Name: sheathless capillary electrophoresis&#8211;mass spectrometry for metabolic profiling of biological samples
Uploaded: 2016-10-01T15:00:00
Duration: 7 min 46 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Sheathless Capillary ElectrophoresisÃ¢â‚¬â€œMass Spectrometry for Metabolic Profiling of Biological Samples at JoVE.com

Dr. Rawi Ramautar would like to acknowledge the financial support of the Veni grant scheme of the Netherlands Organization of Scientific Research (NWO Veni 722.013.008).

Примечание: Протокол, описанный здесь, для использования без футляра CE-MS для метаболических исследований профилирование только для лабораторного применения. Процедуры , описанные ниже, основаны на недавно опубликованной работе 4,5. Дальнейшие детали эксперимента можно найти в этих работах. Перед использованием этого протокола, консультации со всеми соответствующими паспортах безопасности материала (MSDS). Пожалуйста, используйте все необходимые процедуры лаборатории по технике безопасности, в том числе защитные очки, лабораторный халат и перчатки, при проведении экспериментов, описанных в данном протоколе. 1. Приготовление реагентов растворов и образцов <ol><li> Подготовка фонового электролита (BGE) <ol><li> Готовят новое решение BGE (10% (об / об) уксусной кислоты, рН 2,2) каждый день. </li><li> Добавить 9,0 мл воды в стеклянную пробирку емкостью 10 мл и добавляют 1,0 мл раствора уксусной кислоты в воде в вытяжном шкафу. Смешайте раствор тщательно с использованием вихря. </li></ol></li><li> Приготовление метаболита STANDARd смесь <ol><li> Растворить 50 мкл 50 мкМ катионов стандартной смеси, содержащей 60 катионные метаболитов в 50 мкл воды и тщательно перемешать раствор. Хранить при температуре -80 ° С, когда он не используется. </li><li> Растворить 50 мкл 50 мкМ аниона стандартной смеси, содержащей 30 анионные метаболитов в 50 мкл воды и тщательно перемешать раствор. Хранить этот раствор, в виде аликвот для предотвращения замораживания / оттаивания циклов той же стандартной смеси, при температуре -80 &amp; deg; С, когда он не используется. Примечание: метаболит стандартных смесей стабильны в течение 3-х месяцев при надлежащем хранении при температуре -80 ° C. </li></ol></li><li> Получение экстрактов из клеток глиобластомы линии <ol><li> Вымойте прилипшие людских U-87 MG клетки глиобластомы три раза с 1 мл охлажденного льдом 0,9% -ного раствора хлорида натрия 21. </li><li> Добавить 2 мл льдом раствор метанол / вода (8/2, об / об) к адгезивных клеток и скрести с помощью резиновой наконечником клеточным скребком 21. </lя&gt; <li> Собирают раствор метанол / вода в трубе и ultrasonicate в течение 2 мин. </li><li> Добавить хлороформ фракции метанол / вода (конечное соотношение 8/8/2, об / об / об) и центрифугировать пробы в течение 10 мин при 16100 х г и 4 ° С. </li><li> Собирают / водный слой метанола и выпарить эту фракцию с помощью вакуумного концентратора. Развести высушенный материал в 50 мкл воды для анализа без футляра CE-MS. Когда они не используются хранить образцы при -80 ° С. </li></ol></li></ol> 2. Настройка без футляра CE-MS System <ol><li> Установка голого картриджа из плавленого кварца с пористым наконечником эмиттером <ol><li> Поместите новый картридж голый из плавленого кварца с пористым наконечником эмиттера (всего 30 мкм внутренний диаметр х 90 см длины) в приборе CE. </li><li> Нанесите вперед Полоскание при 50 фунтов на квадратный дюйм в течение 15 мин с программным обеспечением управления прибором CE с использованием 100% -ного метанола и визуально проверить, является ли жидкость выливается из capilВыход Лари во время этой стадии ополаскивания. Также выполнить промывание в обратном направлении при 50 фунтов на квадратный дюйм в течение 5 мин с использованием раствора BGE, чтобы визуально исследовать ли жидкость выливается из проводящего капилляра. </li><li> Повторите шаг 2.1.2 при давлении 100 фунтов на квадратный дюйм в случае не образуется капля жидкости не наблюдалось на выходе из капилляра. Установить новый картридж голую из плавленого кварца, если не наблюдалось образовани жидкой капли во время этого этапа. </li><li> Ополосните капилляр Расхождение с водой при 50 фунтов на квадратный дюйм в течение 10 мин, а затем 0,1 М NaOH при 50 фунтов на квадратный дюйм в течение 10 мин, затем водой при 50 фунтов на квадратный дюйм в течение 10 мин и, наконец, с BGE при 50 фунтов на квадратный дюйм в течение 10 мин. Примечание: Шаги 2.1.1 до 2.1.4 требуется только для установки нового капиллярного картриджа. </li></ol></li><li> Муфта капиллярного пористого наконечника эмиттера к ESI-MS Примечание: Перед соединением капилляр CE для MS, убедитесь, что прибор MS был откалиброван и подключен к системе CE. Установите напряжение ESI на0. Установить прибор MS с источником микросфер. Газ 1, газ 2 и температура интерфейса отопитель не были применены, как ESI при очень низких скоростях потока происходит за счет только подаче напряжения ионного распыления установить на 1500 В. Набор занавес на 5 фунтов на квадратный дюйм. <ol><li> Снимите распылитель наконечник картриджа из плавленого кварца из водяной трубки и установить ее в адаптер источника микросфер для присоединения к прибору MS. Убедитесь, что высота флаконов BGE в приборе CE соответствовать высоте наконечника распылителя. </li><li> Проверьте поток жидкости через проводящую капилляра промывкой BGE при 50 фунтов на квадратный дюйм в течение 