Name: sheathless capillary electrophoresis&#8211;mass spectrometry for metabolic profiling of biological samples
Uploaded: 2016-10-01T15:00:00
Duration: 7 min 46 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Sheathless Capillary ElectrophoresisÃ¢â‚¬â€œMass Spectrometry for Metabolic Profiling of Biological Samples at JoVE.com

Dr. Rawi Ramautar would like to acknowledge the financial support of the Veni grant scheme of the Netherlands Organization of Scientific Research (NWO Veni 722.013.008).

LET OP: Het protocol hier beschreven voor het gebruik van sheathless CE-MS voor metabool profiel studies is alleen bedoeld voor gebruik laboratorium. De hieronder beschreven procedures zijn gebaseerd op de onlangs gepubliceerde werk 4,5. Verdere experimentele details zijn te vinden in deze documenten. Voorafgaand aan het gebruik van dit protocol, overleg met alle relevante veiligheidsinformatiebladen (VIB). Gebruik alle passende veiligheidsmaatregelen laboratorium procedures, met inbegrip van een veiligheidsbril, laboratoriumjas en handschoenen, bij het uitvoeren van de experimenten die in dit protocol. 1. Bereiding van reagentia en monsters Solutions <ol><li> Bereiding van de achtergrondelektrolyt (BGE) <ol><li> Bereid een nieuwe BGE-oplossing (10% (v / v) azijnzuur, pH 2,2) per dag. </li><li> Voeg 9,0 ml water in een 10 ml glazen flesje en voeg 1,0 ml azijnzuur aan het water in een zuurkast. Meng de oplossing grondig met behulp van een vortex. </li></ol></li><li> Bereiding van metaboliet stand mengsel <ol><li> Los 50 pi van een 50 pM kationen standaard mengsel dat 60 kationische metabolieten in 50 pi water en meng de oplossing grondig. Bewaar bij -80 ° C wanneer niet in gebruik. </li><li> Los 50 pi van een 50 pM anion standaard mengsel dat 30 anionische metabolieten in 50 pi water en meng de oplossing grondig. Bewaar deze oplossing in aliquots voorkomen vries / ontdooi cycli van dezelfde standaard mengsel bij -80 ° C wanneer niet in gebruik. OPMERKING: De metaboliet standaard mengsels zijn stabiel gedurende 3 maanden bij correcte opslag bij -80 ° C. </li></ol></li><li> De bereiding van uittreksels uit het glioblastoma cellijn <ol><li> Was de hechtende menselijke U-87 MG glioblastoom cellen drie maal met 1 ml ijskoude 0,9% natriumchlorideoplossing 21. </li><li> Voeg 2 ml ijskoude methanol / water-oplossing (, / v 8/2 v) om de hechtende cellen en schraap met een rubberen getipt cel schraper 21. </li&gt; <li> Verzamel de methanol / water-oplossing in een buis en ultrasonicate gedurende 2 minuten. </li><li> chloroform toevoegen methanol / waterfractie (eindverhouding 8/8/2, / / ​​v v v) en centrifugeer het monster gedurende 10 min bij 16.100 xg en 4 ° C. </li><li> Verzamel de methanol / water laag en verdampt deze fractie met behulp van een vacuüm concentrator. Reconstitueer de gedroogde materiaal in 50 ul water voor analyse door sheathless CE-MS. Na gebruik bewaren het monster bij -80 ° C. </li></ol></li></ol> 2. Het instellen van de Sheathless CE-MS-systeem <ol><li> Installatie van de kale fused silica cartridge met de poreuze tip emitter <ol><li> Plaats een nieuwe kale fused silica cartridge met een poreus tip emitter (30 urn inwendige diameter x 90 cm totale lengte) in de CE-instrument. </li><li> Breng een voorwaartse spoeling bij 50 psi gedurende 15 min met de software regelen van de CE instrument met 100% methanol, visueel of vloeistof stroomt uit de capillary outlet tijdens deze spoelstap. Voer ook een spoeling in tegengestelde richting 50 psi gedurende 5 minuten met de BGE oplossing visueel onderzocht of vloeistof stroomt uit de geleidende capillair. </li><li> Herhaal stap 2.1.2 bij een druk van 100 psi bij geen vorming vloeistofdruppel is in de capillaire uitlaat waargenomen. Plaats een nieuwe kale fused-silica cartridge indien geen vorming vloeistofdruppel tijdens deze stap waargenomen. </li><li> Spoel de scheidingscapillair met water bij 50 psi gedurende 10 min, gevolgd door 0,1 M NaOH bij 50 psi gedurende 10 min, vervolgens met water bij 50 psi gedurende 10 min en tenslotte met BGE bij 50 psi gedurende 10 min. OPMERKING: Stappen 2.1.1 tot en met 2.1.4 zijn alleen nodig voor de installatie van een nieuw capillair cartridge. </li></ol></li><li> Koppeling van de capillaire poreuze tip emitter aan ESI-MS OPMERKING: Vóór de CE capillaire MS koppeling, opdat de MS instrument gekalibreerd en verbonden met de CE-systeem. Stel de ESI spanning0. Plaats de MS instrument met een nanospray bron. Gas 1, 2 gas en interface-heater temperatuur werd niet toegepast als ESI tegen zeer lage debieten gebeurt door gewoon de toepassing van de ion spuiten spanning ingesteld op 1500 V. Set het gordijn bij 5 psi. <ol><li> Verwijder de spuit tip van het gefuseerde silica cartridge uit het water buis en installeer het in de nanospray bron adapter voor het koppelen aan de MS-instrument. Zorg ervoor dat de hoogte van de BGE flacons in de CE-instrument overeenkomt met de hoogte van de spuit tip. </li><li> Controleer het debiet van vloeistof door de geleidende capillair door spoelen met BGE bij 50 psi gedurende 5 min. Gedurende deze spoelstap een druppelvorming aan de voet van de ESI