Name: sheathless capillary electrophoresis&#8211;mass spectrometry for metabolic profiling of biological samples
Uploaded: 2016-10-01T15:00:00
Duration: 7 min 46 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Sheathless Capillary ElectrophoresisÃ¢â‚¬â€œMass Spectrometry for Metabolic Profiling of Biological Samples at JoVE.com

Dr. Rawi Ramautar would like to acknowledge the financial support of the Veni grant scheme of the Netherlands Organization of Scientific Research (NWO Veni 722.013.008).

MERK: Protokollen er beskrevet her for bruk av sheathless CE-MS for metabolske profilering studier er for laboratoriebruk. Prosedyrene er beskrevet nedenfor er basert på nylig publisert arbeid 4,5. Ytterligere eksperimentelle detaljer kan finnes i disse papirene. Før du bruker denne protokollen, ta kontakt med alle relevante sikkerhetsdatablad (MSDS). Vennligst bruk alle egnede laboratorium sikkerhetsprosedyrer, herunder vernebriller, frakk og hansker, når gjennomføre forsøkene beskrevet i denne protokollen. 1. Utarbeidelse av reagenser Solutions og Samples <ol><li> Fremstilling av bakgrunnselektrolytt (BGE) <ol><li> Fremstille en ny BGE-oppløsning (10% (v / v) eddiksyre, pH 2,2) hver dag. </li><li> Legge til 9,0 ml vann i et 10 ml hetteglass og tilsett 1,0 ml eddiksyre til vannet i en avtrekkshette. Bland løsningen grundig med en vortex. </li></ol></li><li> Utarbeidelse av metabolitt standard blanding <ol><li> Oppløs 50 ul av en 50 uM kation standardblanding inneholdende 60 kationiske metabolitter i 50 ul vann og blande løsningen grundig. Oppbevares ved -80 ° C når den ikke er i bruk. </li><li> Oppløs 50 ul av en 50 uM anion standardblanding inneholdende 30 anioniske metabolitter i 50 ul vann og blande løsningen grundig. Lagrer denne løsning i porsjoner for å hindre fryse / tine sykluser av den samme standardblanding, ved -80 ° C når de ikke er i bruk. MERK: metabolitten standardblandinger er stabil i 3 måneder når lagret på riktig måte ved -80 ° C. </li></ol></li><li> Utarbeidelse av ekstrakter fra glioblastom cellelinje <ol><li> Vask de adherente humane U-87 MG glioblastom-celler tre ganger med 1 ml iskald 0,9% natriumkloridløsning 21. </li><li> Tilsett 2 ml iskald metanol / vann-oppløsning (8/2, vol / vol) til de adherente celler og skrap ved hjelp av en gummiskrape 21 tippet celle. </li&gt; <li> Samle metanol / vann-oppløsning i et rør og ultrasonicate i 2 min. </li><li> Legg kloroform til metanol / vannfraksjonen (sluttforhold 8/8/2, v / v / v) og sentrifuger prøven i 10 minutter ved 16100 xg og 4 ° C. </li><li> Samle metanol / vannsjiktet og fordampe denne fraksjon ved hjelp av en vakuum-konsentrator. Rekonstituere det tørkede materiale i 50 mL vann for analyse ved sheathless CE-MS. Når den ikke er i bruk oppbevares prøven ved -80 ° C. </li></ol></li></ol> 2. Sette opp Sheathless CE-MS System <ol><li> Installasjon av nakne smeltet-silikapatron med den porøse tips emitter <ol><li> Plasser en ny bart smeltet-silikapatron med en porøs tips emitter (30 mikrometer indre diameter x 90 cm totallengde) i CE instrument. </li><li> Påfør en frem skylling ved 50 psi i 15 min med programvaren som styrer CE instrument med 100% metanol og visuelt sjekke om væske strømmer ut fra capilLary uttak i løpet av denne rensetrinnet. Også utføre en skylling i motsatt retning ved 50 psi i 5 min ved bruk av BGE løsning for visuelt å undersøke hvorvidt væsken strømmer ut fra det ledende kapillær. </li><li> Gjenta trinn 2.1.2 ved et trykk på 100 psi i tilfelle ingen væske dråpedannelse er blitt observert ved kapillær utløpet. Installer en ny bart smeltet-silikapatron hvis ingen væske dråpedannelse ble observert i løpet av dette trinnet. </li><li> Skyll separasjonen kapillær med vann ved 50 psi i 10 minutter, fulgt av 0,1 M NaOH ved 50 psi i 10 min, deretter med vann ved 50 psi i 10 minutter og til slutt med BGE ved 50 psi i 10 min. MERK: Trinn 2.1.1 til 2.1.4 er kun nødvendig for installasjon av en ny kapillær patron. </li></ol></li><li> Kobling av det kapillære porøs spiss emitter til ESI-MS MERK: Før kobling CE kapillær til MS, sikre at MS instrumentet er kalibrert og koblet til CE-systemet. Sett ESI spenning til0. Monter MS instrument med en nanospray kilde. Gass 1, gass 2 og grensesnitt varmeapparat temperatur ble ikke brukt som ESI ved svært lave hastigheter skjer ved bare å bruke den ion spray spenning satt til 1500 V. Set gardinen ved 5 psi. <ol><li> Fjern sprøyta tuppen av smeltet-silikapatron fra vannslangen og installere den i nanospray kilde adapter for å koble til MS instrument. Kontroller at høyden på BGE hetteglassene i CE instrument matche høyden på sprøytespissen. </li><li> Sjekk for strømning av væske gjennom det ledende kapillar ved skylling med BGE ved 50 psi i 5 min. I løpet av denne skylletrinnet bør observeres en dråpedannelse