Name: detection of the ph-dependent activity of escherichia coli chaperone hdeb in vitro and in vivo
Uploaded: 2016-10-23T13:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Detection of the pH-dependent Activity of Escherichia coli Chaperone HdeB In Vitro and In Vivo at JoVE.com

Nous remercions le Dr Claudia Cremers pour ses conseils utiles sur les tests de chaperons. Ken Wan est reconnu pour son aide technique dans la purification HdeB. Ce travail a été soutenu par le Howard Hughes Medical Institute (à JCAB) et les National Institutes of Health subvention RO1 GM102829 à JCAB et UJJ-UD est soutenu par une bourse de recherche postdoctorale de la Fondation allemande pour la recherche (DFG).

1. Expression et purification de périplasmique HdeB REMARQUE: HdeB a été exprimée dans E. cellules de E. coli hébergeant le plasmide pTrc- hdeB 10, et purifié à partir du périplasme lors de la lyse polymyxine. <ol><li> Préparer une culture de nuit de E. cellules de E. coli hébergeant le plasmide pTrc- hdeB 10 dans 30 ml de LB contenant 200 ug / ml d&#39; ampicilline (LB Amp). Inoculer quatre cultures 1 L de LB <sub...

<ol>
	<li>Smith, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Role+of+Gastric+Acid+in+Preventing+Foodborne+Disease+and+How+Bacteria+Overcome+Acid+Conditions.">The Role of Gastric Acid in Preventing Foodborne Disease and How Bacteria Overcome Acid Conditions.</a> J Food Protect. 66, 1292-1303 (2003).</li><li>Hong, W., Wu, Y. E., Fu, X., Chang, Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chaperone-dependent+mechanisms+for+acid+resistance+in+enteric+bacteria.">Chaperone-dependent mechanisms for acid resistance in enteric bacteria.</a> Trends Microbiol. 20 (7), 328-335 (2012).</li><li>Koebnik, R., Locher, K. 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U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regulation+of+the+Heat-shock+Protein+70+Reaction+Cycle+by+the+Mammalian+DnaJ+Homolog,+Hsp40.">Regulation of the Heat-shock Protein 70 Reaction Cycle by the Mammalian DnaJ Homolog, Hsp40.</a> J Biol Chem. 271 (32), 19617-19624 (1996).</li><li>Quan, S., Koldewey, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genetic+selection+designed+to+stabilize+proteins+uncovers+a+chaperone+called+Spy.">Genetic selection designed to stabilize proteins uncovers a chaperone called Spy.</a> Nat Struct Mol Biol. 18, 262-269 (2011).</li><li>Gray, M. J., Wholey, W. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Polyphosphate+Is+a+Primordial+Chaperone.">Polyphosphate Is a Primordial Chaperone.</a> Mol Cell. 53 (5), 689-699 (2014).</li></ol>

<html> Afin d&#39;étudier le mécanisme d&#39;activation et la fonction de chaperon HdeB, de grandes quantités de HdeB doivent être exprimés et purifiés. Un certain nombre de systèmes de vecteurs d&#39;expression sont disponibles pour la production de niveaux élevés d&#39;une protéine cible, y compris les vecteurs pTrc ou pBAD, dont les deux ont été utilisés dans cette étude. Les promoteurs sont facilement accessibles pour E. coli ARN polymérase et d&#39; expression permettent ainsi fortement régu...