spuit naald moet worden genomen. </li><li> Spoel de scheidingscapillair met BGE bij 50 psi gedurende 10 min in voorwaartse richting. Druppelvorming moeten worden geobserveerd op het puntje van de poreuze tip emitter (spuit tip) tijdens deze stap. </li><li> Plaats de poreuze tip emitter naar de ingang van de MS inlaat op een afstand van circa 2-3 mm. </li><li> Breng een spanning van 30 kV met een stijging van 1 min, en begint MS-gegevens in de m / z bereik van 65 tot 1000 m / z voor metabool profilering studies waarbij eerst een ESI spanning van 0. LET OP: De massa spectrum nietig signaal als er geen elektrospray zou moeten zijn. </li><li> Stel de ESI spanning tot 1.000 V, terwijl doorgaan meetgegevens. Verhoog de ESI spanning in stappen van 200 V totdat een constante achtergrondsignaal wordt gedurende minimaal 15 minuten. </li><li> Optimaliseren van de poreuze top emitter positie ten opzichte van het midden van de inlaat MS door hem in de x, y, of z-richting, om te zien welke positie de maximale en meest stabiele MS signaal (totaal ion elektroferogram) bepaalt. </li><li> Na optimalisatie van de positie van de poreuze top emitter en bepalen van de optimale ESI spanning, ingesteld ESI spanning 0 V en de spanning CE van 30 kV afnemen tot 1 kV met een aanlooptijd van 5 min. </li><li> Maak een MS methode using de optimale ESI spanning en een CE methode op CE instrument voor de analyse van metaboliet normen en biologische monsters. </li></ol></li></ol> 3. Analyse van Metabolite Standards and Biological Samples <ol><li> Prestatie-evaluatie van de sheathless CE-MS-systeem <ol><li> Overdracht 20 ul van de anionische metaboliet standaard mengsel in een lege 100 ul microvaatje (PCR flacon) die past in een CE flesje en zet dit flesje in de inlaat monster lade. LET OP: De minimale vereiste volume in het microvaatje voor een betrouwbare injectie 2 pl. <ol><li> Start de MS overname negatieve ionen-modus methode die tijdens stap 2.2.9 en vervolgens de CE-sequentie met behulp van de software regelen van de CE-instrument te starten. </li><li> Spoel de scheidingscapillair met BGE bij 50 psi gedurende 3 min gevolgd door injectie van 2,0 psi gedurende 60 sec (20 nl overeenkomend met 3% van het capillaire volume) en vervolgens door BGE injectie bij 1,0 psi gedurende 10seconde LET OP: Vervolgens wordt MS data-acquisitie geactiveerd. </li><li> Breng een spanning van -30 kV met een aanlooptijd van 1,0 min met een druk van 0,5 psi gedurende 30 min bij de inlaat. Na 30 minuten elektroforetische scheiding, stoppen MS data acquisitie en CE spanning -1 kV af met een helling van 5 min (een geleidelijke afname van de CE-spanning na de elektroforetische scheiding verbetert de duurzaamheid van de poreuze capillaire tip emitter). </li></ol></li><li> Tussen monster injecties Spoel de capillair met water, 0,1 M natriumhydroxide, water en BGE elk bij 30 psi gedurende 3 min. </li><li> Analyseer de opgenomen data door bepaling van de migratietijden en de signaalintensiteit van de geanalyseerde anionogene metabolietmengsel. </li><li> Beoordelen of de anionisch metaboliet standards in het gebied tussen 10 en 28 minuten. </li><li> Controleer of drie structureel verwante isomeren, namelijk D-glucose-1-fosfaat, D-glucose-6-fosfaat en D-fructose-6-fosfaatgedeeltelijk gescheiden, dat wil zeggen, de resolutie tussen de eerste twee pieken is circa 0,75 en de laatste twee pieken is circa 0,50 (zie figuur 1). OPMERKING: Een resolutie van 1,5 wijst op een basislijn scheiding van twee aangrenzende pieken. </li><li> Herhaal stap 3.1.1 en 3.1.2 voor de kationische metaboliet mengsel. Zorg ervoor dat de MS-detectie is nu in de positieve ion-modus en CE spanning 30 kV. </li><li> Analyseer de opgenomen data door bepaling van de migratietijden en de signaalintensiteit van de geanalyseerde kationische metabolietmengsel. </li><li> Beoordelen of de kationische metaboliet standaarden worden weergegeven in het gebied tussen de 8 en 22 minuten. Controleer of isoleucine en leucine migreren tussen de 15 en 15,5 min en bepalen of de resolutie is circa 0,5. </li></ol></li><li> Analyse van biologische monsters <ol><li> Herhaal stap 3.1.1 en 3.1.2 voor anionische metabole profilering van het extract van de glioblastoma cellijn. LET OP: De metabole content verkregen na voorbehandeling van het monster komt overeen met een celdichtheid van ongeveer 20 cellen / nl, dus een 20 nl injectie is het equivalent van 400 cellen per analyse. . </li><li> Een gewonnen ion elektroferogram voor de metaboliet melkzuur (m / z 89,0243) met behulp van 5 mDa nauwkeurigheid van massa&#39;s en controleer of de signaalsterkte hoger is dan 100.000 telt. </li><li> Herhaal stap 3.1.1 en 3.1.2 voor kationische metabole profilering van het extract van de glioblastoma cellijn. LET OP: Een zeer informatie-rijke totale ion elektroferogram moeten worden geobserveerd voor een 20 nl injectie in deze modus. </li><li> Na de analyse of wanneer niet in gebruik, spoel het capillair met water bij 50 psi gedurende 15 min en bewaar het inlaatdeel van de capillair in een flacon met water en het poreuze deel (uitstroomgedeelte) in een buis ook water bevat. </li></ol></li></ol>

