Name: detection of the ph-dependent activity of escherichia coli chaperone hdeb in vitro and in vivo
Uploaded: 2016-10-23T13:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Detection of the pH-dependent Activity of Escherichia coli Chaperone HdeB In Vitro and In Vivo at JoVE.com

نشكر الدكتورة كلوديا كريمرز لها النصيحة مفيدة على المقايسات كوصي. واعترف كين وان للحصول على المساعدة الفنية له في تنقية HdeB. وأيد هذا العمل من قبل معهد هوارد هيوز الطبي (لJCAB) والمعاهد الوطنية للصحة منح RO1 GM102829 إلى JCAB وUJJ-UD يدعمها زمالة أبحاث ما بعد الدكتوراه المقدمة من مؤسسة البحوث الألمانية (DFG).

1. التعبير وتنقية محيط بالجبلة HdeB وأعرب عن HdeB في E. ملاحظة: خلايا القولونية إيواء البلازميد pTrc- hdeB 10، وتنقيته من الجبلة المحيطية على تحلل بوليميكسين. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إعداد الثقافة بين عشية...

<ol>
	<li>Smith, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Role+of+Gastric+Acid+in+Preventing+Foodborne+Disease+and+How+Bacteria+Overcome+Acid+Conditions.">The Role of Gastric Acid in Preventing Foodborne Disease and How Bacteria Overcome Acid Conditions.</a> J Food Protect. 66, 1292-1303 (2003).</li><li>Hong, W., Wu, Y. E., Fu, X., Chang, Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chaperone-dependent+mechanisms+for+acid+resistance+in+enteric+bacteria.">Chaperone-dependent mechanisms for acid resistance in enteric bacteria.</a> Trends Microbiol. 20 (7), 328-335 (2012).</li><li>Koebnik, R., Locher, K. P., Van Gelder, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structure+and+function+of+bacterial+outer+membrane+proteins:+barrels+in+a+nutshell.">Structure and function of bacterial outer membrane proteins: barrels in a nutshell.</a> Mol Microbiol. 37, 239-253 (2000).</li><li>Reichmann, D., Xu, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Order+out+of+Disorder:+Working+Cycle+of+an+Intrinsically+Unfolded+Chaperone.">Order out of Disorder: Working Cycle of an Intrinsically Unfolded Chaperone.</a> Cell. 148 (5), 947-957 (2012).</li><li>Bardwell, J. C. A., Jakob, U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Conditional+disorder+in+chaperone+action.">Conditional disorder in chaperone action.</a> Trends Biochem Sci. 37 (12), 517-525 (2012).</li><li>Tapley, T. L., Korner, J. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structural+plasticity+of+an+acid-activated+chaperone+allows+promiscuous+substrate+binding.">Structural plasticity of an acid-activated chaperone allows promiscuous substrate binding.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 106 (14), 5557-5562 (2009).</li><li>Hong, W., Jiao, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Periplasmic+Protein+HdeA+Exhibits+Chaperone-like+Activity+Exclusively+within+Stomach+pH+Range+by+Transforming+into+Disordered+Conformation.">Periplasmic Protein HdeA Exhibits Chaperone-like Activity Exclusively within Stomach pH Range by Transforming into Disordered Conformation.</a> J Biol Chem. 280 (29), 27029-27034 (2005).</li><li>Zhang, B. W., Brunetti, L., Brooks, C. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Probing+pH-Dependent+Dissociation+of+HdeA+Dimers.">Probing pH-Dependent Dissociation of HdeA Dimers.</a> J Am Chem Soc. 133, 19393-19398 (2011).</li><li>Tapley, T. L., Franzmann, T. M., Chakraborty, S., Jakob, U., Bardwell, J. C. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Protein+refolding+by+pH-triggered+chaperone+binding+and+release.">Protein refolding by pH-triggered chaperone binding and release.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 107 (3), 1071-1076 (2010).</li><li>Dahl, J. -. U., Koldewey, P., Salmon, L., Horowitz, S., Bardwell, J. C. A., Jakob, U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=HdeB+Functions+as+an+Acid-protective+Chaperone+in+Bacteria.">HdeB Functions as an Acid-protective Chaperone in Bacteria.</a> J Biol Chem. 290 (1), 65-75 (2015).</li><li>Waterman, S. R., Small, P. L. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+of+sigmas-dependent+genes+associated+with+the+stationary-phase+acid-resistance+phenotype+of+Shigella+flexneri.">Identification of sigmas-dependent genes associated with the stationary-phase acid-resistance phenotype of Shigella flexneri.