25 ml pipetter för att undvika överdriven klippning av celler under överförings manipulationer. Ordna 50 ml uppsamlingsrör och 1x PBS i en ishink innan inleda förfarandet. </li><li> Tillsätt ytterligare 10 ml iskall 1x PBS till samma skålen. Samla in de återstående cellerna och överföra dem till den 50 ml rör. </li><li> Upprepa för varje maträtt, cellsuspensioner från olika rätter kan kombineras för att minska antalet stickprov och plastavfall. OBS! Eftersom cellerna själva inte kommer att utgöra en stor del av suspensionens volym, kan tre plattor värde av cellsuspensionen kombineras till två 50 ml rör. Eftersom 50 ml rör faktiskt hålla mer än den nominella volymen, kan åtta plattor typiskt spridda över fem sådana rör. </li><li> Centrifugera i 5 minuter vid 1000 xg, 4 ° C. </li><li> Häll försiktigt bort supernatanten. Resuspendera varje pelleten i 10 ml iskall 1x PBS. Konsolidera Resuspended pellets, upp till fem per 50 ml rör, för att minska antalet stickprov. </li><li> Centrifugera 5 minuter vid 1000 xg, 4 ° C. </li><li> Häll försiktigt bort supernatanten. Återsuspendera pelleten i 10 ml iskall 1 x PBS </li><li> Avlägsna kolven från en 20 ml spruta och ställ den åt sidan. Cap munstycket på sprutan och överför cellsuspensionen till den. </li><li> Placera sprutan inuti ett 50 ml rör och centrifugera 5 min vid 1000 xg, 4 ° C. </li><li> Aspirera supernatanten med en fin spets pipett ansluten till en vakuumfälla systemet tills bara det översta lagret av celler börjar att sugas upp. Detta resulterar i en våt cellpellet. </li><li> Ta bort skyddet sprutan sätter kolven och droppa cellerna direkt i en stor plastbägare fylld med LN 2, som hölls i en LN två bad i en frigolitlåda. Forcibly försätta de återstående cellerna från sprutan. </li><li> Överföra de frysta cellerna till 50 ml rör genom att hälla. Löst lock rören så att överflödigt LN 2 avdunsta; håll tfåll över natten vid -80 ° C. Dra lock helt nästa dag. Den frysta cell kan lagras på detta sätt vid -80 ° C tills cryomilling. OBS: Inte tätt stänga rören innan alla LN 2 har synligt avdunstat, annars överdrivet tryck kan orsaka röret att explodera. Inte stänga rören efter det att LN 2 har försvunnit kan resultera i ansamling av frost på celler material, tillsats av ett överskott vatten vikt och effektivt minska protein koncentration vid fräsning. </li></ol> 2. Kryogen Störningar av frysta celler OBS: Alla verktyg för fräsning och manipulationer bör förkylts med LN 2. En liten karaff kommer att krävas för att addera LN 2 inuti burken och för att hälla LN 2 över toppen av den slutna fräs burken. En hemmagjord verktyg visas i referens 19. Kryogeniska handskar kommer att behövas för att hantera LN två kylda malningsapparat. malnings~~POS=TRUNCburk lock som används här (se tabell av material) vanligtvis levereras med en gummipackning installerad; detta kommer att behöva ersättas med en kommersiellt tillgänglig Teflon lock packning på ett tillförlitligt sätt utföra följande protokoll. På grund påtryckningar från gasformig N2 kan bygga upp till höga nivåer inom burken under fräsning, rekommenderar vi att installera en kommersiellt tillgänglig 5 bar / 500 kPa övertrycksventil som en säkerhetsutlösning försiktighetsåtgärd 28. <ol><li> Ta bort cell pärlor från -80 ° C lagring och hålla i en 50 ml rör Hållare på LN 2 bad. </li><li> Pre-kyla 50 ml burk, två 20 mm bollar, och lock i en ren rektangulär ishink innehållande LN 2. Pre-kyla Polytetrafluoreten (PTFE) isolator om använder en; antingen en uppsättning av puckar (se referens 27), eller en hylsa-and-puck (se figur 2). Förkylning är klar när den våldsamma kokning av LN 2 lugnar. </li><li> Ställ lämplig motvikt påkvarn. OBS: Detta kommer att vara lika med massan av burken, burk lock, varvid malkroppar användes, och mängden av celler som skall sättas till burken. Om någon PTFE isolatorer används bör deras massa också ingå. Vi föreslår inspelning massorna i burken, locket och kulor (och deras kombinerade massa, inklusive eventuell isolator används) i förväg och spela in dem på ett informativt ark lagras nära kvarnen. </li><li> Använd pincett, placera de två förkyld 20 mm fräs bollar och de frusna cellerna på insidan av förkylda fräs burk. Obs: På grund av små förluster av material på burken och bollen ytor under fräsning, andelen återvunna materialet ökar när massan av celler malda ökar. Av den metod som beskrivs, materiella förluster är mycket blygsamma, är i storleksordningen av ~ 0,3 g våt cellvikt (WCW). Tillverkarens anvisningar anger den maximala volymen av prov laddade bör vara ~ 1/3 av burk volym. 29 Den totala volymen av kulorna skall vara ~ 1/3 och remaining ~ 1/3 ledigt utrymme är fri rörlighet för kulorna. </li><li> Lägg LN 2 i burken upp till ~ ½ full placera locket på burken och överföra sammansättningen till kvarnen. OBS: Installera först valda isolatorn om du använder en. </li><li> Kläm fast montering på plats och utför tre cykler av fräsning med hjälp av följande program: 400 rpm, 3 min, omvänd rotation varje minut, ingen intervall paus. Kyla malnings burken med LN 2 mellan varje cykel. OBS! Under fräsning en distinkt clunking buller alstras som kulorna kolliderar i burken i planeternas rörelser. Om dessa ljud inte hörs, är fräsning inte förekommer. Avsluta fräscykeln, räknas inte denna cykel, flyttar burken enheten tillbaka till LN 2 och undersöka innehållet i burken. Se till att ingen is har bildats och om den har chip bort från burken väggarna med en förkyld spatel. Börja om från steg 2,5. Om du använder några isolator eller isolator puckar flyttar burken enheten tillbaka till LN <sub&gt; 2 mellan cykler för att åter sval och lägga LN 2 ~ ½ fullt ut varje gång. LN 2 tillsättes kommer att avdunsta inuti burken när temperaturen hos de jar ökar under fräsning. Detta resulterar i tryckuppbyggnad inuti burken. Därför, när urkoppling av burken från kvarnen, frigöra klämman mycket långsamt. Om klämman släpps snabbt, kan cellpulver fly med snabb trycksänkning. En långsam frisättning av klämman tillåter trycket att fly från burken i en mild, kontrollerat sätt, och förhindrar förlust av cellmaterial. Den milda utsläpp av gasformiga N2 kan ofta höras väsande som klämman långsamt släppt - är detta normalt. Vid användning av en hylsa-och-puck isolator, kan burken aggregatet lämnas kvar i kvarnen och LN 2 adderas till isolatorn / burken montering in situ. </li><li> Flytta burken tillbaka till LN 2, och låt vila kortvarigt för att svalna. Vid användning av en hylsa-och-puck isolator, kan burken tas bort från hylsan wed hjälp av två spatlar, ger hävstångseffekt på vardera sidan. När burken vilar i LN 2, försiktigt bort locket, ta bort kulorna med hjälp av pincett, och överföra pulvret till en i förväg kyld 50 ml rör med hjälp av en i förväg kyld spatel. Lägga lite LN 2 till öppen burk / pulver kan hjälpa till att få bort pulver som caked på kulorna, innan du tar bort dem. ANMÄRKNING: När burken har öppnats, tillsätt en liten mängd LN 2 till det innan du tar bort kulorna. Detta kommer att bidra till att återhämta sig pulver caked på ytorna. Cell pulver bör hållas vid -80 ° C eller lägre fram till användning. Enligt vår erfarenhet kan cellpulver lagras på detta sätt, i huvudsak på obestämd tid, utan att påverka prestanda. </li></ol> 3. affinitetsinfångning av proteinkomplex från cellextrakt OBSERVERA: Följande protokoll implementerar affinitetsmedia bestående av en affinitetsligand, bete, eller antikropp som interagerar med det intressanta proteinet, coupled att Micron skala paramagnetiska pärlor. Dessa kan framställas internt 19,30, med hjälp av kommersiellt tillgängliga kit, eller köpas som färdiga reagenser. <ol><li> Cellextrakt Framställning OBS: Vid hantering av cell pulver, kom ihåg att använda redskap och rör förkyld med LN 2. Rör innehållande cell pulver skall alltid hållas på LN 2 när inte vid -80 ° C. Placera 50 ml rör (s) som innehåller cellpulver i en provrörsställ, i en frigolit behållare med LN 2. <ol><li> Väg upp 100 mg av cellpulvret till ett 1,5 eller 2 ml mikrofugrör. OBS: Vi har observerat att denna mängd av celler är en bra utgångspunkt som vanligtvis kommer att ge målproteinet i tiotals till hundratals nanogram