Name: sheathless capillary electrophoresis&#8211;mass spectrometry for metabolic profiling of biological samples
Uploaded: 2016-10-01T15:00:00
Duration: 7 min 46 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Sheathless Capillary ElectrophoresisÃ¢â‚¬â€œMass Spectrometry for Metabolic Profiling of Biological Samples at JoVE.com

Dr. Rawi Ramautar would like to acknowledge the financial support of the Veni grant scheme of the Netherlands Organization of Scientific Research (NWO Veni 722.013.008).

BEMÆRK: Den her beskrevne for brug af sheathless CE-MS for metaboliske profilering undersøgelser protokollen er kun til laboratoriet. Procedurerne beskrevet nedenfor, er baseret på nyligt offentliggjorte arbejde 4,5. Yderligere eksperimentelle detaljer kan findes i disse papirer. Før anvendelse af denne protokol, høre alle relevante materiale sikkerhedsdatablade (MSDS). Brug venligst alle passende laboratorium sikkerhedsprocedurer, herunder sikkerhedsbriller, kittel og handsker, når der udføres forsøgene beskrevet i denne protokol. 1. Forberedelse af reagenser Løsninger og prøver <ol><li> Fremstilling af baggrunden elektrolyt (BGE) <ol><li> Der fremstilles en ny BGE opløsning (10% (v / v) eddikesyre, pH 2,2) hver dag. </li><li> Tilsættes 9,0 ml vand i en 10 ml glasbeholder og tilsæt 1,0 ml eddikesyre til vandet i et stinkskab. Bland opløsningen grundigt efter en vortex. </li></ol></li><li> Udarbejdelse af metabolit standard blanding <ol><li> Opløs 50 pi af en 50 pM kation standard blanding indeholdende 60 kationiske metabolitter i 50 pi vand og blande opløsningen grundigt. Opbevares ved -80 ° C, når den ikke anvendes. </li><li> Opløs 50 pi af en 50 pM anion standard blanding indeholdende 30 anioniske metabolitter i 50 pi vand og blande opløsningen grundigt. denne opløsning opbevares i alikvoter at forhindre fryse / tø cykler af samme standard blanding, ved -80 ° C, når den ikke anvendes. BEMÆRK: metabolit standardblandinger er stabile i 3 måneder ved opbevaring korrekt ved -80 ° C. </li></ol></li><li> Fremstilling af ekstrakter fra glioblastoma-cellelinien <ol><li> Vask de adhærente humane U-87 MG glioblastom-celler tre gange med 1 ml iskold 0,9% natriumchloridopløsning 21. </li><li> Tilsæt 2 ml iskold methanol / vand-opløsning (8/2, v / v), til adhærerende celler og skrabe under anvendelse af en gummi tippes celleskraber 21. </li&gt; <li> Opsaml methanol / vand-opløsning i et reagensglas og ultralydsbehandles i 2 min. </li><li> Tilføj chloroform til methanol / vand fraktion (endeligt forhold 8/8/2, vol / vol / vol) og centrifugeres prøven i 10 minutter ved 16.100 xg og 4 ° C. </li><li> Opsaml methanol / vand lag og fordampe denne fraktion ved hjælp af et vakuum koncentrator. Rekonstituere det tørrede materiale i 50 pi vand til analyse ved sheathless CE-MS. Når du ikke bruger opbevar prøven ved -80 ° C. </li></ol></li></ol> 2. Opsætning af Sheathless CE-MS System <ol><li> Installation af nøgne kvartsglas patron med den porøse spids emitter <ol><li> Placer en ny nøgne kvartsglas patron med en porøs spids emitter (30 um indre diameter x 90 cm samlet længde) i CE instrument. </li><li> Påfør en fremadrettet skylning ved 50 psi i 15 minutter med softwaren styrer CE instrument anvendelse af 100% methanol og visuelt kontrollere, om væske strømmer ud fra capillary kontakten i denne skylletrin. Også udføre en skylning i den modsatte retning ved 50 psi i 5 minutter under anvendelse af BGE løsning til visuelt at undersøge, om væske strømmer ud fra den ledende kapillær. </li><li> Gentag trin 2.1.2 ved et tryk på 100 psi i tilfælde ingen væske dråbedannelse er blevet observeret ved kapillær udløb. Installer en ny nøgne kvartsglas patron, hvis ikke blev observeret nogen flydende drop dannelse under dette trin. </li><li> Skyl separation kapillar med vand ved 50 psi i 10 minutter, efterfulgt af 0,1 M NaOH ved 50 psi i 10 minutter, derefter ved vand ved 50 psi i 10 minutter og endelig med BGE ved 50 psi i 10 min. BEMÆRK: Trin 2.1.1 indtil 2.1.4 kun kræves til installation af en ny kapillær patron. </li></ol></li><li> Kobling af kapillarrøret porøse spids emitter til ESI-MS BEMÆRK: Før kobling CE kapillar til MS, sørge for, at MS instrumentet er kalibreret og forbundet med CE-systemet. Indstil ESI spænding til0. Monter MS instrument med en nanospray kilde. Gas 1, gas 2 og grænseflade varmelegeme temperaturen ikke er blevet anvendt som ESI ved meget lave strømningshastigheder sker ved blot at anvende ion spray spænding sat ved 1500 V. Sæt gardinet på 5 psi. <ol><li> Fjern sprøjten spidsen af ​​kvartsglas patron fra vandet røret og installere den i nanospray kilde adapter til kobling til MS instrument. Sørg for, at højden af ​​BGE hætteglas i CE instrument passer til højden af ​​sprøjten spids. </li><li> Check for strømning af væske gennem den ledende kapillar ved skylning med BGE ved 50 psi i 5 minutter. Under denne skylletrin bemærkes en dråbedannelse ved