Name: sheathless capillary electrophoresis&#8211;mass spectrometry for metabolic profiling of biological samples
Uploaded: 2016-10-01T15:00:00
Duration: 7 min 46 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Sheathless Capillary ElectrophoresisÃ¢â‚¬â€œMass Spectrometry for Metabolic Profiling of Biological Samples at JoVE.com

Dr. Rawi Ramautar would like to acknowledge the financial support of the Veni grant scheme of the Netherlands Organization of Scientific Research (NWO Veni 722.013.008).

OBS: Protokollet som beskrivs här för användning av sheathless CE-MS för metaboliska profilering studier är endast laboratoriebruk. De förfaranden som beskrivs nedan baseras på nyligen publicerat arbete 4,5. Ytterligare experimentella detaljer kan hittas i dessa papper. Innan du använder detta protokoll, samråda med alla relevanta säkerhetsdatablad (SDB). Använd alla lämpliga laboratoriesäkerhetsprocedurer, inklusive skyddsglasögon, skyddsrock och handskar när utför experiment som beskrivs i detta protokoll. 1. Beredning av reagenser Solutions och prover <ol><li> Framställning av bakgrunds elektrolyt (BGE) <ol><li> Förbered en ny BGE-lösning (10% (v / v) ättiksyra, pH 2,2) varje dag. </li><li> Lägga 9,0 ml vatten i en 10 ml glasflaska och tillsätt 1,0 ml ättiksyra till vattnet i ett dragskåp. Blanda lösningen noggrant med en virvel. </li></ol></li><li> Framställning av metabolit standard blandning <ol><li> Lös 50 fil av en 50 ^ M katjon standardblandning innehållande 60 katjoniska metaboliter i 50 pl vatten och blanda lösningen ordentligt. Lagra vid -80 ° C när de inte används. </li><li> Lös 50 fil av en 50 ^ M anjon standardblandning innehållande 30 anjoniska metaboliter i 50 pl vatten och blanda lösningen ordentligt. Förvara lösningen i alikvoter för att förhindra frysning / upptiningscykler av samma standardblandningen, vid -80 ° C när de inte används. OBS! Metaboliten standardblandningar är stabila i 3 månader vid förvaring ordentligt vid -80 ° C. </li></ol></li><li> Beredning av extrakt från glioblastomcellinje <ol><li> Tvätta de vidhäftande humana U-87 MG-glioblastomceller tre gånger med 1 ml iskall 0,9% natriumkloridlösning 21. </li><li> Tillsätt 2 ml iskall lösning av metanol / vatten (8/2, vol / vol) till de vidhäftande cellerna och skrapa med en gummispets cellskrapa 21. </li&gt; <li> Samla lösning av metanol / vatten i ett rör och ultrasonicate i 2 min. </li><li> Lägg kloroform till metanol / vattenfraktionen (slutligt förhållande 8/8/2, vol / vol / vol) och centrifugera provet under 10 min vid 16100 xg och 4 ° C. </li><li> Samla metanol / vattenskiktet och avdunsta denna fraktion med hjälp av en vakuumanrikningsverk. Rekonstruera det torkade materialet i 50 ul vatten för analys av sheathless CE-MS. När den inte används förvara provet vid -80 ° C. </li></ol></li></ol> 2. Ställa in Sheathless CE-MS System <ol><li> Installation av nakna kvarts patron med den porösa spets emitter <ol><li> Placera en ny bar kvarts patron med en porös spets emitter (30 um innerdiameter x 90 cm totallängd) i CE instrument. </li><li> Applicera en framåt sköljning vid 50 psi under 15 min med mjukvaran som styr CE instrument som använder 100% metanol och visuellt kontrollera om vätska som flödar ut från den capillary utlopp under detta sköljningssteg. utför även en sköljning i motsatt riktning vid 50 psi under 5 min med användning av den BGE lösning för att visuellt undersöka om vätska som flödar ut från den konduktiva kapillären. </li><li> Upprepa steg 2.1.2 vid ett tryck av 100 psi i fall ingen vätska droppbildnings har observerats vid kapillär utlopp. Installera en ny bar kvarts patron om inget droppbildningsobserverades under detta steg. </li><li> Skölj separerings kapillär med vatten vid 50 psi under 10 min, följt av 0,1 M NaOH vid 50 psi under 10 min, sedan med vatten vid 50 psi under 10 min och