5 мин. Во время этой промывки шаг должен наблюдаться образования капель на базе опрыскивателя иглы ESI. </li><li> Промывка капилляра разделения с BGE при 50 фунтов на квадратный дюйм в течение 10 мин в прямом направлении. каплеобразования должны наблюдаться на кончике пористого наконечника эмиттером (опрыскиватель наконечника) во время этого этапа. </li><li> Установите пористый наконечник эмиттера к входу на входе MS на расстоянии CМАЖК от 2 до 3 мм. </li><li> Подайте напряжение 30 кВ , используя время разгона 1 мин и начать сбор данных MS в диапазоне m / z от 65 до 1000 м / г для метаболических исследований с использованием профилирующими первый сигнал в виде напряжения ESI 0. Примечание: масс-спектр должен быть недействительным сигнала, как не должно быть никаких электрораспылением. </li><li> Установите напряжение ESI 1000 В то время как вести измерения данных. Увеличьте напряжение ESI с шагом 200 V до постоянного фонового сигнала наблюдается в течение по крайней мере 15 мин. </li><li> Оптимизация пористого наконечника положение эмиттера по отношению к центру входного отверстия MS, перемещая его в направлении оси х, у или г направлении, чтобы видеть, какое положение обеспечивает максимальную и наиболее стабильный сигнал MS (общий ион electropherogram). </li><li> После того, как оптимизировать положение пористого наконечника эмиттером и определения оптимального напряжения ESI, установите напряжение ESI до 0 В и понижения напряжения в сети CE от 30 кВ до 1 кВ при времени рампы 5 мин. </li><li> Создание метода USIN MSг оптимальное напряжение ЭРИ и метод СЕ на приборе CE для анализа стандартов метаболита и биологических образцов. </li></ol></li></ol> 3. Анализ метаболита стандартов и биологических образцов <ol><li> Оценка эффективности без футляра CE-MS системы <ol><li> Передача 20 мкл анионной метаболита стандартной смеси в пустой 100 мкл микровиалы (ПЦР флакон), который вставляется в пузырек CE и поставить этот флакон в лоток ввода образца. Примечание: Минимальный объем, необходимый в микровиалы для надежного инъекции 2 мкл. <ol><li> Начало сбора MS метод в режиме отрицательных ионов, созданный на этапе 2.2.9, а затем запустит процедуру CE с помощью программного обеспечения управления прибором CE. </li><li> Ополосните капилляр Расхождение с BGE при 50 фунтов на квадратный дюйм в течение 3 мин с последующим впрыском в 2,0 фунтов на квадратный дюйм в течение 60 секунд (20 нл что соответствует 3% от объема капиллярного), а затем путем BGE инъекции со скоростью 1,0 фунтов на квадратный дюйм в течение 10сек. Примечание: В дальнейшем, сбор данных MS запускается. </li><li> Нанести напряжение -30 кВ с временем изменения скорости 1,0 мин при давлении 0,5 фунтов на квадратный дюйм в течение 30 мин при входе. После 30 мин электрофоретического разделения, прекратить сбор данных MS и уменьшить напряжение CE до -1 кВ при времени рампы 5 мин (постепенное уменьшение напряжения CE после электрофоретического разделения улучшает прочность пористого наконечника капиллярного эмиттера). </li></ol></li><li> Между инъекциями проб, промыть капилляр с водой, 0,1 М раствор гидроксида натрия, водой и BGE каждый на 30 фунтов на квадратный дюйм в течение 3 мин. </li><li> Анализ записанных данных путем определения времени миграции и интенсивности сигнала анализируемого анионного метаболита смеси. </li><li> Оценка ли появляются анионные стандарты метаболита в области от 10 до 28 мин. </li><li> Проверьте , т.е., D-глюкозо-1-фосфат, D-глюкоза-6-фосфат и D-фруктозо-6-фосфат три структурно родственные изомеры,частично отделена, то есть разрешение между первыми двумя пиками около 0,75 и последних двух пиков около 0,50 (см рисунок 1). ПРИМЕЧАНИЕ: Разрешение 1,5 указывает на базовое разделение двух соседних пиков. </li><li> Повторите шаги 3.1.1 и 3.1.2 для катионного метаболита смеси. Убедитесь в том, что обнаружение MS сейчас находится в режиме положительного иона и напряжения CE +30 кВ. </li><li> Анализ записанных данных путем определения времени миграции и интенсивность сигнала анализируемого катионного метаболита смеси. </li><li> Оценка ли появляются катионные метаболит стандарты в области между 8 и 22 мин. Проверьте, правильно ли изолейцин и лейцин мигрируют между 15 и 15,5 мин и определить, если разрешение составляет около 0,5. </li></ol></li><li> Анализ биологических образцов <ol><li> Повторите шаги 3.1.1 и 3.1.2 для анионной метаболического профилирования экстракта клеток глиобластомы линии. ПРИМЕЧАНИЕ: метаболический контент, полученный после предварительной обработки образца соответствует плотности клеток CIRCA 20 клеток / НЛ, следовательно, 20 нл инъекции является эквивалентом 400 ячеек на анализ. , </li><li> Создание извлекаемого ионного electropherogram для метаболита молочной кислоты (m / z 89,0243) , используя 5 точность масс МДА и проверить , является ли более 100000 отсчетов интенсивность сигнала. </li><li> Повторите шаги 3.1.1 и 3.1.2 для катионного обмена веществ профилирования экстракта клеток глиобластомы линии. Примечание: Очень богатые информация общая ион electropherogram должны наблюдаться в течение 20 нл инъекции в этом режиме. </li><li> После анализа или когда он не используется, промыть капилляр с водой при 50 фунтов на квадратный дюйм в течение 15 мин и сохранить входной части капилляра в сосуд, содержащий воду и пористой секции (выходная часть) в трубе, также содержащей воду. </li></ol></li></ol>