varierar efter affinitetsinfångning för en måttligt uttryckt protein (~ massa 50 kDa, närvarande på tusentals kopior per cell), förutsatt utvinning och fånga effektivitet i målet är ≳70%. Sådana utbyten ge direkt visualization av den renade fraktionen genom SDS-PAGE och proteinfärgning. </li><li> Tara analytisk balans med den tomma mikrofugrör. Fördela cell pulvret i ett rör med hjälp av en LN två kyld sked eller spatel. Kontrollera massan av pulvret fördelas inuti röret på analysvåg. OBS: För att underlätta vägning av cellpulver, kan små volymetriska doseringsskedar användas. Dessa har befunnits ge reproducerbara resultat (se referens 19). Vi har funnit bästa resultat med skruvkork eller &quot;safe-lock&quot; mikrocentrifugrör. Tryck från att avdunsta LN 2 som kan komma in i rören kan orsaka vanliga mikrocentrifugrör till pop öppna under efterföljande uppvärmningen strax före tillsatsen av extraktionslösningen - vilket kan resultera i förlust av provet. </li><li> Öppna röret (eller lossa skruvkork) med cellpulver och låt stå vid RT under 1 min. Detta kommer att frigöra trycket i röret och förhindra omedelbar frysning av utvinninglösning när de tillsätts till pulvret. Ingen upptining observeras under 1 min inkubation. </li><li> Tillsätt 400 pl extraktionsmedlet kompletterats med proteashämmare och vortex en kort stund, sedan hålla på is medan du fortsätter till steg 3.1.5. Prover bör hållas på is mellan alla efterföljande manipulationer tills elueringen. OBS: Den bästa sammansättningen av extraktionsmedlet kommer att bero på proteinkomplexet (ES) som skall renas. Viss allmän vägledning ges i tabell 1 och stöd referenser. </li><li> Använd en mikroultraljud att ge provet en kort låg energipuls för att skingra några aggregat. (Ultra) sonikat med 4 pulser (2 sekunder vardera, 2 A, ca 15-20 J av den totala energin). OBS: Vortexblandning doserar cellen pulvret i extraktionsmedlet, men beroende på lösningens karaktär, kan observeras vissa aggregat. Vi har funnit att dispergering dessa aggregat ger det bästa avkastningen under efterföljande affinitetsinfångning. En kort mikrospets soniningen sprider lätt dessa aggregat. Lösningen ska visas halvgenomskinlig men homogen, utan uppenbara aggregat. Vattenbad sonicators tenderar att vara alltför låg effekt för att på ett effektivt sätt sprida sådana aggregat utan betydligt längre provhandläggningstider, men kan vara lämpliga med lämpliga inställningar. </li><li> Klargöra extraktet genom centrifugering (t.ex., 20000 x g, 10 min, 4 ° C). ANMÄRKNING: En alikvot av det klargjorda cellextraktet kan sparas för jämförelse med innehållet i pelleten, den post-affinitetsinfångnings supernatant, och de fraktioner som erhölls efter eluering från affinitetsmediet för att bestämma effektiviteten av extraktion och avskiljning av målproteinet , t.ex. genom western blöt (se diskussion). </li><li> Avlägsna supernatanten (förtydligas extrakt) och fortsätt till affinitetsinfångnings. OBS: Pelleten kan återextraheras i SDS-PAGE-provladdningsbuffert vid 70 ° C för att bestämma graden av frisättning av målproteinet dnder den första icke-denaturer extraktion genom jämförelse med det extrakt som erhållits i steg 3.1.6. </li></ol></li><li> affinitets Capture <ol><li> Förtvättas det magnetiska affinitetsmediet. Detta kan göras medan cellextrakten håller centrifugeras. </li><li> Placera röret (er) på magneten. Pärlorna kommer att ackumuleras på den sida av röret inom några sekunder, vilket tillåter lagringslösning som skall avlägsnas. </li><li> Tillsätt 500 l av extraktionslösning till pärlor. Kortfattat virvel blandning vid medelhastighet (tillräcklig för att suspendera). Puls snurra rören i en mini-centrifug för att samla allt innehåll till botten. Om du gör det garanterar minimi överföring av lösningar. Placera rören på magneten och aspirera lösningen. OBS: Magnetiska medier med särdrag finns tillgängliga från en mängd olika kommersiella leverantörer. Resultaten kan variera beroende på dessa egenskaper, inklusive pärlstorlek, likformighet, ytbeläggning, och antikroppskopplingskemi. Side-by-side prövningar i din ansökan rekommenderas innan han gick över ett val reagens. </li><li> Starta affinitetsinfångnings genom att överföra klarcellextraktet till en 1,5-2,0 ml rör innehållande förtvättad affinitetsmedium och vortex en kort stund för att resuspendera. </li><li> Inkubera i 30 min vid 4 ° C med kontinuerlig varsam blandning på en rotator hjul; pärlorna bör hålla sig svävande i hela inkubation. </li><li> Puls-snurra rören i en minicentrifug för att samla allt innehåll till botten av röret. Aspirera supernatanten och tvätta pärlorna tre gånger med 1 ml kall extraktionslösningen såsom beskrivs i steg 3.2.3. Placera rören på magneten. Ta lösningen. Fortsätt att lägga till nästa lösning och upprepa. Under 2 nd tvätta, överför pärlorna och tvättlösning tillsammans till ett nytt mikrofugrör genom pipettering. Detta minskar provkontaminering, vid punkten för eluering, genom slumpmässiga proteiner adsorberas till väggarna hos röret som används för inkubation med than cellextrakt. Efter den 3: e tvätten, bör pärlorna vara puls-spunnet helt kort i en minicentrifug för att samla allt innehåll till botten. Placera röret tillbaka på magneten och ta bort eventuellt kvarvarande vätska. Detta medger avlägsnande av de sista pl lösning före eluering, garanterar de eluerade proverna kommer att ha enhetliga volymer. Det garanterar också elueringen blir effektiv, eftersom elueringslösningen inte kommer att spädas ut av resterande tvätt; sådana rester kan också bidra till salteffekter och förändrar migreringen av proteiner i SDS-PAGE (se nedan). ANMÄRKNING: En alikvot av den post-bindande supematanten kan sparas för jämförelse med det klargjorda extraktet genereras i 3.1.6. genom western blöt. Resultatet kommer att ange graden av utarmning av målproteinet från cellextraktet. </li><li> Eluera i antingen en naturlig denaturera sätt; överväga strategin bäst för nedströms ansökan 1. OBS: Detaljerna infödda eluering strategies kommer att bero på affinitetsmärkningen som används (se diskussion). För de flesta användare, denaturerande eluering med SDS-PAGE-provbuffert följt av analys av provet genom SDS-PAGE med proteinfärgning 31, kommer att vara den mest praktiska ursprungliga strategi. OBS: Sammansättningen av provbufferten kommer att bero på elektroforessystem som används. Många labb avge sina egna Tris-glycin geler, att använda sig av diskontinuerliga elektrofores och Laemmli buffertsystemet 32-34. En gemensam provbuffert recept (1x) innehåller: 10% (vikt / volym) sackaros, 50 mM DTT, 2% (vikt / volym) SDS, 62,5 mM Tris-Cl pH 8,8, 0,0004% (vikt / vol) bromfenolblått 31 . Vi föreslår att förbereda en 1.1x lager som utelämnar DTT. 1/10: e volymen av 500 mM DTT bör läggas till provet före SDS-PAGE (se nedan). Många kommersiellt tillgängliga SDS-PAGE-system är också tillgängliga; Dessa kan inkludera systemspecifika provbuffertar. </li><li> Lägga SDS-PAGE-provbuffert utan reducerande medel (för att minska utsläppetav antikroppskedjor från pärlorna) och inkubera under 5-10 minuter vid rumstemperatur med omrörning. OBS: Detta kommer att störa de flesta affinitetsbaserade interaktioner, släppa de infångade proteinerna i supernatanten. Mer ihållande interaktioner kan dra nytta av förhöjd temperatur för övergång (typiskt 70 ° C är tillräcklig). </li><li> Samla och spara supernatanten. Prover kan frysas vid -20 ° C under kort lagring (några dagar) eller -80 ° C för långtidsförvaring tills analys önskas. </li><li> Utsätta proverna för SDS-PAGE följt av proteinfärgning med användning av standardtekniker 31. MS kan användas för att karakterisera provets sammansättning 1. Individuella proteinband kan skäras ut för identifiering eller hela provet kan karakteriseras i en enda analys genom elektrofores av provet endast kortvarigt (4-6 mm in i gelén) och bearbetning av alla proteinerna i provet tillsammans som en &quot;gel pluggen. &#39; OBS: Lägg DTT före initing elektrofores. Om planerar att gå vidare till MS, kan proverna alkyleras efter elektrofores 35; emellertid är det ofta mer bekvämt att alkylera före elektrofores 36. </li></ol></li></ol>