Un environnement naturel commun dans lequel les agents pathogènes microbiens expérience protéines conditions qui se déroulent à l&#39; acide induite est l&#39;estomac des mammifères (plage de pH 1-4), dont le pH acide sert une barrière efficace contre les agents pathogènes d&#39;origine alimentaire 1. Dépliement des protéines et de l&#39; agrégation, qui est causée par la protonation de la chaîne latérale d&#39;acides aminés, affectent les processus biologiques, endommage les structures cellulaires et provoque finalement la mort cellulaire 1,2. Etant donné que le pH du périplasme bactérien s&#39;équilibre presque instantanément le pH de l&#39; environnement due à la diffusion libre des protons à travers la membrane externe poreuse, les protéines de la membrane périplasmique et internes des bactéries Gram-négatives sont des composants cellulaires les plus vulnérables dans des conditions acides au stress 3. Pour protéger leur protéome périplasmique contre les dommages induits par l&#39;acide rapide, les bactéries Gram-négatives utilisent les chaperons périplasmiques activés par un acide et HdeA HdeB. HdeA est un chaperon conditionnellement désordonné <sup&gt; 4,5: A pH neutre, HdeA est présente sous forme repliée, dimère de chaperon inactif. Après un changement de pH inférieur à pH 3, la fonction de chaperon de HdeA est rapidement activé 6,7. L&#39; activation de HdeA nécessite de profonds changements structurels, y compris sa dissociation en monomères, et le dépliement partiel des monomères 6-8. Une fois activé, HdeA se lie aux protéines qui se déroulent dans des conditions acides. Il empêche efficacement leur agrégation à la fois au cours de l&#39;incubation à faible pH, ainsi que sur la neutralisation du pH. Lors du retour à pH 7,0, HdeA facilite le repliement de ses protéines clientes de manière ATP-indépendante et reconvertit en son dimère, conformation chaperonner-inactive 9. De même, le chaperon HdeB homologue est également chaperon inactif à un pH de 7,0. Contrairement à HdeA, cependant, l&#39;activité de chaperon de HdeB atteint son maximum apparent à pH 4,0, les conditions dans lesquelles HdeB est encore largement plié et dimères 10. De plus, abaissant encore les caus de pHes l&#39;inactivation de HdeB. Ces résultats suggèrent que, malgré leur grande homologie, HdeA et HdeB diffèrent dans leur mode d&#39;activation fonctionnelle qui leur permet de couvrir une large gamme de pH avec leur fonction protectrice de chaperon. Une autre protéine chaperon qui a été impliquée dans la résistance à l&#39; acide de E. coli est la Hsp31 cytoplasmique, qui semble stabiliser les protéines clientes dépliés jusqu&#39;à des conditions neutres soient rétablies. Le mode précis de l&#39;action de Hsp31, cependant, est resté énigmatique 12. Étant donné que d&#39; autres bactéries entéropathogènes telles que Salmonella manquent l&#39;opéron hdeAB, il est très probable que d&#39; autres chaperons périplasmiques non encore identifiés pourraient existent qui sont impliqués dans la résistance aux acides de ces bactéries 11. Les protocoles présentés ici permettent de surveiller l&#39;activité de chaperon dépendant du pH HdeB in vitro et in vivo , 10 et peuvent être appliqués pour étudier d&#39; autres chaperonstelles que Hsp31. En variante, le réseau complexe de facteurs de transcription qui contrôlent l&#39;expression des hdeAB peut potentiellement être étudiée par le test in vivo du stress. Afin de caractériser la fonction de chaperon de protéines in vivo, les différentes configurations expérimentales peuvent être appliquées. Une voie est d&#39;appliquer la protéine dépliage des conditions de stress et de caractériser les souches mutantes phénotypique que soit surexpriment le gène d&#39;intérêt ou de porter une délétion du gène. Des études protéomiques peuvent être menées pour identifier les protéines qui ne sont plus globale dans des conditions de stress lorsque le chaperon est présent, ou l&#39;influence d&#39;un chaperon sur une enzyme spécifique peut être déterminée dans des conditions de stress à l&#39; aide de dosages enzymatiques 14-16. Dans cette étude, nous avons choisi de surexprimer HdeB dans une souche rpoH de suppression, qui n&#39;a pas le choc thermique facteur sigma 32. rpoH contrôle l&#39;expression de tous les principaux E. chaperons coli et sa suppression est connu pour augmenter sensibilité à des conditions de stress environnementaux qui causent le dépliement des protéines 15. L&#39;activité in vivo dans le chaperon de HdeB a été déterminée en surveillant sa capacité à supprimer la sensibilité au pH de la souche Δ rpoH. Au total, les protocoles présentés ici fournissent une méthode rapide et simple pour caractériser l&#39;activité d&#39;un chaperon activé par un acide in vitro ainsi que dans le contexte in vivo.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="2190">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:216px;">NEB10-beta E. coli cells</td>
			<td style="width:64px;">New England Biolabs</td>
			<td style="width:119px;">C3019I</td>
			<td style="width:1791px;"></td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:216px;">Ampicillin</td>
			<td style="width:64px;">Gold Biotechnology</td>
			<td style="width:119px;">A-301-3</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">LB Broth mix, Lennox</td>
			<td style="width:64px;">LAB Express</td>
			<td style="width:119px;">3003</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:216px;">IPTG</td>
			<td style="width:64px;">Gold Biotechnology</td>
			<td style="width:119px;">I2481C50</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:216px;">Sodium chloride</td>
			<td style="width:64px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:119px;">S271-10</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Tris</td>
			<td style="width:64px;">Amresco</td>
			<td style="width:119px;">0826-5kg</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:216px;">EDTA</td>
			<td style="width:64px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:119px;">BP120-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:216px;">Polymyxin B sulfate&#160;</td>