<ol>
	<li>Ramautar, R., Berger, R., van der Greef, J., Hankemeier, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+metabolomics:+strategies+to+understand+biology.">Human metabolomics: strategies to understand biology.</a> Curr Opin Chem Biol. 17, 841-846 (2013).</li><li>Wishart, D. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=HMDB+3.0--The+Human+Metabolome+Database+in+2013.">HMDB 3.0--The Human Metabolome Database in 2013.</a> Nucleic Acids Res. 41, D801-D807 (2013).</li><li>Psychogios, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+human+serum+metabolome.">The human serum metabolome.</a> PLoS One. 6, e16957 (2011).</li><li>Gulersonmez, M. C., Lock, S., Hankemeier, T., Ramautar, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sheathless+capillary+electrophoresis-mass+spectrometry+for+anionic+metabolic+profiling.">Sheathless capillary electrophoresis-mass spectrometry for anionic metabolic profiling.</a> Electrophoresis. 37, 1007-1014 (2016).</li><li>Ramautar, R., Busnel, J. M., Deelder, A. M., Mayboroda, O. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Enhancing+the+coverage+of+the+urinary+metabolome+by+sheathless+capillary+electrophoresis-mass+spectrometry.">Enhancing the coverage of the urinary metabolome by sheathless capillary electrophoresis-mass spectrometry.</a> Anal Chem. 84, 885-892 (2012).</li><li>Ramautar, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Metabolic+profiling+of+human+urine+by+CE-MS+using+a+positively+charged+capillary+coating+and+comparison+with+UPLC-MS.">Metabolic profiling of human urine by CE-MS using a positively charged capillary coating and comparison with UPLC-MS.</a> Mol Biosyst. 7, 194-199 (2011).</li><li>Naz, S., Garcia, A., Barbas, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multiplatform+analytical+methodology+for+metabolic+fingerprinting+of+lung+tissue.">Multiplatform analytical methodology for metabolic fingerprinting of lung tissue.</a> Anal Chem. 85, 10941-10948 (2013).</li><li>Ibanez, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CE/LC-MS+multiplatform+for+broad+metabolomic+analysis+of+dietary+polyphenols+effect+on+colon+cancer+cells+proliferation.">CE/LC-MS multiplatform for broad metabolomic analysis of dietary polyphenols effect on colon cancer cells proliferation.</a> Electrophoresis. 33, 2328-2336 (2012).</li><li>Soga, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Simultaneous+determination+of+anionic+intermediates+for+Bacillus+subtilis+metabolic+pathways+by+capillary+electrophoresis+electrospray+ionization+mass+spectrometry.">Simultaneous determination of anionic intermediates for Bacillus subtilis metabolic pathways by capillary electrophoresis electrospray ionization mass spectrometry.</a> Anal Chem. 74, 2233-2239 (2002).</li><li>Soga, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantitative+metabolome+analysis+using+capillary+electrophoresis+mass+spectrometry.">Quantitative metabolome analysis using capillary electrophoresis mass spectrometry.</a> J Proteome Res. 2, 488-494 (2003).</li><li>Britz-McKibbin, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Capillary+electrophoresis-electrospray+ionization-mass+spectrometry+(CE-ESI-MS)-based+metabolomics.">Capillary electrophoresis-electrospray ionization-mass spectrometry (CE-ESI-MS)-based metabolomics.</a> Methods Mol Biol. 708, 229-246 (2011).</li><li>Ibanez, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+new+metabolomic+workflow+for+early+detection+of+Alzheimer's+disease.">A new metabolomic workflow for early detection of Alzheimer's disease.