</a> Mol Microbiol. 21 (5), 925-940 (1996).</li><li>Mucacic, M., Baneyx, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chaperone+Hsp31+Contributes+to+Acid+Resistance+in+Stationary-Phase+Escherichia+coli.">Chaperone Hsp31 Contributes to Acid Resistance in Stationary-Phase Escherichia coli.</a> Appl Environ Microbiol. 73 (3), 1014-1018 (2007).</li><li>Daugherty, D. L., Rozema, D., Hanson, P. E., Gellman, S. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Artificial+Chaperone-assisted+Refolding+of+Citrate+Synthase.">Artificial Chaperone-assisted Refolding of Citrate Synthase.</a> J Biol Chem. 273, 33961-33971 (1998).</li><li>Jakob, U., Muse, W., Eser, M., Bardwell, J. C. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chaperone+Activity+with+a+Redox+Switch.">Chaperone Activity with a Redox Switch.</a> Cell. 96 (3), 341-352 (1999).</li><li>Guisbert, E., Yura, T., Rhodius, V. A., Gross, C. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Convergence+of+Molecular,+Modeling,+and+Systems+Approaches+for+an+Understanding+of+the+Escherichia+coli+Heat+Shock+Response.">Convergence of Molecular, Modeling, and Systems Approaches for an Understanding of the Escherichia coli Heat Shock Response.</a> Microbiol Mol Biol Rev. 72 (3), 545-554 (2008).</li><li>Tomoyasu, T., Mogk, A., Langen, H., Goloubinoff, P., Bukau, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genetic+dissection+of+the+roles+of+chaperones+and+proteases+in+protein+folding+and+degradation+in+the+Escherichia+coli+cytosol.">Genetic dissection of the roles of chaperones and proteases in protein folding and degradation in the Escherichia coli cytosol.</a> Mol Microbiol. 40 (2), 397-413 (2001).</li><li>Schuck, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Size-Distribution+Analysis+of+Macromolecules+by+Sedimentation+Velocity+Ultracentrifugation+and+Lamm+Equation+Modeling.">Size-Distribution Analysis of Macromolecules by Sedimentation Velocity Ultracentrifugation and Lamm Equation Modeling.</a> Biophys J. 78 (3), 1606-1619 (2000).</li><li>Patel, T. R., Winzor, D. J., Scott, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Analytical+ultracentrifugation:+A+versatile+tool+for+the+characterisation+of+macromolecular+complexes+in+solution.">Analytical ultracentrifugation: A versatile tool for the characterisation of macromolecular complexes in solution.</a> Methods. 95, 55-61 (2016).</li><li>Sambrook, J., Russell, D. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Purification+of+Nucleic+Acids+by+Extraction+with+Phenol:Chloroform.">Purification of Nucleic Acids by Extraction with Phenol:Chloroform.</a> Cold Spring Harb Protoc. 2006, (2006).</li><li>Foit, L., George, J. S., Zhang, B. i. n. W., Brooks, C. L., Bardwell, J. C. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chaperone+activation+by+unfolding.">Chaperone activation by unfolding.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 110, 1254-1262 (2013).</li><li>Nicoll, W. S., Boshoff, A., Ludewig, M. H., Hennessy, F., Jung, M., Blatch, G. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Approaches+to+the+isolation+and+characterization+of+molecular+chaperones.">Approaches to the isolation and characterization of molecular chaperones.</a> Protein Express Purif. 46, 1-15 (2006).</li><li>Minami, Y., Hohfeld, J., Ohtsuka, K., Hartl, F. U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regulation+of+the+Heat-shock+Protein+70+Reaction+Cycle+by+the+Mammalian+DnaJ+Homolog,+Hsp40.">Regulation of the Heat-shock Protein 70 Reaction Cycle by the Mammalian DnaJ Homolog, Hsp40.</a> J Biol Chem. 271 (32), 19617-19624 (1996).</li><li>Quan, S., Koldewey, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genetic+selection+designed+to+stabilize+proteins+uncovers+a+chaperone+called+Spy.">Genetic selection designed to stabilize proteins uncovers a chaperone called Spy.</a> Nat Struct Mol Biol. 18, 262-269 (2011).</li><li>Gray, M. J., Wholey, W. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Polyphosphate+Is+a+Primordial+Chaperone.">Polyphosphate Is a Primordial Chaperone.</a> Mol Cell. 53 (5), 689-699 (2014).</li></ol>

