Name: detection of the ph-dependent activity of escherichia coli chaperone hdeb in vitro and in vivo
Uploaded: 2016-10-23T13:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Detection of the pH-dependent Activity of Escherichia coli Chaperone HdeB In Vitro and In Vivo at JoVE.com

Мы благодарим доктора Клаудии Cremers за ее полезные советы по шаперонов анализов. Кен Ван признан за его технической помощи в очистке HdeB. Эта работа была поддержана Медицинского института Говарда Хьюза (к JCAB) и Национальных институтов здравоохранения грант RO1 GM102829 к JCAB и Ujj-UD поддерживается постдокторской исследовательской стипендии, предоставленной исследовательским фондом немецкой (DFG).

1. Экспрессия и очистка периплазмической HdeB Примечание: HdeB было выражено в Е. Клетки палочки , несущие плазмиду pTrc- hdeB 10 и очищают от периплазме при полимиксина лизиса. <ol><li> Подготовка ночной культуры Е. Клетки палочки , несущие плазмиду pTrc- hdeB 10</...

<ol>
	<li>Smith, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Role+of+Gastric+Acid+in+Preventing+Foodborne+Disease+and+How+Bacteria+Overcome+Acid+Conditions.">The Role of Gastric Acid in Preventing Foodborne Disease and How Bacteria Overcome Acid Conditions.</a> J Food Protect. 66, 1292-1303 (2003).</li><li>Hong, W., Wu, Y. E., Fu, X., Chang, Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chaperone-dependent+mechanisms+for+acid+resistance+in+enteric+bacteria.">Chaperone-dependent mechanisms for acid resistance in enteric bacteria.</a> Trends Microbiol. 20 (7), 328-335 (2012).</li><li>Koebnik, R., Locher, K. P., Van Gelder, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structure+and+function+of+bacterial+outer+membrane+proteins:+barrels+in+a+nutshell.">Structure and function of bacterial outer membrane proteins: barrels in a nutshell.</a> Mol Microbiol. 37, 239-253 (2000).</li><li>Reichmann, D., Xu, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Order+out+of+Disorder:+Working+Cycle+of+an+Intrinsically+Unfolded+Chaperone.">Order out of Disorder: Working Cycle of an Intrinsically Unfolded Chaperone.</a> Cell. 148 (5), 947-957 (2012).</li><li>Bardwell, J. C. A., Jakob, U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Conditional+disorder+in+chaperone+action.">Conditional disorder in chaperone action.</a> Trends Biochem Sci. 37 (12), 517-525 (2012).</li><li>Tapley, T. L., Korner, J. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structural+plasticity+of+an+acid-activated+chaperone+allows+promiscuous+substrate+binding.">Structural plasticity of an acid-activated chaperone allows promiscuous substrate binding.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 106 (14), 5557-5562 (2009).</li><li>Hong, W., Jiao, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Periplasmic+Protein+HdeA+Exhibits+Chaperone-like+Activity+Exclusively+within+Stomach+pH+Range+by+Transforming+into+Disordered+Conformation.">Periplasmic Protein HdeA Exhibits Chaperone-like Activity Exclusively within Stomach pH Range by Transforming into Disordered Conformation.</a> J Biol Chem. 280 (29), 27029-27034 (2005).</li><li>Zhang, B. W., Brunetti, L., Brooks, C. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Probing+pH-Dependent+Dissociation+of+HdeA+Dimers.">Probing pH-Dependent Dissociation of HdeA Dimers.</a> J Am Chem Soc. 133, 19393-19398 (2011).</li><li>Tapley, T. L., Franzmann, T. M., Chakraborty, S., Jakob, U., Bardwell, J. C. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Protein+refolding+by+pH-triggered+chaperone+binding+and+release.">Protein refolding by pH-triggered chaperone binding and release.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 107 (3), 1071-1076 (2010).</li><li>Dahl, J. -. U., Koldewey, P., Salmon, L., Horowitz, S., Bardwell, J. C. A., Jakob, U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=HdeB+Functions+as+an+Acid-protective+Chaperone+in+Bacteria.">HdeB Functions as an Acid-protective Chaperone in Bacteria.</a> J Biol Chem. 290 (1), 65-75 (2015).</li><li>Waterman, S. R., Small, P. L. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+of+sigmas-dependent+genes+associated+with+the+stationary-phase+acid-resistance+phenotype+of+Shigella+flexneri.">Identification of sigmas-dependent genes associated with the stationary-phase acid-resistance phenotype of Shigella flexneri.