foden af ​​ESI sprøjten nål. </li><li> Skyl adskillelse kapillar med BGE ved 50 psi i 10 minutter i fremadgående retning. Dråbedannelse bør observeres ved spidsen af ​​den porøse spids emitter (sprøjten spids) under dette trin. </li><li> Placer porøse spids emitter til indgangen af ​​MS indløb ved en afstand på ca.IRCA 2 til 3 mm. </li><li> Påfør en spænding på 30 kV ved hjælp af en rampe på cirka 1 minut og begynde at erhverve MS-data i m / z området fra 65 til 1.000 m / z for stofskifteprofil undersøgelser under anvendelse af først en ESI spænding på 0. BEMÆRK: Massespektret bør være ugyldige af signal, da der ikke bør være nogen elektrospray. </li><li> Indstil ESI spænding til 1000 V, mens fortsætte måledata. Øge ESI spænding med intervaller på 200 V, indtil en konstant baggrundssignal observeres i mindst 15 min. </li><li> Optimere den porøse spids emitter position i forhold til midten af ​​MS indløb ved at flytte det i x, y eller z-retning for at se, hvilken position giver maksimal og mest stabile MS signal (total ion elektroferogram). </li><li> Efter optimering af positionen af ​​den porøse spids emitter og bestemmelse af optimale ESI spænding, indstille ESI spændingen til 0 V og formindske CE spænding fra 30 kV til 1 kV via en rampe på cirka 5 minutter. </li><li> Opret en MS-metode using den optimale ESI spænding og en CE-metoden på CE instrument til analyse af metabolit standarder og biologiske prøver. </li></ol></li></ol> 3. Analyse af Metabolit Standarder og biologiske prøver <ol><li> Evaluering af den sheathless CE-MS-system <ol><li> Overfør 20 ul af anioniske metabolit standard blanding i en tom 100 pi eppendorfrøret (PCR hætteglas), som passer ind i en CE hætteglas og sætte denne hætteglasset i indløbet prøve bakken. BEMÆRK: Den mindste volumen kræves i eppendorfrøret for en pålidelig injektion er 2 pi. <ol><li> Start MS erhvervelse negative ion-mode fremgangsmåde skabes under trin 2.2.9 og efterfølgende starte CE-sekvensen ved hjælp af softwaren styrer CE instrument. </li><li> Skyl adskillelsen kapillar med BGE ved 50 psi i 3 minutter efterfulgt af injektion med 2,0 psi i 60 sekunder (20 nl svarende til 3% af den kapillære volumen) og derefter ved BGE injektion ved 1,0 psi i 10sek. BEMÆRK: Efterfølgende MS dataopsamling udløst. </li><li> Påfør en spænding på -30 kV med en rampe på cirka 1,0 minut med et tryk på 0,5 psi i 30 minutter ved indløbet. Efter en 30 min elektroforetisk separation, stop MS dataindsamlings- og formindske CE spænding til -1 kV via en rampe på cirka 5 minutter (et gradvist fald af CE spænding efter elektroforetisk separation forbedrer holdbarheden af ​​den porøse spids kapillær emitter). </li></ol></li><li> Mellem prøve injektioner, skylles kapillaret med vand, 0,1 M natriumhydroxid, vand og BGE hver ved 30 psi i 3 min. </li><li> Analyser de registrerede data ved at bestemme migrationen gange, og signalet intensiteten af ​​den analyserede anioniske metabolit blanding. </li><li> Vurder om de anioniske metabolit standarder vises i området mellem 10 og 28 min. </li><li> Kontroller om tre strukturelt beslægtede isomerer, dvs., D-glucose-1-phosphat, D-glucose-6-phosphat og D-Fructose-6-phosphat erdelvist adskilt, dvs. resolutionen mellem de to første toppe er circa 0,75 og af de sidste to toppe er circa 0,50 (se figur 1). BEMÆRK: En opløsning på 1,5 indikerer en baseline adskillelse af to tilstødende toppe. </li><li> Gentag trin 3.1.1 og 3.1.2 for den kationiske metabolit blandingen. Sørg for, at MS detektion er nu i positiv ion-mode og CE spænding er 30 kV. </li><li> Analyser de registrerede data ved at bestemme migrationen gange, og signalet intensiteten af ​​den analyserede kationiske metabolit blanding. </li><li> Vurder om de kationiske metabolit standarder vises i området mellem 8 og 22 min. Kontroller, om isoleucin og leucin migrerer mellem 15 og 15,5 min og afgøre, om beslutningen er circa 0,5. </li></ol></li><li> Analyse af biologiske prøver <ol><li> Gentag trin 3.1.1 og 3.1.2 for anioniske metabolisk profilering af ekstraktet af glioblastom cellelinje. BEMÆRK: metaboliske contelt opnået efter prøven forbehandling svarer til en celledensitet på ca. 20 celler / nl derfor en 20 nl injektion svarer til 400 celler pr analyse. . </li><li> Opret en ekstraheret ion elektroferogram for metabolitten mælkesyre (m / z 89,0243) med 5 mDa masse nøjagtighed og kontrollere, om det signal intensitet er over 100.000 tæller. </li><li> Gentag trin 3.1.1 og 3.1.2 for kationiske metabolisk profilering af ekstraktet af glioblastom cellelinje. BEMÆRK: bør overholdes Et meget information-rige total ion elektroferogram for en 20 nl indsprøjtning i denne tilstand. </li><li> Efter analyser eller når den ikke bruges, skylles kapillaret med vand ved 50 psi i 15 minutter og opbevares indløbet del af kapillarrøret i et hætteglas indeholdende vand og det porøse afsnit (udløbsdel) i et rør også indeholder vand. </li></ol></li></ol>