<html> من أجل دراسة آلية تفعيل وظيفة كوصي من HdeB، كميات كبيرة من HdeB يجب أن تكون أعرب وتنقيته. تتوفر لإنتاج مستويات عالية من بروتين الهدف، بما في ذلك pTrc أو pBAD ناقلات، وكلاهما المستخدمة في هذه الدراسة عدد من أنظمة ناقلات التعبير. المروجين يمكن الوصول إليها بسهولة لE. القول?...

والبيئة الطبيعية المشتركة التي مسببات الأمراض الميكروبية تجربة الظروف التي تتكشف البروتين الحمضية التي يسببها هي المعدة الثدييات (المدى درجة الحموضة 1-4)، التي تعد بمثابة حاجز فعال ضد مسببات الأمراض التي تنقلها الأغذية 1 الرقم الهيدروجيني الحمضية. البروتين تتكشف والتجميع، والذي كان سببه الجانب الأحماض الأمينية سلسلة بروتوناتيون، ويؤثر على العمليات الحيوية، والأضرار الهياكل الخلوية ويتسبب في نهاية المطاف موت الخلية 1،2. منذ الرقم الهيدروجيني للالجبلة المحيطية البكتيرية equilibrates على الفور تقريبا مع درجة الحموضة البيئية بسبب نشر خالية من البروتونات عبر الغشاء الخارجي يسهل اختراقها، بروتينات غشاء محيط بالجبلة والداخلية من البكتيريا سالبة الجرام هي المكونات الخلوية الأكثر ضعفا في ظل الظروف الحمضية من الإجهاد 3. لحماية بروتيوم محيط بالجبلة ضد الضرر بوساطة حمض السريع، والبكتيريا سالبة الجرام الاستفادة من المحرمين محيط بالجبلة تنشيط حمض HdeA وHdeB. HdeA هو كوصي المختلين مشروط <sup&gt; 4،5: في الرقم الهيدروجيني محايدة، HdeA غير بوصفها و، ديمر-كوصي غير نشط مطوية. بناء على التحول درجة الحموضة أقل من الرقم الهيدروجيني 3، وظيفة كوصي HdeA وسرعان ما تنشيط 6،7. تفعيل HdeA يتطلب تغييرات عميقة الهيكلية، بما في ذلك الانفصال حيز أحادية، والجزئي تتكشف أحادية 6-8. بمجرد تفعيلها، HdeA ترتبط بالبروتين التي تتكشف في ظل الظروف الحمضية. ويمنع على نحو فعال التجميع على حد سواء خلال حضانة في انخفاض الرقم الهيدروجيني، وكذلك على تحييد الحموضة. لدى عودته إلى 7.0 درجة الحموضة، HdeA يسهل refolding من البروتينات عملائها بطريقة ATP مستقلة ويحول مرة أخرى إلى مثنوي، التشكل كوصي خاملا 9 منه. وبالمثل، كوصي HdeB مثلي والوصيفة-نشط أيضا في درجة الحموضة 7.0. على عكس HdeA، ومع ذلك، النشاط كوصي HdeB ويصل الحد الأقصى واضح في الرقم الهيدروجيني 4.0، الظروف التي لا تزال مطوية HdeB إلى حد كبير ومثنوي 10. وعلاوة على ذلك، مما خفض مركز دراسات الرقم الهيدروجينيوفاق لتثبيط HdeB. وتشير هذه النتائج أنه على الرغم من التماثل على نطاق واسع، HdeA وHdeB تختلف في طريقتهم في تفعيل وظيفي والسماح لهم لتغطية مجموعة ودرجة الحموضة واسع مع وظيفة كوصي الحمائية. واحد كوصي الأخرى التي تورطت في مقاومة الأحماض من E. القولونية هو Hsp31 حشوية، والذي يظهر على استقرار البروتينات العميل تكشفت حتى تتم استعادة الظروف محايدة. وضع دقيق للعمل Hsp31، ومع ذلك، ظلت غامضة 12. وبالنظر إلى أن البكتيريا ممرض للأمعاء أخرى مثل السالمونيلا تفتقر إلى الاوبرون hdeAB، فمن المحتمل جدا أن مرافقين محيط بالجبلة بعد مجهولين آخرين قد توجد التي تشارك في مقاومة الأحماض من هذه البكتيريا 11. البروتوكولات المعروضة هنا تسمح لمراقبة النشاط كوصي تعتمد على درجة الحموضة من HdeB في التجارب المختبرية والحية 10 ويمكن تطبيقها للتحقيق مرافقين آخرينمثل Hsp31. بدلا من ذلك، شبكة معقدة من عوامل النسخ التي تتحكم في التعبير عن hdeAB من المحتمل أن يتم التحقيق من قبل في الجسم الحي الإجهاد الفحص. لتوصيف وظيفة كوصي من البروتينات في الجسم الحي، ويمكن تطبيقها على الاجهزة التجريبية المختلفة. طريق واحد هو تطبيق البروتين تتكشف ظروف الإجهاد وظاهريا تميز سلالات متحولة إما بإفراط عن الجينات في المصالح أو تحمل حذف هذا الجين. ويمكن إجراء دراسات البروتين لتحديد أي البروتينات لم يعد مجموع المباراتين تحت ظروف الإجهاد عندما كوصي هو الحاضر، أو تأثير كوصي على انزيم معين يمكن تحديده خلال ظروف الإجهاد باستخدام المقايسات الأنزيمية 14-16. في هذه الدراسة، اخترنا بإفراط HdeB في سلالة rpoH الحذف، التي تفتقر إلى الصدمة الحرارية عامل سيغما 32. RpoH تسيطر على التعبير عن كل E. كبير مرافقين القولونية وحذفها من المعروف أن زيادة السيناتورitivity لظروف الإجهاد البيئية التي تسبب البروتين تتكشف 15. تقرر في الجسم الحي النشاط كوصي من HdeB من خلال رصد قدرتها على قمع حساسية الرقم الهيدروجيني للسلالة Δ rpoH. وإجمالا، فإن البروتوكولات المعروضة هنا توفر نهج سريع ومباشر لوصف النشاط من كوصي الحمضية التي تنشط في المختبر وكذلك في سياق في الجسم الحي.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="2190">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:216px;">NEB10-beta E. coli cells</td>