</a> Mol Microbiol. 21 (5), 925-940 (1996).</li><li>Mucacic, M., Baneyx, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chaperone+Hsp31+Contributes+to+Acid+Resistance+in+Stationary-Phase+Escherichia+coli.">Chaperone Hsp31 Contributes to Acid Resistance in Stationary-Phase Escherichia coli.</a> Appl Environ Microbiol. 73 (3), 1014-1018 (2007).</li><li>Daugherty, D. L., Rozema, D., Hanson, P. E., Gellman, S. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Artificial+Chaperone-assisted+Refolding+of+Citrate+Synthase.">Artificial Chaperone-assisted Refolding of Citrate Synthase.</a> J Biol Chem. 273, 33961-33971 (1998).</li><li>Jakob, U., Muse, W., Eser, M., Bardwell, J. C. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chaperone+Activity+with+a+Redox+Switch.">Chaperone Activity with a Redox Switch.</a> Cell. 96 (3), 341-352 (1999).</li><li>Guisbert, E., Yura, T., Rhodius, V. A., Gross, C. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Convergence+of+Molecular,+Modeling,+and+Systems+Approaches+for+an+Understanding+of+the+Escherichia+coli+Heat+Shock+Response.">Convergence of Molecular, Modeling, and Systems Approaches for an Understanding of the Escherichia coli Heat Shock Response.</a> Microbiol Mol Biol Rev. 72 (3), 545-554 (2008).</li><li>Tomoyasu, T., Mogk, A., Langen, H., Goloubinoff, P., Bukau, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genetic+dissection+of+the+roles+of+chaperones+and+proteases+in+protein+folding+and+degradation+in+the+Escherichia+coli+cytosol.">Genetic dissection of the roles of chaperones and proteases in protein folding and degradation in the Escherichia coli cytosol.</a> Mol Microbiol. 40 (2), 397-413 (2001).</li><li>Schuck, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Size-Distribution+Analysis+of+Macromolecules+by+Sedimentation+Velocity+Ultracentrifugation+and+Lamm+Equation+Modeling.">Size-Distribution Analysis of Macromolecules by Sedimentation Velocity Ultracentrifugation and Lamm Equation Modeling.</a> Biophys J. 78 (3), 1606-1619 (2000).</li><li>Patel, T. R., Winzor, D. J., Scott, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Analytical+ultracentrifugation:+A+versatile+tool+for+the+characterisation+of+macromolecular+complexes+in+solution.">Analytical ultracentrifugation: A versatile tool for the characterisation of macromolecular complexes in solution.</a> Methods. 95, 55-61 (2016).</li><li>Sambrook, J., Russell, D. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Purification+of+Nucleic+Acids+by+Extraction+with+Phenol:Chloroform.">Purification of Nucleic Acids by Extraction with Phenol:Chloroform.</a> Cold Spring Harb Protoc. 2006, (2006).</li><li>Foit, L., George, J. S., Zhang, B. i. n. W., Brooks, C. L., Bardwell, J. C. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chaperone+activation+by+unfolding.">Chaperone activation by unfolding.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 110, 1254-1262 (2013).</li><li>Nicoll, W. S., Boshoff, A., Ludewig, M. H., Hennessy, F., Jung, M., Blatch, G. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Approaches+to+the+isolation+and+characterization+of+molecular+chaperones.">Approaches to the isolation and characterization of molecular chaperones.</a> Protein Express Purif. 46, 1-15 (2006).</li><li>Minami, Y., Hohfeld, J., Ohtsuka, K., Hartl, F. U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regulation+of+the+Heat-shock+Protein+70+Reaction+Cycle+by+the+Mammalian+DnaJ+Homolog,+Hsp40.">Regulation of the Heat-shock Protein 70 Reaction Cycle by the Mammalian DnaJ Homolog, Hsp40.</a> J Biol Chem. 271 (32), 19617-19624 (1996).</li><li>Quan, S., Koldewey, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genetic+selection+designed+to+stabilize+proteins+uncovers+a+chaperone+called+Spy.">Genetic selection designed to stabilize proteins uncovers a chaperone called Spy.</a> Nat Struct Mol Biol. 18, 262-269 (2011).</li><li>Gray, M. J., Wholey, W. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Polyphosphate+Is+a+Primordial+Chaperone.">Polyphosphate Is a Primordial Chaperone.</a> Mol Cell. 53 (5), 689-699 (2014).</li></ol>

