Name: detection of the ph-dependent activity of escherichia coli chaperone hdeb in vitro and in vivo
Uploaded: 2016-10-23T13:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Detection of the pH-dependent Activity of Escherichia coli Chaperone HdeB In Vitro and In Vivo at JoVE.com

Vi tackar Dr Claudia Cremers för hennes användbara råd om eskortering analyser. Ken Wan är känd för sin tekniskt stöd i HdeB rening. Detta arbete stöddes av Howard Hughes Medical Institute (till JCAB) och National Institutes of Health bidrag RO1 GM102829 till JCAB och UJJ-UD stöds av en postdoktoral forskning stipendium från den tyska Research Foundation (DFG).

1. Expression och rening av periplasmiska HdeB OBS: HdeB uttrycktes i E. coli-celler som hyser plasmiden pTrc- hdeB 10, och renades från periplasman vid polymyxin lys. <ol><li> Förbereda en över natten kultur av E. coli-celler som hyser plasmiden pTrc- hdeB 10 i 30 ml LB innehållande 200 ug / ml ampicillin (LB Amp). Inokulera fyra 1 L kulturer av LB Amp och odla dem vid 37 ° C och 200 rpm tills OD 600 nm av 0,7 har ...

<ol>
	<li>Smith, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Role+of+Gastric+Acid+in+Preventing+Foodborne+Disease+and+How+Bacteria+Overcome+Acid+Conditions.">The Role of Gastric Acid in Preventing Foodborne Disease and How Bacteria Overcome Acid Conditions.</a> J Food Protect. 66, 1292-1303 (2003).</li><li>Hong, W., Wu, Y. E., Fu, X., Chang, Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chaperone-dependent+mechanisms+for+acid+resistance+in+enteric+bacteria.">Chaperone-dependent mechanisms for acid resistance in enteric bacteria.</a> Trends Microbiol. 20 (7), 328-335 (2012).</li><li>Koebnik, R., Locher, K. P., Van Gelder, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structure+and+function+of+bacterial+outer+membrane+proteins:+barrels+in+a+nutshell.">Structure and function of bacterial outer membrane proteins: barrels in a nutshell.</a> Mol Microbiol. 37, 239-253 (2000).</li><li>Reichmann, D., Xu, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Order+out+of+Disorder:+Working+Cycle+of+an+Intrinsically+Unfolded+Chaperone.">Order out of Disorder: Working Cycle of an Intrinsically Unfolded Chaperone.</a> Cell. 148 (5), 947-957 (2012).</li><li>Bardwell, J. C. A., Jakob, U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Conditional+disorder+in+chaperone+action.">Conditional disorder in chaperone action.</a> Trends Biochem Sci. 37 (12), 517-525 (2012).</li><li>Tapley, T. L., Korner, J. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structural+plasticity+of+an+acid-activated+chaperone+allows+promiscuous+substrate+binding.">Structural plasticity of an acid-activated chaperone allows promiscuous substrate binding.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 106 (14), 5557-5562 (2009).</li><li>Hong, W., Jiao, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Periplasmic+Protein+HdeA+Exhibits+Chaperone-like+Activity+Exclusively+within+Stomach+pH+Range+by+Transforming+into+Disordered+Conformation.">Periplasmic Protein HdeA Exhibits Chaperone-like Activity Exclusively within Stomach pH Range by Transforming into Disordered Conformation.</a> J Biol Chem. 280 (29), 27029-27034 (2005).</li><li>Zhang, B. W., Brunetti, L., Brooks, C. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Probing+pH-Dependent+Dissociation+of+HdeA+Dimers.">Probing pH-Dependent Dissociation of HdeA Dimers.</a> J Am Chem Soc. 133, 19393-19398 (2011).</li><li>Tapley, T. L., Franzmann, T. M., Chakraborty, S., Jakob, U., Bardwell, J. C. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Protein+refolding+by+pH-triggered+chaperone+binding+and+release.">Protein refolding by pH-triggered chaperone binding and release.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 107 (3), 1071-1076 (2010).</li><li>Dahl, J. -. U., Koldewey, P., Salmon, L., Horowitz, S., Bardwell, J. C. A., Jakob, U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=HdeB+Functions+as+an+Acid-protective+Chaperone+in+Bacteria.">HdeB Functions as an Acid-protective Chaperone in Bacteria.</a> J Biol Chem. 290 (1), 65-75 (2015).</li><li>Waterman, S. R., Small, P. L. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+of+sigmas-dependent+genes+associated+with+the+stationary-phase+acid-resistance+phenotype+of+Shigella+flexneri.">Identification of sigmas-dependent genes associated with the stationary-phase acid-resistance phenotype of Shigella flexneri.</a> Mol Microbiol. 21 (5), 925-940 (1996).</li><li>Mucacic, M., Baneyx, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chaperone+Hsp31+Contributes+to+Acid+Resistance+in+Stationary-Phase+Escherichia+coli.">Chaperone Hsp31 Contributes to Acid Resistance in Stationary-Phase Escherichia coli.</a> Appl Environ Microbiol. 73 (3), 1014-1018 (2007).</li><li>Daugherty, D. L., Rozema, D., Hanson, P. E., Gellman, S. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Artificial+Chaperone-assisted+Refolding+of+Citrate+Synthase.">Artificial Chaperone-assisted Refolding of Citrate Synthase.</a> J Biol Chem. 273, 33961-33971 (1998).</li><li>Jakob, U., Muse, W., Eser, M., Bardwell, J. C. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chaperone+Activity+with+a+Redox+Switch.">Chaperone Activity with a Redox Switch.</a> Cell. 96 (3), 341-352 (1999).</li><li>Guisbert, E., Yura, T., Rhodius, V. A., Gross, C. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Convergence+of+Molecular,+Modeling,+and+Systems+Approaches+for+an+Understanding+of+the+Escherichia+coli+Heat+Shock+Response.">Convergence of Molecular, Modeling, and Systems Approaches for an Understanding of the Escherichia coli Heat Shock Response.</a> Microbiol Mol Biol Rev. 72 (3), 545-554 (2008).</li><li>Tomoyasu, T., Mogk, A., Langen, H., Goloubinoff, P., Bukau, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genetic+dissection+of+the+roles+of+chaperones+and+proteases+in+protein+folding+and+degradation+in+the+Escherichia+coli+cytosol.">Genetic dissection of the roles of chaperones and proteases in protein folding and degradation in the Escherichia coli cytosol.</a> Mol Microbiol. 40 (2), 397-413 (2001).</li><li>Schuck, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Size-Distribution+Analysis+of+Macromolecules+by+Sedimentation+Velocity+Ultracentrifugation+and+Lamm+Equation+Modeling.">Size-Distribution Analysis of Macromolecules by Sedimentation Velocity Ultracentrifugation and Lamm Equation Modeling.</a> Biophys J. 78 (3), 1606-1619 (2000).</li><li>Patel, T. R., Winzor, D. J., Scott, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Analytical+ultracentrifugation:+A+versatile+tool+for+the+characterisation+of+macromolecular+complexes+in+solution.">Analytical ultracentrifugation: A versatile tool for the characterisation of macromolecular complexes in solution.</a> Methods. 95, 55-61 (2016).</li><li>Sambrook, J., Russell, D. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Purification+of+Nucleic+Acids+by+Extraction+with+Phenol:Chloroform.">Purification of Nucleic Acids by Extraction with Phenol:Chloroform.</a> Cold Spring Harb Protoc. 2006, (2006).</li><li>Foit, L., George, J. S., Zhang, B. i. n. W., Brooks, C. L., Bardwell, J. C. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chaperone+activation+by+unfolding.">Chaperone activation by unfolding.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 110, 1254-1262 (2013).</li><li>Nicoll, W. S., Boshoff, A., Ludewig, M. H., Hennessy, F., Jung, M., Blatch, G. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Approaches+to+the+isolation+and+characterization+of+molecular+chaperones.">Approaches to the isolation and characterization of molecular chaperones.</a> Protein Express Purif. 46, 1-15 (2006).</li><li>Minami, Y., Hohfeld, J., Ohtsuka, K., Hartl, F. U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regulation+of+the+Heat-shock+Protein+70+Reaction+Cycle+by+the+Mammalian+DnaJ+Homolog,+Hsp40.">Regulation of the Heat-shock Protein 70 Reaction Cycle by the Mammalian DnaJ Homolog, Hsp40.</a> J Biol Chem. 271 (32), 19617-19624 (1996).</li><li>Quan, S., Koldewey, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genetic+selection+designed+to+stabilize+proteins+uncovers+a+chaperone+called+Spy.">Genetic selection designed to stabilize proteins uncovers a chaperone called Spy.</a> Nat Struct Mol Biol. 18, 262-269 (2011).</li><li>Gray, M. J., Wholey, W. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Polyphosphate+Is+a+Primordial+Chaperone.">Polyphosphate Is a Primordial Chaperone.</a> Mol Cell. 53 (5), 689-699 (2014).</li></ol>