			<td style="width:64px;">ICN Biomedicals Inc.</td>
			<td style="width:119px;">100565</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">0.2 UM pore sterile Syringe Filter</td>
			<td style="width:64px;">Corning</td>
			<td style="width:119px;">431218</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="84">
			<td height="84" style="height:84px;width:216px;">HiTrap Q HP (CV 5 ml)</td>
			<td style="width:64px;">GE Healthcare Life Sciences</td>
			<td style="width:119px;">17-1153-01</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Mini-Protean TGX, 15%</td>
			<td style="width:64px;">Bio-Rad</td>
			<td style="width:119px;">4561046</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Malate dehydrogenase (MDH)</td>
			<td style="width:64px;">Roche</td>
			<td style="width:119px;">10127914001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:216px;">Potassium phosphate (Monobasic)</td>
			<td style="width:64px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:119px;">BP362-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:216px;">Potassium phosphate (Dibasic)</td>
			<td style="width:64px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:119px;">BP363-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">F-4500 fluorescence spectrophotometer</td>
			<td style="width:64px;">Hitachi</td>
			<td style="width:119px;">FL25</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Oxaloacetate</td>
			<td style="width:64px;">Sigma</td>
			<td style="width:119px;">O4126-5G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">NADH</td>
			<td style="width:64px;">Sigma&#160;</td>
			<td style="width:119px;">N8129-100MG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Sodium phosphate monobasic</td>
			<td style="width:64px;">Sigma&#160;</td>
			<td style="width:119px;">S9390-2.5KG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Sodium phosphate dibasic</td>
			<td style="width:64px;">Sigma&#160;</td>
			<td style="width:119px;">S397-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Lactate dehydrogenase (LDH)</td>
			<td style="width:64px;">Roche</td>
			<td style="width:119px;">10127230001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:216px;">Beckman Proteome Lab XL-I analytical Ultracentrifuge</td>
			<td style="width:64px;">Beckman Coulter</td>
			<td style="width:119px;">392764</td>
			<td>https://www.beckmancoulter.com/wsrportal/wsrportal.portal?_nfpb=true&#38;_windowLabel=UCM_RENDERER&#38;_urlType=render&#38;wlpUCM_RENDERER_path=%252Fwsr%252Fresearch-and-discovery%252Fproducts-and-services%252Fcentrifugation%252Fproteomelab-xl-a-xl-i%252Findex.htm#2/10//0/25/1/0/asc/2/392764///0/1//0/%2Fwsrportal%2Fwsr%2Fresearch-and-discovery%2Fproducts-and-services%2Fcentrifugation%2Fproteomelab-xl-a-xl-i%2Findex.htm/</td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:216px;">Centerpiece, 12 mm, Epon Charcoal-filled</td>
			<td style="width:64px;">Beckman Coulter</td>
			<td style="width:119px;">306493</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:216px;">AN-50 Ti Rotor, Analytical, 8-Place</td>
			<td style="width:64px;">Beckman Coulter</td>
			<td style="width:119px;">363782</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Wizard Plus Miniprep Kit</td>
			<td style="width:64px;">Promega</td>
			<td style="width:119px;">A1470</td>
			<td>used for plasmid purification (Protocol 5.1)</td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:216px;">L-arabinose</td>
			<td style="width:64px;">Gold Biotechnology</td>
			<td style="width:119px;">A-300-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:216px;">Glycine</td>
			<td style="width:64px;">DOT Scientific Inc</td>
			<td style="width:119px;">DSG36050-1000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:216px;">Fluorescence Cell cuvette</td>
			<td style="width:64px;">Hellma Analytics</td>
			<td style="width:119px;">119004F-10-40</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Oligonucleotides</td>
			<td style="width:64px;">Invitrogen</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:216px;">Phusion High-Fidelity DNA polymerase</td>
			<td style="width:64px;">New England Biolabs</td>
			<td style="width:119px;">M0530S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">dNTP set</td>
			<td style="width:64px;">Invitrogen</td>
			<td style="width:119px;">10297018</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:216px;">Hydrochloric Acid</td>
			<td style="width:64px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:119px;">A144-212</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:216px;">Sodium Hydroxide</td>
			<td style="width:64px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:119px;">BP359-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Amicon Ultra 15 mL 3K NMWL</td>
			<td style="width:64px;">Millipore</td>
			<td style="width:119px;">UFC900324</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:216px;">Centrifuge Avanti J-26XPI</td>
			<td style="width:64px;">Beckman Coulter</td>
			<td style="width:119px;">393127</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Varian Cary 50 spectrophotometer</td>
			<td style="width:64px;">Agilent Tech</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="84">
			<td height="84" style="height:84px;width:216px;">Spectra/Por 1 Dialysis Membrane MWCO: 6 kDa</td>
			<td style="width:64px;">Spectrum Laboratories</td>
			<td style="width:119px;">132650</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Amicon Ultra Centrifugal Filter Units 30K</td>
			<td style="width:64px;">Millipore</td>
			<td style="width:119px;">UFC803024</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:216px;">SDS</td>
			<td style="width:64px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:119px;">bp166-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Veriti 96-Well Thermal Cycler</td>
			<td style="width:64px;">Thermo Fisher</td>
			<td style="width:119px;">4375786</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