<html> Для изучения механизма активации и шаперонного функции HdeB, большие количества HdeB должны быть экспрессирован и очищен. Ряд векторных систем экспрессии доступны для получения высоких уровней белка-мишени, в том числе PTRC или pBAD векторы, оба из которых были использованы в этом исследов...

Распространенной природная среда , в которой микробные патогены опыт кислотно-индуцированного протеина условия разворачивание желудка млекопитающих (диапазон рН 1-4), чей кислый рН служит эффективным барьером против пищевых патогенов 1. Разворачивания белка и агрегации, которая вызывается боковой цепи аминокислоты протонирования, влияет на биологические процессы, повреждения оборудования клеточные структуры , и в конечном итоге приводит к гибели клеток в 1,2 раза . Поскольку рН бактериальной периплазмы уравновешивает практически мгновенно при рН среды за счет свободной диффузии протонов через пористую внешнюю мембрану, периплазматические и внутренние мембранные белки грамотрицательных бактерий являются наиболее уязвимые клеточные компоненты в условиях кислотно-стресс - 3. Для того, чтобы защитить их периплазматической протеом от быстрого повреждения кислотой опосредовано, грамотрицательные бактерии используют кислотно-активированный периплазмической шаперонов HdeA и HdeB. HdeA является условно неупорядоченных шаперонная <sup&gt; 4,5: при нейтральном рН, HdeA присутствует в виде сложенной, шаперонного-неактивный димер. При сдвиге рН ниже рН 3, функция шаперонная HdeA в быстро активируется 6,7. Активация HdeA требует глубоких структурных изменений, в том числе его диссоциации на мономеры, а также частичное разворачивание мономеров 6-8. После активации HdeA связывается с белками, которые разворачиваются в кислых условиях. Это эффективно предотвращает их агрегацию и во время инкубации при низком рН, а также при рН нейтрализации. При возврате до рН 7,0, HdeA облегчает рефолдинга своих клиентов белков в АТФ-независимым образом , и преобразует его обратно в димерной, шаперон-неактивной конформации 9. Точно так же, гомологичные шаперонная HdeB также шаперон-неактивными при рН 7,0. В отличие от HdeA, однако, шаперонная активность HdeB достигает своего максимума при кажущейся рН 4,0, условия , при которых HdeB до сих пор в значительной степени сложена и димерных 10. Кроме того, дальнейшее понижение рН CAUSэс инактивация HdeB. Эти результаты свидетельствуют о том, что, несмотря на обширные гомологии, HdeA и HdeB различаются по способу их функциональной активации позволяет им охватывать широкий диапазон рН с их защитной функции шаперона. Еще один шаперонная , который вовлечен в кислотной резистентности E. палочка является цитоплазматическим Hsp31, который , как представляется , стабилизировать развернутые клиентские белки , пока нейтральные условия не будут восстановлены. Точный механизм действия Hsp31, однако, остается загадочным 12. Учитывая , что другие Энтеропатогенная бактерии , такие как Salmonella , отсутствие оперон hdeAB, весьма вероятно , что другие еще неизвестные периплазматические шапероны могут существовать, которые участвуют в кислотной резистентности этих бактерий 11. Протоколы , представленные здесь , позволяют контролировать рН-зависимой шаперонную активности HdeB в пробирке и в естественных условиях 10 и могут быть применены для исследования других шапероновтакие как Hsp31. С другой стороны , сложная сеть факторов транскрипции , которые контролируют экспрессию hdeAB потенциально могут быть исследованы с помощью естественных условиях стресс - теста в. Для того, чтобы охарактеризовать функцию шаперона белков в естественных условиях, различные экспериментальные установки могут быть применены. Один путь состоит в применении разворачивания белка стрессовые состояния и фенотипически характеризуют мутантные штаммы, которые либо сверхэкспрессии представляющего интерес гена или нести делеция гена. Протеомные исследования могут быть проведены, чтобы определить , какие белки больше не агрегированный в стрессовых условиях , когда шаперонная присутствует, или влияние компаньонкой на конкретного фермента