slutligen med BGE vid 50 psi under 10 min. OBS: Steg 2.1.1 tills 2.1.4 krävs endast för installation av en ny kapillär kassett. </li></ol></li><li> Koppling av kapillär porös spets emitter till ESI-MS OBS: Innan koppling av CE kapillär till MS, se till att MS instrumentet har kalibrerats och ansluts till CE-systemet. Ställa in ESI spänning till0. Montera MS instrument med en nanospraykälla. Gas 1, gas 2 och gränssnitts värmare temperatur har inte tillämpats som ESI vid mycket låga flöden inträffar genom att bara applicera jonspray spänning satt till 1500 V. Ställ gardinen på 5 psi. <ol><li> Ta bort sprutan spetsen av kvarts patron från vattenröret och installera den i nanospraykällan adapter för koppling till MS instrument. Säkerställa att höjden av BGE injektionsflaskorna i CE instrumentet matcha höjden av sprutan spetsen. </li><li> Kontrollera för flöde av vätska genom det ledande kapillären genom sköljning med BGE vid 50 psi under 5 min. Under denna sköljning steg en droppbildning vid basen av ESI sprutan nål bör observeras. </li><li> Spola separations kapillär med BGE vid 50 psi under 10 minuter i riktning framåt. Droppbildning bör observeras på spetsen av den porösa spets emitter (spruta spets) under detta steg. </li><li> Placera den porösa spets emitter till ingången av MS inlopp på ett avstånd av cIRCA 2 till 3 mm. </li><li> Applicera en spänning på 30 kV med hjälp av en ramp på 1 minut och börja förvärva MS-data i m / z sträcker sig från 65 till 1000 m / z för metaboliska profilering studier med först en ESI spänning på 0. OBS: Masspektrumet bör vara ogiltig av signal som inte bör elektro. </li><li> Ställ ESI spänning till 1000 V medan bedriva mätdata. Öka ESI spänning med steg om 200 V tills en konstant bakgrundssignal observeras under minst 15 minuter. </li><li> Optimera den porösa spets emitter läge i förhållande till centrum av den MS inlopp genom att flytta den i x, y eller z-riktning för att se vilken position ger den maximala och mest stabila MS-signal (total ion elektroferogram). </li><li> Efter att optimera positionen för den porösa spets emitter och bestämma den optimala ESI spänning, ställ in ESI spänningen till 0 V och minska CE spänningen från 30 kV till 1 kV med hjälp av en ramp tid av fem minuter. </li><li> Skapa en MS-metod using optimal ESI spänning och en CE-metod på CE instrument för analys av metaboliter standarder och biologiska prover. </li></ol></li></ol> 3. Analys av metaboliter standarder och biologiska prover <ol><li> Prestanda utvärdering av sheathless CE-MS-system <ol><li> Transfer 20 il av anjoniska metaboliten standardblandningen till en tom 100 l mikrorör (PCR-rör) som passar in i en CE-flaskan och sätta denna flaska i intagsfacket. OBS: Den minsta volym som krävs i mikroröret för en tillförlitlig injektion är 2 | j, l. <ol><li> Starta MS förvärvet negativ jon-läge metod som skapades under steg 2.2.9 och därefter starta CE-sekvensen med hjälp av mjukvaran som styr CE instrument. </li><li> Skölj separerings kapillär med BGE vid 50 psi under 3 min följt av injektion vid 2,0 psi under 60 sek (20 nl motsvarande 3% av det kapillära volym) och sedan av BGE injektion vid 1,0 psi under 10sek. OBS: Därefter MS datainsamling utlöses. </li><li> Applicera en spänning på -30 kV med en ramptid på 1,0 min med ett tryck av 0,5 psi under 30 min vid inloppet. Efter en 30 minuters elektroforesseparation, stoppa MS datainsamling och minska CE spänningen till -1 kV med hjälp av en ramp tid av fem minuter (en gradvis minskning av CE-spänningen efter elektroforetisk separation förbättrar hållbarheten hos den porösa spets kapillär emitter). </li></ol></li><li> Mellan provinjektioner, skölj kapillären med vatten, 0,1 M natriumhydroxid, vatten och BGE vardera vid 30 psi under 3 min. </li><li> Analysera inspelade data genom att bestämma migrationstider och signalintensiteten