detection of the ph-dependent activity of escherichia coli chaperone hdeb in vitro and in vivo

Les bactéries sont fréquemment exposés à des changements environnementaux, tels que les modifications de pH, de la température, de l&#39;état redox, exposition à la lumière ou de force mécanique. Beaucoup de ces conditions provoquer le dépliement des protéines dans la cellule et avoir un impact négatif sur la survie de l&#39;organisme. Un groupe de, chaperons moléculaires spécifiques de stress non apparentés ont été montré à jouer un rôle essentiel dans la survie de ces conditions de stress. Bien que complètement plié et chaperon inactif avant stress, ces protéines se dérouler rapidement et devenir chaperon active dans des conditions de stress spécifiques. Une fois activé, ces chaperons conditionnellement désordonnés se lient à un grand nombre de protéines différentes de l&#39;agrégation sujette, de prévenir leur agglomération et de faciliter, soit directement, soit indirectement repliement des protéines lors du retour à des conditions non stressantes. La principale méthode pour obtenir une compréhension plus détaillée sur le mécanisme de leur reconnaissance d&#39;activation et le client implique la purification et subsequent caractérisation de ces protéines en utilisant dans des essais in vitro chaperons. Suivi in vivo des tests de stress sont absolument essentiels pour confirmer indépendamment l&#39;obtenu dans les résultats in vitro. Ce protocole décrit in vitro et in vivo des méthodes pour caractériser l&#39;activité de chaperon de E. coli HdeB, un chaperon activé par un acide. Les mesures de diffusion de la lumière ont été utilisées comme une lecture commode pour la capacité de HdeB pour empêcher l&#39; agrégation induite par l&#39; acide d&#39;une protéine cliente du modèle établi, MDH, in vitro. expériences d&#39;ultracentrifugation analytique ont été appliquées pour révéler la formation complexe entre HdeB et son LDH de protéine de client, de faire la lumière sur le sort des protéines clientes à leur retour à des conditions non stressantes. des dosages d&#39;activité enzymatique des protéines clientes ont été réalisées pour évaluer les effets de l&#39;inactivation HdeB sur le client et la réactivation induite par le pH. Enfin, des études de survie ont été utilisés pour monitor l&#39;influence de la fonction de chaperon de HdeB in vivo.

HdeA et HdeB sont homologues E. protéines coli, connus pour protéger les protéines périplasmiques contre les conditions de stress acide 10. Notre travail a révélé que semblable à HdeA, HdeB fonctionne également comme un acide activé chaperon moléculaire. Cependant, contrairement aux fonctions HdeA, HdeB à un pH qui est toujours potentiellement bactéricide, mais nettement plus élevée que l&#39;optimum de pH de HdeA 6,9,10,22. Afin d&#...

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Detection of the pH-dependent Activity of Escherichia coli Chaperone HdeB In Vitro and In Vivo

Cette étude décrit les techniques biophysiques, biochimiques et moléculaires permettant de caractériser l&#39;activité de chaperon d&#39;Escherichia coli HdeB dans des conditions de pH acides. Ces méthodes ont été appliquées avec succès pour d&#39;autres chaperons acide de protection tels que HdeA et peuvent être modifiés pour travailler pour d&#39;autres chaperons et des conditions de stress.

Détection de l&#39;activité dépendant du pH de<em&gt; Escherichia coli</em&gt; Chaperone HdeB<em&gt; In vitro</em&gt; et<em&gt; In Vivo</em

Bacteria are frequently exposed to environmental changes, such as alterations in pH, temperature, redox status, light exposure or mechanical force. Many ...

Research

JoVE Journal

Biochemistry

Detection of the pH-dependent Activity of Escherichia coli Chaperone HdeB In Vitro and In Vivo

Directed Protein Packaging within Outer Membrane Vesicles from Escherichia coli: Design, Production and Purification

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Réalisé Conditionnement des protéines dans la membrane externe de vésicules<em&gt; Escherichia coli</em&gt;: Conception, production et purification

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