может быть определена во время стрессовых условиях с использованием ферментативных анализов 14-16. В данном исследовании мы выбрали гиперэкспрессией HdeB в штамм rpoH удаления, в которой отсутствует фактор сигмы теплового шока 32. RpoH контролирует экспрессию всех основных Е. палочки наставники и его исключение как известно, увеличивает Сенсitivity к условиям окружающей среды , которые вызывают стресс разворачивания белка 15. В естественных условиях шаперонная активность HdeB определяли путем мониторинга его способностью подавлять чувствительность рН штамма Δ rpoH. В целом, протоколы , представленные здесь , обеспечивают быстрый и простой подход к характеризации активности кислой активированного шаперона в пробирке, а также в контексте в естественных условиях.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="2190">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:216px;">NEB10-beta E. coli cells</td>
			<td style="width:64px;">New England Biolabs</td>
			<td style="width:119px;">C3019I</td>
			<td style="width:1791px;"></td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:216px;">Ampicillin</td>
			<td style="width:64px;">Gold Biotechnology</td>
			<td style="width:119px;">A-301-3</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">LB Broth mix, Lennox</td>
			<td style="width:64px;">LAB Express</td>
			<td style="width:119px;">3003</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:216px;">IPTG</td>
			<td style="width:64px;">Gold Biotechnology</td>
			<td style="width:119px;">I2481C50</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:216px;">Sodium chloride</td>
			<td style="width:64px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:119px;">S271-10</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Tris</td>
			<td style="width:64px;">Amresco</td>
			<td style="width:119px;">0826-5kg</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:216px;">EDTA</td>
			<td style="width:64px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:119px;">BP120-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:216px;">Polymyxin B sulfate&#160;</td>
			<td style="width:64px;">ICN Biomedicals Inc.</td>
			<td style="width:119px;">100565</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">0.2 UM pore sterile Syringe Filter</td>
			<td style="width:64px;">Corning</td>
			<td style="width:119px;">431218</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="84">
			<td height="84" style="height:84px;width:216px;">HiTrap Q HP (CV 5 ml)</td>
			<td style="width:64px;">GE Healthcare Life Sciences</td>
			<td style="width:119px;">17-1153-01</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Mini-Protean TGX, 15%</td>
			<td style="width:64px;">Bio-Rad</td>
			<td style="width:119px;">4561046</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Malate dehydrogenase (MDH)</td>
			<td style="width:64px;">Roche</td>
			<td style="width:119px;">10127914001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:216px;">Potassium phosphate (Monobasic)</td>
			<td style="width:64px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:119px;">BP362-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:216px;">Potassium phosphate (Dibasic)</td>
			<td style="width:64px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:119px;">BP363-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">F-4500 fluorescence spectrophotometer</td>
			<td style="width:64px;">Hitachi</td>
			<td style="width:119px;">FL25</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Oxaloacetate</td>
			<td style="width:64px;">Sigma</td>
			<td style="width:119px;">O4126-5G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">NADH</td>
			<td style="width:64px;">Sigma&#160;</td>
			<td style="width:119px;">N8129-100MG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Sodium phosphate monobasic</td>
			<td style="width:64px;">Sigma&#160;</td>
			<td style="width:119px;">S9390-2.5KG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Sodium phosphate dibasic</td>
			<td style="width:64px;">Sigma&#160;</td>