			<td style="width:64px;">New England Biolabs</td>
			<td style="width:119px;">C3019I</td>
			<td style="width:1791px;"></td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:216px;">Ampicillin</td>
			<td style="width:64px;">Gold Biotechnology</td>
			<td style="width:119px;">A-301-3</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">LB Broth mix, Lennox</td>
			<td style="width:64px;">LAB Express</td>
			<td style="width:119px;">3003</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:216px;">IPTG</td>
			<td style="width:64px;">Gold Biotechnology</td>
			<td style="width:119px;">I2481C50</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:216px;">Sodium chloride</td>
			<td style="width:64px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:119px;">S271-10</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Tris</td>
			<td style="width:64px;">Amresco</td>
			<td style="width:119px;">0826-5kg</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:216px;">EDTA</td>
			<td style="width:64px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:119px;">BP120-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:216px;">Polymyxin B sulfate&#160;</td>
			<td style="width:64px;">ICN Biomedicals Inc.</td>
			<td style="width:119px;">100565</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">0.2 UM pore sterile Syringe Filter</td>
			<td style="width:64px;">Corning</td>
			<td style="width:119px;">431218</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="84">
			<td height="84" style="height:84px;width:216px;">HiTrap Q HP (CV 5 ml)</td>
			<td style="width:64px;">GE Healthcare Life Sciences</td>
			<td style="width:119px;">17-1153-01</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Mini-Protean TGX, 15%</td>
			<td style="width:64px;">Bio-Rad</td>
			<td style="width:119px;">4561046</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Malate dehydrogenase (MDH)</td>
			<td style="width:64px;">Roche</td>
			<td style="width:119px;">10127914001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:216px;">Potassium phosphate (Monobasic)</td>
			<td style="width:64px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:119px;">BP362-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:216px;">Potassium phosphate (Dibasic)</td>
			<td style="width:64px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:119px;">BP363-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">F-4500 fluorescence spectrophotometer</td>
			<td style="width:64px;">Hitachi</td>
			<td style="width:119px;">FL25</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Oxaloacetate</td>
			<td style="width:64px;">Sigma</td>
			<td style="width:119px;">O4126-5G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">NADH</td>
			<td style="width:64px;">Sigma&#160;</td>
			<td style="width:119px;">N8129-100MG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Sodium phosphate monobasic</td>
			<td style="width:64px;">Sigma&#160;</td>
			<td style="width:119px;">S9390-2.5KG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Sodium phosphate dibasic</td>
			<td style="width:64px;">Sigma&#160;</td>
			<td style="width:119px;">S397-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Lactate dehydrogenase (LDH)</td>
			<td style="width:64px;">Roche</td>
			<td style="width:119px;">10127230001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:216px;">Beckman Proteome Lab XL-I analytical Ultracentrifuge</td>