</a> J Chromatogr A. 1302, 65-71 (2013).</li><li>Kuehnbaum, N. L., Britz-McKibbin, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=New+advances+in+separation+science+for+metabolomics:+resolving+chemical+diversity+in+a+post-genomic+era.">New advances in separation science for metabolomics: resolving chemical diversity in a post-genomic era.</a> Chem Rev. 113, 2437-2468 (2013).</li><li>Nemes, P., Rubakhin, S. S., Aerts, J. T., Sweedler, J. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Qualitative+and+quantitative+metabolomic+investigation+of+single+neurons+by+capillary+electrophoresis+electrospray+ionization+mass+spectrometry.">Qualitative and quantitative metabolomic investigation of single neurons by capillary electrophoresis electrospray ionization mass spectrometry.</a> Nat Protoc. 8, 783-799 (2013).</li><li>Hirayama, A., Wakayama, M., Soga, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Metabolome+analysis+based+on+capillary+electrophoresis-mass+spectrometry.">Metabolome analysis based on capillary electrophoresis-mass spectrometry.</a> Trac-Trend Anal Chem. 61, 215-222 (2014).</li><li>Maxwell, E. J., Chen, D. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Twenty+years+of+interface+development+for+capillary+electrophoresis-electrospray+ionization-mass+spectrometry.">Twenty years of interface development for capillary electrophoresis-electrospray ionization-mass spectrometry.</a> Anal Chim Acta. 627, 25-33 (2008).</li><li>Bonvin, G., Schappler, J., Rudaz, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Capillary+electrophoresis-electrospray+ionization-mass+spectrometry+interfaces:+fundamental+concepts+and+technical+developments.">Capillary electrophoresis-electrospray ionization-mass spectrometry interfaces: fundamental concepts and technical developments.</a> J Chromatogr A. 1267, 17-31 (2012).</li><li>Hirayama, A., Tomita, M., Soga, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sheathless+capillary+electrophoresis-mass+spectrometry+with+a+high-sensitivity+porous+sprayer+for+cationic+metabolome+analysis.">Sheathless capillary electrophoresis-mass spectrometry with a high-sensitivity porous sprayer for cationic metabolome analysis.</a> Analyst. 137, 5026-5033 (2012).</li><li>Bonvin, G., Schappler, J., Rudaz, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Non-aqueous+capillary+electrophoresis+for+the+analysis+of+acidic+compounds+using+negative+electrospray+ionization+mass+spectrometry.">Non-aqueous capillary electrophoresis for the analysis of acidic compounds using negative electrospray ionization mass spectrometry.</a> J Chromatogr A. 1323, 163-173 (2014).</li><li>Moini, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Simplifying+CE-MS+operation.+2.+Interfacing+low-flow+separation+techniques+to+mass+spectrometry+using+a+porous+tip.">Simplifying CE-MS operation. 2. Interfacing low-flow separation techniques to mass spectrometry using a porous tip.</a> Anal Chem. 79, 4241-4246 (2007).</li><li>Dettmer, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Metabolite+extraction+from+adherently+growing+mammalian+cells+for+metabolomics+studies:+optimization+of+harvesting+and+extraction+protocols.">Metabolite extraction from adherently growing mammalian cells for metabolomics studies: optimization of harvesting and extraction protocols.</a> Anal Bioanal Chem. 399, 1127-1139 (2011).</li></ol>