på bunnen av den ESI sprøyter nålen. </li><li> Spyl separasjon kapillar med BGE ved 50 psi i 10 min i fremoverretningen. Dråpedannelse bør observeres på spissen av den porøse spiss emitter (sprøyter tip) i løpet av dette trinnet. </li><li> Plasser den porøse tips emitter til inngangen av MS innløp i en avstand på cIRCA 2-3 mm. </li><li> Påfør en spenning på 30 kV ved hjelp av en rampe tid på 1 min og begynne å anskaffe MS data i m / z varierer fra 65 til 1000 m / z for metabolske profilering studier med første en ESI spenning på 0. MERK: massespekteret bør være blottet for signal som det bør ikke være noe elektro. </li><li> Sett ESI spenning til 1000 V mens bære på måledata. Øke den ESI spenningen med trinn på 200 V til en konstant bakgrunnssignal blir observert i minst 15 min. </li><li> Optimal den porøse spiss emitter stilling i forhold til midten av MS innløp ved å bevege det i den x, y eller z-retningen for å se hvilken stilling gir maksimal og mest stabile MS signal (total ion elektroferogrammet). </li><li> Etter å optimalisere posisjonen av det porøse spissen emitter og bestemme den optimale ESI spenningen, setter ESI spenningen til 0 V og redusere CE spenningen fra 30 kV til 1 kV ved hjelp av en rampe tid av 5 min. </li><li> Opprett en MS metode using optimal ESI spenning og en CE-metoden på CE-instrument for analyse av metabolitten standarder og biologiske prøver. </li></ol></li></ol> 3. Analyse av metabolitter Standarder og biologiske prøver <ol><li> Ytelse evaluering av sheathless CE-MS system <ol><li> Overfør 20 mL av anioniske metabolitten standard blandingen i en tom 100 ul microvial (PCR hetteglass) som passer inn i en CE hetteglass og sette denne hetteglasset i inntaksprøve skuffen. MERK: Minste volum som kreves i microvial for en pålitelig injeksjon er 2 pl. <ol><li> Start MS oppkjøpet negative ion modus metode opprettet i trinn 2.2.9 og senere starte CE sekvens ved hjelp av programvaren som styrer CE instrument. </li><li> Skyll separasjon kapillar med BGE ved 50 psi i 3 minutter, fulgt av injeksjon på 2,0 psi i 60 sek (20 nl svarende til 3% av kapillaren volum) og deretter ved BGE injeksjon på 1,0 psi i 10sek. MERK: Deretter MS datainnsamling utløst. </li><li> Anvende en spenning på -30 kV med en rampe tid på 1,0 minutter med et trykk på 0,5 MPa i 30 min ved innløpet. Etter en 30 min elektroforetisk separasjon, stoppe MS datainnsamling og minske spenningen for å CE -1 kV ved hjelp av en rampe tid av 5 min (en gradvis reduksjon av CE-spenning etter den elektroforetiske atskillelse forbedrer varigheten av den porøse spiss kapillar emitter). </li></ol></li><li> Mellom prøve injeksjoner, skyll kapillaren med vann, 0,1 M natriumhydroksid, vann og BGE hver ved 30 psi i 3 min. </li><li> Analyser de registrerte data ved å bestemme migrerings ganger og signalstyrken for analysert anioniske metabolitten blanding. </li><li> Vurdere om de anioniske metabolitt-standardene vises i området mellom 10 og 28 min. </li><li> Sjekk om tre strukturelt beslektede isomerer, dvs. D-glukose-1-fosfat, D-glukose-6-fosfat og D-fruktose-6-fosfat erdelvis adskilt, det vil si, er oppløsningen mellom de første to toppene ca 0,75, og av de to siste toppene er circa 0,50 (se figur 1). MERK: En oppløsning på 1,5 indikerer en baseline separasjon av to tilstøtende topper. </li><li> Gjenta trinn 3.1.1 og 3.1.2 for kationiske metabolitten blanding. Sørg for at MS påvisning er nå i positiv ion modus og CE spenningen er 30 kV. </li><li> Analyser de registrerte data ved å bestemme migrerings ganger og signalstyrken for analysert kationiske metabolitten blanding. </li><li> Vurdere om de kationiske metabolitt-standardene vises i området mellom 8 og 22 min. Sjekk om isoleucin og leucin migrerer mellom 15 og 15,5 min og finne ut om oppløsningen er circa 0,5. </li></ol></li><li> Analyse av biologiske prøver <ol><li> Gjenta trinn 3.1.1 og 3.1.2 for anioniske metabolsk profilering av ekstrakt av glioblastom cellelinje. MERK: Den metabolske contelt oppnådd etter prøven forbehandling svarer til en celletetthet på ca. 20 celler / nl, derfor er en 20 nl injeksjon tilsvarende 400 celler per analyse. . </li><li> Lag en ekstrahert ion elektroferogrammet for metabolitten melkesyre (m / z 89,0243) med 5 mDa masse nøyaktighet og sjekke om signalstyrken er over 100.000 teller. </li><li> Gjenta trinn 3.1.1 og 3.1.2 for kationiske metabolsk profilering av ekstrakt av glioblastom cellelinje. MERK: En svært mye informasjon samlet ion elektroferogrammet bør observeres for en 20 nl injeksjon i denne modusen. </li><li> Etter analysene, eller når den ikke er i bruk, skyll kapillaren med vann ved 50 psi i 15 min og lagre innløps del av kapillaren i en ampulle inneholdende vann og den porøse delen (utløp del) i et rør som også inneholder vann. </li></ol></li></ol>