av det analyserade anjoniska metaboliten blandning. </li><li> Bedöma om de anjoniska metabolit standarder visas i området mellan 10 och 28 minuter. </li><li> Kontrollera om tre strukturellt besläktade isomerer, dvs, D-glukos-1-fosfat, D-glukos-6-fosfat och D-fruktos-6-fosfat ärdelvis separerade, dvs är upplösningen mellan de två första topparna cirka 0,75 och de sista två topparna är cirka 0,50 (se figur 1). OBS: En upplösning på 1,5 indikerar en baslinje separation av två intilliggande toppar. </li><li> Upprepa steg 3.1.1 och 3.1.2 för det katjoniska metaboliten blandning. Se till att MS-detektion är nu i positiv jon-läge och CE spänningen är 30 kV. </li><li> Analysera inspelade data genom att bestämma migrationstider och signalintensiteten av det analyserade katjoniska metaboliten blandning. </li><li> Bedöma om de katjoniska metabolit standarder visas i området mellan 8 och 22 min. Kontrollera om isoleucin och leucin migrerar mellan 15 och 15,5 minuter och avgöra om upplösningen är cirka 0,5. </li></ol></li><li> Analys av biologiska prover <ol><li> Upprepa steg 3.1.1 och 3.1.2 för anjoniska metabolisk profilering av extraktet av glioblastomcellinje. OBS: Den metaboliska contält som erhållits efter prov förbehandling motsvarar en celldensitet av cirka 20 celler / nl, därför är en 20 nl injektion motsvarande 400 celler per analys. . </li><li> Skapa ett extraherat jon elektroferogram för metaboliten mjölksyra (m / z 89,0243) med användning av 5 mDa massa noggrannhet och kontrollera om signalstyrkan är över 100.000 räknas. </li><li> Upprepa steg 3.1.1 och 3.1.2 för katjonisk metabolisk profilering av extraktet av glioblastomcellinje. OBS: En mycket informationsrika total jon elektroferogram bör observeras under en 20 nl injektion i det här läget. </li><li> Efter eventuella analyser eller när den inte används, skölj kapillären med vatten vid 50 psi under 15 min och lagra inloppsdelen av kapillären i en injektionsflaska som innehåller vatten och den porösa delen (utloppsdel) i ett rör även innehållande vatten. </li></ol></li></ol>

<ol>
	<li>Ramautar, R., Berger, R., van der Greef, J., Hankemeier, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+metabolomics:+strategies+to+understand+biology.">Human metabolomics: strategies to understand biology.</a> Curr Opin Chem Biol. 17, 841-846 (2013).</li><li>Wishart, D. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=HMDB+3.0--The+Human+Metabolome+Database+in+2013.">HMDB 3.0--The Human Metabolome Database in 2013.</a> Nucleic Acids Res. 41, D801-D807 (2013).</li><li>Psychogios, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+human+serum+metabolome.">The human serum metabolome.</a> PLoS One. 6, e16957 (2011).</li><li>Gulersonmez, M. C., Lock, S., Hankemeier, T., Ramautar, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sheathless+capillary+electrophoresis-mass+spectrometry+for+anionic+metabolic+profiling.">Sheathless capillary electrophoresis-mass spectrometry for anionic metabolic profiling.</a> Electrophoresis. 37, 1007-1014 (2016).</li><li>Ramautar, R., Busnel, J. M., Deelder, A. M., Mayboroda, O. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Enhancing+the+coverage+of+the+urinary+metabolome+by+sheathless+capillary+electrophoresis-mass+spectrometry.">Enhancing the coverage of the urinary metabolome by sheathless capillary electrophoresis-mass spectrometry.</a> Anal Chem. 84, 885-892 (2012).</li><li>Ramautar, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Metabolic+profiling+of+human+urine+by+CE-MS+using+a+positively+charged+capillary+coating+and+comparison+with+UPLC-MS.">Metabolic profiling of human urine by CE-MS using a positively charged capillary coating and comparison with UPLC-MS.</a> Mol Biosyst. 7, 194-199 (2011).