<html> För att studera mekanismen för aktivering och chaperonfunktion av HdeB, stora mängder HdeB måste uttryckas och renas. Ett antal expressionsvektorsystem tillgängliga för produktion av höga nivåer av ett målprotein, inklusive pTrc eller pBAD-vektorer, vilka båda används i denna studie. Promotor är lätt åtkomliga för E. coli RNA-polymeras och därmed tillåta starkt uppreglerat uttryck av HdeB i någon E. coli-stam. Denna aspekt är särskilt relevant för in vivo uttryck stu...

En vanlig naturliga miljö där mikrobiella patogener upplever syra-inducerade protein utspelas villkor är däggdjur magen (pH-område 1-4), vars surt pH fungerar som en effektiv barriär mot livsmedelsburna patogener 1. Protein utbredning och aggregation, som orsakas av aminosyrasidokedjan protone påverkar biologiska processer, skadar cellstrukturer och slutligen orsakar celldöd 1,2. Sedan pH-värdet hos den bakteriella periplasman i jämvikt nästan ögonblickligen med miljö pH på grund av den fria diffusionen av protoner genom det porösa yttre membranet, periplasmiska och inre membranproteiner av Gram-negativa bakterier är de mest sårbara cellulära komponenter under syrastressbetingelser 3. För att skydda deras periplasmatiska proteomet mot snabb syra-medierad skada, gramnegativa bakterier utnyttjar syraaktiverade periplasmiska chaperoner HdeA och HdeB. HdeA är ett villkorligt störda kaperon <sup&gt; 4,5: Vid neutralt pH, är närvarande som en vikt, chaperon-inaktiv dimer HdeA. Vid ett pH-skift under pH 3, är HdeA s chaperonfunktion snabbt aktiveras 6,7. Aktivering av HdeA kräver omfattande strukturförändringar, inklusive dess dissociation i monomerer, och den partiella utspelas monomerer 6-8. När den är aktiverad, binder HdeA till proteiner som utvecklas under sura betingelser. Det förhindrar effektivt deras sammanläggning både under inkubation vid lågt pH samt på pH neutralisering. Efter återkomst till pH 7,0, HdeA underlättar veckningen av dess klient proteiner i en ATP-oberoende sätt och omvandlar tillbaka till sin dimer, chaperon-inaktiv konforma 9. På liknande sätt är den homologa chaperone HdeB också chaperon-inaktiv vid pH 7,0. Till skillnad från HdeA dock HdeB s förkläde aktivitet når sin skenbara maximum vid pH 4,0, under vilka förutsättningar HdeB är fortfarande till stor del viks och dimera 10. Dessutom ytterligare sänkning av pH causes inaktivering av HdeB. Dessa resultat tyder på att trots deras omfattande homologi, HdeA och HdeB skiljer sig i deras sätt att funktionell aktivering ger dem möjlighet att täcka ett brett pH-intervall med deras skyddande förkläde funktion. En andra chaperon som har varit inblandad i syrabeständigheten hos E. coli är den cytoplasmatiska Hsp31, som verkar för att stabilisera ovikta klient proteiner tills neutrala förhållanden har återställts. Den exakta verk Hsp31 åtgärder har dock förblivit gåtfulla 12. Med tanke på att andra enteropatogena bakterier såsom Salmonella saknar hdeAB operonet, är det mycket troligt att andra ännu oidentifierade periplasmiska kaperoner kan finnas som är involverade i syrabeständigheten hos dessa bakterier 11. De protokoll som presenteras här gör det möjligt att övervaka pH-beroende chaperon aktiviteten av HdeB in vitro och in vivo 10 och kan tillämpas för att undersöka andra kaperonersåsom Hsp31. Alternativt kan det komplexa nätverket av transkriptionsfaktorer som styr uttrycket av hdeAB potentiellt undersökas av vivo spänningstest på. För att karakterisera chaperonfunktion av proteiner in vivo, kan olika experimentella uppställningar tillämpas. En väg är att tillämpa protein utspelas spänningsförhållanden och fenotypiskt karakterisera mutantstammar som antingen överuttrycker genen av intresse eller bär en deletion av genen. Proteomikstudier kan utföras för att identifiera vilka proteiner inte längre aggregat under stressförhållanden när kaperonet är närvarande, eller påverkan av en förkläde på ett specifikt enzym kan bestämmas under stressförhållanden med användning av