<ol>
	<li>Ramautar, R., Berger, R., van der Greef, J., Hankemeier, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+metabolomics:+strategies+to+understand+biology.">Human metabolomics: strategies to understand biology.</a> Curr Opin Chem Biol. 17, 841-846 (2013).</li><li>Wishart, D. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=HMDB+3.0--The+Human+Metabolome+Database+in+2013.">HMDB 3.0--The Human Metabolome Database in 2013.</a> Nucleic Acids Res. 41, D801-D807 (2013).</li><li>Psychogios, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+human+serum+metabolome.">The human serum metabolome.</a> PLoS One. 6, e16957 (2011).</li><li>Gulersonmez, M. C., Lock, S., Hankemeier, T., Ramautar, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sheathless+capillary+electrophoresis-mass+spectrometry+for+anionic+metabolic+profiling.">Sheathless capillary electrophoresis-mass spectrometry for anionic metabolic profiling.</a> Electrophoresis. 37, 1007-1014 (2016).</li><li>Ramautar, R., Busnel, J. M., Deelder, A. M., Mayboroda, O. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Enhancing+the+coverage+of+the+urinary+metabolome+by+sheathless+capillary+electrophoresis-mass+spectrometry.">Enhancing the coverage of the urinary metabolome by sheathless capillary electrophoresis-mass spectrometry.</a> Anal Chem. 84, 885-892 (2012).</li><li>Ramautar, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Metabolic+profiling+of+human+urine+by+CE-MS+using+a+positively+charged+capillary+coating+and+comparison+with+UPLC-MS.">Metabolic profiling of human urine by CE-MS using a positively charged capillary coating and comparison with UPLC-MS.</a> Mol Biosyst. 7, 194-199 (2011).</li><li>Naz, S., Garcia, A., Barbas, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multiplatform+analytical+methodology+for+metabolic+fingerprinting+of+lung+tissue.">Multiplatform analytical methodology for metabolic fingerprinting of lung tissue.</a> Anal Chem. 85, 10941-10948 (2013).</li><li>Ibanez, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CE/LC-MS+multiplatform+for+broad+metabolomic+analysis+of+dietary+polyphenols+effect+on+colon+cancer+cells+proliferation.">CE/LC-MS multiplatform for broad metabolomic analysis of dietary polyphenols effect on colon cancer cells proliferation.</a> Electrophoresis. 33, 2328-2336 (2012).</li><li>Soga, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Simultaneous+determination+of+anionic+intermediates+for+Bacillus+subtilis+metabolic+pathways+by+capillary+electrophoresis+electrospray+ionization+mass+spectrometry.">Simultaneous determination of anionic intermediates for Bacillus subtilis metabolic pathways by capillary electrophoresis electrospray ionization mass spectrometry.</a> Anal Chem. 74, 2233-2239 (2002).</li><li>Soga, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantitative+metabolome+analysis+using+capillary+electrophoresis+mass+spectrometry.">Quantitative metabolome analysis using capillary electrophoresis mass spectrometry.</a> J Proteome Res. 2, 488-494 (2003).</li><li>Britz-McKibbin, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Capillary+electrophoresis-electrospray+ionization-mass+spectrometry+(CE-ESI-MS)-based+metabolomics.">Capillary electrophoresis-electrospray ionization-mass spectrometry (CE-ESI-MS)-based metabolomics.</a> Methods Mol Biol. 708, 229-246 (2011).</li><li>Ibanez, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+new+metabolomic+workflow+for+early+detection+of+Alzheimer's+disease.">A new metabolomic workflow for early detection of Alzheimer's disease.