			<td style="width:64px;">Beckman Coulter</td>
			<td style="width:119px;">392764</td>
			<td>https://www.beckmancoulter.com/wsrportal/wsrportal.portal?_nfpb=true&#38;_windowLabel=UCM_RENDERER&#38;_urlType=render&#38;wlpUCM_RENDERER_path=%252Fwsr%252Fresearch-and-discovery%252Fproducts-and-services%252Fcentrifugation%252Fproteomelab-xl-a-xl-i%252Findex.htm#2/10//0/25/1/0/asc/2/392764///0/1//0/%2Fwsrportal%2Fwsr%2Fresearch-and-discovery%2Fproducts-and-services%2Fcentrifugation%2Fproteomelab-xl-a-xl-i%2Findex.htm/</td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:216px;">Centerpiece, 12 mm, Epon Charcoal-filled</td>
			<td style="width:64px;">Beckman Coulter</td>
			<td style="width:119px;">306493</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:216px;">AN-50 Ti Rotor, Analytical, 8-Place</td>
			<td style="width:64px;">Beckman Coulter</td>
			<td style="width:119px;">363782</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Wizard Plus Miniprep Kit</td>
			<td style="width:64px;">Promega</td>
			<td style="width:119px;">A1470</td>
			<td>used for plasmid purification (Protocol 5.1)</td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:216px;">L-arabinose</td>
			<td style="width:64px;">Gold Biotechnology</td>
			<td style="width:119px;">A-300-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:216px;">Glycine</td>
			<td style="width:64px;">DOT Scientific Inc</td>
			<td style="width:119px;">DSG36050-1000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:216px;">Fluorescence Cell cuvette</td>
			<td style="width:64px;">Hellma Analytics</td>
			<td style="width:119px;">119004F-10-40</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Oligonucleotides</td>
			<td style="width:64px;">Invitrogen</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:216px;">Phusion High-Fidelity DNA polymerase</td>
			<td style="width:64px;">New England Biolabs</td>
			<td style="width:119px;">M0530S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">dNTP set</td>
			<td style="width:64px;">Invitrogen</td>
			<td style="width:119px;">10297018</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:216px;">Hydrochloric Acid</td>
			<td style="width:64px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:119px;">A144-212</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:216px;">Sodium Hydroxide</td>
			<td style="width:64px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:119px;">BP359-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Amicon Ultra 15 mL 3K NMWL</td>
			<td style="width:64px;">Millipore</td>
			<td style="width:119px;">UFC900324</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:216px;">Centrifuge Avanti J-26XPI</td>
			<td style="width:64px;">Beckman Coulter</td>
			<td style="width:119px;">393127</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Varian Cary 50 spectrophotometer</td>
			<td style="width:64px;">Agilent Tech</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="84">
			<td height="84" style="height:84px;width:216px;">Spectra/Por 1 Dialysis Membrane MWCO: 6 kDa</td>
			<td style="width:64px;">Spectrum Laboratories</td>
			<td style="width:119px;">132650</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Amicon Ultra Centrifugal Filter Units 30K</td>
			<td style="width:64px;">Millipore</td>
			<td style="width:119px;">UFC803024</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:216px;">SDS</td>
			<td style="width:64px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:119px;">bp166-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Veriti 96-Well Thermal Cycler</td>
			<td style="width:64px;">Thermo Fisher</td>
			<td style="width:119px;">4375786</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