			<td style="width:119px;">S397-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Lactate dehydrogenase (LDH)</td>
			<td style="width:64px;">Roche</td>
			<td style="width:119px;">10127230001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:216px;">Beckman Proteome Lab XL-I analytical Ultracentrifuge</td>
			<td style="width:64px;">Beckman Coulter</td>
			<td style="width:119px;">392764</td>
			<td>https://www.beckmancoulter.com/wsrportal/wsrportal.portal?_nfpb=true&#38;_windowLabel=UCM_RENDERER&#38;_urlType=render&#38;wlpUCM_RENDERER_path=%252Fwsr%252Fresearch-and-discovery%252Fproducts-and-services%252Fcentrifugation%252Fproteomelab-xl-a-xl-i%252Findex.htm#2/10//0/25/1/0/asc/2/392764///0/1//0/%2Fwsrportal%2Fwsr%2Fresearch-and-discovery%2Fproducts-and-services%2Fcentrifugation%2Fproteomelab-xl-a-xl-i%2Findex.htm/</td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:216px;">Centerpiece, 12 mm, Epon Charcoal-filled</td>
			<td style="width:64px;">Beckman Coulter</td>
			<td style="width:119px;">306493</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:216px;">AN-50 Ti Rotor, Analytical, 8-Place</td>
			<td style="width:64px;">Beckman Coulter</td>
			<td style="width:119px;">363782</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Wizard Plus Miniprep Kit</td>
			<td style="width:64px;">Promega</td>
			<td style="width:119px;">A1470</td>
			<td>used for plasmid purification (Protocol 5.1)</td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:216px;">L-arabinose</td>
			<td style="width:64px;">Gold Biotechnology</td>
			<td style="width:119px;">A-300-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:216px;">Glycine</td>
			<td style="width:64px;">DOT Scientific Inc</td>
			<td style="width:119px;">DSG36050-1000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:216px;">Fluorescence Cell cuvette</td>
			<td style="width:64px;">Hellma Analytics</td>
			<td style="width:119px;">119004F-10-40</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Oligonucleotides</td>
			<td style="width:64px;">Invitrogen</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:216px;">Phusion High-Fidelity DNA polymerase</td>
			<td style="width:64px;">New England Biolabs</td>
			<td style="width:119px;">M0530S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">dNTP set</td>
			<td style="width:64px;">Invitrogen</td>
			<td style="width:119px;">10297018</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:216px;">Hydrochloric Acid</td>
			<td style="width:64px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:119px;">A144-212</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:216px;">Sodium Hydroxide</td>
			<td style="width:64px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:119px;">BP359-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Amicon Ultra 15 mL 3K NMWL</td>
			<td style="width:64px;">Millipore</td>
			<td style="width:119px;">UFC900324</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:216px;">Centrifuge Avanti J-26XPI</td>
			<td style="width:64px;">Beckman Coulter</td>
			<td style="width:119px;">393127</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Varian Cary 50 spectrophotometer</td>
			<td style="width:64px;">Agilent Tech</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="84">
			<td height="84" style="height:84px;width:216px;">Spectra/Por 1 Dialysis Membrane MWCO: 6 kDa</td>
			<td style="width:64px;">Spectrum Laboratories</td>
			<td style="width:119px;">132650</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Amicon Ultra Centrifugal Filter Units 30K</td>
			<td style="width:64px;">Millipore</td>
			<td style="width:119px;">UFC803024</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:216px;">SDS</td>
			<td style="width:64px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:119px;">bp166-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Veriti 96-Well Thermal Cycler</td>
			<td style="width:64px;">Thermo Fisher</td>
			<td style="width:119px;">4375786</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