<ol>
	<li>Ramautar, R., Berger, R., van der Greef, J., Hankemeier, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+metabolomics:+strategies+to+understand+biology.">Human metabolomics: strategies to understand biology.</a> Curr Opin Chem Biol. 17, 841-846 (2013).</li><li>Wishart, D. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=HMDB+3.0--The+Human+Metabolome+Database+in+2013.">HMDB 3.0--The Human Metabolome Database in 2013.</a> Nucleic Acids Res. 41, D801-D807 (2013).</li><li>Psychogios, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+human+serum+metabolome.">The human serum metabolome.</a> PLoS One. 6, e16957 (2011).</li><li>Gulersonmez, M. C., Lock, S., Hankemeier, T., Ramautar, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sheathless+capillary+electrophoresis-mass+spectrometry+for+anionic+metabolic+profiling.">Sheathless capillary electrophoresis-mass spectrometry for anionic metabolic profiling.</a> Electrophoresis. 37, 1007-1014 (2016).</li><li>Ramautar, R., Busnel, J. M., Deelder, A. M., Mayboroda, O. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Enhancing+the+coverage+of+the+urinary+metabolome+by+sheathless+capillary+electrophoresis-mass+spectrometry.">Enhancing the coverage of the urinary metabolome by sheathless capillary electrophoresis-mass spectrometry.</a> Anal Chem. 84, 885-892 (2012).</li><li>Ramautar, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Metabolic+profiling+of+human+urine+by+CE-MS+using+a+positively+charged+capillary+coating+and+comparison+with+UPLC-MS.">Metabolic profiling of human urine by CE-MS using a positively charged capillary coating and comparison with UPLC-MS.</a> Mol Biosyst. 7, 194-199 (2011).</li><li>Naz, S., Garcia, A., Barbas, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multiplatform+analytical+methodology+for+metabolic+fingerprinting+of+lung+tissue.">Multiplatform analytical methodology for metabolic fingerprinting of lung tissue.</a> Anal Chem. 85, 10941-10948 (2013).</li><li>Ibanez, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CE/LC-MS+multiplatform+for+broad+metabolomic+analysis+of+dietary+polyphenols+effect+on+colon+cancer+cells+proliferation.">CE/LC-MS multiplatform for broad metabolomic analysis of dietary polyphenols effect on colon cancer cells proliferation.</a> Electrophoresis. 33, 2328-2336 (2012).</li><li>Soga, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Simultaneous+determination+of+anionic+intermediates+for+Bacillus+subtilis+metabolic+pathways+by+capillary+electrophoresis+electrospray+ionization+mass+spectrometry.">Simultaneous determination of anionic intermediates for Bacillus subtilis metabolic pathways by capillary electrophoresis electrospray ionization mass spectrometry.</a> Anal Chem. 74, 2233-2239 (2002).</li><li>Soga, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantitative+metabolome+analysis+using+capillary+electrophoresis+mass+spectrometry.">Quantitative metabolome analysis using capillary electrophoresis mass spectrometry.</a> J Proteome Res. 2, 488-494 (2003).</li><li>Britz-McKibbin, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Capillary+electrophoresis-electrospray+ionization-mass+spectrometry+(CE-ESI-MS)-based+metabolomics.">Capillary electrophoresis-electrospray ionization-mass spectrometry (CE-ESI-MS)-based metabolomics.</a> Methods Mol Biol. 708, 229-246 (2011).</li><li>Ibanez, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+new+metabolomic+workflow+for+early+detection+of+Alzheimer's+disease.">A new metabolomic workflow for early detection of Alzheimer's disease.