The authors declare that they have no competing financial interests.

Dessa tre protokoll arbetar tillsammans för att (1) förbereda celler för solid-state brott genom cryomilling, (2) åstadkomma brott i en planet kulkvarn, och (3) producerar extrakt från cell pulver till affinitetsinfångning ett protein av intresse i komplex med dess fysiologiska interactmedlemmar. Många olika cellysering tekniker finns, inklusive mekaniska / fysikaliska metoder som utnyttjar krossning effekt, klippning och / eller tryck, samt kemiska / enzymatiska metoder, var och en med olika för- och nackdelar 49,50. Varje utredare uppmuntras att undersöka metoder är mest lämpade för sina analyser, med tanke på att någon vald metod för cellbrott och proteinextraktion är sannolikt att införa fördomar 51,52 nödvändiggör empirisk optimering (diskuteras nedan). Mekaniska metoder kan producera hög värme och / eller skjuvkrafter, som kan störa proteinkomplex. Cryomilling undviker uppvärmningseffekter genom att använda LN två kylning av prover för than varaktighet av processen. Planet kulkvarnar förstås att förlita sig på påverkan och friktionskrafter, inklusive skjuvspänning, som komponenter i partikelstorleksminskning 53,54. Vid inställningar rapporterade vi inte har observerat degeneration av proteinkomplex. I själva verket har vi extraherade och hämtas synes intakta ~ 50 Mda kärnpor komplex 11 och enzymatiskt aktiva retrotransposoner uppvisar högre specifik aktivitet än preparat som använder &quot;mild&quot; tvättmedel baserade lys 7. Kemiska / enzymatiska metoder för cellys lider av begränsningen att innehållet i cellen frigörs i ett in vitro-miljö som stödjer avbrott i cellmembran och strukturella makromolekyler, men kanske inte passar för underhåll av integriteten hos proteinkomplexet (es ) av intresse. Ofta, varken beståndsdelarna i komplexen som bildas med proteinet av intresse och inte heller de villkor som behövs för att stabilisera målkomplex ärkända i förväg. En stor fördel med solid-state fräsning är att brott och utvinning är okopplade, medger källmaterial som skall framställas utan tillsatt vätska, lagras (vid -80 ° C eller lägre), samlat och bekvämt hämtas för on-demand experiment; t.ex. att undersöka optimerade in vitro förutsättningar för affinitetsinfångning. Proteininteraktioner är mest stabila vid hög koncentration 55,56, därför minimera volymen av extraktionsmedlet kan vara fördelaktigt för att bevara fysiologiska interaktioner. Å andra sidan finns det praktiska överväganden - de proteinkomplex behöver partition ut ur cellerna och in i en icke-viskös vattenhaltig fas, fri från olösliga aggregat, för att blanda de målkomplex med affinitetsmediet. Dessutom behövs en viss standardisering och kontroll över in vitro miljö (pH, saltkoncentration, etc.) för systematisering och reproducerbarhet. Vi finner att extraherar produced i utspädnings intervallet 1: 4-1: 9 (vikt: vol) uppfyller praktiska och teoretiska problem, som ger kvalitetsresultat. Dessutom, det optimala förhållandet mellan cellextrakt för att affinitetsmedelbehov som skall fastställas. Detta görs empiriskt genom titrering av extrakt med varierande mängder av affinitetsmediet och kan ha detekterbara effekter på förhållandet signal-till-brus av experimentet, diskuteras ytterligare nedan. En utmärkt utarmning av målproteinet är typiskt ≥70% av den lösliga fraktionen av målproteinet, men&gt; 90% är önskvärt och kan vara möjlig att uppnå med noggrann parametrering av extraktionsbetingelser. Många sådana praktiska överväganden behandlas i referens 1. Paramagnetiska pärlor manipuleras med hjälp neodymmagneter i en specialiserad mikrocentrifugrör hållare, även hemlagad alternativ är livskraftiga. När de placeras i hållaren, pärlor ansamlas vid sidan av röret under inverkan av det magnetiska fältet. Lösningar kan därefter avlägsnas utan disturbing pärlorna. En begränsning av den presenterade cryomilling protokollet utvecklats med planet kulkvarn används här (se tabell of Materials), är att en minimal mängd material krävs för att effektivt kvarn och återställa cell pulver med hjälp av den här enheten (&gt; 1 g). Sådana mängder kan lätt erhållas med många mikrober, cellinjer och modellorganismer, och kan också ofta uppnås med vävnader utskurna från försöksdjur. Emellertid kan vissa cellinjer vara mycket svårt att växa i överflöd och djurvävnader kan vara knappa. Små mängder av material kan jämförbar malas med hjälp av andra anordningar som utnyttjar mindre behållare, men potentiellt på bekostnad av pulver finhet uppnås. Dessutom kan kostnaden för mekaniska fräsanordningar vara oöverkomligt dyr för vissa laboratorier. Cryomilling kan uppnås med användning av ett antal alternativa uppställningar 14-19, inklusive, mest kostnadseffektivt för hand med användning av en pestle och murbruk, även om brott verkningsgrad sjunker avsevärt. Affinitetsinfångning protokoll syftar typiskt för en hög effektivitet av cell-lys för att underlätta maximal proteinextraktion i lösning och därmed maximal potential för infångning av målproteinet komplex. Å andra sidan har det visats för jäst in vitro skarvning extrakt att maximal lys inte kan likställa med maximal in vitro biokemisk aktivitet 57,58. Vi har inte observerat sådana problem i de system vi har testat hittills och därför inte avsiktligt begränsa vår cellbrott när cryomilling. Icke desto mindre bör denna möjlighet i åtanke när man optimerar för in vitro-enzymatiska analyser. Även cryomilling är en mycket effektiv metod för att bryta celler, en begränsad mängd ultraljudsbehandling ofta gynnar produktions homogena helcellextrakt från däggdjursvävnader eftersom inhomogena aggregat kan ibland observeras genom visuell inspektion: typiskti extraktionsbetingelser med användning av låg till måttlig salt (100-300 mM) och icke-jonisk detergent (0,1-1% vol / vol) koncentrationer. Eftersom vi observerat att närvaron av dessa aggregat kan minska avkastningen och / eller kvaliteten på den efterföljande affinitetsinfångnings, vi rutinmässigt genomföra ultraljudsbehandling för att sprida dem (även när de inte observeras med blotta ögat). Aggregaten är förenliga med agglomererade membranfragment, som är jämförbara med dem som tidigare rapporterats i extrakt från malda jästceller 58. Ultraljudsbehandling används också i vissa protokoll för att klippa DNA och befria kromatin fragment i lösning, men graden av ultraljud tillämpas i detta protokoll inte nämnvärt fragment DNA. Den begränsade tillgängligheten (eller den höga kostnaden) av en utmärkt affinitetsligand eller antikropp mot det specifika proteinet av intresse kan vara en annan hinder. Ett brett utbud av kommersiellt tillgängliga affinitetsreagens kan tas tillvara när modellorganism är mottaglig för genomisk märkning eller transfection med ektopiska expressionsvektorer, som medger expression av proteiner av intresse som affinitets-taggade fusioner. Däremot har produktionen av anpassade antikroppar blivit allt möjligt och både polyklonala och monoklonala antikroppar kan utföra utmärkt i affinitetsinfångning applikationer. Dessa många överväganden omfattas också mer i detalj i referens 1. Exempel på hur cellen lyseringsmetoden och val av affinitetsmediet kan påverka Resultaten illustreras i Figur 1. Exempel på effekter som utövas av olika extraktionsmedel kan ses i referenser 1,11,24. Eftersom dessa och andra experimentella parametrar påverkar kvaliteten på affinitetsinfångnings, vilket gör det svårt att skilja FP, till förråd av &quot;pärla proteom&quot; och beräkningsmetoder eliminera ospecifika föroreningar har tagits fram för att hjälpa till att identifiera ramprogrammen 40-43. Ändå sådana metoder endast substitute för optimal beredning av prov i en begränsad utsträckning 59. Användning av bästa praxis och empiriskt optimera affinitetsinfångnings experiment kommer att ge högsta kvalitet prover som sedan analyseras nedströms, diskuteras vidare nedan. En lätt implementeras praxis som kan förbättra prov renhet är infödd eluering. Nativt eluering Oftast används för att erhålla den affinitet isolerad proteinkomplex, intakt, för ytterligare experimentering; men eftersom det ofta förbättrar prov renhet, det kan också användas för detta skäl. Emellertid, som visats i figur 1, panel II, kan förmågan hos nativt eluering för att förbättra prov renhet beror på en exakt titrering av den mängd affinitetsmedium till överflödet av målproteinet i cellextraktet - när mediet är i överskott kan lediga paratoper tillåta off-target ansamling av FP proteiner observer i inbyggt eluerade fraktionerna. Med hjälp av reagens och förfaranden som beskrivs här, det hsom varit vår erfarenhet att den största enskilda bidragsgivaren av ramprogrammen till våra experiment är det märkta proteinet själv en gång avlägsnats från ramen för den levande cellen. (Fig. 1.II och Fig. S1). I sådana fall, modercellinjen kontroller som ger irrelevanta proteom i frånvaro av antigenet är av inget praktiskt värde; likaledes för taggen enbart eller spik-kontroller som saknar något annat än målantigenet. Därför, när praktisk vi genomför I-DIRT 7,38, som direkt mäter ackumuleringen av efter lys proteininteraktioner med hjälp av kvantitativa MS. Som nämnts i steg 3.2.7 i protokollet, kommer förfaranden för infödda eluering variera med detaljerna i affinitetssystemet används. Nativt eluering är oftast uppnås genom kompetitiv undanträngning av det märkta proteinkomplex eller proteolytisk klyvning av taggen, släppa komplexet från affinitetsmediet. Flera affinitetssystem som består av små epitopmärkningar existerar, for som epitopen i sig är tillgängligt som peptid som är användbar för konkurrenskraftig eluering av etiketteproteinkomplex 60. Likaså flera proteaser finns tillgängliga för att specifikt klyva besläktade platser strategiskt placerade i affinitet taggade fusionsproteiner 61. Beroende på detaljerna i de valda affinitetssystem, kan den lämpliga elueringen systemet antas. I allmänhet, kommer kvaliteten på de uppnådda resultaten påverkas avsevärt av kvaliteten på provberedning. Det är viktigt att arbeta noggrant och exakt genom varje steg i dessa protokoll, och så snabbt som möjligt med bibehållande av omsorg och precision. Det är lämpligt att spåra uppdelningen av proteinet av intresse genom varje steg för att förstå effektiviteten av varje manipulation. Till exempel: hur riklig är proteinet av intresse i cellen eller vävnaden i fråga? Kanske proteinet som studeras (och dess komplex) kommer att vara svårt att karaktärisera massspektrometri på grund av begränsad omfattning. Om de renade komplexen kan detekteras genom allmän proteinfärgning (ungefär nanogram intervall), kommer sannolikt att lyckas masspektrometri. Om den infångade proteinet av intresse endast kan upptäckas genom känsliga förstärkt kemiluminiscerande western blotting (ungefär pikogram intervall), är mindre sannolikt att vara effektiva masspektrometri. Även om proteinet av intresse är rikligt förekommande i cellen, hur rikligt är det i cellextraktet som produceras? Gör proteinet partitionen till lösningen eller är det i pelleten? Om det senare, kan en ny extraktion lösning utarbetas som kan förbättra återvinningen. När väl cellextraktet kombineras med affinitetsmediet, hur effektivt är det protein fångas? Har proteinet förblir bundna genom efterföljande tvättar? Vad om andra copurifying proteiner? Genom att spara en alikvot av varje prov vid lämpliga steg av protokollet dessa frågor lätt kan besvaras, typiskt genom western blotting mot proteinet av intresseeller allmän proteinfärgning, men andra analyser kan också vara lämpliga. Optimera varje steg kommer att öka utbytet och renheten av infångade komplex, även om det kan finnas en avvägning göras i maximera ett attribut eller den andra. En typisk tillämpning av affinitetsinfångning för många forskare är att identifiera kandidat in vivo Interact för ett litet antal proteiner av intresse; dessa kandidater vanligen utsätts för validering av ortogonala metoder in vivo för att visa den biologiska betydelsen av fysiska interactmedlemmarna. Affinitetsinfångning används också av hög genomströmning studier för att generera listor med copurifying proteiner som observerats på en (nästan) proteomet-nivå, vilket underlättar beräknings slutsatser om förmodade in vivo komplex. Många exempel på sådana studier kan hittas i litteraturen. Detta tillvägagångssätt avstår från optimering av villkoren för fångst för varje givet mål till förmån för att utforska människany mål; som sådana, de antydda komplexen själva sällan hämtas helt intakt och mycket ren i varje givet prov. Snarare är de partiella överlappningar i kompositioner som observerats mellan många olika affinitets fångade prov användas som underlag för de slutsatser 42. Båda tillvägagångssätten bidrar värdefulla data till vår förståelse av interactome. Ändå är en stor fördel av affinitetsinfångning att det ger ofta möjlighet att få komplexen intakt och högrenat, förutsatt att ansträngningar görs för att optimera förfarandet. Vi tror att framtiden för den strategi ligger i att öka den lätthet och effektivitet att optimera infångandet av endogena proteinkomplex 11, för mer exakt bedömning av spektrat av fysiologiska Interact och mer frekvent användning i längre nedströms biokemiska, enzymologisk och strukturstudier, t.ex., refererar 7,9,23.