enzymatiska analyser 14-16. I denna studie valde vi att överuttrycka HdeB i en rpoH deletionsstam, som saknar värmechockssigmafaktorn 32. rpoH kontrollerar uttrycket av samtliga större E. coli chaperoner och dess deletion är känt för att öka sensitivity miljöstresstillstånd som orsakar protein utspelas 15. In vivo chaperon aktivitet hos HdeB bestämdes genom att övervaka dess förmåga att undertrycka pH-känsligheten hos Δ rpoH stam. Helt och hållet, de protokoll som presenteras här ger en snabb och enkel metod för att karaktärisera aktiviteten av en syraaktiverad kaperon in vitro såväl som i in vivo sammanhang.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="2190">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:216px;">NEB10-beta E. coli cells</td>
			<td style="width:64px;">New England Biolabs</td>
			<td style="width:119px;">C3019I</td>
			<td style="width:1791px;"></td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:216px;">Ampicillin</td>
			<td style="width:64px;">Gold Biotechnology</td>
			<td style="width:119px;">A-301-3</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">LB Broth mix, Lennox</td>
			<td style="width:64px;">LAB Express</td>
			<td style="width:119px;">3003</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:216px;">IPTG</td>
			<td style="width:64px;">Gold Biotechnology</td>
			<td style="width:119px;">I2481C50</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:216px;">Sodium chloride</td>
			<td style="width:64px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:119px;">S271-10</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Tris</td>
			<td style="width:64px;">Amresco</td>
			<td style="width:119px;">0826-5kg</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:216px;">EDTA</td>
			<td style="width:64px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:119px;">BP120-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:216px;">Polymyxin B sulfate&#160;</td>
			<td style="width:64px;">ICN Biomedicals Inc.</td>
			<td style="width:119px;">100565</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">0.2 UM pore sterile Syringe Filter</td>
			<td style="width:64px;">Corning</td>
			<td style="width:119px;">431218</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="84">
			<td height="84" style="height:84px;width:216px;">HiTrap Q HP (CV 5 ml)</td>
			<td style="width:64px;">GE Healthcare Life Sciences</td>
			<td style="width:119px;">17-1153-01</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Mini-Protean TGX, 15%</td>
			<td style="width:64px;">Bio-Rad</td>
			<td style="width:119px;">4561046</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Malate dehydrogenase (MDH)</td>
			<td style="width:64px;">Roche</td>
			<td style="width:119px;">10127914001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:216px;">Potassium phosphate (Monobasic)</td>
			<td style="width:64px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:119px;">BP362-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:216px;">Potassium phosphate (Dibasic)</td>
			<td style="width:64px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:119px;">BP363-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">F-4500 fluorescence spectrophotometer</td>
			<td style="width:64px;">Hitachi</td>
			<td style="width:119px;">FL25</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Oxaloacetate</td>
			<td style="width:64px;">Sigma</td>
			<td style="width:119px;">O4126-5G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">NADH</td>
			<td style="width:64px;">Sigma&#160;</td>
			<td style="width:119px;">N8129-100MG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Sodium phosphate monobasic</td>
			<td style="width:64px;">Sigma&#160;</td>
			<td style="width:119px;">S9390-2.5KG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Sodium phosphate dibasic</td>
			<td style="width:64px;">Sigma&#160;</td>
			<td style="width:119px;">S397-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Lactate dehydrogenase (LDH)</td>