</li><li>Naz, S., Garcia, A., Barbas, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multiplatform+analytical+methodology+for+metabolic+fingerprinting+of+lung+tissue.">Multiplatform analytical methodology for metabolic fingerprinting of lung tissue.</a> Anal Chem. 85, 10941-10948 (2013).</li><li>Ibanez, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CE/LC-MS+multiplatform+for+broad+metabolomic+analysis+of+dietary+polyphenols+effect+on+colon+cancer+cells+proliferation.">CE/LC-MS multiplatform for broad metabolomic analysis of dietary polyphenols effect on colon cancer cells proliferation.</a> Electrophoresis. 33, 2328-2336 (2012).</li><li>Soga, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Simultaneous+determination+of+anionic+intermediates+for+Bacillus+subtilis+metabolic+pathways+by+capillary+electrophoresis+electrospray+ionization+mass+spectrometry.">Simultaneous determination of anionic intermediates for Bacillus subtilis metabolic pathways by capillary electrophoresis electrospray ionization mass spectrometry.</a> Anal Chem. 74, 2233-2239 (2002).</li><li>Soga, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantitative+metabolome+analysis+using+capillary+electrophoresis+mass+spectrometry.">Quantitative metabolome analysis using capillary electrophoresis mass spectrometry.</a> J Proteome Res. 2, 488-494 (2003).</li><li>Britz-McKibbin, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Capillary+electrophoresis-electrospray+ionization-mass+spectrometry+(CE-ESI-MS)-based+metabolomics.">Capillary electrophoresis-electrospray ionization-mass spectrometry (CE-ESI-MS)-based metabolomics.</a> Methods Mol Biol. 708, 229-246 (2011).</li><li>Ibanez, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+new+metabolomic+workflow+for+early+detection+of+Alzheimer's+disease.">A new metabolomic workflow for early detection of Alzheimer's disease.</a> J Chromatogr A. 1302, 65-71 (2013).</li><li>Kuehnbaum, N. L., Britz-McKibbin, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=New+advances+in+separation+science+for+metabolomics:+resolving+chemical+diversity+in+a+post-genomic+era.">New advances in separation science for metabolomics: resolving chemical diversity in a post-genomic era.</a> Chem Rev. 113, 2437-2468 (2013).</li><li>Nemes, P., Rubakhin, S. S., Aerts, J. T., Sweedler, J. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Qualitative+and+quantitative+metabolomic+investigation+of+single+neurons+by+capillary+electrophoresis+electrospray+ionization+mass+spectrometry.">Qualitative and quantitative metabolomic investigation of single neurons by capillary electrophoresis electrospray ionization mass spectrometry.</a> Nat Protoc. 8, 783-799 (2013).</li><li>Hirayama, A., Wakayama, M., Soga, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Metabolome+analysis+based+on+capillary+electrophoresis-mass+spectrometry.">Metabolome analysis based on capillary electrophoresis-mass spectrometry.</a> Trac-Trend Anal Chem. 61, 215-222 (2014).</li><li>Maxwell, E. J., Chen, D. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Twenty+years+of+interface+development+for+capillary+electrophoresis-electrospray+ionization-mass+spectrometry.">Twenty years of interface development for capillary electrophoresis-electrospray ionization-mass spectrometry.</a> Anal Chim Acta. 627, 25-33 (2008).</li><li>Bonvin, G., Schappler, J., Rudaz, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Capillary+electrophoresis-electrospray+ionization-mass+spectrometry+interfaces:+fundamental+concepts+and+technical+developments.">Capillary electrophoresis-electrospray ionization-mass spectrometry interfaces: fundamental concepts and technical developments.</a> J Chromatogr A. 1267, 17-31 (2012).</li><li>Hirayama, A., Tomita, M., Soga, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sheathless+capillary+electrophoresis-mass+spectrometry+with+a+high-sensitivity+porous+sprayer+for+cationic+metabolome+analysis.">Sheathless capillary electrophoresis-mass spectrometry with a high-sensitivity porous sprayer for cationic metabolome analysis.