We have nothing to disclose.

Een sheathless CE-MS methode waarbij een poreus tip emitter is gepresenteerd voor de analyse van zeer polaire en geladen metabolieten. Een uniek kenmerk van deze benadering is dat anionische of kationische metabolieten kunnen worden geprofileerd door slechts het schakelen van de MS detectie en CE spanningpolariteit. Een groot aantal zeer polaire en geladen metabolieten in biologische monsters kunnen worden geanalyseerd met een hoog scheidend vermogen, wat cruciaal is voor structureel vergelijkbare metabolieten en met detectiegrenzen in de (lage) nanomolaire bereik. Het gepresenteerde protocol gericht op het gebruik van sheathless CE-MS metabool profilering van celextracten om de bruikbaarheid van de werkwijze voor metabolische profiel van een biologisch monster illustreren. De hier beschreven benadering kan ook gebruikt worden voor metabolische profielen van andere soorten biologische monsters, zoals humane urine 5, aangezien een juiste monstervoorbehandeling procedure wordt gebruikt. De sheathless CE-MS method is gebaseerd op een poreuze punt emitter die het gebruik van de intrinsiek lage stroom eigenschap van CE toelaat. In deze context is een stabiele ESI signaal een voorwaarde voor reproduceerbare metabool profilering studies. Aldus is het belangrijk dat de spuit tip correct geplaatst vóór de MS inlaat. In deze opstelling, de ESI proces is voornamelijk afhankelijk van de aard van de BGE en derhalve BGE optimalisatie kritisch. De sheathless configuratie is minder veelzijdig in vergelijking met huls- vloeistof CE-MS systemen waar allerlei sheath-vloeibare preparaten kunnen worden toegevoegd aan de ionisatie-efficiëntie te verbeteren. De sheathless ESI spuit naald moet volledig worden gevuld met geleidende vloeistof (dat wil zeggen, BGE oplossing). Een instabiele ESI signaal kan resulteren uit een gedeeltelijk of volledig verstopt capillair. Spoelen onder hoge druk met BGE kan dit probleem op te lossen. Anders de scheidingscapillair moet worden vervangen. Voorafgaand aan de beoordeling van de analytische prestaties, een stabiele ESI achtergrond signaalAllereerst moet worden gegenereerd die consistent van dag tot dag. De analytische prestaties van de sheathless CE-MS methode voor het metabool profiel studies moet dagelijks worden gecontroleerd met behulp van metaboliet standaard mengsels. Onder dezelfde experimentele omstandigheden, consistente migratietijden, dwz variatie dan 3% voor in-dag (n = 10) en tussen-dag (n = 5) met een 20 nl injectie van een metaboliet standaardmengsel (12,5 uM), piek hoogte / gebieden (variatie dan 15%) en nummerplaten (tussen 60.000 en 400.000) worden verkregen. Detectiegrenzen moet in het nanomolaire bereik voor de meeste metaboliet normen. Alleen wanneer deze criteria is voldaan is de werkwijze gereed voor metabool profilering van biologische monsters. Zo niet, MS instrument moet worden afgestemd en opnieuw gekalibreerd of poreuze capillaire tip emitter moet worden veranderd. Een effectieve spoelstap tussen CE-MS-analyses van groot belang, niet alleen voorvoorkomen van mogelijke overdracht maar ook om de scheiding prestaties te handhaven. Potentiële overdracht kan worden veroorzaakt door BGE flesjes besmet met het monster en derhalve opgelost door vervanging door nieuw BGE flesjes. Wanneer de sheathless CE-MS methode niet gebruikt, is het belangrijk om de scheidingscapillair ontkoppelen en de inlaatzijde van de capillair in water en de buitenkant verzonken met de beschermhuls in een buis met water capillaire langere levensduur slaan. Samengevat, de voorgestelde sheathless CE-MS werkwijze vertoont een sterke mogelijkheid van metabole profilering van biologische monsters als gebruik volgens de procedures die in dit protocol. In dit stadium worden interlaboratoriumonderzoeken vergelijkingsgegevens zeker nodig voor sheathless CE-MS om de (lange termijn) reproduceerbaarheid en betrouwbaarheid van deze benadering voor metabolomics beoordelen. Dit protocol kan een dergelijk onderzoek te stimuleren. Verschillende analytische uitdagingen moeten nog worden onderzocht. Voor een optimale performance dient de CE huidige voorkeur beneden 5 uA en in dit stadium de capillaire poreuze punt emitters zijn uitsluitend bedoeld als een lengte van 91 cm die de ontwikkeling van high-throughput assays kunnen belemmeren gehouden. Bovendien werd een lage pH buffer scheiding voor anionische metabool profilering die niet optimaal voor het bereiken van een basislijn scheiding van structureel verwante suiker fosfaten zijn. Ook belangrijk is dat alleen anionische metabolieten kunnen worden geanalyseerd die (gedeeltelijk) negatief geladen onder de gebruikte scheidingsomstandigheden. De volgende stap is het nut van de sheathless CE-MS methode voor klinische studies metabool profiel nog beoordelen, kan een poreuze capillaire tip emitter alleen gebruikt voor de analyse van maximaal 100 biologische monsters. Algemeen zullen verdere ontwikkeling van de sheathless CE-MS benadering een nieuwe richting te openen in het gebied van metabolomics, dat wil zeggen, tot een beter begrip van biologische functies sruime-beperkte gevallen.