<ol>
	<li>Ramautar, R., Berger, R., van der Greef, J., Hankemeier, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+metabolomics:+strategies+to+understand+biology.">Human metabolomics: strategies to understand biology.</a> Curr Opin Chem Biol. 17, 841-846 (2013).</li><li>Wishart, D. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=HMDB+3.0--The+Human+Metabolome+Database+in+2013.">HMDB 3.0--The Human Metabolome Database in 2013.</a> Nucleic Acids Res. 41, D801-D807 (2013).</li><li>Psychogios, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+human+serum+metabolome.">The human serum metabolome.</a> PLoS One. 6, e16957 (2011).</li><li>Gulersonmez, M. C., Lock, S., Hankemeier, T., Ramautar, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sheathless+capillary+electrophoresis-mass+spectrometry+for+anionic+metabolic+profiling.">Sheathless capillary electrophoresis-mass spectrometry for anionic metabolic profiling.</a> Electrophoresis. 37, 1007-1014 (2016).</li><li>Ramautar, R., Busnel, J. M., Deelder, A. M., Mayboroda, O. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Enhancing+the+coverage+of+the+urinary+metabolome+by+sheathless+capillary+electrophoresis-mass+spectrometry.">Enhancing the coverage of the urinary metabolome by sheathless capillary electrophoresis-mass spectrometry.</a> Anal Chem. 84, 885-892 (2012).</li><li>Ramautar, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Metabolic+profiling+of+human+urine+by+CE-MS+using+a+positively+charged+capillary+coating+and+comparison+with+UPLC-MS.">Metabolic profiling of human urine by CE-MS using a positively charged capillary coating and comparison with UPLC-MS.</a> Mol Biosyst. 7, 194-199 (2011).</li><li>Naz, S., Garcia, A., Barbas, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multiplatform+analytical+methodology+for+metabolic+fingerprinting+of+lung+tissue.">Multiplatform analytical methodology for metabolic fingerprinting of lung tissue.</a> Anal Chem. 85, 10941-10948 (2013).</li><li>Ibanez, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CE/LC-MS+multiplatform+for+broad+metabolomic+analysis+of+dietary+polyphenols+effect+on+colon+cancer+cells+proliferation.">CE/LC-MS multiplatform for broad metabolomic analysis of dietary polyphenols effect on colon cancer cells proliferation.</a> Electrophoresis. 33, 2328-2336 (2012).</li><li>Soga, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Simultaneous+determination+of+anionic+intermediates+for+Bacillus+subtilis+metabolic+pathways+by+capillary+electrophoresis+electrospray+ionization+mass+spectrometry.">Simultaneous determination of anionic intermediates for Bacillus subtilis metabolic pathways by capillary electrophoresis electrospray ionization mass spectrometry.</a> Anal Chem. 74, 2233-2239 (2002).</li><li>Soga, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantitative+metabolome+analysis+using+capillary+electrophoresis+mass+spectrometry.">Quantitative metabolome analysis using capillary electrophoresis mass spectrometry.</a> J Proteome Res. 2, 488-494 (2003).</li><li>Britz-McKibbin, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Capillary+electrophoresis-electrospray+ionization-mass+spectrometry+(CE-ESI-MS)-based+metabolomics.">Capillary electrophoresis-electrospray ionization-mass spectrometry (CE-ESI-MS)-based metabolomics.</a> Methods Mol Biol. 708, 229-246 (2011).</li><li>Ibanez, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+new+metabolomic+workflow+for+early+detection+of+Alzheimer's+disease.">A new metabolomic workflow for early detection of Alzheimer's disease.