			<td style="width:64px;">Roche</td>
			<td style="width:119px;">10127230001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:216px;">Beckman Proteome Lab XL-I analytical Ultracentrifuge</td>
			<td style="width:64px;">Beckman Coulter</td>
			<td style="width:119px;">392764</td>
			<td>https://www.beckmancoulter.com/wsrportal/wsrportal.portal?_nfpb=true&#38;_windowLabel=UCM_RENDERER&#38;_urlType=render&#38;wlpUCM_RENDERER_path=%252Fwsr%252Fresearch-and-discovery%252Fproducts-and-services%252Fcentrifugation%252Fproteomelab-xl-a-xl-i%252Findex.htm#2/10//0/25/1/0/asc/2/392764///0/1//0/%2Fwsrportal%2Fwsr%2Fresearch-and-discovery%2Fproducts-and-services%2Fcentrifugation%2Fproteomelab-xl-a-xl-i%2Findex.htm/</td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:216px;">Centerpiece, 12 mm, Epon Charcoal-filled</td>
			<td style="width:64px;">Beckman Coulter</td>
			<td style="width:119px;">306493</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:216px;">AN-50 Ti Rotor, Analytical, 8-Place</td>
			<td style="width:64px;">Beckman Coulter</td>
			<td style="width:119px;">363782</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Wizard Plus Miniprep Kit</td>
			<td style="width:64px;">Promega</td>
			<td style="width:119px;">A1470</td>
			<td>used for plasmid purification (Protocol 5.1)</td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:216px;">L-arabinose</td>
			<td style="width:64px;">Gold Biotechnology</td>
			<td style="width:119px;">A-300-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:216px;">Glycine</td>
			<td style="width:64px;">DOT Scientific Inc</td>
			<td style="width:119px;">DSG36050-1000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:216px;">Fluorescence Cell cuvette</td>
			<td style="width:64px;">Hellma Analytics</td>
			<td style="width:119px;">119004F-10-40</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Oligonucleotides</td>
			<td style="width:64px;">Invitrogen</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:216px;">Phusion High-Fidelity DNA polymerase</td>
			<td style="width:64px;">New England Biolabs</td>
			<td style="width:119px;">M0530S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">dNTP set</td>
			<td style="width:64px;">Invitrogen</td>
			<td style="width:119px;">10297018</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:216px;">Hydrochloric Acid</td>
			<td style="width:64px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:119px;">A144-212</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:216px;">Sodium Hydroxide</td>
			<td style="width:64px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:119px;">BP359-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Amicon Ultra 15 mL 3K NMWL</td>
			<td style="width:64px;">Millipore</td>
			<td style="width:119px;">UFC900324</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:216px;">Centrifuge Avanti J-26XPI</td>
			<td style="width:64px;">Beckman Coulter</td>
			<td style="width:119px;">393127</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Varian Cary 50 spectrophotometer</td>
			<td style="width:64px;">Agilent Tech</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="84">
			<td height="84" style="height:84px;width:216px;">Spectra/Por 1 Dialysis Membrane MWCO: 6 kDa</td>
			<td style="width:64px;">Spectrum Laboratories</td>
			<td style="width:119px;">132650</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Amicon Ultra Centrifugal Filter Units 30K</td>
			<td style="width:64px;">Millipore</td>
			<td style="width:119px;">UFC803024</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:216px;">SDS</td>
			<td style="width:64px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:119px;">bp166-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Veriti 96-Well Thermal Cycler</td>
			<td style="width:64px;">Thermo Fisher</td>
			<td style="width:119px;">4375786</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