A correction was made to: Protein Complex Affinity Capture from Cryomilled Mammalian Cells. The References section has been updated from:
<ol start="29">
	<li>Cristea, I. M., &#38; Chait, B. T. Conjugation of magnetic beads for immunopurification of protein complexes. Cold Spring Harbor Protocols. 2011 (5) (2011).</li>
	<li>Rosenberg, I. M. Electrophoretic Techniques. Protein Analysis and Purification. (4), 63&#8211;117 (2005).</li>
	<li>Ornstein, L. Disc Electrophoresis. I. Background and Theory. Ann N Y Acad Sci. 121 (A2), 321&#8211;349 (1964).</li>
	<li>Davis, B. J. Disc Electrophoresis. II. Method and Application to Human Serum Proteins. Ann N Y Acad Sci. 121, 404&#8211;427 (1964).</li>
	<li>Laemmli, U. K. Cleavage of structural proteins during the assembly of the head of bacteriophage T4. Nature. 227 (5259), 680&#8211;685 (1970).</li>
	<li>Shevchenko, A., Tomas, H., Havlis, J., Olsen, J. V., &#38; Mann, M. In-gel digestion for mass spectrometric characterization of proteins and proteomes. Nature protocols. 1 (6), 2856&#8211;2860 (2006).</li>
	<li>DeGrasse, J. A., Kalkum, M., Krutchinsky, A.N., Padovan, J. C., &#38; Zhang, W. MALDI Sample Preparation. rockefeller.edu at &#60;http://prowl.rockefeller.edu/protocols/in-gel-digestion.html&#62; (2006).</li>
	<li>Lubas, M., Christensen, M. S., et al. Interaction profiling identifies the human nuclear exosome targeting complex. Mol Cell. 43 (4), 624&#8211;637 (2011).</li>
	<li>Tackett, A. J., DeGrasse, J. A., Sekedat, M. D., Oeffinger, M., Rout, M. P., &#38; Chait, B. T. I-DIRT, a general method for distinguishing between specific and nonspecific protein interactions. J Proteome Res. 4 (5), 1752&#8211;1756 (2005).</li>
	<li>Wang, X., &#38; Huang, L. Identifying dynamic interactors of protein complexes by quantitative mass spectrometry. Mol Cell Proteomics. 7 (1), 46&#8211;57 (2008).</li>
	<li>Trinkle-Mulcahy, L., Boulon, S., et al. Identifying specific protein interaction partners using quantitative mass spectrometry and bead proteomes. J Cell Biol. 183 (2), 223&#8211;239 (2008).</li>
	<li>Boulon, S., Ahmad, Y., et al. Establishment of a protein frequency library and its application in the reliable identification of specific protein interaction partners. Mol Cell Proteomics. 9 (5), 861&#8211;879 (2010).</li>
	<li>Armean, I. M., Lilley, K. S., &#38; Trotter, M. W. B. Popular computational methods to assess multiprotein complexes derived from label-free affinity purification and mass spectrometry (AP-MS) experiments. Mol Cell Proteomics. 12 (1), 1&#8211;13 (2013).</li>
	<li>Mellacheruvu, D., Wright, Z., et al. The CRAPome: a contaminant repository for affinity purification-mass spectrometry data. Nat Methods. (2013).</li>
	<li>Cheeseman, I. M., &#38; Desai, A. A combined approach for the localization and tandem affinity purification of protein complexes from metazoans. Sci. STKE 2005 (266), pl1 (2005).</li>
	<li>Goldberg, S. Mechanical/physical methods of cell disruption and tissue homogenization. Methods in Molecular Biology. 424 (Chapter 1), 3&#8211;22 (2008).</li>
	<li>Grabski, A. C. Advances in preparation of biological extracts for protein purification. Methods in Enzymology. 463 (C), 285&#8211;303 (2009).</li>
	<li>Dhabaria, A., Cifani, P., Reed, C., Steen, H., &#38; Kentsis, A. A High-Efficiency Cellular Extraction System for Biological Proteomics. J Proteome Res. 14 (8), 3403&#8211;3408 (2015).</li>
	<li>Glatter, T., Ahrn&#233;, E., &#38; Schmidt, A. Comparison of Different Sample Preparation Protocols Reveals Lysis Buffer-Specific Extraction Biases in Gram-Negative Bacteria and Human Cells. J Proteome Res. 15 (2), 679 (2016).</li>
	<li>Zhao, Q.-Q., Yamada, S., &#38; Jimbo, G. The Mechanism and Grinding Limit of Planetary Ball Milling. KONA. 7, 29&#8211;36 (1989).</li>
	<li>Sheng-Yong, L., Qiong-Jing, M., Zheng, P., Xiao-Dong, L., &#38; Jian-Hua, Y. Simulation of ball motion and energy transfer in a planetary ball mill. Chinese Phys. B 21 (7), 078201 (2012).</li>
	<li>Fulton, A. B. How crowded is the cytoplasm? Cell. 30 (2), 345&#8211;347 (1982).</li>
	<li>Ellis, R. J. Macromolecular crowding: obvious but underappreciated. Trends Biochem Sci. 26 (10), 597&#8211;604 (2001).</li>
	<li>Kalkum, M. Using the Retsch MM301 Ball Mill for Cryogenic Disruption of Yeast Cells. 2 City of Hope, (2003).</li>
	<li>Staley, J. Making Whole Cell Extract of Saccharomyces cerevisiae cells using the Retsch MM301 Ball Mill. Retsch GmbH: (2005).</li>
	<li>Bell, A. W., Nilsson, T., Kearney, R. E., &#38; Bergeron, J. J. M. The protein microscope: Incorporating mass spectrometry into cell biology. Nat Methods. 4 (10), 783&#8211;784 (2007).</li>
	<li>Zhao, X., Li, G., &#38; Liang, S. Several affinity tags commonly used in chromatographic purification. J Anal Methods Chem. 2013 (1), 581093&#8211;8 (2013).</li>
	<li>Waugh, D. S. An overview of enzymatic reagents for the removal of affinity tags. 80 (2), 283&#8211;293 (2011).</li>
	<li>Williams, R. J., &#38; Lyman, C. M. A neutral buffered standard for hydrogen ion work and accurate titrations which can be prepared in one minute. J Am Chem Soc. 54 (5), 1911&#8211;1912 (1932).</li>
	<li>Johnson, M. Detergents: Triton X-100, Tween-20, and More. labome.com. 3 (163) (2013).</li>
	<li>Deppert, W. R., &#38; Luka&#265;in, R. Buffers and Additives. Journal of Chromatography Library. 61 (C), 839&#8211;862 (1999).</li>
	<li>Ugwu, S. O., &#38; Apte, S. P. The Effect of Buffers on Protein Conformational Stability. Pharmaceutical Technology. 28 (3), 86&#8211;108 (2004).</li>
	<li>Linke, D. Detergents: an overview. Methods in Enzymology. 463 (34), 603&#8211;617 (2009).</li>
	<li>Zhang, J. Protein-Protein Interactions in Salt Solutions. Protein-Protein Interactions Computational and Experimental Tools. (18), 359&#8211;376 (2012).</li>
</ol>
to:
<ol start="29">
	<li>Ball Mills - Guidelines for sample amount and ball charge. 1&#8211;3at &#60;http://www.retsch.com/products/milling/ball-mills/planetary-ball-mill-pm-100/information-downloads/&#62; Retsch GmbH (2014).</li>
	<li>Cristea, I. M., &#38; Chait, B. T. Conjugation of magnetic beads for immunopurification of protein complexes. Cold Spring Harbor Protocols. 2011 (5) (2011).</li>
	<li>Rosenberg, I. M. Electrophoretic Techniques. Protein Analysis and Purification. (4), 63&#8211;117 (2005).</li>
	<li>Ornstein, L. Disc Electrophoresis. I. Background and Theory. Ann N Y Acad Sci. 121 (A2), 321&#8211;349 (1964).</li>
	<li>Davis, B. J. Disc Electrophoresis. II. Method and Application to Human Serum Proteins. Ann N Y Acad Sci. 121, 404&#8211;427 (1964).</li>
	<li>Laemmli, U. K. Cleavage of structural proteins during the assembly of the head of bacteriophage T4. Nature. 227 (5259), 680&#8211;685 (1970).</li>
	<li>Shevchenko, A., Tomas, H., Havlis, J., Olsen, J. V., &#38; Mann, M. In-gel digestion for mass spectrometric characterization of proteins and proteomes. Nature protocols. 1 (6), 2856&#8211;2860 (2006).</li>
	<li>DeGrasse, J. A., Kalkum, M., Krutchinsky, A.N., Padovan, J. C., &#38; Zhang, W. MALDI Sample Preparation. rockefeller.edu at &#60;http://prowl.rockefeller.edu/protocols/in-gel-digestion.html&#62; (2006).</li>
	<li>Lubas, M., Christensen, M. S., et al. Interaction profiling identifies the human nuclear exosome targeting complex. Mol Cell. 43 (4), 624&#8211;637 (2011).</li>
	<li>Tackett, A. J., DeGrasse, J. A., Sekedat, M. D., Oeffinger, M., Rout, M. P., &#38; Chait, B. T. I-DIRT, a general method for distinguishing between specific and nonspecific protein interactions. J Proteome Res. 4 (5), 1752&#8211;1756 (2005).</li>
	<li>Wang, X., &#38; Huang, L. Identifying dynamic interactors of protein complexes by quantitative mass spectrometry. Mol Cell Proteomics. 7 (1), 46&#8211;57 (2008).</li>
	<li>Trinkle-Mulcahy, L., Boulon, S., et al. Identifying specific protein interaction partners using quantitative mass spectrometry and bead proteomes. J Cell Biol. 183 (2), 223&#8211;239 (2008).</li>
	<li>Boulon, S., Ahmad, Y., et al. Establishment of a protein frequency library and its application in the reliable identification of specific protein interaction partners. Mol Cell Proteomics. 9 (5), 861&#8211;879 (2010).</li>
	<li>Armean, I. M., Lilley, K. S., &#38; Trotter, M. W. B. Popular computational methods to assess multiprotein complexes derived from label-free affinity purification and mass spectrometry (AP-MS) experiments. Mol Cell Proteomics. 12 (1), 1&#8211;13 (2013).</li>
	<li>Mellacheruvu, D., Wright, Z., et al. The CRAPome: a contaminant repository for affinity purification-mass spectrometry data. Nat Methods. (2013).</li>
	<li>Cheeseman, I. M., &#38; Desai, A. A combined approach for the localization and tandem affinity purification of protein complexes from metazoans. Sci. STKE 2005 (266), pl1 (2005).</li>
	<li>Deppert, W. R., &#38; Luka&#265;in, R. Buffers and Additives. Journal of Chromatography Library. 61 (C), 839&#8211;862 (1999).</li>
	<li>Ugwu, S. O., &#38; Apte, S. P. The Effect of Buffers on Protein Conformational Stability. Pharmaceutical Technology. 28 (3), 86&#8211;108 (2004).</li>
	<li>Linke, D. Detergents: an overview. Methods in Enzymology. 463 (34), 603&#8211;617 (2009).</li>
	<li>Zhang, J. Protein-Protein Interactions in Salt Solutions. Protein-Protein Interactions Computational and Experimental Tools. (18), 359&#8211;376 (2012).</li>
	<li>Goldberg, S. Mechanical/physical methods of cell disruption and tissue homogenization. Methods in Molecular Biology. 424 (Chapter 1), 3&#8211;22 (2008).</li>
	<li>Grabski, A. C. Advances in preparation of biological extracts for protein purification. Methods in Enzymology. 463 (C), 285&#8211;303 (2009).</li>
	<li>Dhabaria, A., Cifani, P., Reed, C., Steen, H., &#38; Kentsis, A. A High-Efficiency Cellular Extraction System for Biological Proteomics. J Proteome Res. 14 (8), 3403&#8211;3408 (2015).</li>
	<li>Glatter, T., Ahrn&#233;, E., &#38; Schmidt, A. Comparison of Different Sample Preparation Protocols Reveals Lysis Buffer-Specific Extraction Biases in Gram-Negative Bacteria and Human Cells. J Proteome Res. 15 (2), 679 (2016).</li>
	<li>Zhao, Q.-Q., Yamada, S., &#38; Jimbo, G. The Mechanism and Grinding Limit of Planetary Ball Milling. KONA. 7, 29&#8211;36 (1989).</li>
	<li>Sheng-Yong, L., Qiong-Jing, M., Zheng, P., Xiao-Dong, L., &#38; Jian-Hua, Y. Simulation of ball motion and energy transfer in a planetary ball mill. Chinese Phys. B 21 (7), 078201 (2012).</li>
	<li>Fulton, A. B. How crowded is the cytoplasm? Cell. 30 (2), 345&#8211;347 (1982).</li>
	<li>Ellis, R. J. Macromolecular crowding: obvious but underappreciated. Trends Biochem Sci. 26 (10), 597&#8211;604 (2001).</li>
	<li>Kalkum, M. Using the Retsch MM301 Ball Mill for Cryogenic Disruption of Yeast Cells. 2 City of Hope, (2003).</li>
	<li>Staley, J. Making Whole Cell Extract of Saccharomyces cerevisiae cells using the Retsch MM301 Ball Mill. Retsch GmbH: (2005).</li>
	<li>Bell, A. W., Nilsson, T., Kearney, R. E., &#38; Bergeron, J. J. M. The protein microscope: Incorporating mass spectrometry into cell biology. Nat Methods. 4 (10), 783&#8211;784 (2007).</li>
	<li>Zhao, X., Li, G., &#38; Liang, S. Several affinity tags commonly used in chromatographic purification. J Anal Methods Chem. 2013 (1), 581093&#8211;8 (2013).</li>
	<li>Waugh, D. S. An overview of enzymatic reagents for the removal of affinity tags. 80 (2), 283&#8211;293 (2011).</li>
</ol>