</a> J Chromatogr A. 1302, 65-71 (2013).</li><li>Kuehnbaum, N. L., Britz-McKibbin, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=New+advances+in+separation+science+for+metabolomics:+resolving+chemical+diversity+in+a+post-genomic+era.">New advances in separation science for metabolomics: resolving chemical diversity in a post-genomic era.</a> Chem Rev. 113, 2437-2468 (2013).</li><li>Nemes, P., Rubakhin, S. S., Aerts, J. T., Sweedler, J. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Qualitative+and+quantitative+metabolomic+investigation+of+single+neurons+by+capillary+electrophoresis+electrospray+ionization+mass+spectrometry.">Qualitative and quantitative metabolomic investigation of single neurons by capillary electrophoresis electrospray ionization mass spectrometry.</a> Nat Protoc. 8, 783-799 (2013).</li><li>Hirayama, A., Wakayama, M., Soga, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Metabolome+analysis+based+on+capillary+electrophoresis-mass+spectrometry.">Metabolome analysis based on capillary electrophoresis-mass spectrometry.</a> Trac-Trend Anal Chem. 61, 215-222 (2014).</li><li>Maxwell, E. J., Chen, D. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Twenty+years+of+interface+development+for+capillary+electrophoresis-electrospray+ionization-mass+spectrometry.">Twenty years of interface development for capillary electrophoresis-electrospray ionization-mass spectrometry.</a> Anal Chim Acta. 627, 25-33 (2008).</li><li>Bonvin, G., Schappler, J., Rudaz, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Capillary+electrophoresis-electrospray+ionization-mass+spectrometry+interfaces:+fundamental+concepts+and+technical+developments.">Capillary electrophoresis-electrospray ionization-mass spectrometry interfaces: fundamental concepts and technical developments.</a> J Chromatogr A. 1267, 17-31 (2012).</li><li>Hirayama, A., Tomita, M., Soga, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sheathless+capillary+electrophoresis-mass+spectrometry+with+a+high-sensitivity+porous+sprayer+for+cationic+metabolome+analysis.">Sheathless capillary electrophoresis-mass spectrometry with a high-sensitivity porous sprayer for cationic metabolome analysis.</a> Analyst. 137, 5026-5033 (2012).</li><li>Bonvin, G., Schappler, J., Rudaz, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Non-aqueous+capillary+electrophoresis+for+the+analysis+of+acidic+compounds+using+negative+electrospray+ionization+mass+spectrometry.">Non-aqueous capillary electrophoresis for the analysis of acidic compounds using negative electrospray ionization mass spectrometry.</a> J Chromatogr A. 1323, 163-173 (2014).</li><li>Moini, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Simplifying+CE-MS+operation.+2.+Interfacing+low-flow+separation+techniques+to+mass+spectrometry+using+a+porous+tip.">Simplifying CE-MS operation. 2. Interfacing low-flow separation techniques to mass spectrometry using a porous tip.</a> Anal Chem. 79, 4241-4246 (2007).</li><li>Dettmer, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Metabolite+extraction+from+adherently+growing+mammalian+cells+for+metabolomics+studies:+optimization+of+harvesting+and+extraction+protocols.">Metabolite extraction from adherently growing mammalian cells for metabolomics studies: optimization of harvesting and extraction protocols.</a> Anal Bioanal Chem. 399, 1127-1139 (2011).</li></ol>