detection of the ph-dependent activity of escherichia coli chaperone hdeb in vitro and in vivo

Бактерии часто подвергаются к изменениям окружающей среды, такие как изменения рН, температуры, окислительно-восстановительного состояния, освещенности или механической силы. Многие из этих условий вызывают разворачивания белка в клетке и оказывают вредное воздействие на выживание организма. Группа не связаны, стресс специфических молекулярных шаперонов было показано, играют существенную роль в выживании этих условиях стресса. В то время как полностью сложена и компаньонка-неактивным до того стресса, эти белки быстро разворачиваются и становятся шаперонная-активными при определенных условиях стресса. После активации эти условно неупорядоченные хапероны связываются с большим числом различных агрегатных склонными белков, предотвращают их агрегацию и прямо или косвенно способствовать белок рефолдинга после возвращения в условиях без стресса. Основной подход для получения более детального понимания о механизме их активации и распознавания клиента включает в себя очистку и subsequenт характеристика этих белков с использованием в пробирке шаперонов анализов. Последующие действия в естественных условиях стресс - анализов абсолютно необходимы , чтобы подтвердить , независимо друг от друга полученный в пробирке результатов. Этот протокол описывает в пробирке и в естественных условиях методы , чтобы охарактеризовать шаперонную активность Е. HdeB палочка, кислотно-активированный компаньонка. Измерения рассеяние света были использованы в качестве удобного чтения-аута для емкости HdeB для предотвращения кислотно-индуцированной агрегации установленного белка модель клиента, МДГ, в пробирке. Аналитические эксперименты ультрацентрифугирования были применены для выявления образования комплекса между HdeB и его белка клиент СДГ, чтобы пролить свет на судьбу клиента белков после их возвращения в условиях без стресса. Были проведены ферментные анализы активности клиента белков контролировать эффекты HdeB на рН-индуцированной инактивации и реактивации клиента. И, наконец, исследования выживаемости были использованы для Monitoг влияние функции шаперонного HdeB в естественных условиях.

HdeA и HdeB гомологичны E. палочки белки, известные защитить периплазмической белки от кислых условиях стресса 10. Наша работа показала, что похоже на HdeA, HdeB также функционирует как кислотный активированными молекул компаньонку. Тем не менее, в отличие от функций ...

Watch this Scientific Journal Video about Detection of the pH-dependent Activity of Escherichia coli Chaperone HdeB In Vitro and In Vivo at JoVE.com

Detection of the pH-dependent Activity of Escherichia coli Chaperone HdeB In Vitro and In Vivo

Это исследование описывает биофизические, биохимические и молекулярные методы характеризуют шаперонную активность кишечной палочки HdeB в кислых условиях рН. Эти методы были успешно применены для других кислотно-защитных наставниками, таких как HdeA и может быть изменен, чтобы работать для других шаперонов и стрессовых условиях.

Обнаружение рН-зависимой активности<em&gt; Кишечная палочка</em&gt; Сопровождающий HdeB<em&gt; In Vitro</em&gt; и<em&gt; В Vivo</em

Bacteria are frequently exposed to environmental changes, such as alterations in pH, temperature, redox status, light exposure or mechanical force. Many ...

Research

JoVE Journal

Biochemistry

Detection of the pH-dependent Activity of Escherichia coli Chaperone HdeB In Vitro and In Vivo

Directed Protein Packaging within Outer Membrane Vesicles from Escherichia coli: Design, Production and Purification

Directed Protein Packaging within Outer Membrane Vesicles from Escherichia coli: Design, Production and Purification

Направленный Белок Упаковка в везикул наружной мембраны из<em&gt; Кишечная палочка</em&gt;: Проектирование, производство и очистка

An increasing interest in applying synthetic biology techniques to program outer membrane vesicles (OMV) are leading to some very interesting and unique ...