A correction was made to: Protein Complex Affinity Capture from Cryomilled Mammalian Cells. The References section has been updated.

Erratum: Protein Complex Affinity Capture from Cryomilled Mammalian Cells

En typisk tillämpning av de presenterade förfarandena är att stabilisera och erhålla ett högt utbyte och renhet av endogena proteinkomplex är av intresse för interactomic karakterisering 1. Det är underförstått att dynamiska näten i båda stabilt och transient associerade makromolekylära komplex, huvudsakligen bestående av proteiner, orchestrate cellulära processer 2,3. Även om det finns många experimentella metoder för att identifiera protein-proteininteraktioner, är affinitetsinfångning bland de mest använda metoderna för att isolera och dissekera fysiologiska proteinkomplex 4-6. Dessutom har denna teknik fördelen att ge de makromolekylära komplex som fysiska enheter, inte bara som datapunkter i en utläsning; fördelaktigt, kan de erhållna komplexen således användas i en mängd ytterligare nedströms biokemiska, enzymatiska och strukturella analyser 7-9. De presenterade protokoll har utvecklats som svar på behovet av att kartlägga protein-proteininteraktioner nätverk och karakterisera makromolekylära komplex i sina roller som de effektormolekyler i cellbiologi. De är detaljerade med avseende på deras tillämpning på däggdjursceller odlade i vävnadskultur, men är lika tillämpbara på ett brett spektrum av biologiska prover som ges lämpliga systemspecifika tweaks. Historien om affinitetsinfångning sträcker sig tillbaka till början av nittonhundratalet med de första immunoaffinitetskromatografi experiment - som liknar det som brukar kallas numera som immunoprecipitation (IP) - som förekommer i litteraturen av de tidiga 1950-talet. Mainstream användning av tekniken vidareutvecklas genom sekelskiftet till den nuvarande 10-13. Diverse cell och molekylärbiologiska studier har använt mekaniska brott på celler genom målning vid låga temperaturer under åtminstone de senaste fyrtio åren 14-19; och molekylära separationer använder (super) paramagnetiska pärlor har become allt vanligare under de senaste två decennierna 20. Genom att kombinera dessa olika tekniker har använts för att synergistiskt förbättra resultaten som kan erhållas i proteinkomplex affinitetsinfångning experiment 1, vilket framgår av en omfattande samling av verk som produceras av oss själva och det bredare forskarsamhället 7,9,11,18,19,21 -23. Stödjande Resultaten presenteras i Figur 1. En samling av varningar och överväganden som gäller för verkställande effektiva affinitetsinfångning experiment kan hittas i referens 1. Normalt denna metod är mest lämplig för: (I) katalog interactmedlemmarna av ett protein av intresse, det vill säga använda protein masspektrometri (MS) för att identifiera hittills okända copurifying proteiner (förberedande analys); (II) -analys med avseende på närvaro av en speciell samverkande partner, dvs använder MS eller western-blot för att detektera en särskild protein eller begränsad uppsättning av proteiner som misstänks iagera med proteinet av intresse (hypotestestning); eller (III) förbereda endogent sammansatta proteinkomplex som innehåller proteinet av intresse för vidare studier av ytterligare tekniker (preparativ upparbetning). Innan man börjar på en affinitetsinfångnings experimentell regim är det absolut nödvändigt att ha en hög kvalitet affinitetsreagens som binder till målproteinet, typiskt en IP-kompetent antikropp mot det nativa målproteinet av intresse eller mot en tagg bifogas ett fusionsprotein. Det är också viktigt att ha lämpliga metoder för experimentell avläsning på plats: allmän proteinfärgning (såsom Coomassie blå, Sypro Ruby eller silver, efter SDS-PAGE), Western blotting, och protein MS är alla vanligen används i samband med affinitetsinfångning 1. De presenterade protokoll utnyttjar antikroppar konjugerade magnetiska pärlor som affinitetsmedium. Medan funktionen av affinitetsmediet initialt kan valideras i tester som utnyttjar några experimentella parametrar, tillfå bästa resultat varje försök bör empiriskt optimeras 1,11,24. Protokollen är separerade i tre distinkta faser: (1) framställning av frusen cellmaterial; (2) cellbrott genom solid state fräsning vid kryogen temperatur; och (3) proteinextraktion och affinitetsinfångning med användning antikroppsförenade paramagnetiska pärlor.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="1304">
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:567px;">Growth media &#38; cell culturing implements</td>
			<td style="width:172px;"></td>
			<td style="width:164px;"></td>
			<td style="width:403px;">For producing frozen cells (I)</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">500 cm^2 culture dishes</td>
			<td style="width:172px;">Corning</td>
			<td>431110</td>
			<td>For producing frozen cells (I)</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Large beaker (1-2L)</td>
			<td style="width:172px;"></td>
			<td></td>
			<td>For producing frozen cells (I)</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Rectangular ice pan&#160;</td>
			<td>Fisher Scientific&#160;</td>
			<td>13-900-747</td>
			<td>For producing frozen cells (I), &#38; cryomilling (II)</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Phosphate buffered saline (PBS)</td>
			<td style="width:172px;"></td>
			<td style="width:164px;"></td>
			<td>For producing frozen cells (I)</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Large cell scrapers</td>
			<td>Fisher Scientific&#160;</td>
			<td>08-100-242</td>
			<td>For producing frozen cells (I)</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Liquid nitrogen&#160;</td>
			<td style="width:172px;"></td>
			<td style="width:164px;"></td>
			<td>For producing frozen cells (I), cryomilling (II), &#38; affinity capture (III)</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:567px;">50 ml conical tubes</td>
			<td>Corning</td>
			<td>352098</td>
			<td>For producing frozen cells (I), &#38; cryomilling (II)</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">20 ml Luer lock syringe</td>
			<td style="width:172px;"></td>
			<td style="width:164px;"></td>
			<td>For producing frozen cells (I)</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Leur lock syringe caps</td>
			<td>www.dymax.com</td>
			<td>T11182</td>
			<td>For producing frozen cells (I)</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Refrigerated centrifuge</td>
			<td style="width:172px;"></td>
			<td style="width:164px;"></td>
			<td>For producing frozen cells (I)</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">50 ml tube rack, 4 position</td>
			<td style="width:172px;"></td>
			<td style="width:164px;"></td>
			<td>For producing frozen cells (I), cryomilling (II), &#38; affinity capture (III)</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Styrofoam box</td>
			<td style="width:172px;"></td>
			<td style="width:164px;"></td>
			<td>For producing frozen cells (I), cryomilling (II), &#38; affinity capture (III)</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Planetary ball mill, PM 100&#160;</td>
			<td>Retsch</td>
			<td>20.540.0001&#160;</td>
			<td>For cryomilling (II)</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Stainless steel milling jar, 50 ml&#160;</td>
			<td>Retsch</td>
			<td>01.462.0149</td>
			<td>For cryomilling (II)</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Stainless steel milling balls, 20 mm &#216;&#160;</td>
			<td>Retsch</td>
			<td>05.368.0062</td>
			<td>For cryomilling (II)</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Lid gasket: PFA encapsulated spring energized seal, 2.62 mm 44.63 mm&#160;&#160;</td>
			<td style="width:172px;">www.marcorubber.com</td>
			<td>T1044-2.62x44.63</td>
			<td>For cryomilling (II)</td>
		</tr>
		<tr height="26">
			<td height="26" style="height:26px;">mini-LN2 decanter</td>
			<td style="width:172px;">homemade</td>
			<td style="width:164px;">see Ref 19</td>
			<td>For cryomilling (II)</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">250 ml PTFE jar insulator (optional)</td>
			<td style="width:172px;">Retsch</td>
			<td style="width:164px;">custom order</td>
			<td>For cryomilling (II)</td>
		</tr>
		<tr height="41">
			<td height="41" style="height:41px;">PTFE puck insulator (optional)</td>
			<td style="width:172px;">homemade</td>
			<td style="width:164px;">The Rockefeller University</td>
			<td>For cryomilling (II); can be produced by The Rockefeller University High Energy Physics Instrument Shop, or design blueprints provided, upon request.</td>
		</tr>
		<tr height="41">
			<td height="41" style="height:41px;">5 bar/500 KPA pressure relief valve (optional)</td>
			<td style="width:172px;">http://www.leeimh.com/</td>
			<td style="width:164px;">558 series check valve</td>
			<td>For cryomilling (II)</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:567px;">1.5 - 2 ml microfuge tubes</td>
			<td style="width:172px;"></td>
			<td style="width:164px;"></td>
			<td>For affinity capture (III)</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:567px;">Extractant</td>
			<td style="width:172px;"></td>
			<td style="width:164px;"></td>
			<td>For affinity capture (III)</td>
		</tr>
		<tr height="41">
			<td height="41" style="height:41px;width:567px;">cOmplete EDTA free protease inhibitor cocktail tablets</td>
			<td style="width:172px;">Roche Applied Science</td>
			<td style="width:164px;">11873580001</td>
			<td style="width:403px;">For affinity capture (III)</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:567px;">Vortex mixer</td>
			<td style="width:172px;"></td>
			<td style="width:164px;"></td>
			<td>For affinity capture (III)</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:567px;">Ice bucket</td>
			<td style="width:172px;"></td>
			<td style="width:164px;"></td>
			<td>For affinity capture (III)</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:567px;">Microtip sonicator, Q700</td>
			<td style="width:172px;">Qsonica</td>
			<td style="width:164px;">Q700</td>
			<td>For affinity capture (III)</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">low intensity 1/16&#8221; microtip probe</td>
			<td style="width:172px;">Qsonica</td>
			<td style="width:164px;">4717</td>
			<td>For affinity capture (III)</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:567px;">Bench-top refrigerated microcentrifuge</td>
			<td style="width:172px;"></td>
			<td style="width:164px;"></td>
			<td>For affinity capture (III)</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:567px;">Dynabeads M-270 Epoxy</td>
			<td style="width:172px;">Thermo Fisher</td>
			<td style="width:164px;">14302D</td>
			<td>For affinity capture (III)</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:567px;">Antibody or affinity ligand coupled to Dynabeads</td>
			<td style="width:172px;">homemade</td>
			<td style="width:164px;"></td>
			<td>For affinity capture (III); see reference 19</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:567px;">Sample rotator&#160;</td>
			<td style="width:172px;"></td>
			<td style="width:164px;"></td>
			<td>For affinity capture (III)</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:567px;">Neodymium magnet</td>
			<td style="width:172px;">Life Technologies</td>
			<td style="width:164px;">123-21D&#160;</td>
			<td>For affinity capture (III)</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:567px;">SDS-PAGE sample buffer (no reducing agent)</td>
			<td style="width:172px;"></td>
			<td style="width:164px;"></td>
			<td>For affinity capture (III)</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:567px;">DTT</td>
			<td style="width:172px;"></td>
			<td style="width:164px;"></td>
			<td>For affinity capture (III)</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:567px;">SDS-PAGE system</td>
			<td style="width:172px;"></td>
			<td style="width:164px;"></td>
			<td>For affinity capture (III)</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:567px;">SDS-polyacrylamide gel</td>
			<td style="width:172px;"></td>
			<td style="width:164px;"></td>
			<td>For affinity capture (III)</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:567px;">Protein Stain</td>
			<td style="width:172px;"></td>
			<td style="width:164px;"></td>
			<td>For affinity capture (III)</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

protein complex affinity capture from cryomilled mammalian cells

Affinitetsinfångning är en effektiv teknik för isolering av endogena proteinkomplex för vidare studier. När den används tillsammans med en antikropp, är denna teknik också ofta kallad immunoprecipitation. Affinitetsinfångning kan appliceras i en bänkskala och i en hög genomströmning sammanhang. När den kombineras med protein masspektrometri, har affinitetsinfångning visat sig vara en arbetshäst av interactome analys. Även om det finns potentiellt många sätt att utföra de många stegen, följande protokoll genomföra våra gynnade metoder. Två funktioner är utmärkande: användningen av cryomilled cellpulver för att framställa cellextrakt, och antikroppskopplade paramagnetiska pärlor som affinitetsmedium. I många fall har vi erhållit överlägsna resultat med de som erhölls med mer konventionella affinitetsinfångningsmetoder. Cryomilling undviker många problem som är förknippade med andra former av cellbrott. Det ger effektiv sönderbrytning av materialet, samtidigt som man undviker denaturation som hör samman med uppvärmning eller skumning. Den behåller det nativa proteinkoncentrationen upp till punkten för utvinning, mildra makromolekylära dissociation. Det minskar den tid extraherade proteiner bringar i lösning, vilket begränsar skadliga enzymaktiviteter, och det kan minska den icke-specifika adsorptionen av proteiner genom affinitetsmediet. Micron skala magnetiska affinitets media har blivit allt vanligare under de senaste åren i allt högre grad ersätter den traditionella agarose- och Sepharose-baserade medier. Främsta fördelarna med magnetiska media inkluderar typiskt lägre ospecifik proteinadsorption; ingen storlek uteslutningsgräns eftersom proteinkomplex bindning sker på pärlan ytan snarare än inom porer; och enkel manipulation och hantering med hjälp av magneter.