</a> J Chromatogr A. 1302, 65-71 (2013).</li><li>Kuehnbaum, N. L., Britz-McKibbin, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=New+advances+in+separation+science+for+metabolomics:+resolving+chemical+diversity+in+a+post-genomic+era.">New advances in separation science for metabolomics: resolving chemical diversity in a post-genomic era.</a> Chem Rev. 113, 2437-2468 (2013).</li><li>Nemes, P., Rubakhin, S. S., Aerts, J. T., Sweedler, J. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Qualitative+and+quantitative+metabolomic+investigation+of+single+neurons+by+capillary+electrophoresis+electrospray+ionization+mass+spectrometry.">Qualitative and quantitative metabolomic investigation of single neurons by capillary electrophoresis electrospray ionization mass spectrometry.</a> Nat Protoc. 8, 783-799 (2013).</li><li>Hirayama, A., Wakayama, M., Soga, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Metabolome+analysis+based+on+capillary+electrophoresis-mass+spectrometry.">Metabolome analysis based on capillary electrophoresis-mass spectrometry.</a> Trac-Trend Anal Chem. 61, 215-222 (2014).</li><li>Maxwell, E. J., Chen, D. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Twenty+years+of+interface+development+for+capillary+electrophoresis-electrospray+ionization-mass+spectrometry.">Twenty years of interface development for capillary electrophoresis-electrospray ionization-mass spectrometry.</a> Anal Chim Acta. 627, 25-33 (2008).</li><li>Bonvin, G., Schappler, J., Rudaz, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Capillary+electrophoresis-electrospray+ionization-mass+spectrometry+interfaces:+fundamental+concepts+and+technical+developments.">Capillary electrophoresis-electrospray ionization-mass spectrometry interfaces: fundamental concepts and technical developments.</a> J Chromatogr A. 1267, 17-31 (2012).</li><li>Hirayama, A., Tomita, M., Soga, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sheathless+capillary+electrophoresis-mass+spectrometry+with+a+high-sensitivity+porous+sprayer+for+cationic+metabolome+analysis.">Sheathless capillary electrophoresis-mass spectrometry with a high-sensitivity porous sprayer for cationic metabolome analysis.</a> Analyst. 137, 5026-5033 (2012).</li><li>Bonvin, G., Schappler, J., Rudaz, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Non-aqueous+capillary+electrophoresis+for+the+analysis+of+acidic+compounds+using+negative+electrospray+ionization+mass+spectrometry.">Non-aqueous capillary electrophoresis for the analysis of acidic compounds using negative electrospray ionization mass spectrometry.</a> J Chromatogr A. 1323, 163-173 (2014).</li><li>Moini, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Simplifying+CE-MS+operation.+2.+Interfacing+low-flow+separation+techniques+to+mass+spectrometry+using+a+porous+tip.">Simplifying CE-MS operation. 2. Interfacing low-flow separation techniques to mass spectrometry using a porous tip.</a> Anal Chem. 79, 4241-4246 (2007).</li><li>Dettmer, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Metabolite+extraction+from+adherently+growing+mammalian+cells+for+metabolomics+studies:+optimization+of+harvesting+and+extraction+protocols.">Metabolite extraction from adherently growing mammalian cells for metabolomics studies: optimization of harvesting and extraction protocols.</a> Anal Bioanal Chem. 399, 1127-1139 (2011).</li></ol>