We have nothing to disclose.

En sheathless CE-MS-metode som anvender en porøs spiss emitter er blitt presentert for analyse av sterkt polare og ladede metabolitter. En unik funksjon i denne tilnærmingen er at anioniske eller kationiske metabolitter kan profilert ved bare å bytte MS deteksjon og CE spenning polaritet. Et bredt utvalg av høyt ladede polare og metabolitter i biologiske prøver kan analyseres med en høy separasjonseffektivitet, noe som er avgjørende for strukturelt lignende metabolitter, og med påvisningsgrenser i (lav) nanomolare området. Den presenterte protokollen fokusert på bruk av sheathless CE-MS for metabolske profilering av celle-ekstrakter for å eksemplifisere anvendeligheten av fremgangsmåten for metabolske profilering av en biologisk prøve. Den metode som er beskrevet her kan også anvendes for metabolske profilering av andre typer av biologiske prøver, slik som humant urin 5, gitt at en passende prøve forbehandling prosedyre benyttes. Den sheathless CE-MS-metod er basert på en porøs spiss emitter som gjør bruk av den iboende lav-flyt egenskap av CE. I denne sammenheng, er en stabil ESI signal en forutsetning for reproduserbare metaboliske studier profilering. Det er derfor viktig at sprøytespissen er riktig plassert i front av MS innløpet. I dette oppsettet er det ESI prosessen i hovedsak avhengig av arten av BGE og derfor er kritisk BGE optimalisering. Den sheathless konfigurasjonen er mindre allsidig i forhold til sliren-væske CE-MS-systemer der mange forskjellige overtrekks-flytende preparater kan tilsettes for å forbedre ioniseringen effektivitet. Den sheathless ESI sprøyten nål må fylles helt med ledende væske (dvs. BGE løsning). En ustabil ESI signal kan resultere fra en delvis eller fullstendig plugget kapillær. Skylling ved høye trykk med BGE kan løse dette problemet. Ellers separasjons kapillær må skiftes. Før vurdering av analyse ytelse, en stabil ESI bakgrunnssignalskal genereres første som er konsistent fra en dag til en annen. Den analytiske ytelsen til sheathless CE-MS metode for metabolske profilering studier må sjekkes daglig bruker metabolitt standardblandinger. Under de samme forsøksbetingelser, konsekvent migrasjonstider, dvs. variasjon under 3% for i løpet av dag (n = 10) og mellom-dag (n = 5) under anvendelse av en 20 nl injeksjon av en metabolitt standard blanding (12,5 pM), topp høyder / områder (variasjon under 15%) og plate nummer (som varierer mellom 60 000 og 400 000) skal innhentes. Deteksjonsgrenser bør være i nanomolar rekkevidde for de fleste metabolitt standarder. Først når disse kriteriene er oppfylt er metoden klar for metabolske profilering av biologiske prøver. Hvis ikke, må MS-instrumentet som skal avstemmes, og re-kalibreres eller den porøse spissen kapillær emitter må endres. En effektiv rensetrinnet mellom CE-MS-analyser er av stor betydning, ikke bare for åforhindre potensiell overføring, men også for å opprettholde separasjonsytelse. Potensiell overføring kan være forårsaket av BGE ampuller forurenset med prøven, og derfor løses ved erstatning med nye BGE ampuller. Når sheathless CE-MS-metoden ikke er i bruk, er det viktig å koble separasjon kapillær og for å lagre innløpssiden av kapillaren i vannet, og på utsiden neddykket med den beskyttende hylsen i et rør inneholdende vann for å forlenge levetiden kapillar. Oppsummert viser foreslått sheathless CE-MS-metoden et stort potensial for metabolske profilering av biologiske prøver når det brukes i henhold til prosedyrene som er rapportert i denne protokollen. På dette stadiet er sammenlignende laboratorieprøver data definitivt behov for sheathless CE-MS for å vurdere (langsiktig) reproduserbarhet og robusthet av denne tilnærmingen for metabolomics. Denne protokollen kan stimulere en slik studie. Ulike analytiske utfordringene må likevel tas i betraktning. For optimal performance bør CE nåværende holdes fortrinnsvis under 5 uA og på dette stadiet kapillær porøse tips emittere er bare gitt til en lengde på 91 cm som kan hemme utviklingen av high-throughput analyser. Dessuten ble en lav pH separasjonsbuffer anvendt for anionisk metabolsk profilering som kanskje ikke er den mest optimale for å oppnå en grunnlinje-separasjon av strukturelt beslektede sukker fosfater. Også viktig er at bare anioniske metabolitter kan analyseres som (delvis) negativt ladet under de brukte separasjonsbetingelser. Det neste trinnet er å vurdere nytten av sheathless CE-MS metode for kliniske metabolsk profilering studier som i dag, kan en enkelt porøs tips kapillær emitter bare brukes for analyse av opptil 100 biologiske prøver. Samlet sett vil videre utvikling i sheathless CE-MS tilnærming åpner en ny retning innen metabolomics, dvs. mot en dypere forståelse av biologiske funksjoner i srikelig begrensede saker.