Figur 1, panel I illustrerar att cryomilling och magnetiska pärlor kan arbeta tillsammans för att förbättra prov kvalitet. Paneler IA-C visar att det material som utgör den olösliga medium som används för affinitetsinfångnings kan påverka den återvunna proteomet 19. Proteinet av intresse, renade FLAG-märkt bakteriellt alkaliskt fosfatas (BAP), spetsades in i humana cellextrakt. BAP förväntas inte specifikt interagera med och samrena humana proteiner. Undertecknandet av copurifying proteiner, bedöms med SDS-PAGE och Coomassie-färgning, varierade beroende på vilket medium som används. Micron skala magnetiska pärlorna visade den renaste profil, vilket indikerar en relativt låg nivå av icke-specifik proteinadsorption. Paneler ID och lE illustrerar att metoden enligt cellys också kan påverka den återvunna proteomet. I det visade exemplet, en endogen proteinkomplexet (NEXT komplex 37), utsattes för affinitets capture från cyromilled eller sonikeras cellextrakt 19. Färre hög massa föroreningar observerades då cellextraktet producerades från cryomilled cellpulver. En utmaning vid användning av affinitetsinfångning att studera endogena proteinkomplex är att det kan vara svårt att särskilja bona fide fysiologiska Interactmedlemmar av proteinet av intresse från falska positiva (fps). FP kan uppkomma från många källor, inklusive icke-specifik adsorption till rör och kärl, affinitetsmediet, antikroppen eller affinitetsliganden, och / eller till det intressanta proteinet självt. Som ett resultat, måste betydande ansträngningar ägnas åt att optimera inspelningsprocessen. Detektering av ramprogrammen fortfarande en central utmaning för vilken ett stort antal olika verktyg har utvecklats, inklusive experimentell 38-40 och beräknings närmar 41-43, var och en med olika för- och nackdelar. I våra egna experiment tidigare noterade vi ett mönster av FP-protein-bindning, som erhölls efter inkubering av α-FLAG magnetiskt medium med extrakt kontrollcell, som var distinkt från det mönster som erhållits i närvaro av 3xFLAG-märkta proteiner. Dessutom kunde dessa FP frigöras från mediet genom inkubation med 3xFLAG peptid 7. Denna observation är i överensstämmelse med opportunistisk bindning av ramprogrammen till α-FLAG paratop i frånvaro av det besläktade epitopen. Att förstå denna typ av FP bakgrund är viktigt eftersom många studier använder en omärkt &quot;parental cellinje&quot; som en falsk kontroll för affinitetsinfångning; dessa kontroller kan därför vara olämpligt att bestämma specificiteten av interaktioner med taggade proteinet. För att bestämma bakgrundsbindningen bidrar med vår affinitetsmedium när paratoper antikropps är upptagna eller inte genomförde vi mock affinitetsinfångning experiment använder α-FLAG magnetiskt medium och HEK 293T cellextrakt (ingen märkt protein uttryckt) i närvaro eller frånvaro av en 3xFLAGpeptid spike-in. Resultaten visas i Figur 1, panel II. I korthet framställdes α-FLAG magnetiskt medium inkuberades i cellextrakt (av ≳10 mg / ml totalt protein) innehållande 500 mM NaCl och 1% volym / volym Triton X-100 i 20 mM HEPES-Na pH 7,4 under 30 min. Mediet inkuberades sedan med 1 mg / ml 3xFLAG peptid att kompetitivt undantränga eventuella proteiner bundna till α-FLAG paratop native eller med SDS-PAGE-provbuffert för att uppnå en denaturerande eluering. Dessutom utfördes samma experiment utfört när cellextrakten spetsades med 1 | ig / ml och 10 | ig / ml 3xFLAG peptid. Alla de eluerade fraktionerna utsattes för SDS-PAGE och silverfärgning. Vi observerade att i avsaknad av dess besläktade epitop, inte α-FLAG mediet fånga en detekterbar nivå av bakgrunds proteiner som kan elueras med 3xFLAG peptid - i exemplet i figur 1-II, var en dominerande art observerades vid mellan 37 och 50 kDa. Mönstret eluerades medSDS-PAGE-provbuffert var jämförbar, med ytterligare framstående arter. Men i närvaro av 1 pg / ml 3xFLAG peptid, FP bindning till affinitetsmediet elimineras under nivån för detektering och observerades inte i vare sig nativa eller denature elueringsfraktionerna. Detta resultat antyder att unoccupied paratoper antikropp kan promiskuösa i frånvaro av deras besläktade epitopen och bidrar signifikant till proteomet erhållits under affinitetsinfångning även för antikroppar som binder deras epitop vid hög affinitet, vilket är fallet för 3xFLAG / α-FLAG M2 parning. Det suggestd också att mycket stringenta betingelser med användning av hög salthalt, ofta väljs för att mildra icke-specifik bindning, kan vara ineffektiva i frånvaron av interaktion antigen / antikropp. Att följa upp vi utfört ett liknande experiment inklusive analys med SDS-PAGE samt kvantitativ MS (Fig. S1). Av de 347 proteinerna kvantifierade, observerade vi att varje protein med undantag för en (falsk discomycket ränta = 1%; Tabell S1) var associerad med 3xFLAG-märkta bete protein jämfört med en 3xFLAG peptid spetsat kontrollprov. Dessa resultat tyder på att i våra experiment överväldigande majoritet av proteiner observerade kommer sannolikt att samrenas med det märkta proteinet eller utanför mål biprodukter av lediga α-FLAG paratoper. Enligt vår erfarenhet är höga signal-till-brus-affinitetsinfångning resultat exemplifieras i SDS-PAGE och proteinfärgning av en diskret mönster av skarpa, riklig och ungefär stökiometriska band samt en brist på bakgrundsfärgning från andra svagare band; talrika exempel på denna princip kan ses i referens 11. Motivet för användning av en PTFE-isolator (vilket rekommenderas) när cryomilling är att minska hastigheten för uppvärmningen av burken under målningen, mildra bördan av upprepad LN två kylning under malningsprocessen, och minska graden av isbildning i burken. Detta underlättar konsekvent fräsprestanda och underlättar hanteringen av cellpulvret. Exempel isolatorer kan hittas i referens 27 (puckar) och avbildas i fig 2, nedan (ärm-och-puck). <img alt="Figur 1" src="/files/ftp_upload/54518/54518fig1.jpg" /> Figur 1: Välj Representativa resultat. (I) Denna panel har ändrats från referens 19. Coomassie Blue-färgad SDS-polyakrylamidgel. (VÄNSTER) Micron skala magnetiska pärlor visar lägre utanför målbindande än agaros-baserade medier. (A) magnetiska pärlor; (B) traditionell agaros; (C) järn impregnerade (magnetisk) agaros; var och en kopplad till anti-FLAG M2 antikroppar och används för att fånga FLAG-märkt bakteriellt alkaliskt fosfatas (BAP; märkt) spikades i extrakt framställda av cryomilled HEK-293-celler. Agaros-baserade