</a> J Chromatogr A. 1302, 65-71 (2013).</li><li>Kuehnbaum, N. L., Britz-McKibbin, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=New+advances+in+separation+science+for+metabolomics:+resolving+chemical+diversity+in+a+post-genomic+era.">New advances in separation science for metabolomics: resolving chemical diversity in a post-genomic era.</a> Chem Rev. 113, 2437-2468 (2013).</li><li>Nemes, P., Rubakhin, S. S., Aerts, J. T., Sweedler, J. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Qualitative+and+quantitative+metabolomic+investigation+of+single+neurons+by+capillary+electrophoresis+electrospray+ionization+mass+spectrometry.">Qualitative and quantitative metabolomic investigation of single neurons by capillary electrophoresis electrospray ionization mass spectrometry.</a> Nat Protoc. 8, 783-799 (2013).</li><li>Hirayama, A., Wakayama, M., Soga, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Metabolome+analysis+based+on+capillary+electrophoresis-mass+spectrometry.">Metabolome analysis based on capillary electrophoresis-mass spectrometry.</a> Trac-Trend Anal Chem. 61, 215-222 (2014).</li><li>Maxwell, E. J., Chen, D. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Twenty+years+of+interface+development+for+capillary+electrophoresis-electrospray+ionization-mass+spectrometry.">Twenty years of interface development for capillary electrophoresis-electrospray ionization-mass spectrometry.</a> Anal Chim Acta. 627, 25-33 (2008).</li><li>Bonvin, G., Schappler, J., Rudaz, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Capillary+electrophoresis-electrospray+ionization-mass+spectrometry+interfaces:+fundamental+concepts+and+technical+developments.">Capillary electrophoresis-electrospray ionization-mass spectrometry interfaces: fundamental concepts and technical developments.</a> J Chromatogr A. 1267, 17-31 (2012).</li><li>Hirayama, A., Tomita, M., Soga, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sheathless+capillary+electrophoresis-mass+spectrometry+with+a+high-sensitivity+porous+sprayer+for+cationic+metabolome+analysis.">Sheathless capillary electrophoresis-mass spectrometry with a high-sensitivity porous sprayer for cationic metabolome analysis.</a> Analyst. 137, 5026-5033 (2012).</li><li>Bonvin, G., Schappler, J., Rudaz, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Non-aqueous+capillary+electrophoresis+for+the+analysis+of+acidic+compounds+using+negative+electrospray+ionization+mass+spectrometry.">Non-aqueous capillary electrophoresis for the analysis of acidic compounds using negative electrospray ionization mass spectrometry.</a> J Chromatogr A. 1323, 163-173 (2014).</li><li>Moini, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Simplifying+CE-MS+operation.+2.+Interfacing+low-flow+separation+techniques+to+mass+spectrometry+using+a+porous+tip.">Simplifying CE-MS operation. 2. Interfacing low-flow separation techniques to mass spectrometry using a porous tip.</a> Anal Chem. 79, 4241-4246 (2007).</li><li>Dettmer, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Metabolite+extraction+from+adherently+growing+mammalian+cells+for+metabolomics+studies:+optimization+of+harvesting+and+extraction+protocols.">Metabolite extraction from adherently growing mammalian cells for metabolomics studies: optimization of harvesting and extraction protocols.</a> Anal Bioanal Chem. 399, 1127-1139 (2011).</li></ol>