We have nothing to disclose.

En sheathless CE-MS-metode anvender en porøs spids emitter er blevet præsenteret for analysen af ​​stærkt polære og ladede metabolitter. En unik egenskab ved denne fremgangsmåde er, at anioniske eller kationiske metabolitter kan profileres ved kun at skifte MS detektion og CE spænding polaritet. En bred vifte af meget polære og ladede metabolitter i biologiske prøver kan analyseres med en høj adskillelse effektivitet, som er afgørende for lignende struktur metabolitter, og med detektionsgrænser i (lav) nanomolær rækkevidde. Den præsenterede protokol fokuseret på anvendelsen af ​​sheathless CE-MS for metabolisk profilering af celleekstrakter for at eksemplificere anvendeligheden af ​​fremgangsmåden til metabolisk profilering af en biologisk prøve. Kan også anvendes den her beskrevne fremgangsmåde til metabolisk profilering af andre typer af biologiske prøver, såsom humant urin 5, idet der anvendes en korrekt procedure prøve forbehandling. Den sheathless CE-MS method er baseret på en porøs spids emitter, der tillader brugen af ​​iboende lave flow egenskab af CE. I denne sammenhæng, en stabil ESI signal er en forudsætning for reproducerbare metaboliske profilering undersøgelser. Således er det vigtigt, at sprøjten spids er korrekt placeret foran MS indløb. I denne opsætning, ESI-processen er primært afhængig af karakteren af ​​BGE og derfor BGE optimering er kritisk. Den sheathless konfiguration er mindre alsidige i forhold til kappe-flydende CE-MS systemer, hvor der kan tilsættes alle former for kappe-væske sammensætninger for at forbedre ionisering effektivitet. Den sheathless ESI sprøjten nål skal være helt fyldt med ledende væske (dvs. BGE opløsning). En ustabil ESI signal kan skyldes en delvis eller fuldt tilsluttet kapillær. Skylning ved høje tryk med BGE kan løse dette problem. Ellers skal udskiftes adskillelse kapillar. Forud for vurderingen af ​​den analytiske ydeevne, et stabilt ESI baggrund signalbør genereres først som er konsistent fra den ene dag til den anden. Den analytiske ydeevne sheathless CE-MS metode til metaboliske profilering undersøgelser skal kontrolleres dagligt bruger metabolit standard blandinger. Under de samme eksperimentelle betingelser, konsistente migration gange, dvs., variation under 3% i inden-dag (n = 10) og mellem-dag (n = 5) under anvendelse af en 20 nl injektion af en metabolit standard blanding (12,5 uM), peak bør indhentes højder / områder (variation under 15%) og plade numre (på mellem 60.000 og 400.000). Detektionsgrænser skal være i det nanomolære område for de fleste metabolit standarder. Kun når disse kriterier er opfyldt, er fremgangsmåden klar til metabolisk profilering af biologiske prøver. Hvis ikke, skal tilpasses og MS instrument re-kalibreres eller det porøse spids kapillær emitter skal ændres. En effektiv skylletrin mellem CE-MS-analyser er af stor betydning, ikke blot forforhindre potentiel overførsel men også for at opretholde adskillelsen ydeevne. Potentiel fremførsel kan skyldes BGE hætteglas forurenet med prøven, og derfor løses ved erstatning med nye BGE hætteglas. Når sheathless CE-MS-metoden ikke er i brug, er det vigtigt at frakoble adskillelse kapillar og lagre indgangssiden af ​​kapillarrøret i vand og ydersiden neddykket med den beskyttende muffe i et rør indeholdende vand for at forlænge kapillær levetid. Sammenfattende den foreslåede sheathless CE-MS-metode viser et stort potentiale for metabolisk profilering af biologiske prøver, når de anvendes i overensstemmelse med fremgangsmåderne rapporteret i denne protokol. På dette stadium, er absolut nødvendig mellem laboratorier sammenligning data for sheathless CE-MS for at vurdere den (lang sigt) reproducerbarhed og robusthed af denne tilgang til metabolomics. Denne protokol kan stimulere en sådan undersøgelse. Forskellige analytiske udfordringer skal stadig tages i betragtning. For optimal performance, bør CE-strøm holdes foretrukket under 5 pA og på dette tidspunkt de kapillære porøse tip udledere, kun udleveres ved en længde på 91 cm, som kan hæmme udviklingen af ​​high-throughput analyser. Desuden var der en lav pH adskillelse puffer anvendt til anionisk stofskifteprofil der ikke kan være den mest optimale for at opnå en baseline separation af strukturelt beslægtede sukkeropløsninger fosfater. Også vigtigt er, at kun anioniske metabolitter kan analyseres som (delvis) negativt ladet under de anvendte separationsbetingelserne. Det næste skridt er at vurdere nytten af ​​den sheathless CE-MS-metode til kliniske stofskifteprofil studier som i øjeblikket kan en enkelt porøs spids kapillar emitter kun anvendes til analyse af op til 100 biologiske prøver. Samlet set vil yderligere udvikling i sheathless CE-MS metode åbne en ny retning inden for metabolomics, dvs, i retning af en dybere forståelse af biologiske funktioner i srigelig-begrænsede tilfælde.