detection of the ph-dependent activity of escherichia coli chaperone hdeb in vitro and in vivo

Bakterier utsätts ofta för miljöförändringar, såsom förändringar i pH, temperatur, redox-status, ljusexponering eller mekanisk kraft. Många av dessa förhållanden ge protein utspelas i cellen och har negativ inverkan på överlevnaden av organismen. En grupp av obesläktade, stressspecifika molekylära kaperoner har visats spela viktiga roller i överlevnaden av dessa stressförhållanden. Medan helt vikta och förkläde-inaktiv innan stress, dessa proteiner snabbt utvecklas och bli förkläde aktiva under specifika stressförhållanden. När den är aktiverad, dessa villkorligt oordnade chaperoner binda till ett stort antal olika aggregering benägna proteiner, förhindra deras aggregering och antingen direkt eller indirekt underlätta proteinåterveckning efter återkomsten till icke-påfrestningar. Den primära metoden för att få en mer detaljerad förståelse om mekanismen för deras aktivering och klient erkännande innebär rening och subsequent karakterisering av dessa proteiner med användning av in vitro-eskorte analyser. Uppföljning in vivo spänningsanalyser är absolut nödvändigt att självständigt bekräfta erhållna in vitro resultat. Detta protokoll beskriver in vitro och in vivo-metoder för att karakterisera kaperonet aktiviteten för E. coli HdeB, en syraaktiverad chaperone. Ljusmätningar Spridnings användes som en bekväm avläsning för HdeB förmåga att förhindra syra-inducerad aggregation av en etablerad modell klient protein, MDH, in vitro. Analytiska ultracentrifugeringsexperiment applicerades för att avslöja komplexbildning mellan HdeB och dess klient protein LDH, att bringa klarhet i vad som händer med klient proteiner när de återvänder till icke-påfrestningar. Enzymatiska aktivitetsanalyser av klient proteinerna utfördes för att övervaka effekterna av HdeB på pH-inducerad klient inaktivering och reaktivering. Slutligen har studier överlevnads används för att monitor påverkan av HdeB s chaperonfunktion in vivo.

HdeA och HdeB är homologa E. coli-proteiner, som är kända för att skydda periplasmatiska proteiner mot sura stressförhållanden 10. Vårt arbete visar att liknande HdeA, HdeB fungerar också som en syra aktiverad molekylära förkläde. Men i motsats till HdeA, HdeB funktioner vid ett pH som fortfarande potentiellt baktericid, men betydligt högre än pH-optimum för HdeA 6,9,10,22. För att undersöka pH-optimum för HdeB s chaperon-aktivitet in v...

Watch this Scientific Journal Video about Detection of the pH-dependent Activity of Escherichia coli Chaperone HdeB In Vitro and In Vivo at JoVE.com

Detection of the pH-dependent Activity of Escherichia coli Chaperone HdeB In Vitro and In Vivo

Denna studie beskriver biofysiska, biokemiska och molekylära tekniker för att karakterisera chaperone aktiviteten hos Escherichia coli HdeB under sura pH-betingelser. Dessa metoder har tillämpats med framgång för andra syraskydds chaperoner såsom HdeA och kan modifieras för att fungera för andra chaperoner och stressförhållanden.

Detektering av den pH-beroende aktivitet för<em&gt; Escherichia coli</em&gt; Chaperone HdeB<em&gt; In Vitro</em&gt; och<em&gt; In Vivo</em

Bacteria are frequently exposed to environmental changes, such as alterations in pH, temperature, redox status, light exposure or mechanical force. Many ...

Research

JoVE Journal

Biochemistry

Detection of the pH-dependent Activity of Escherichia coli Chaperone HdeB In Vitro and In Vivo

Directed Protein Packaging within Outer Membrane Vesicles from Escherichia coli: Design, Production and Purification

Directed Protein Packaging within Outer Membrane Vesicles from Escherichia coli: Design, Production and Purification

Riktad Protein Förpackning inom yttre membranvesiklar från<em&gt; Escherichia coli</em&gt;: Design, produktion och rening

An increasing interest in applying synthetic biology techniques to program outer membrane vesicles (OMV) are leading to some very interesting and unique ...