We have nothing to disclose.

Без футляра метод CE-MS с использованием пористого наконечника эмиттер был представлен для анализа сильно полярных и заряженных метаболитов. Уникальной особенностью этого подхода является то, что анионные или катионные метаболиты могут быть профилированными лишь переключением обнаружения и напряжения CE полярность MS. Широкий диапазон сильно полярных и заряженных метаболитов в биологических пробах могут быть проанализированы с высокой эффективностью разделения, которая имеет решающее значение для структурно-подобных метаболитов, а также с пределов обнаружения в (низком) диапазоне наномолярной. Представленный протокол сосредоточены на использовании без футляра CE-MS для метаболического профилирования клеточных экстрактов для того, чтобы иллюстрировать полезность метода метаболического профилирования биологического образца. Описанный здесь подход может быть также использован для метаболического профилирования других видов биологических образцов, таких как мочи человека 5, при условии , что используется надлежащая процедура пробоподготовки. Без футляра CE-MS-метоd основан на пористым эмиттером наконечника, который позволяет использовать Искробезопасные низкопоточной свойство CE. В этом контексте, стабильный сигнал ESI является предварительным условием для получения воспроизводимых метаболических исследований профилирующих. Таким образом, важно, чтобы наконечник распылителя правильно расположен в передней части впускного отверстия MS. В этой установки, процесс ЭРИ в основном зависит от характера BGE и, следовательно, оптимизация BGE имеет решающее значение. Конфигурация без футляра является менее универсальным по сравнению с оболочкой-жидкостных систем CE-MS, где все виды оболочка-жидких композиций, могут быть добавлены с целью повышения эффективности ионизации. Без футляра ЭРИ опрыскиватель игла должна быть полностью заполнена проводящей жидкости (то есть BGE раствор). Нестабильный сигнал ЭРИ может быть результатом частичного или полностью вставлена ​​капилляра. Полоскание при высоких давлениях с BGE может решить эту проблему. В противном случае капиллярная разделение необходимо заменить. До оценки аналитической производительности, стабильного фонового сигнала ESIдолжны быть сгенерированы первым, который согласуется с одного дня к другому. Аналитическая производительность без футляра метода CE-MS для метаболических исследований профилирующих необходимо ежедневно проверять с использованием стандартных метаболит смесей. В тех же самых экспериментальных условиях, постоянное время миграции, то есть, изменение уровня ниже 3% в течение в день (n = 10) , а также между днем (п = 5) с использованием 20 NL инъекции стандартной смеси метаболит (12,5 мкМ), пик высоты / площади (вариации менее 15%) и номерные знаки (в диапазоне от 60000 до 400000 человек) должно быть получено. Пределы обнаружения должно быть в диапазоне наномолярной для большинства стандартов метаболита. Только тогда, когда эти критерии соблюдены является метод готов к метаболическим профилированием биологических образцов. Если нет, то прибор мобильная станция должна быть настроена и повторно откалиброван или пористый наконечник капиллярный эмиттер должен быть изменен. Эффективный шаг промывки между CE-МС анализ имеет большое значение не только дляпредотвращения возможного переноса, но и для поддержания эффективности разделения. Потенциал унос может быть вызвано BGE флаконов, загрязненных образца и, следовательно, разрешены заменой новыми флаконах BGE. Когда метод без футляра CE-MS не используется, важно, чтобы отключить капилляр разделительную и хранить входной стороне капилляра в воде и снаружи флюсом с защитной гильзой в пробирку, содержащую воду, чтобы продлить срок службы капилляров. Таким образом, предлагаемый метод без футляра СЕ-МС показывает сильный потенциал для метаболического профилирования биологических образцов при использовании в соответствии с процедурами, сообщенных в данном протоколе. На данном этапе, сравнительные данные межлабораторные, безусловно, необходимы для CE без футляра-МС в целях оценки (долгосрочный) воспроизводимости и надежность такого подхода для метаболомике. Этот протокол может стимулировать такое исследование. Различные аналитические проблемы по-прежнему необходимо учитывать. Для оптимального перфорацияormance, ток CE должна быть предпочтительно ниже 5 мкА и на данном этапе капиллярные пористые кончик излучатели только при условии, при длине 91 см, которые могут препятствовать развитию высокой пропускной способности анализа. Кроме того, буфер с низким рН разделение использовали для анионной метаболического профилирования, которые не могут быть наиболее оптимальным для достижения базовой линии разделения структурно родственных сахаров фосфатов. Также важным является то, что только анионные метаболиты могут быть проанализированы которые (частично) отрицательно заряженные при используемых условиях разделения. Следующий шаг заключается в оценке полезности метода без футляра CE-MS для клинических исследований метаболического профилирующими как в настоящее время, один пористый наконечник капиллярная эмиттер может быть использован только для анализа до 100 биологических образцов. В целом, дальнейшее развитие в подходе без футляра CE-MS откроет новое направление в области метаболомике, то есть к более глубокому пониманию биологических функций в секширокие ограниченным случаи.