I moderne metabolomics, er høje ende analytisk separationsteknikker anvendt til at analysere en lang række metabolit klasser for at opnå en repræsentativ udlæsning af den fysiologiske status af en organisme 1. Det endelige mål for en metabolomics undersøgelse er at få et svar på et givet biologisk / klinisk spørgsmål. På nuværende tidspunkt er den menneskelige metabolomet Database består af mere end 40.000 metabolit poster, der repræsenterer både endogene og eksogene forbindelser (sidstnævnte oprindelse fra næringsstoffer, mikrobiota, narkotika og andre kilder) 2. I betragtning af den betydelige diversitet fysisk-kemiske egenskaber og koncentrationsinterval af disse metabolitter, bør flere analyseteknikker med forskellige mekanismer separation anvendes sammen for at profilere så mange metabolitter som muligt i en given biologisk prøve. F.eks Psychogios et al. Anvendes en kombination af fem analytiske separationsteknikker for metabolisk profiling af human serum resulterer i detektion af mere end 4.000 kemisk forskellige metabolitter 3. I dette papir vil der blive lagt vægt på nyligt udviklede CE-MS strategier for metabolisk profilering af biologiske prøver 4,5. I CE, mere specifikt kapillarzoneelektroforese (CZE; normalt omtales som CE) er forbindelser adskilles på basis af deres ladning-til-størrelsesforhold, og derfor er denne analyseteknik er særdeles velegnet til analyse af polære og ladede metabolitter. Adskillelsen mekanisme CE er fundamentalt forskellige fra kromatografiske teknikker, hvorved der tilvejebringes en komplementær visning på metaboliske sammensætning biologiske prøver 6-8. Soga og medarbejdere var de første til at vise nytten af CE-MS for den globale profilering af metabolitter i biologiske prøver 9,10. Indtil nu har muligheden og nytten af CE-MS for metabolomics blevet bredt demonstreret 11-15.CE er generelt koblet til MS via en kappe-væske grænseflade teknik 16,17; Men på grund af fortynding af det kapillære eluatet efter hylsteret-væske, detekteringsfølsomheden er uløseligt kompromitteret. For nylig blev det påvist, at anvendelsen af en sheathless grænseflade væsentligt forbedret påvisning dækning af metabolitter er til stede i forskellige biologiske prøver sammenlignet med CE-MS ved anvendelse af en klassisk kappe-væske-grænsefladen 5,18,19. For eksempel blev detekteret circa 900 molekylære funktioner i human urin ved sheathless CE-MS henviser ca. 300 molekylære funktioner blev observeret med skede-væske CE-MS 5. Den sheathless anvendte brugerflade var baseret på en porøs spids emitter, som blev opfundet af Moini 20, hvilket tillader effektiv brug af iboende lave flow ejendom CE i kombination med nano-ESI-MS. For at stimulere brugen af ​​sheathless CE-MS på metabolomics,en protokol præsenteres beskriver, hvordan denne fremgangsmåde kan anvendes til analyse af stærkt polære metabolitter i biologiske prøver, som eksemplificeret for analyse af ekstrakter fra glioblastoma-cellelinien. Det vises, at også kan anvendes sheathless CE-MS-metode til profilering af kationiske metabolitter til profilering af anioniske metabolitter på nøjagtigt samme kapillære og separationsbetingelser, derved reducere analyse tid og tilvejebringe en enkelt analytisk platform for den globale profilering af ladede metabolitter. Protokollen beskriver også en strategi for en effektiv tilpasning af sheathless porøse spids emitter med MS instrument.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="958">
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">CESI 8000 instrument</td>
			<td style="width:167px;">Sciex</td>
			<td style="width:181px;">A98089</td>
			<td style="width:395px;">OptiMS adapter required to couple CESI to MS</td>
		</tr>
		<tr height="61">
			<td height="61" style="height:61px;width:216px;">OptiMS Fused-Silica Cartridge, 30 &#956;m ID x 90 cm total length</td>
			<td style="width:167px;">Sciex</td>
			<td style="width:181px;">B07367</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="41">
			<td height="41" style="height:41px;width:216px;">OptiMS Adapter for Sciex Nanospray III source</td>
			<td style="width:167px;">Sciex</td>
			<td style="width:181px;">B07363</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">CESI vials</td>
			<td style="width:167px;">Sciex</td>
			<td style="width:181px;">B11648</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Micro vials</td>
			<td style="width:167px;">Sciex</td>
			<td style="width:181px;">144709</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Glacial acetic acid</td>
			<td style="width:167px;">Sigma</td>
			<td style="width:181px;">A6283</td>
			<td>Use in fume hood</td>
		</tr>
		<tr height="41">
			<td height="41" style="height:41px;width:216px;">Cationic metabolite mixture</td>
			<td style="width:167px;">Human Metabolome Technologies</td>
			<td style="width:181px;">H3304-3034</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="41">
			<td height="41" style="height:41px;width:216px;">Anionic metabolite mixture</td>
			<td style="width:167px;">Human Metabolome Technologies</td>
			<td style="width:181px;">H3304-1031</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="41">
			<td height="41" style="height:41px;width:216px;">Methanol (LC-MS Ultra Chromasolv)</td>
			<td style="width:167px;">Sigma</td>
			<td style="width:181px;">14262</td>
			<td>Use in fume hood</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Sodium hydroxide solution</td>
			<td style="width:167px;">Sigma</td>
			<td style="width:181px;">72079</td>
			<td>0.1 M</td>
		</tr>
		<tr height="41">
			<td height="41" style="height:41px;width:216px;">U-87 MG Glioblastoma cell line</td>
			<td style="width:167px;">Sigma</td>
			<td>89081402</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Chloroform</td>
			<td style="width:167px;">Sigma</td>
			<td align="right" style="width:181px;">650498</td>
			<td>Toxic; use in fume hood</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

sheathless capillary electrophoresis&#8211;mass spectrometry for metabolic profiling of biological samples