reningaruppvisade högre nivåer av icke-specifik adsorption (omärkta band). (höger) Utdrag framställts av cryomilled HeLa-celler uppvisar lägre off-target adsorption på antikroppskopplade magnetiska kulor än de som produceras av ultraljudsbehandling när den används för att rena en endogen proteinkomplex. LAP-märkta 44 RBM7 var affinitet tagits med magnetiska kulor kopplade till polyklonala anti-GFP-antikroppar för att rena NEXT komplex 19,37 (D) Extrakt från cryomilled pulver; (E) extrakt framställs genom ultraljudsbehandling av intakta celler. Den vertikala svarta stapeln belyser en region av gelén där höga mass ospecifika Interactmedlemmar observeras att anrikas i det prov som beretts genom sonikering. De svarta pilar angivna förväntade specifika interactmedlemmarna (märkt). Band observerade ~ 50 kDa i spår D och E är hänförliga till lama IgG tunga kedjor. (II) Silver färgad SDS-polyakrylamidgel. (Std.) En mock affinitetsinfångning utfördes på HEK-293T-cell extrakt på standardsättet. Efter infångning, utfördes eluering av det bundna materialet uppnås via (N) icke-denaturer eluering med 1 mg / ml 3xFLAG peptid eller (D) denaturerande eluering i SDS-PAGE-provbuffert; (PB 1) som Std. men 3xFLAG peptid inkluderades i extraktionslösningen på 1 | j, g / ml för att blockera de α-FLAG paratoper på affinitetsmedium; (PB 10) i form av PB 1 men i närvaro av 10 | ig / ml 3xFLAG peptid. IgG-relaterade band och 3xFLAG peptid är märkta. <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/54518/54518fig1large.jpg" target="_blank">Klicka här för att se en större version av denna siffra.</a> <img alt="figur 2" src="/files/ftp_upload/54518/54518fig2.jpg" /> Figur 2: Sleeve-och-pucken PTFE isolator. En 250 ml PTFE burk visas (1). En 50 ml rostfri stålfräsning burk (2) passar insidan av PTFE burken (3) och ger denmöjlighet att lämna malnings burken installerad inom kvarnen mellan cyklerna. En övre PTFE isolator puck (2) används mellan klämenheten och burken locket. Att kyla den installerade burk och isolatoraggregat (3), är LN 2 sattes direkt in i kroppen av isolatorn, som omger burken. Nästa cykel av fräsning kan sedan initieras. <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/54518/54518fig2large.jpg" target="_blank">Klicka här för att se en större version av denna siffra.</a> <table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody><tr><td> Reagens </td><td> föreslog Koncentration </td><td> Anmärkningar </td></tr><tr><td> Natriumklorid </td><td> 0,1 till 0,5 M </td><td> Höga koncentrationer (&gt; 300 mm) tenderar att förbättra utvinningen av totalt protein och hålla bakgrunden låg, men kan skala bort en del i övrigt stabil interaktörer. Koncentrationer under 150 mM är vanligtvis inte effektiva för att minska ospecifik bakgrund. </td></tr><tr><td> ammoniumacetat </td><td> 0,2-2 M </td><td> Ett salt, som består av två buffertar, ger det en neutral pH-lösning 57. Högre koncentrationer stabilisera vissa proteinkomplex. Sura lösningar kan resultera från gamla, felaktigt lagrade kristallina lager på grund av ammoniakförlusterna. Inga ytterligare pH-buffert eller salter krävs extraktionsmedel innehållande ammoniumacetat. Kan kombineras med NaCl för att modulera erhållna resultaten. </td></tr><tr><td> Tween 20 </td><td> 0,1% vol / vol </td><td> En icke-jonisk detergent 58; kombineras typiskt med NaCl. </td></tr><tr><td> Triton X-100 </td><td> 0,5-1% vol / vol </td><td> En icke-jonisk detergent 58; kombineras typiskt med antingen NaCl eller NH 4 CH3 CO2H </td></tr><tr><td> CHAPS </td><td> 5 mM </td><td> En zwitterjonisk detergent 58 &lt;/ Sup&gt;; kombineras typiskt med NaCl. </td></tr><tr><td> sarkosyl </td><td> 1 mM </td><td> En anjoniska rengöringsmedel 58 som minskar bakgrunden och kan strippa stabila komplexa komponenter, eventuellt avslöjande binär anslutning; kombineras typiskt med NaCl. </td></tr><tr><td rowspan="2"> Tris-Cl </td><td> 20 mM </td><td rowspan="2"> pKa av 8,8 vid 4 ° C, 8,1 vid 25 ° C. </td></tr><tr><td> (PH 8,0) </td></tr><tr><td rowspan="2"> HEPES-Na </td><td> 20 mM </td><td rowspan="2"> pKa av 7,8 vid 4 ° C, 7,5 vid 25 ° C. NaOH eller KOH används för pH-ekvilibrering beroende på salt (t.ex. NaCl, KCl, eller CH 3 CO 2 K) som används i extraktionsmedlet. </td></tr><tr><td> (PH 7,4) </td></tr></tbody></table> Tabell 1: Några förslag reagenser användbara för rening av proteinkomplex. Denna tabell lister vissa reagens som vi har funnit användbara för rening av proteinkomplex från humana cellinjer, med föreslagna arbets koncentrationer. En typisk extraktionsmedel formulering innehåller en pH-buffert, ett salt, och en diskmedel 1,11,24,45-48. Bästa praxis är att identifiera minst Komplex blandning av reagens som ger det önskade resultatet. <img alt="Figur S1" src="/files/ftp_upload/54518/54518figS1.jpg" /> Figur S1: Blanda efter rening (kartan-) SILAC analys av falska positiva. I. Schematiskt diagram: I detta experiment 3xFLAG-taggade ORF2p proteinkomplex (uttryckta från pLD401) renades från tunga och lätta märkt HEK-293T-celler 7, respektive. Ljuset märkta cellextraktet spetsades med 3xFLAG peptid för att förhindra affinitetsinfångning av 3xFLAG-märkta ORF2p genom kompetitiv hämning; detta förväntas inte att blockera bindningen av proteiner som kan förekomma icke-specifitiskt med det magnetiska mediet eller de icke-paratopa strukturer av antikroppen. Efter eluering från de magnetiska pärlorna, de tunga och lätta prov blandades efter rening och analyserades genom kvantitativ MS (MAP-SILAC 39) för att bestämma den fraktion av proteiner associerade med antingen provet; ytterligare metod detalj ligger i tabell S1. II. Silver färgad gel som visar att de lätta och tunga märkta material ge jämförbara resultat (jämför L med H), och att reningen genomföres i närvaro av 3xFLAG spike-in (LI) var kompetitivt inhiberad. Nedan en Coomassie Blue G-250 färgad gel plugg bestående av den blandade H och LI fraktioner, före gelbaserad proteomic analys, såsom beskrivs i Tabell S1. <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/54518/54518figS1large.jpg" target="_blank">Klicka här för att ladda ner en större version av denna siffra.</a> Tabell S1:MAP-SILAC. Detta ark innehåller data som erhållits vid utförandet av MAP-SILAC experiment som beskrivs i figur S1. <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/54518/Table_S1.xlsx" target="_blank">Klicka här för att ladda ned den här tabellen.</a>