detection of the ph-dependent activity of escherichia coli chaperone hdeb in vitro and in vivo

وكثيرا ما تتعرض البكتيريا لتغيرات بيئية، مثل التغيرات في درجة الحموضة، ودرجة الحرارة، وحالة الأكسدة، التعرض للضوء أو القوة الميكانيكية. العديد من هذه الشروط يسبب البروتين تتكشف في الخلية ويكون لها تأثير ضار على بقاء الكائن الحي. وقد أظهرت مجموعة من لا علاقة لها، المحرمين الجزيئي الإجهاد محددة للعب أدوار أساسية في بقاء هذه ظروف الإجهاد. في حين مطوية بالكامل وكوصي غير نشط قبل الإجهاد، وهذه البروتينات تتكشف بسرعة ويصبح-كوصي نشط تحت ظروف الإجهاد محددة. تنشيط مرة واحدة، وهذه مرافقين المختلين مشروط ربط عدد كبير من البروتينات المعرضة للتجميع مختلفة، ومنع تجميع وإما بشكل مباشر أو غير مباشر تسهيل بروتين refolding لدى عودته إلى الظروف غير الإجهاد. النهج الأساسي لاكتساب فهم أكثر تفصيلا حول آلية تفعيل والعميل الاعتراف بها ينطوي على تنقية وsubsequenر توصيف هذه البروتينات باستخدام فحوصات في المختبر كوصي. المتابعة في المقايسات إجهاد الجسم الحي ضرورية للغاية لتأكيد مستقل حصلت في نتائج المختبر. يصف هذا البروتوكول في التجارب المختبرية وأساليب الجسم الحي لوصف النشاط كوصي من E. القولونية HdeB، وهو كوصي حمض تفعيلها. واستخدمت القياسات نثر الخفيفة، مريحة للقراءة خارج عن قدرة HdeB لمنع تجميع الناجم عن حمض من البروتين العميل نموذج المعمول بها، مليون درهم، في المختبر. طبقت التجارب تنبيذ فائق التحليلية للكشف عن تشكيل المعقد بين HdeB ورابطة حقوق الإنسان البروتين عملائها، لتسليط الضوء على مصير البروتينات العميل لدى عودتهم إلى الظروف غير الإجهاد. وأجريت فحوصات النشاط الأنزيمية للبروتينات العميل لرصد آثار HdeB على تعطيل العميل الناجم عن درجة الحموضة وتنشيط. وأخيرا، استخدمت دراسات البقاء على قيد الحياة لرصد ومراقبةص تأثير وظيفة كوصي HdeB في الجسم الحي.

HdeA وHdeB هي مثلي E. البروتينات القولونية، والمعروف لحماية البروتينات محيط بالجبلة ضد ظروف الإجهاد الحمضية 10. كشفت عملنا التي تشبه إلى HdeA، HdeB يعمل أيضا تنشيط حمض كوصي الجزيئية. ومع ذلك، وعلى النقيض من وظائف HdeA، HdeB في الرقم الهيدروجيني ال...

Watch this Scientific Journal Video about Detection of the pH-dependent Activity of Escherichia coli Chaperone HdeB In Vitro and In Vivo at JoVE.com

Detection of the pH-dependent Activity of Escherichia coli Chaperone HdeB In Vitro and In Vivo

توضح هذه الدراسة تقنيات الطبيعية الحيوية، والكيمياء الحيوية والجزيئية لوصف النشاط كوصي من الإشريكية القولونية HdeB في ظل الظروف الحامضية. وقد تم تطبيق هذه الأساليب بنجاح للمرافقين آخرين حامض واقية مثل HdeA ويمكن تعديل للعمل من أجل مرافقين آخرين وظروف الإجهاد.

الكشف عن تعتمد على درجة الحموضة آخر من<em&gt; كولاي</em&gt; الوصيفة HdeB<em&gt; في المختبر</em&gt; و<em&gt; في فيفو</em

Bacteria are frequently exposed to environmental changes, such as alterations in pH, temperature, redox status, light exposure or mechanical force. Many ...

Research

JoVE Journal

Biochemistry

Detection of the pH-dependent Activity of Escherichia coli Chaperone HdeB In Vitro and In Vivo

Directed Protein Packaging within Outer Membrane Vesicles from Escherichia coli: Design, Production and Purification

Directed Protein Packaging within Outer Membrane Vesicles from Escherichia coli: Design, Production and Purification

توجه التغليف البروتين داخل الخارجي غشاء الحويصلات من<em&gt; كولاي</em&gt;: تصميم وإنتاج وتنقية

An increasing interest in applying synthetic biology techniques to program outer membrane vesicles (OMV) are leading to some very interesting and unique ...