I metabolomics, er en bred vifte af analytiske teknikker, der anvendes til den globale profilering af (endogene) metabolitter i komplekse prøver. I dette papir, er en protokol præsenteres til analyse af anioniske og kationiske metabolitter i biologiske prøver ved kapillarelektroforese-massespektrometri (CE-MS). CE er velegnet til analyse af stærkt polære og ladede metabolitter som forbindelser adskilles på basis af deres ladning-til-størrelsesforhold. En nyligt udviklet sheathless grænseflade design, dvs. en porøs spids interface, anvendes til kobling CE til elektrosprayionisering (ESI) MS. Denne grænseflade tilgang giver en effektiv udnyttelse af den iboende lav flow ejendom af CE i kombination med MS, hvilket resulterer i nanomolære detektionsgrænser for en bred vifte af polære metabolit klasser. Protokollen præsenteres her, er baseret på at ansætte en ikke-byggemodnede kvartsglas kapillar med en porøs spids emitter ved lav-pH-separation betingelser for analyse af enbred vifte af metabolit klasser i biologiske prøver. Det påvises, at den samme sheathless CE-MS-metode kan anvendes til profilering af kationiske metabolitter, herunder aminosyrer, nucleosider og små peptider eller anioniske metabolitter, herunder sukker- phosphater, nukleotider og organiske syrer, ved kun at skifte MS detektion og adskillelse spænding polaritet. Meget informationsrige metaboliske profiler i forskellige biologiske prøver, såsom urin, cerebrospinalvæske og ekstrakter af glioblastom cellelinie, kan opnås ved denne protokol i mindre end 1 time af CE-MS-analyse.

Den foreslåede sheathless CE-MS-metode kan tilvejebringe højeffektive, dvs. plade tal fra 60.000 til 400.000, profiler til anioniske og kationiske metabolitter i nanomolære detektionsgrænser anvendelse af 10% eddikesyre (pH 2,2) som BGE. Adskillelsen af metoden til analyse af stærkt polære anioniske metabolitter påvises i tre strukturelt beslægtede sukker fosfat isomerer (figur 1). Selvom en baseline adskillelse ikke blev opnået for disse tre analytter, en delvis adskillelse er tilstrækkelig til at tillade deres selektive påvisning af MS da disse analytter har nøjagtig de samme masse. Potentialet for det sheathless CE-MS-metode til metabolisk profilering af begrænset antal celler, dvs., en 20 nl injektion svarer til 400 celler (celledensitet er ca. 20 celler / nl), demonstreres til analyse af kationiske metabolitter i et ekstrakt af glioblastoma-cellelinien (Figur 2), hvor mere end 300 molekylære funktioner blev påvist over en S / N-forholdet ≥ 5. <img alt="figur 1" src="/files/ftp_upload/54535/54535fig1.jpg" /> Figur 1. Analyse af sukker fosfat isomerer ved sheathless CE-MS. Udvundet ion elektroferogram for tre sukkerphosphat-isomerer (25 uM) opnået med sheathless CE-MS i negativ ion-mode. Forsøgsbetingelser: BGE, 10% eddikesyre (pH 2,2); adskillelse spænding, -30 kV (+0,5 psi påført ved indløbet af CE kapillar); prøveinjektion, 2,0 psi i 60 sek. Gengivet med tilladelse 4. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/54535/54535fig1large.jpg" target="_blank">Klik her for at se en større version af dette tal.</a> <img alt="Figur 2" src="/files/ftp_upload/54535/54535fig2.jpg" /> Figur 2. Analyse af isoleucin og Leucine ved sheathless CE-MS. Udvundet ion elektroferogram af to aminosyre-isomerer (25 uM) opnået med sheathless CE-MS i positiv ion-mode. Forsøgsbetingelser: BGE, 10% eddikesyre (pH 2,2); adskillelse spænding, +30 kV; prøve injektion, 2,0 psi i 60 sek. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/54535/54535fig2large.jpg" target="_blank">Klik her for at se en større version af dette tal.</a> <img alt="Figur 3" src="/files/ftp_upload/54535/54535fig3.jpg" /> Figur 3. potentiale sheathless CE-MS til profilering kationiske metabolitter i en cellelinje ekstrakt. Metabolic profil (total ion elektroferogram) observeret i et uddrag af et glioblastom cellelinie med sheathless CE-MS i positiv ion-mode. Forsøgsbetingelser: BGE, 10% eddikesyre (pH 2,2); adskillelse spænding, +30 kV; prøveinjektion, 2,0 psi i 60 sek. Gengivet med tilladelse 4 </sop&gt;. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/54535/54535fig3large.jpg" target="_blank">Klik her for at se en større version af dette tal.</a>

Watch this Scientific Journal Video about Sheathless Capillary ElectrophoresisÃ¢â‚¬â€œMass Spectrometry for Metabolic Profiling of Biological Samples at JoVE.com

Sheathless Capillary ElectrophoresisÃƒÆ’Ã‚Â¢ÃƒÂ¢Ã¢â‚¬Å¡Ã‚Â¬ÃƒÂ¢Ã¢â€šÂ¬Ã…â€œMass Spectrometry for Metabolic Profiling of Biological Samples

En protokol til metabolisk profilering af biologiske prøver ved kapillarelektroforese-massespektrometri ved hjælp af en sheathless porøs spids interface design præsenteres.