</a> Analyst. 137, 5026-5033 (2012).</li><li>Bonvin, G., Schappler, J., Rudaz, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Non-aqueous+capillary+electrophoresis+for+the+analysis+of+acidic+compounds+using+negative+electrospray+ionization+mass+spectrometry.">Non-aqueous capillary electrophoresis for the analysis of acidic compounds using negative electrospray ionization mass spectrometry.</a> J Chromatogr A. 1323, 163-173 (2014).</li><li>Moini, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Simplifying+CE-MS+operation.+2.+Interfacing+low-flow+separation+techniques+to+mass+spectrometry+using+a+porous+tip.">Simplifying CE-MS operation. 2. Interfacing low-flow separation techniques to mass spectrometry using a porous tip.</a> Anal Chem. 79, 4241-4246 (2007).</li><li>Dettmer, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Metabolite+extraction+from+adherently+growing+mammalian+cells+for+metabolomics+studies:+optimization+of+harvesting+and+extraction+protocols.">Metabolite extraction from adherently growing mammalian cells for metabolomics studies: optimization of harvesting and extraction protocols.</a> Anal Bioanal Chem. 399, 1127-1139 (2011).</li></ol>

We have nothing to disclose.

En sheathless CE-MS-metod som utnyttjar en porös spets emitter har presenterats för analys av mycket polära och laddade metaboliter. En unik egenskap hos denna metod är att anjoniska eller katjoniska metaboliter kan profileras genom att endast växla MS-detektion och CE spänning polaritet. Ett brett utbud av mycket polära och laddade metaboliter i biologiska prover kan analyseras med en hög avskiljningsgrad, vilket är avgörande för strukturellt liknande metaboliter, och med detektionsgräns på (låg) nanomolära området. Den presenterade protokollet fokuserats på användningen av sheathless CE-MS för metabolisk profilering av cellextrakt i syfte att exemplifiera användbarheten av metoden för metabolisk profilering av ett biologiskt prov. Tillvägagångssättet som beskrivs här kan också användas för metabolisk profilering av andra typer av biologiska prover, såsom humant urin 5, med tanke på att en ordentlig förbehandling av provet förfarande används. Den sheathless CE-MS-metod är baserad på en porös spets emitter som medger användning av den i sig låga flytegenskap av CE. I detta sammanhang är en stabil ESI signal en förutsättning för reproducerbara metaboliska profileringsstudier. Således är det viktigt att sprutan spetsen är korrekt placerad framför den MS inlopp. I denna uppsättning, är ESI processen huvudsakligen beroende på vilken typ av BGE och därför är BGE optimering kritisk. Den sheathless konfigurationen är mindre mångsidig i jämförelse med mantel-flytande CE-MS-system, där alla typer av mantel-flytande kompositionerna kan tillsättas för att förbättra den joniseringseffektivitet. Den sheathless ESI spruta nålen måste vara helt fylld med ledande vätska (dvs BGE lösning). En instabil ESI signal kan bli följden av en partiell eller helt ansluten kapillär. Sköljning vid höga tryck med BGE kan lösa det här problemet. Annars separations kapillär behöver bytas ut. Före bedömningen av den analytiska prestanda, en stabil ESI bakgrundssignalbör genereras först som är konsekvent från en dag till en annan. Den analytiska prestanda sheathless CE-MS-metod för metaboliska profilering studier måste kontrolleras dagligen med metabolit standardblandningar. Under samma försöksbetingelser, konsekventa migrations gånger, dvs variation under 3% för inom dag (n = 10) och mellan-dag (n = 5) med hjälp av en 20 nl injektion av en metabolit standardblandning (12,5 M), topp höjder / områden (variation under 15%) och plattnummer (som sträcker sig mellan 60.000 och 400.000) bör