В современных метаболомике методики аналитического разделения высокого конца используются для анализа широкого спектра классов метаболита для того , чтобы получить представительную считывающий физиологического состояния организма 1. Конечная цель исследования Метаболомика является получение ответа на данную биологическую / клинический вопрос. В настоящее время база данных Человеческий Метаболом состоит из более чем 40000 записей метаболита , представляющих как эндогенные и экзогенные соединения (последние берущие начало от питательных веществ, микробиоты, наркотиков и других источников) 2. Учитывая огромное разнообразие в физико-химических свойств и диапазон концентраций этих метаболитов, несколько аналитических методов с различными механизмами разделения следует использовать в сочетании с тем, чтобы как можно больше профилю метаболитов, как это возможно в данной биологической пробе. Например, Psychogios и др. Использовали комбинацию пяти аналитических методов разделения метаболического профiling человеческой сыворотки , что приводит к обнаружению более чем 4000 химически различных метаболитов 3. В данной статье внимание будет уделено недавно разработанных стратегий CE-MS для метаболического профилирования биологических образцов 4,5. В CE, более конкретно капиллярный электрофорез зона (CZE, как правило, называют, как CE), соединения разделяются на основе их отношения заряда к размеру и, следовательно, этот аналитический метод очень хорошо подходит для анализа полярных и заряженных метаболитов. Механизм разделения СЕ принципиально отличается от хроматографических методов , на основе, тем самым обеспечивая дополнительную точку зрения на метаболическую состава биологических образцов 6-8. Сога и сотрудники были первыми , чтобы показать полезность CE-MS для глобального профилирования метаболитов в биологических образцах 9,10. До сих пор , целесообразность и полезность CE-MS для метаболомике не была широко продемонстрирована 11-15.CE , как правило , в сочетании с МС с помощью оболочки-жидкость , взаимодействующего технику 16,17; Тем не менее, из-за разбавления капиллярного стоках путем оболочка-жидкость, чувствительность обнаружения неотъемлемо скомпрометированы. В последнее время было показано , что использование интерфейса без футляра значительно улучшило охват обнаружения метаболитов , присутствующих в различных биологических образцах по сравнению с CE-МС с использованием классического интерфейса оболочка-жидкость 5,18,19. Например, около 900 молекулярных особенностей были обнаружены в человеческой моче без футляра CE-МС , тогда как около 300 молекулярных особенностей наблюдались с оболочкой-жидкость CE-MS 5. Интерфейс без футляра был использован , основан на пористый наконечник эмиттера, который был изобретен Моини 20, что позволяет эффективно использовать внутренне низкопоточной свойство CE в сочетании с нано-ESI-MS. Для того, чтобы стимулировать использование без футляра CE-MS в области метаболомике,протокол представлен описанием того, как этот подход может быть использован для анализа сильно полярных метаболитов в биологических образцах, в качестве примера для анализа экстрактов из клеток глиобластомы линии. Показано, что без футляра метод СЕ-МС для профилирования катионных метаболитов могут также быть использованы для профилирования анионных метаболитов с использованием точно такой же капиллярные и разделительные условия, тем самым уменьшая время анализа и предоставления одной единой аналитической платформы для глобального профилирования заряженные метаболитов. Протокол также описывает стратегию эффективного выравнивания без футляра пористого наконечника эмиттера с прибором MS.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="958">
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">CESI 8000 instrument</td>
			<td style="width:167px;">Sciex</td>
			<td style="width:181px;">A98089</td>
			<td style="width:395px;">OptiMS adapter required to couple CESI to MS</td>
		</tr>
		<tr height="61">
			<td height="61" style="height:61px;width:216px;">OptiMS Fused-Silica Cartridge, 30 &#956;m ID x 90 cm total length</td>
			<td style="width:167px;">Sciex</td>
			<td style="width:181px;">B07367</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="41">
			<td height="41" style="height:41px;width:216px;">OptiMS Adapter for Sciex Nanospray III source</td>
			<td style="width:167px;">Sciex</td>
			<td style="width:181px;">B07363</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">CESI vials</td>
			<td style="width:167px;">Sciex</td>
			<td style="width:181px;">B11648</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Micro vials</td>
			<td style="width:167px;">Sciex</td>
			<td style="width:181px;">144709</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Glacial acetic acid</td>
			<td style="width:167px;">Sigma</td>
			<td style="width:181px;">A6283</td>
			<td>Use in fume hood</td>
		</tr>
		<tr height="41">
			<td height="41" style="height:41px;width:216px;">Cationic metabolite mixture</td>
			<td style="width:167px;">Human Metabolome Technologies</td>
			<td style="width:181px;">H3304-3034</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="41">
			<td height="41" style="height:41px;width:216px;">Anionic metabolite mixture</td>
			<td style="width:167px;">Human Metabolome Technologies</td>
			<td style="width:181px;">H3304-1031</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="41">
			<td height="41" style="height:41px;width:216px;">Methanol (LC-MS Ultra Chromasolv)</td>
			<td style="width:167px;">Sigma</td>
			<td style="width:181px;">14262</td>
			<td>Use in fume hood</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Sodium hydroxide solution</td>
			<td style="width:167px;">Sigma</td>
			<td style="width:181px;">72079</td>
			<td>0.1 M</td>
		</tr>
		<tr height="41">
			<td height="41" style="height:41px;width:216px;">U-87 MG Glioblastoma cell line</td>
			<td style="width:167px;">Sigma</td>
			<td>89081402</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Chloroform</td>
			<td style="width:167px;">Sigma</td>
			<td align="right" style="width:181px;">650498</td>
			<td>Toxic; use in fume hood</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

sheathless capillary electrophoresis&#8211;mass spectrometry for metabolic profiling of biological samples