In de hedendaagse metabolomics, zijn high-end analytische scheidingstechnieken gebruikt om een breed scala van metaboliet klassen analyseren om een vertegenwoordiger te verkrijgen uitlezen van de fysiologische status van een organisme 1. Het uiteindelijke doel van een metabolomics studie is om een ​​antwoord op een gegeven biologische / klinische vraag te verkrijgen. Momenteel wordt de menselijke metaboloom database bestaat uit meer dan 40.000 metaboliet data die zowel endogene en exogene verbindingen (deze afkomstig van voedingsstoffen, microbiota, drugs en andere bronnen) 2. Gezien de enorme diversiteit in de fysisch-chemische eigenschappen en concentratiebereik van deze metabolieten, moeten meerdere technieken met verschillende mechanismen scheiding worden gecombineerd om zoveel mogelijk metabolieten profileren een gegeven biologisch monster. Bijvoorbeeld Psychogios et al. Gebruik gemaakt van een combinatie van vijf analytische scheidingstechnieken voor metabole Prof.iling van humaan serum resulteert in de detectie van meer dan 4000 chemisch diverse metabolieten 3. In dit artikel wordt aandacht besteed aan de recent ontwikkelde CE-MS strategieën voor het metabool profiel van biologische monsters 4,5. In CE, meer in het bijzonder capillaire zone elektroforese (CZE, gewoonlijk aangeduid als CE) verbindingen worden gescheiden op basis van hun lading naar formaatverhouding en bijgevolg deze analysetechniek is zeer geschikt voor de analyse van polaire en geladen metabolieten. Het scheidingsmechanisme CE is fundamenteel verschillend van chromatografische gebaseerde technieken, waardoor een complementaire uitzicht op de metabole samenstelling van biologische monsters 6-8. Soga en medewerkers waren de eersten die de bruikbaarheid van CE-MS tonen voor de wereldwijde profilering van metabolieten in biologische monsters 9,10. Tot nu toe is de haalbaarheid en het nut van de CE-MS metabolomics op grote schaal gedemonstreerd 11-15.CE algemeen gekoppeld aan MS via een mantel-vloeistof interface techniek 16,17; Vanwege verdunning van het capillair effluent van de huls-vloeistof, de detectiegevoeligheid intrinsiek aangetast. Recent werd aangetoond dat het gebruik van een sheathless interface van de detectie dekking van metabolieten in verschillende biologische monsters aanzienlijk verbeterd in vergelijking met CE-MS onder toepassing van een klassieke mantel-vloeistof grensvlak 5,18,19. Zo werden circa 900 moleculaire eigenschappen in menselijke urine gedetecteerd door sheathless CE-MS dat ongeveer 300 moleculaire eigenschappen werden waargenomen sheath-vloeistof CE-MS 5. De sheathless-interface was gebaseerd op een poreuze punt emitter, die werd uitgevonden door Moini 20, waardoor het effectieve gebruik van de intrinsiek lage stroom eigenschap van CE in combinatie met nano-ESI-MS. Om het gebruik van sheathless CE-MS in het gebied van metabolomics stimuleren,een protocol wordt beschreven hoe deze benadering kan worden gebruikt voor de analyse van zeer polaire metabolieten in biologische monsters, zoals geïllustreerd voor de analyse van fragmenten van de glioblastoma cellijn. Er wordt aangetoond dat de sheathless CE-MS methode voor de profilering van kationische metabolieten ook kan worden gebruikt voor de profilering van anionische metabolieten exact dezelfde capillair en scheidingsomstandigheden, waardoor analysetijd verminderd en één analytische platform voor de wereldwijde profilering van geladen metabolieten. Het protocol beschrijft ook een strategie voor een doeltreffende aanpassing van de sheathless poreuze tip emitter met de MS-instrument.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="958">
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">CESI 8000 instrument</td>
			<td style="width:167px;">Sciex</td>
			<td style="width:181px;">A98089</td>
			<td style="width:395px;">OptiMS adapter required to couple CESI to MS</td>
		</tr>
		<tr height="61">
			<td height="61" style="height:61px;width:216px;">OptiMS Fused-Silica Cartridge, 30 &#956;m ID x 90 cm total length</td>
			<td style="width:167px;">Sciex</td>
			<td style="width:181px;">B07367</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="41">
			<td height="41" style="height:41px;width:216px;">OptiMS Adapter for Sciex Nanospray III source</td>
			<td style="width:167px;">Sciex</td>
			<td style="width:181px;">B07363</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">CESI vials</td>
			<td style="width:167px;">Sciex</td>
			<td style="width:181px;">B11648</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Micro vials</td>
			<td style="width:167px;">Sciex</td>
			<td style="width:181px;">144709</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Glacial acetic acid</td>
			<td style="width:167px;">Sigma</td>
			<td style="width:181px;">A6283</td>
			<td>Use in fume hood</td>
		</tr>
		<tr height="41">
			<td height="41" style="height:41px;width:216px;">Cationic metabolite mixture</td>
			<td style="width:167px;">Human Metabolome Technologies</td>
			<td style="width:181px;">H3304-3034</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="41">
			<td height="41" style="height:41px;width:216px;">Anionic metabolite mixture</td>
			<td style="width:167px;">Human Metabolome Technologies</td>
			<td style="width:181px;">H3304-1031</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="41">
			<td height="41" style="height:41px;width:216px;">Methanol (LC-MS Ultra Chromasolv)</td>
			<td style="width:167px;">Sigma</td>
			<td style="width:181px;">14262</td>
			<td>Use in fume hood</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Sodium hydroxide solution</td>
			<td style="width:167px;">Sigma</td>
			<td style="width:181px;">72079</td>
			<td>0.1 M</td>
		</tr>
		<tr height="41">
			<td height="41" style="height:41px;width:216px;">U-87 MG Glioblastoma cell line</td>
			<td style="width:167px;">Sigma</td>
			<td>89081402</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Chloroform</td>
			<td style="width:167px;">Sigma</td>
			<td align="right" style="width:181px;">650498</td>
			<td>Toxic; use in fume hood</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

sheathless capillary electrophoresis&#8211;mass spectrometry for metabolic profiling of biological samples