Quantification of the Abundance and Charging Levels of Transfer RNAs in Escherichia coli

Quantification of the Abundance and Charging Levels of Transfer RNAs in Escherichia coli

Kvantifiering av överflödet och laddning nivåer av överföring RNAs i Escherichia coli

Transfer RNA (tRNA) is an essential part of the translational machinery in any organism. tRNAs bind and transfer amino acids to the translating ribosome. ...

Rab10 Phosphorylation Detection by LRRK2 Activity Using SDS-PAGE with a Phosphate-binding Tag

Rab10 fosforylering detektion av LRRK2 aktivitet med SDS-PAGE med en fosfat-bindande tagg

Mutations in leucine-rich repeat kinase 2 (LRRK2) have been shown to be linked with familial Parkinson&#39;s disease (FPD). Since abnormal activation of ...

Defining Hsp33's Redox-regulated Chaperone Activity and Mapping Conformational Changes on Hsp33 Using Hydrogen-deuterium Exchange Mass Spectrometry

Definiera Hsp33's Redox-reglerade förkläde aktivitet och mappning konfirmerande ändringar på Hsp33 med hjälp av väte-deuterium Exchange masspektrometri

Living organisms regularly need to cope with fluctuating environments during their life cycle, including changes in temperature, pH, the accumulation of ...

Detection of Phospholipase C Activity in the Brain Homogenate from the Honeybee

Påvisande av fosfolipas C aktivitet i hjärnan Homogenatet från honungsbiet

The honeybee is a model organism for evaluating complex behaviors and higher brain function, such as learning, memory, and division of labor. The mushroom ...

Quantification of Hypopigmentation Activity In Vitro

Kvantifiering av hypopigmentering aktivitet In Vitro

This study presents laboratory methods for the quantification of hypopigmentation activity in vitro. Melanin, the major pigment in melanocytes, is ...

Large-scale Production of Recombinant RNAs on a Circular Scaffold Using a Viroid-derived System in Escherichia coli

Large-scale Production of Recombinant RNAs on a Circular Scaffold Using a Viroid-derived System in Escherichia coli

Storskalig produktion av rekombinant RNAs på en cirkulär byggnadsställning Viroid-härledda System med i Escherichia coli

With increasing interest in RNA biology and the use of RNA molecules in sophisticated biotechnological applications, the methods to produce large amounts ...

Site-Directed Mutagenesis for In Vitro and In Vivo Experiments Exemplified with RNA Interactions in Escherichia Coli

Site-Directed Mutagenesis for In Vitro and In Vivo Experiments Exemplified with RNA Interactions in Escherichia Coli

Webbplats riktad mutagenes för In Vitro och i Vivo experiment exemplifieras med RNA interaktioner i Escherichia Coli

Site-directed mutagenesis is a technique used to introduce specific mutations in DNA to investigate the interaction between small non-coding ribonucleic ...

Site Specific Lysine Acetylation of Histones for Nucleosome Reconstitution using Genetic Code Expansion in Escherichia coli

Site Specific Lysine Acetylation of Histones for Nucleosome Reconstitution using Genetic Code Expansion in Escherichia coli

Platsspecifik lysin acetylering av histoner för nukleosomkonstitution med hjälp av genetisk kodexpansion i Escherichia coli

Acetylated histone proteins can be easily expressed in Escherichia coli encoding a mutant, N&#949;-acetyl-lysine (AcK)-specific Methanosarcina mazi ...

Extraction and Visualization of Protein Aggregates after Treatment of Escherichia coli with a Proteotoxic Stressor

Extraction and Visualization of Protein Aggregates after Treatment of Escherichia coli with a Proteotoxic Stressor

Extraktion och visualisering av proteinaggregat efter behandling av Escherichia coli med proteotoxisk stressor

The exposure of living organisms to environmental and cellular stresses often causes disruptions in protein homeostasis and can result in protein ...