В метаболомике широкий спектр аналитических методов используется для глобального профилирования (эндогенных) метаболитов в сложных образцах. В данной работе, протокол представлен для анализа анионных и катионных метаболитов в биологических образцах с помощью капиллярного электрофореза-масс-спектрометрии (CE-MS). CE хорошо подходит для анализа сильно полярных и заряженных метаболитов, как соединения разделены на основании их отношения заряда к размеру. Недавно был разработан без футляра взаимодействия конструкции, то есть пористый интерфейс наконечник, используется для соединения CE с ионизацией электрораспылением (ESI) МС. Этот взаимодействие подход позволяет эффективно использовать внутренне низкопоточной свойство CE в сочетании с МС, в результате чего в наномолярными пределов обнаружения для широкого диапазона полярных классов метаболита. Протокол, представленные здесь, основаны на использовании голую из кварцевого стекла капилляр с пористым наконечником излучателя в условиях разделения с низким уровнем рН для анализаШирокий спектр классов метаболита в биологических образцах. Показано, что тот же самый метод без футляра СЕ-МС может использоваться для профилирования катионных метаболитов, в том числе аминокислот, нуклеозидов и малых пептидов, или анионным метаболиты, в том числе сахара фосфаты, нуклеотиды и органических кислот, с помощью только переключая обнаружение MS и полярность напряжения разделения. Высоко информационно насыщенные метаболические профили в различных биологических образцах, таких как моча, спинно-мозговой жидкости и экстрактов клеточной линии глиобластомы, может быть получена с помощью этого протокола, менее чем за 1 час анализа CE-MS.

Предложенный метод без футляра СЕ-МС способна обеспечить высокую эффективность, то есть, число пластин в пределах от 60000 до 400000, профили для анионных и катионных метаболитов в пределах обнаружения наномолярными с использованием 10% уксусной кислоты (рН 2,2) в качестве BGE. Эффективность разделения метода для анализа сильно полярных метаболитов анионные демонстрируется в течение трех структурно родственных сахарофосфатного изомеров (рисунок 1). Хотя базовое разделение не было получено для этих трех аналитов, частичное разделение достаточно, чтобы позволить их селективного обнаружения с помощью МС, поскольку эти аналиты имеют точно такую ​​же массу. Потенциал без футляра метода CE-MS для метаболического профилирования ограниченного числа клеток, то есть, 20 п инъекции соответствует 400 клеток (плотность клеток составляет около 20 клеток / NL), демонстрируется для анализа катионных метаболитов в экстракте из клеток глиобластомы линии (Рисунок 2), в котором были обнаружены выше S / N-отношения ≥ 5 более 300 молекулярных особенностей. <img alt="Рисунок 1" src="/files/ftp_upload/54535/54535fig1.jpg" /> Рисунок 1. Анализ сахарофосфатного изомеров без футляра CE-MS. Извлекаемого ионного electropherogram для трех сахарофосфатного изомеров (25 мкМ) , полученных с помощью CE без футляра-МС в режиме отрицательных ионов. Экспериментальные условия: BGE, 10% уксусной кислоты (рН 2,2); напряжение разделения, -30 кВ (0,5 фунтов на квадратный дюйм применяется на входе в капилляр CE); вводимой пробы, 2,0 фунтов на квадратный дюйм в течение 60 сек. Воспроизводится с разрешения 4. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/54535/54535fig1large.jpg" target="_blank">Пожалуйста</a> , <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/54535/54535fig1large.jpg" target="_blank">нажмите здесь</a> , <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/54535/54535fig1large.jpg" target="_blank">чтобы посмотреть увеличенную версию этой фигуры.</a> <img alt="фигура 2" src="/files/ftp_upload/54535/54535fig2.jpg" /> Рисунок 2. Анализ изолейцин и Leucine по CE без футляра-МС. извлекаемого ионного electropherogram двух изомеров аминокислот (25 мкМ) , полученных с помощью CE без футляра-МС в режиме положительных ионов. Экспериментальные условия: BGE, 10% уксусной кислоты (рН 2,2); напряжение разделения, +30 кВ; впрыска образца, 2,0 фунтов на квадратный дюйм в течение 60 секунд. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/54535/54535fig2large.jpg" target="_blank">Пожалуйста</a> , <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/54535/54535fig2large.jpg" target="_blank">нажмите здесь</a> , <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/54535/54535fig2large.jpg" target="_blank">чтобы посмотреть увеличенную версию этой фигуры.</a> <img alt="Рисунок 3" src="/files/ftp_upload/54535/54535fig3.jpg" /> Рисунок 3. Потенциал без футляра CE-MS для профилирования катионные метаболитов в экстракте клеточной линии. Метаболический профиль (всего ионов electropherogram) наблюдается в экстракте линии клеток глиобластомы с CE без футляра-МС в режиме положительных ионов. Экспериментальные условия: BGE, 10% уксусной кислоты (рН 2,2); напряжение разделения, +30 кВ; вводимой пробы, 2,0 фунтов на квадратный дюйм в течение 60 сек. Воспроизводится с разрешения 4 </sвверх&gt;. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/54535/54535fig3large.jpg" target="_blank">Пожалуйста</a> , <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/54535/54535fig3large.jpg" target="_blank">нажмите здесь</a> , <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/54535/54535fig3large.jpg" target="_blank">чтобы посмотреть увеличенную версию этой фигуры.</a>

Watch this Scientific Journal Video about Sheathless Capillary ElectrophoresisÃ¢â‚¬â€œMass Spectrometry for Metabolic Profiling of Biological Samples at JoVE.com

Sheathless Capillary ElectrophoresisÃƒÆ’Ã‚Â¢ÃƒÂ¢Ã¢â‚¬Å¡Ã‚Â¬ÃƒÂ¢Ã¢â€šÂ¬Ã…â€œMass Spectrometry for Metabolic Profiling of Biological Samples

Протокол для метаболического профилирования биологических образцов с помощью капиллярного электрофореза-масс-спектрометрии с использованием пористого без футляра дизайн интерфейса наконечника представлен.