In metabolomics, is een breed scala van analytische technieken die worden gebruikt voor de wereldwijde profilering van (endogene) metabolieten in complexe monsters. In dit artikel wordt een gepresenteerde protocol voor de analyse van anionen en kationen metabolieten in biologische monsters door capillaire elektroforese-massaspectrometrie (CE-MS). CE is zeer geschikt voor de analyse van zeer polaire en geladen metabolieten als verbindingen worden gescheiden op basis van hun lading-tot-gewicht verhouding. Een recent ontwikkelde sheathless interface design, dat wil zeggen, een poreuze tip-interface, wordt gebruikt voor het koppelen van CE om elektrospray ionisatie (ESI) MS. Deze interfacing aanpak maakt het mogelijk het effectieve gebruik van de intrinsiek low-flow eigendom van CE in combinatie met MS, wat resulteert in nanomolaire detectielimieten voor een breed scala van polaire metaboliet klassen. De hier gepresenteerde protocol is gebaseerd op het gebruik van een kale fused-silica capillair met een poreuze punt emitter bij lage pH scheidingsomstandigheden voor de analyse van eenbreed scala van metaboliet klassen in biologische monsters. Er wordt aangetoond dat dezelfde sheathless CE-MS methode voor de profilering van kationogene metabolieten, zoals aminozuren, nucleosiden en kleine peptiden of anionische metabolieten, zoals suikerfosfaten, nucleotiden en organische zuren, kunnen worden gebruikt door alleen schakelen van de MS detectie en scheiding spanning polariteit. Sterk informatie-rijke metabolische profielen in diverse biologische monsters, zoals urine, cerebrospinale vloeistof en extracten van de glioblastoma cellijn, kan worden verkregen door dit protocol in minder dan 1 uur van de CE-MS-analyse.

De voorgestelde sheathless CE-MS methode is in staat om zeer efficiënte, dwz nummerplaten variërend van 60.000 tot 400.000, profielen voor anionogene en kationogene metabolieten bij nanomolaire detectielimieten toepassing van 10% azijnzuur (pH 2,2) als BGE. De prestatie scheiding van de werkwijze voor de analyse van zeer polaire anionische metabolieten is aangetoond voor drie structureel verwante suikeroplossingen fosfaat isomeren (figuur 1). Hoewel een basislijnscheiding werd niet verkregen voor deze drie analyten, een gedeeltelijke scheiding voldoende is om hun selectieve detectie door MS mogelijk te maken wanneer deze analyten dezelfde exacte massa. Het potentieel van de sheathless CE-MS methode voor metabool profilering van beperkt aantal cellen, dat wil zeggen, een 20 nl injectie overeen met 400 cellen (celdichtheid ongeveer 20 cellen / nl), is aangetoond voor de analyse van kationische metabolieten in een extract van de glioblastoma cellijn (Figuur 2), waarbij meer dan 300 moleculaire eigenschappen boven een S / N-verhouding ≥ 5 werden gedetecteerd. <img alt="Figuur 1" src="/files/ftp_upload/54535/54535fig1.jpg" /> Figuur 1. Analyse van suiker fosfaat isomeren door sheathless CE-MS. Gehaald ion elektroferogram drie suiker fosfaat isomeren (25 pm), verkregen met sheathless CE-MS in negatieve ionen-modus. Experimentele omstandigheden: BGE, 10% azijnzuur (pH 2,2); scheiding spanning, -30 kV (0,5 psi toegepast bij de inlaat van de capillaire CE); monsterinjectie, 2,0 psi gedurende 60 sec. Overgenomen met toestemming 4. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/54535/54535fig1large.jpg" target="_blank">Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.</a> <img alt="Figuur 2" src="/files/ftp_upload/54535/54535fig2.jpg" /> Figuur 2. Analyse van isoleucine en leucine door sheathless CE-MS. Gehaald ion electropherogram van twee aminozuur isomeren (25 pm), verkregen met sheathless CE-MS in de positieve ion-modus. Experimentele omstandigheden: BGE, 10% azijnzuur (pH 2,2); scheiding voltage, 30 kV; sample injectie, 2,0 psi gedurende 60 sec. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/54535/54535fig2large.jpg" target="_blank">Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.</a> <img alt="figuur 3" src="/files/ftp_upload/54535/54535fig3.jpg" /> Figuur 3. Potentieel van sheathless CE-MS voor het profileren van kationische metabolieten in een cellijn extract. Metabole profiel (totaal ion elektroferogram) waargenomen in een extract van een glioblastoma cellijn met sheathless CE-MS in de positieve ion-modus. Experimentele omstandigheden: BGE, 10% azijnzuur (pH 2,2); scheiding voltage, 30 kV; monsterinjectie, 2,0 psi gedurende 60 sec. Overgenomen met toestemming 4 </sup&gt;. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/54535/54535fig3large.jpg" target="_blank">Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.</a>

Watch this Scientific Journal Video about Sheathless Capillary ElectrophoresisÃ¢â‚¬â€œMass Spectrometry for Metabolic Profiling of Biological Samples at JoVE.com

Sheathless Capillary ElectrophoresisÃƒÆ’Ã‚Â¢ÃƒÂ¢Ã¢â‚¬Å¡Ã‚Â¬ÃƒÂ¢Ã¢â€šÂ¬Ã…â€œMass Spectrometry for Metabolic Profiling of Biological Samples

Een protocol voor het metabool profiel van biologische monsters door capillaire elektroforese-massaspectrometrie met behulp van een sheathless poreuze tip interface design wordt gepresenteerd.