I moderne metabolomics, er high end analytisk separasjonsteknikker anvendes for å analysere et bredt spekter av metabolitten klasser for å oppnå en representativ avlesning av den fysiologiske statusen til en organisme 1. Det ultimate målet for en metabolomics studien er å få et svar på et gitt biologisk / klinisk spørsmål. I dag er den menneskelige metabolomet Database består av mer enn 40.000 metabolitt oppføringer som representerer både endogene og eksogene forbindelser (sistnevnte stammer fra næringsstoffer, bakterieflora, narkotika og andre kilder) 2. Gitt det store mangfold i fysisk-kjemiske egenskaper og konsentrasjonsområde av disse metabolittene, bør flere analytiske teknikker med forskjellige separasjonsmekanismer brukes i kombinasjon for å profilere så mange metabolitter som mulig i en gitt biologisk prøve. For eksempel Psychogios et al. Brukt en kombinasjon av fem analytiske separasjonsteknikker for metabolsk profiling av humant serum som resulterer i deteksjon av mer enn 4000 kjemiske ulike metabolitter 3. I denne artikkelen skal tas hensyn til nylig utviklet CE-MS strategier for metabolsk profilering av biologiske prøver 4,5. I CE, nærmere bestemt kapillar sone-elektroforese (CZE, normalt omtalt som evt) blir forbindelser separert på basis av deres ladning-til-størrelse-forhold, og derfor er denne analyseteknikk særlig egnet for analyse av polare og ladede metabolitter. Separasjonen mekanismen for CE er fundamentalt forskjellig fra kromatografiske-baserte teknikker, for derved å tilveiebringe en komplementær syn på den metaboliske sammensetningen av biologiske prøver 6-8. Soga og medarbeidere var de første til å vise nytten av CE-MS for den globale profilering av metabolitter i biologiske prøver 9,10. Til nå har muligheten og nytten av CE-MS for metabolomics blitt mye påvist 11-15.CE er vanligvis koblet til MS via en tolle væske grensesnitt teknikk 16,17; imidlertid, på grunn av fortynning av den kapillære avløpet ved tolle væske, deteksjonsfølsomheten blir egen kompromittert. Nylig ble det påvist at bruken av et sheathless grensesnitt signifikant forbedret deteksjon dekning av metabolitter som er tilstede i forskjellige biologiske prøver, sammenlignet med CE-MS anvendelse av en klassisk kappe-væske-grenseflate 5,18,19. For eksempel ble circa 900 molekylære egenskaper påvist i human urin ved sheathless CE-MS, mens omtrent 300 molekylære egenskaper ble observert med kappe-væske CE-MS 5. Den sheathless grensesnitt som ble brukt var basert på en porøs spiss emitter, som ble oppfunnet av Moini 20, slik at effektiv bruk av den iboende lav-flyt egenskap av CE i kombinasjon med nano-ESI-MS. For å stimulere bruk av sheathless CE-MS innen metabolomics,en protokoll er presentert som beskriver hvordan denne tilnærmingen kan brukes for analyse av svært polare metabolitter i biologiske prøver, som er eksemplifisert for analyse av ekstrakter fra glioblastoma cellelinje. Det er vist at den sheathless CE-MS fremgangsmåte for profilering av kationiske metabolitter kan også benyttes for profilering av anioniske metabolitter ved hjelp av nøyaktig de samme kapillær og separasjonsbetingelser, og dermed redusere analysetiden og tilveiebringe en enkel analytisk plattform for den globale profilering av ladede metabolitter. Protokollen beskriver også en strategi for effektiv innretting av sheathless porøs spiss emitter med MS instrumentet.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="958">
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">CESI 8000 instrument</td>
			<td style="width:167px;">Sciex</td>
			<td style="width:181px;">A98089</td>
			<td style="width:395px;">OptiMS adapter required to couple CESI to MS</td>
		</tr>
		<tr height="61">
			<td height="61" style="height:61px;width:216px;">OptiMS Fused-Silica Cartridge, 30 &#956;m ID x 90 cm total length</td>
			<td style="width:167px;">Sciex</td>
			<td style="width:181px;">B07367</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="41">
			<td height="41" style="height:41px;width:216px;">OptiMS Adapter for Sciex Nanospray III source</td>
			<td style="width:167px;">Sciex</td>
			<td style="width:181px;">B07363</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">CESI vials</td>
			<td style="width:167px;">Sciex</td>
			<td style="width:181px;">B11648</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Micro vials</td>
			<td style="width:167px;">Sciex</td>
			<td style="width:181px;">144709</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Glacial acetic acid</td>
			<td style="width:167px;">Sigma</td>
			<td style="width:181px;">A6283</td>
			<td>Use in fume hood</td>
		</tr>
		<tr height="41">
			<td height="41" style="height:41px;width:216px;">Cationic metabolite mixture</td>
			<td style="width:167px;">Human Metabolome Technologies</td>
			<td style="width:181px;">H3304-3034</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="41">
			<td height="41" style="height:41px;width:216px;">Anionic metabolite mixture</td>
			<td style="width:167px;">Human Metabolome Technologies</td>
			<td style="width:181px;">H3304-1031</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="41">
			<td height="41" style="height:41px;width:216px;">Methanol (LC-MS Ultra Chromasolv)</td>
			<td style="width:167px;">Sigma</td>
			<td style="width:181px;">14262</td>
			<td>Use in fume hood</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Sodium hydroxide solution</td>
			<td style="width:167px;">Sigma</td>
			<td style="width:181px;">72079</td>
			<td>0.1 M</td>
		</tr>
		<tr height="41">
			<td height="41" style="height:41px;width:216px;">U-87 MG Glioblastoma cell line</td>
			<td style="width:167px;">Sigma</td>
			<td>89081402</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Chloroform</td>
			<td style="width:167px;">Sigma</td>
			<td align="right" style="width:181px;">650498</td>
			<td>Toxic; use in fume hood</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

sheathless capillary electrophoresis&#8211;mass spectrometry for metabolic profiling of biological samples