Без футляра Капиллярный электрофорез-масс-спектрометрии для Метаболический Профилирование биологических образцов

In metabolomics, a wide range of analytical techniques is used for the global profiling of (endogenous) metabolites in complex samples. In this paper, a ...

Research

JoVE Journal

Biochemistry

Sheathless Capillary Electrophoresis&#8211;Mass Spectrometry for Metabolic Profiling of Biological Samples

Multimer-PAGE: A Method for Capturing and Resolving Protein Complexes in Biological Samples

Мультимеру-PAGE: метод для захвата и Разрешающая белковых комплексов в биологических образцах

There are many well-developed methods for purifying and studying single proteins and peptides. However, most cellular functions are carried out by ...

Resolving Affinity Purified Protein Complexes by Blue Native PAGE and Protein Correlation Profiling

Разрешающая Affinity Очищенная Белковые комплексы от Синей Native ПААГ и белка корреляции профилирование

Most proteins act in association with others; hence, it is crucial to characterize these functional units in order to fully understand biological ...

Mass Spectrometry and Luminogenic-based Approaches to Characterize Phase I Metabolic Competency of In Vitro Cell Cultures

Mass Spectrometry and Luminogenic-based Approaches to Characterize Phase I Metabolic Competency of In Vitro Cell Cultures

Масс-спектрометрия и люминогенные подходы, основанные на Охарактеризуйте Фазу I метаболических компетентности в<em&gt; In Vitro</em&gt; Клеточные культуры

Xenobiotic metabolizing enzymes play a key function in the biotransformation of medicines and toxicants by adding functional groups that increase ...

Deep Proteome Profiling by Isobaric Labeling, Extensive Liquid Chromatography, Mass Spectrometry, and Software-assisted Quantification

Глубокая протеома профилирование Изобарический маркировки, обширные жидкостная хроматография, масс-спектрометрии и при содействии программного обеспечения количественной оценки

Many exceptional advances have been made in mass spectrometry (MS)-based proteomics, with particular technical progress in liquid chromatography (LC) ...

Optimal Preparation of Formalin Fixed Samples for Peptide Based Matrix Assisted Laser Desorption/Ionization Mass Spectrometry Imaging Workflows

Оптимальная подготовка формалин фиксированной образцы для пептида основан матрицу помогает лазерная десорбция/ионизации масс-спектрометрия визуализации рабочих процессов

The use of matrix-assisted laser desorption/ionization, mass spectrometry imaging (MALDI MSI) has rapidly expanded, since this technique analyzes a host ...

Polysome Profiling in Leishmania, Human Cells and Mouse Testis

Polysome Profiling in Leishmania, Human Cells and Mouse Testis

Полисома профилирование лейшманий, клетки человека и мыши яичка

Proper protein expression at the right time and in the right amounts is the basis of normal cell function and survival in a fast-changing environment. For ...

Use of Electron Paramagnetic Resonance in Biological Samples at Ambient Temperature and 77 K

Использование электронного парамагнитного резонанса в биологических образцах при окружающей температуре и 77 K

The accurate and specific detection of reactive oxygen species (ROS) in different cellular and tissue compartments is essential to the study of ...

Nitropeptide Profiling and Identification Illustrated by Angiotensin II

НитропептидНое профилирование и идентификация Иллюстрировано Ангиотензином II

Protein nitration is one of the most important post-translational modifications (PTM) on tyrosine residues and it can be induced by chemical actions of ...

Extremely Rapid and Specific Metabolic Labelling of RNA In Vivo with 4-Thiouracil (Ers4tU)

Extremely Rapid and Specific Metabolic Labelling of RNA In Vivo with 4-Thiouracil Ers4tU

Чрезвычайно быстрая и специфическая метаболическая маркировка РНК in Vivo с 4-Thiouracil (Ers4tU)

The nucleotide analogue, 4-thiouracil (4tU), is readily taken up by cells and incorporated into RNA as it is transcribed in vivo, allowing isolation of ...

Label-Free Immunoprecipitation Mass Spectrometry Workflow for Large-scale Nuclear Interactome Profiling

Без этикетки Иммунопрецитис Масса Спектромтертрия Рабочий процесс для крупномасштабного ядерного взаимодействия Профилирование

Immunoaffinity purification mass spectrometry (IP-MS) has emerged as a robust quantitative method of identifying protein-protein interactions. This ...