Quantification of the Abundance and Charging Levels of Transfer RNAs in Escherichia coli

Quantification of the Abundance and Charging Levels of Transfer RNAs in Escherichia coli

التحديد الكمي للوفرة وفرض مستويات نقل الكشف في الإشريكيّة القولونية

Transfer RNA (tRNA) is an essential part of the translational machinery in any organism. tRNAs bind and transfer amino acids to the translating ribosome. ...

Rab10 Phosphorylation Detection by LRRK2 Activity Using SDS-PAGE with a Phosphate-binding Tag

كشف الفسفرة Rab10 بالنشاط LRRK2 باستخدام مخزونات النشر الاستراتيجي-الصفحة مع علامة ربط الفوسفات

Mutations in leucine-rich repeat kinase 2 (LRRK2) have been shown to be linked with familial Parkinson&#39;s disease (FPD). Since abnormal activation of ...

Defining Hsp33's Redox-regulated Chaperone Activity and Mapping Conformational Changes on Hsp33 Using Hydrogen-deuterium Exchange Mass Spectrometry

تعريف النشاط وصي ينظم الأكسدة والاختزال في Hsp33 وتعيين التغييرات كونفورماشونال في Hsp33 باستخدام الهيدروجين الديوتريوم التبادل الكتلي

Living organisms regularly need to cope with fluctuating environments during their life cycle, including changes in temperature, pH, the accumulation of ...

Detection of Phospholipase C Activity in the Brain Homogenate from the Honeybee

الكشف عن نشاط ج فوسفوليباسي في هوموجيناتي المخ من نحل العسل

The honeybee is a model organism for evaluating complex behaviors and higher brain function, such as learning, memory, and division of labor. The mushroom ...

Quantification of Hypopigmentation Activity In Vitro

التحديد الكمي لنشاط نقص التصبغ في المختبر

This study presents laboratory methods for the quantification of hypopigmentation activity in vitro. Melanin, the major pigment in melanocytes, is ...

Large-scale Production of Recombinant RNAs on a Circular Scaffold Using a Viroid-derived System in Escherichia coli

Large-scale Production of Recombinant RNAs on a Circular Scaffold Using a Viroid-derived System in Escherichia coli

الإنتاج الواسع النطاق للكشف المؤتلف في سقالة دائرية باستخدام نظام المستمدة من فرويد في الإشريكيّة القولونية

With increasing interest in RNA biology and the use of RNA molecules in sophisticated biotechnological applications, the methods to produce large amounts ...

Site-Directed Mutagenesis for In Vitro and In Vivo Experiments Exemplified with RNA Interactions in Escherichia Coli

Site-Directed Mutagenesis for In Vitro and In Vivo Experiments Exemplified with RNA Interactions in Escherichia Coli

الطفرات موقع الموجه لفي المختبر وفي فيفو التجارب المتمثلة بالتفاعلات الحمض النووي الريبي في الإشريكيّة القولونية

Site-directed mutagenesis is a technique used to introduce specific mutations in DNA to investigate the interaction between small non-coding ribonucleic ...

Site Specific Lysine Acetylation of Histones for Nucleosome Reconstitution using Genetic Code Expansion in Escherichia coli

Site Specific Lysine Acetylation of Histones for Nucleosome Reconstitution using Genetic Code Expansion in Escherichia coli

موقع محدد ليسين أسيتيل الهستونات لإعادة تشكيل النوكليوسوم باستخدام توسيع الشفرة الوراثية في الإشريكية القولونية

Acetylated histone proteins can be easily expressed in Escherichia coli encoding a mutant, N&#949;-acetyl-lysine (AcK)-specific Methanosarcina mazi ...

Extraction and Visualization of Protein Aggregates after Treatment of Escherichia coli with a Proteotoxic Stressor

Extraction and Visualization of Protein Aggregates after Treatment of Escherichia coli with a Proteotoxic Stressor

استخراج وتصور مجاميع البروتين بعد علاج الإشريكية القولونية مع الإجهاد البروتيوكسي

The exposure of living organisms to environmental and cellular stresses often causes disruptions in protein homeostasis and can result in protein ...