Watch this Scientific Journal Video about Protein Complex Affinity Capture from Cryomilled Mammalian Cells at JoVE.com

Protein Complex Affinity Capture from Cryomilled Mammalian Cells

Här beskriver vi protokoll för att störa däggdjursceller genom solid-state fräsning vid en kryogen temperatur, producerar ett cellextrakt från den resulterande cellpulver, och isolera proteinkomplex av intresse genom affinitetsinfångning vid antikroppsförenade mikron-skaleparamagnetiska pärlor.

Proteinkomplex Affinity Capture från Cryomilled däggdjursceller

Affinity capture is an effective technique for isolating endogenous protein complexes for further study. When used in conjunction with an antibody, this ...

Research

JoVE Journal

Biochemistry

Tandem Affinity Purification of Protein Complexes from Eukaryotic Cells

Tandem Affinitetsrening av proteinkomplex från eukaryota celler

The purification of active protein-protein and protein-nucleic acid complexes is crucial for the characterization of enzymatic activities and de novo ...

Resolving Affinity Purified Protein Complexes by Blue Native PAGE and Protein Correlation Profiling

Lösa affinitetsrenat proteinkomplex av Blue Native PAGE och protein Korrelation profilering

Most proteins act in association with others; hence, it is crucial to characterize these functional units in order to fully understand biological ...

mRNA Interactome Capture from Plant Protoplasts

MRNA-interaktomfångst från plant protoplaster

RNA-binding proteins (RBPs) determine the fates of RNAs. They participate in all RNA biogenesis pathways and especially contribute to post-transcriptional ...

Biochemical and Structural Characterization of the Carbohydrate Transport Substrate-binding-protein SP0092

Biokemiska och strukturell karaktärisering av den kolhydrat Transport substrat-bindande-protein SP0092

Development of new antimicrobials and vaccines for Streptococcus pneumoniae (pneumococcus) are necessary to halt the rapid rise in multiple resistant ...

Toeprinting Analysis of Translation Initiation Complex Formation on Mammalian mRNAs

Toeprinting analys av översättning inledande komplexa bildande på däggdjur mRNA

Translation initiation is the rate-limiting step of protein synthesis and represents a key point at which cells regulate their protein output. Regulation ...

2 in 1: One-step Affinity Purification for the Parallel Analysis of Protein-Protein and Protein-Metabolite Complexes

2 i 1: enstegs affinitet rening för parallell analys av Protein-Protein och Protein-metaboliten komplex

Cellular processes are regulated by interactions between biological molecules such as proteins, metabolites, and nucleic acids. While the investigation of ...

Translating Ribosome Affinity Purification (TRAP) for RNA Isolation from Endothelial Cells In Vivo

Translating Ribosome Affinity Purification TRAP for RNA Isolation from Endothelial Cells In Vivo

Översätta ribosom affinitetsrening (fälla) för RNA-isolering från endotelceller in vivo

Many studies have been limited to using in vitro cellular assays and whole tissues or isolating of specific cell types from animals for in vitro analysis ...

Activated Cross-linked Agarose for the Rapid Development of Affinity Chromatography Resins - Antibody Capture as a Case Study

Aktiverat tvärbunden Aguppstod för den snabba utvecklingen av affinitet Kromatografihartser-antikropps fångst som en fallstudie

The purification of monoclonal antibodies (mAbs) is commonly achieved by Protein A affinity chromatography, which can account for up to 25% of the overall ...

Detection of Protein S-Acylation using Acyl-Resin Assisted Capture

Detektion av Protein S-Acylation med Acyl-Harts Assisted Capture

Protein S-acylation, also referred to as S-palmitoylation, is a reversible post-translational modification of cysteine residues with long-chain fatty ...

Purification of Ubiquitinated p53 Proteins from Mammalian Cells

Rening av Ubiquitinated p53-proteiner från däggdjursceller

Ubiquitination is a type of posttranslational modification that regulates not only the stability but also the localization and function of a substrate ...