I metabolomics, er et bredt utvalg av analytiske teknikker som brukes for den globale profileringen av (endogene) metabolitter i komplekse prøver. I dette papiret, er en protokoll presentert for analyse av anioniske og kationiske metabolitter i biologiske prøver ved kapillær elektroforese-massespektrometri (CE-MS). CE er godt egnet for analyse av svært polare metabolitter og ladede forbindelser som separeres på basis av deres ladning-til-størrelsesforhold. En nylig utviklet sheathless samvirking utforming, det vil si, en porøs spiss grensesnitt, blir brukt for å kople til CE elektrospray ionisering (ESI) MS. Dette grensesnitt tilnærmingen gjør effektiv bruk av den iboende lav-flow tilhører CE i kombinasjon med MS, noe som resulterer i nanomolare deteksjonsgrenser for et bredt spekter av polare metabolitten klasser. Protokollen presentert her, er basert på anvendelse av et nakent smeltet silisiumdioksyd-kapillær med en porøs spiss emitter ved lav-pH-separasjonsbetingelser for analyse av enbredt spekter av metabolitt klasser i biologiske prøver. Det er vist at det samme sheathless CE-MS-metoden kan anvendes for profilering av kationiske metabolittene, inkludert aminosyrer, nukleosider og små peptider, eller anioniske metabolitter, inkludert sukker fosfater, nukleotider og organiske syrer, ved bare å bytte MS deteksjon og separasjon spenning polaritet. Sterkt informasjonsrike metabolske profiler i forskjellige biologiske prøver, slik som urin, cerebrospinalvæske og ekstrakter av glioblastoma cellelinje, kan oppnås ved denne protokollen i mindre enn en time av CE-MS-analyse.

Den foreslåtte sheathless CE-MS-metoden er i stand til å gi svært effektiv, dvs. plate tall som varierer fra 60 000 til 400 000, profiler for anioniske og kationiske metabolitter ved nanomolare deteksjonsgrensene ved hjelp av 10% eddiksyre (pH 2,2) i BGE. Separasjonen gjennomføring av fremgangsmåten for analyse av sterkt polare anioniske metabolitter er demonstrert i tre strukturelt beslektede sukkerfosfat isomerer (figur 1). Selv om en grunnlinje-separasjon ikke ble oppnådd for disse tre analyttene, er tilstrekkelig til å tillate deres selektive deteksjon av MS som disse analyttene har samme eksakt masse en delvis separasjon. Potensialet av den sheathless CE-MS-metode for metabolisk profilering av begrenset antall celler, dvs. tilsvarer en 20 nl injeksjon til 400-celler (celletetthet er ca. 20 celler / nl), er demonstrert for analyse av kationiske metabolitter i en ekstrakt av glioblastoma cellelinje (Figur 2), der mer enn 300 molekylære funksjoner ble oppdaget over en S / N-forholdet ≥ 5. <img alt="Figur 1" src="/files/ftp_upload/54535/54535fig1.jpg" /> Figur 1. Analyse av sukker fosfat isomerer av sheathless CE-MS. Hentet ion elektroferogrammet for tre sukkerfosfat isomerer (25 mm) som oppnås med sheathless CE-MS i negativ ion modus. Eksperimentelle betingelser: BGE, 10% eddiksyre (pH 2,2); separasjon spenning, -30 kV (0,5 psi anvendes ved innløpet av CE-kapillære); prøveinjeksjon, 2,0 psi i 60 sek. Gjengitt med tillatelse fire. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/54535/54535fig1large.jpg" target="_blank">Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.</a> <img alt="Figur 2" src="/files/ftp_upload/54535/54535fig2.jpg" /> Figur 2. Analyse av isoleucin og leucine ved sheathless CE-MS. Ekstrahert ion elektroferogrammet av to aminosyre-isomerer (25 uM) ble oppnådd med sheathless CE-MS i positiv ionemodus. Eksperimentelle betingelser: BGE, 10% eddiksyre (pH 2,2); separasjon spenning, 30 kV; prøveinjeksjon, 2,0 psi i 60 sek. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/54535/54535fig2large.jpg" target="_blank">Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.</a> <img alt="Figur 3" src="/files/ftp_upload/54535/54535fig3.jpg" /> Figur 3. Potensiale sheathless CE-MS for profilering kationiske metabolitter i en cellelinje ekstrakt. Metabolsk profil (total ion elektroferogrammet) observert i et utdrag av et glioblastom cellelinje med sheathless CE-MS i positiv ion modus. Eksperimentelle betingelser: BGE, 10% eddiksyre (pH 2,2); separasjon spenning, 30 kV; prøveinjeksjon, 2,0 psi i 60 sek. Gjengitt med tillatelse 4 </sopp&gt;. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/54535/54535fig3large.jpg" target="_blank">Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.</a>

Watch this Scientific Journal Video about Sheathless Capillary ElectrophoresisÃ¢â‚¬â€œMass Spectrometry for Metabolic Profiling of Biological Samples at JoVE.com

Sheathless Capillary ElectrophoresisÃƒÆ’Ã‚Â¢ÃƒÂ¢Ã¢â‚¬Å¡Ã‚Â¬ÃƒÂ¢Ã¢â€šÂ¬Ã…â€œMass Spectrometry for Metabolic Profiling of Biological Samples

En protokoll for metabolsk profilering av biologiske prøver med kapillær elektroforese-massespektrometri ved anvendelse av en sheathless porøs spiss grensesnitt design er presentert.