Quantification of the Abundance and Charging Levels of Transfer RNAs in Escherichia coli

Quantification of the Abundance and Charging Levels of Transfer RNAs in Escherichia coli

Количественная оценка изобилие и зарядки уровней передачи РНК в Escherichia coli

Transfer RNA (tRNA) is an essential part of the translational machinery in any organism. tRNAs bind and transfer amino acids to the translating ribosome. ...

Rab10 Phosphorylation Detection by LRRK2 Activity Using SDS-PAGE with a Phosphate-binding Tag

Обнаружение Rab10 фосфорилирования LRRK2 деятельностью с помощью SDS-страницы с тегом фосфат привязки

Mutations in leucine-rich repeat kinase 2 (LRRK2) have been shown to be linked with familial Parkinson&#39;s disease (FPD). Since abnormal activation of ...

Defining Hsp33's Redox-regulated Chaperone Activity and Mapping Conformational Changes on Hsp33 Using Hydrogen-deuterium Exchange Mass Spectrometry

Определение Hsp33 в редокс регулируемых Chaperone активность и сопоставления конформационные изменения на Hsp33 с использованием водорода дейтерия обмен масс-спектрометрия

Living organisms regularly need to cope with fluctuating environments during their life cycle, including changes in temperature, pH, the accumulation of ...

Detection of Phospholipase C Activity in the Brain Homogenate from the Honeybee

Определение активности фосфолипазы C в мозг огневки от пчелы

The honeybee is a model organism for evaluating complex behaviors and higher brain function, such as learning, memory, and division of labor. The mushroom ...

Quantification of Hypopigmentation Activity In Vitro

Количественная оценка деятельности гипопигментация в пробирке

This study presents laboratory methods for the quantification of hypopigmentation activity in vitro. Melanin, the major pigment in melanocytes, is ...

Large-scale Production of Recombinant RNAs on a Circular Scaffold Using a Viroid-derived System in Escherichia coli

Large-scale Production of Recombinant RNAs on a Circular Scaffold Using a Viroid-derived System in Escherichia coli

Крупномасштабное производство рекомбинантных молекул РНК на круговой лески с помощью вироиды производные системы в Escherichia coli

With increasing interest in RNA biology and the use of RNA molecules in sophisticated biotechnological applications, the methods to produce large amounts ...

Site-Directed Mutagenesis for In Vitro and In Vivo Experiments Exemplified with RNA Interactions in Escherichia Coli

Site-Directed Mutagenesis for In Vitro and In Vivo Experiments Exemplified with RNA Interactions in Escherichia Coli

Сайт Направленный мутагенез для In Vitro и In Vivo экспериментов примером взаимодействия РНК в Escherichia Coli

Site-directed mutagenesis is a technique used to introduce specific mutations in DNA to investigate the interaction between small non-coding ribonucleic ...

Site Specific Lysine Acetylation of Histones for Nucleosome Reconstitution using Genetic Code Expansion in Escherichia coli

Site Specific Lysine Acetylation of Histones for Nucleosome Reconstitution using Genetic Code Expansion in Escherichia coli

Сайт Конкретные лизин ацетиляции гистонов для нуклеосомы Восстановление с использованием генетического расширения кода в Escherichia coli

Acetylated histone proteins can be easily expressed in Escherichia coli encoding a mutant, N&#949;-acetyl-lysine (AcK)-specific Methanosarcina mazi ...

Extraction and Visualization of Protein Aggregates after Treatment of Escherichia coli with a Proteotoxic Stressor

Extraction and Visualization of Protein Aggregates after Treatment of Escherichia coli with a Proteotoxic Stressor

Экстракция и визуализация белковых агрегатов после лечения кишечной палочки протеотоксическим стрессором

The exposure of living organisms to environmental and cellular stresses often causes disruptions in protein homeostasis and can result in protein ...