Sheathless capillaire elektroforese-massaspectrometrie voor metabole of Biological Samples

In metabolomics, a wide range of analytical techniques is used for the global profiling of (endogenous) metabolites in complex samples. In this paper, a ...

Research

JoVE Journal

Biochemistry

Sheathless Capillary Electrophoresis&#8211;Mass Spectrometry for Metabolic Profiling of Biological Samples

Multimer-PAGE: A Method for Capturing and Resolving Protein Complexes in Biological Samples

Multimeer-PAGE: Een methode voor het vastleggen en oplossen eiwitcomplexen Biological Samples

There are many well-developed methods for purifying and studying single proteins and peptides. However, most cellular functions are carried out by ...

Resolving Affinity Purified Protein Complexes by Blue Native PAGE and Protein Correlation Profiling

Het oplossen van Affiniteit gezuiverde eiwit complexen door Blue inheemse PAGE en Protein Correlatie Profiling

Most proteins act in association with others; hence, it is crucial to characterize these functional units in order to fully understand biological ...

Mass Spectrometry and Luminogenic-based Approaches to Characterize Phase I Metabolic Competency of In Vitro Cell Cultures

Mass Spectrometry and Luminogenic-based Approaches to Characterize Phase I Metabolic Competency of In Vitro Cell Cultures

Massaspectrometrie en luminogene gebaseerde benaderingen voor karakteriseren Fase I Metabolic competentie van<em&gt; In Vitro</em&gt; Cell Cultures

Xenobiotic metabolizing enzymes play a key function in the biotransformation of medicines and toxicants by adding functional groups that increase ...

Deep Proteome Profiling by Isobaric Labeling, Extensive Liquid Chromatography, Mass Spectrometry, and Software-assisted Quantification

Diepe Proteoom profilering door isobaar Labeling, uitgebreide vloeistofchromatografie, massaspectrometrie en Software-bijgewoonde kwantificering

Many exceptional advances have been made in mass spectrometry (MS)-based proteomics, with particular technical progress in liquid chromatography (LC) ...

Optimal Preparation of Formalin Fixed Samples for Peptide Based Matrix Assisted Laser Desorption/Ionization Mass Spectrometry Imaging Workflows

Optimale voorbereiding van formaline vaste monsters voor Peptide Matrix gebaseerde bijgestaan Laser desorptie/ionisatie massaspectrometrie Imaging Workflows

The use of matrix-assisted laser desorption/ionization, mass spectrometry imaging (MALDI MSI) has rapidly expanded, since this technique analyzes a host ...

Polysome Profiling in Leishmania, Human Cells and Mouse Testis

Polysome Profiling in Leishmania, Human Cells and Mouse Testis

Polysoom profilering in Leishmania, menselijke cellen en muis Testis

Proper protein expression at the right time and in the right amounts is the basis of normal cell function and survival in a fast-changing environment. For ...

Use of Electron Paramagnetic Resonance in Biological Samples at Ambient Temperature and 77 K

Gebruik van Electron paramagnetisch resonantie in biologische monsters bij kamertemperatuur en 77 K

The accurate and specific detection of reactive oxygen species (ROS) in different cellular and tissue compartments is essential to the study of ...

Nitropeptide Profiling and Identification Illustrated by Angiotensin II

Nitropeptide profilering en identificatie geïllustreerd door angiotensine II

Protein nitration is one of the most important post-translational modifications (PTM) on tyrosine residues and it can be induced by chemical actions of ...

Extremely Rapid and Specific Metabolic Labelling of RNA In Vivo with 4-Thiouracil (Ers4tU)

Extremely Rapid and Specific Metabolic Labelling of RNA In Vivo with 4-Thiouracil Ers4tU

Zeer snelle en specifieke metabolische etikettering van RNA in vivo met 4-thiouracil (Ers4tU)

The nucleotide analogue, 4-thiouracil (4tU), is readily taken up by cells and incorporated into RNA as it is transcribed in vivo, allowing isolation of ...

Label-Free Immunoprecipitation Mass Spectrometry Workflow for Large-scale Nuclear Interactome Profiling

Label-vrije Immunoprecipitation massaspectrometrie workflow voor grootschalige nucleaire interactome profilering

Immunoaffinity purification mass spectrometry (IP-MS) has emerged as a robust quantitative method of identifying protein-protein interactions. This ...