Sheathless kapillarelektroforese-massespektrometri for Metabolic profilering biologiske prøver

In metabolomics, a wide range of analytical techniques is used for the global profiling of (endogenous) metabolites in complex samples. In this paper, a ...

Research

JoVE Journal

Biochemistry

Sheathless Capillary Electrophoresis&#8211;Mass Spectrometry for Metabolic Profiling of Biological Samples

Multimer-PAGE: A Method for Capturing and Resolving Protein Complexes in Biological Samples

Multimer-PAGE: A Fremgangsmåde til registrering og Løsning proteinkomplekser i biologiske prøver

There are many well-developed methods for purifying and studying single proteins and peptides. However, most cellular functions are carried out by ...

Resolving Affinity Purified Protein Complexes by Blue Native PAGE and Protein Correlation Profiling

Løsning affinitetsrensede proteinkomplekser ved Blå Native PAGE og protein Korrelation Profilering

Most proteins act in association with others; hence, it is crucial to characterize these functional units in order to fully understand biological ...

Mass Spectrometry and Luminogenic-based Approaches to Characterize Phase I Metabolic Competency of In Vitro Cell Cultures

Mass Spectrometry and Luminogenic-based Approaches to Characterize Phase I Metabolic Competency of In Vitro Cell Cultures

Massespektrometri og luminogent tilgange til Karakterisere Fase I Metabolisk Kompetenceudvikling af<em&gt; In vitro</em&gt; Cell Cultures

Xenobiotic metabolizing enzymes play a key function in the biotransformation of medicines and toxicants by adding functional groups that increase ...

Deep Proteome Profiling by Isobaric Labeling, Extensive Liquid Chromatography, Mass Spectrometry, and Software-assisted Quantification

Dyb proteomet profilering af Isobar mærkning, omfattende væskekromatografi, massespektrometri og Software-assisteret kvantificering

Many exceptional advances have been made in mass spectrometry (MS)-based proteomics, with particular technical progress in liquid chromatography (LC) ...

Optimal Preparation of Formalin Fixed Samples for Peptide Based Matrix Assisted Laser Desorption/Ionization Mass Spectrometry Imaging Workflows

Optimal forberedelse af Formalin fast prøver for peptid baseret Matrix Assisted Laser Desorption/Ionisation massespektrometri Imaging arbejdsprocesser

The use of matrix-assisted laser desorption/ionization, mass spectrometry imaging (MALDI MSI) has rapidly expanded, since this technique analyzes a host ...

Polysome Profiling in Leishmania, Human Cells and Mouse Testis

Polysome Profiling in Leishmania, Human Cells and Mouse Testis

Polysome profilering i Leishmania, menneskelige celler og mus Testis

Proper protein expression at the right time and in the right amounts is the basis of normal cell function and survival in a fast-changing environment. For ...

Use of Electron Paramagnetic Resonance in Biological Samples at Ambient Temperature and 77 K

Brug af elektron paramagnetisk resonans i biologiske prøver ved omgivende temperatur og 77 K

The accurate and specific detection of reactive oxygen species (ROS) in different cellular and tissue compartments is essential to the study of ...

Nitropeptide Profiling and Identification Illustrated by Angiotensin II

Nitropeptid profilering og identifikation illustreret af angiotensin II

Protein nitration is one of the most important post-translational modifications (PTM) on tyrosine residues and it can be induced by chemical actions of ...

Extremely Rapid and Specific Metabolic Labelling of RNA In Vivo with 4-Thiouracil (Ers4tU)

Extremely Rapid and Specific Metabolic Labelling of RNA In Vivo with 4-Thiouracil Ers4tU

Ekstremt hurtig og specifik metabolisk mærkning af RNA in vivo med 4-thiouracil (Ers4tU)

The nucleotide analogue, 4-thiouracil (4tU), is readily taken up by cells and incorporated into RNA as it is transcribed in vivo, allowing isolation of ...

Label-Free Immunoprecipitation Mass Spectrometry Workflow for Large-scale Nuclear Interactome Profiling

Label-fri Immunoprecipitation massespektrometri workflow for storstilet nuklear Interactome profilering

Immunoaffinity purification mass spectrometry (IP-MS) has emerged as a robust quantitative method of identifying protein-protein interactions. This ...