Sheathless Kapillær elektroforese-massespektrometri for Metabolsk profilering av biologiske prøver

In metabolomics, a wide range of analytical techniques is used for the global profiling of (endogenous) metabolites in complex samples. In this paper, a ...

Research

JoVE Journal

Biochemistry

Sheathless Capillary Electrophoresis&#8211;Mass Spectrometry for Metabolic Profiling of Biological Samples

Multimer-PAGE: A Method for Capturing and Resolving Protein Complexes in Biological Samples

Multimer-PAGE: En metode for å fange og løse protein komplekser i biologiske prøver

There are many well-developed methods for purifying and studying single proteins and peptides. However, most cellular functions are carried out by ...

Resolving Affinity Purified Protein Complexes by Blue Native PAGE and Protein Correlation Profiling

Løse affinitetsrenset protein komplekser av Blå Native PAGE og Protein korrelasjon Profiling

Most proteins act in association with others; hence, it is crucial to characterize these functional units in order to fully understand biological ...

Mass Spectrometry and Luminogenic-based Approaches to Characterize Phase I Metabolic Competency of In Vitro Cell Cultures

Mass Spectrometry and Luminogenic-based Approaches to Characterize Phase I Metabolic Competency of In Vitro Cell Cultures

Massespektrometri og Luminogenic baserte tilnærminger for å karakter Fase I Metabolsk kompetansen<em&gt; In Vitro</em&gt; Cell Cultures

Xenobiotic metabolizing enzymes play a key function in the biotransformation of medicines and toxicants by adding functional groups that increase ...

Deep Proteome Profiling by Isobaric Labeling, Extensive Liquid Chromatography, Mass Spectrometry, and Software-assisted Quantification

Dyp proteom profilering av isobar merking, omfattende flytende Ture, massespektrometri og Software-baserte kvantifisering

Many exceptional advances have been made in mass spectrometry (MS)-based proteomics, with particular technical progress in liquid chromatography (LC) ...

Optimal Preparation of Formalin Fixed Samples for Peptide Based Matrix Assisted Laser Desorption/Ionization Mass Spectrometry Imaging Workflows

Optimal utarbeidelse av Formalin fast prøver for peptid basert Matrix assistert Laser desorpsjon/ionisering massespektrometri Imaging arbeidsflyter

The use of matrix-assisted laser desorption/ionization, mass spectrometry imaging (MALDI MSI) has rapidly expanded, since this technique analyzes a host ...

Polysome Profiling in Leishmania, Human Cells and Mouse Testis

Polysome Profiling in Leishmania, Human Cells and Mouse Testis

Polysome profilering i Leishmania, menneskelige celler og mus testikkel

Proper protein expression at the right time and in the right amounts is the basis of normal cell function and survival in a fast-changing environment. For ...

Use of Electron Paramagnetic Resonance in Biological Samples at Ambient Temperature and 77 K

Bruk av elektron spinn resonans i biologiske prøver omgivelsestemperatur og 77 K

The accurate and specific detection of reactive oxygen species (ROS) in different cellular and tissue compartments is essential to the study of ...

Nitropeptide Profiling and Identification Illustrated by Angiotensin II

Nitropeptide profilering og identifisering illustrert av angiotensin II

Protein nitration is one of the most important post-translational modifications (PTM) on tyrosine residues and it can be induced by chemical actions of ...

Extremely Rapid and Specific Metabolic Labelling of RNA In Vivo with 4-Thiouracil (Ers4tU)

Extremely Rapid and Specific Metabolic Labelling of RNA In Vivo with 4-Thiouracil Ers4tU

Ekstremt rask og spesifikk metabolsk merking av RNA in vivo med 4-Thiouracil (Ers4tU)

The nucleotide analogue, 4-thiouracil (4tU), is readily taken up by cells and incorporated into RNA as it is transcribed in vivo, allowing isolation of ...

Label-Free Immunoprecipitation Mass Spectrometry Workflow for Large-scale Nuclear Interactome Profiling

Label-fri Immunutfelling masse massespektrometri arbeidsflyt for stor skala kjernefysisk Interactome profilering

Immunoaffinity purification mass spectrometry (IP-MS) has emerged as a robust quantitative method of identifying protein-protein interactions. This ...