erhållas. Detektionsgränser bör vara i det nanomolära intervallet för de flesta metabolit standarder. Först när dessa kriterier är uppfyllda är metoden klar för metabolisk profil av biologiska prover. Om inte, behöver MS instrument som skall avstämmas och åter kalibrerad eller den porösa spets kapillär emitter behöver ändras. En effektiv sköljningssteg mellan CE-MS-analyser är av stor betydelse, inte bara förförhindra potentiell överföring utan också för att bibehålla separationsprestanda. Potentiell överföring kan orsakas av BGE flaskor förorenade med provet, och därför lösas genom ersättning med nya BGE flaskor. När sheathless CE-MS-metoden inte används, är det viktigt att koppla bort separations kapillären och för att lagra inloppssidan av kapillären i vatten och utsidan nedsänkt med skyddshylsan i ett rör innehållande vatten för att förlänga kapillär livstid. Sammanfattningsvis visar den föreslagna sheathless CE-MS-metoden en stark potential för metabolisk profilering av biologiska prover när de används i enlighet med de förfaranden som redovisas i detta protokoll. I detta skede är mellan laboratorier jämförelsedata definitivt behövs för sheathless CE-MS för att bedöma den (långsiktiga) reproducerbarhet och robusthet av denna strategi för metabolomik. Detta protokoll kan stimulera en sådan studie. Olika analytiska utmaningar måste fortfarande övervägas. För optimal performance bör CE strömmen hållas företrädesvis under 5 iA och i detta skede de kapillära porösa spets sändare tillhandahålls endast med en längd av 91 cm, som kan hämma utvecklingen av hög genomströmning analyser. Dessutom har en låg pH separation används för anjoniska metabolisk profilering som kanske inte är den mest optimala för att uppnå en baslinje separation av strukturellt besläktade fosfater socker. Också viktigt är att endast anjoniska metaboliter kan analyseras som (delvis) negativt laddad under använda separationsbetingelserna. Nästa steg är att bedöma användbarheten av sheathless CE-MS-metod för kliniska metabolisk profilering studier för närvarande, kan en enda porös spets kapillär emitter endast användas för analys av upp till 100 biologiska prover. Totalt sett kommer en vidareutveckling i sheathless CE-MS metod öppnar en ny riktning inom metabolomik, dvs mot en djupare förståelse av biologiska funktioner i sriklig fritt fall.

I samtida metabolomics, är avancerade analytiska separationstekniker användas för att analysera ett brett spektrum av metabolit klasser för att erhålla ett representativt utläsning av den fysiologiska statusen hos en organism 1. Det slutgiltiga målet med en metabolomik studie är att få ett svar på ett givet biologiskt / klinisk fråga. För närvarande är den mänskliga Metabolome databas bestående av mer än 40.000 metabolit bidrag som representerar både endogena och exogena föreningar (den senare med ursprung från näringsämnen, mikroorganismer, läkemedel och andra källor) 2. Med tanke på den enorma mångfalden i fysikalisk-kemiska egenskaper och koncentrationsintervall av dessa metaboliter, bör flera analytiska tekniker med olika mekanismer separations användas tillsammans för att profilera så många metaboliter som möjligt i ett givet biologiskt prov. Till exempel använde Psychogios et al. En kombination av fem analytiska separationstekniker för metabolisk profiling av humant serumresulterar i detektionen av mer än 4000 kemiskt olika metaboliter 3. I detta dokument, kommer uppmärksamhet att ägnas åt nyutvecklade CE-MS strategier för metabolisk profilering av biologiska prover 4,5. I CE, närmare bestämt kapillärzonelektrofores (CZE, normalt kallat CE), föreningar separeras på basis av deras laddning till storleksförhållande, och därför är mycket lämpad för analys av polära och laddade metaboliter denna analysteknik. Mekanismen för CE-separation är fundamentalt annorlunda från kromatografiska baserade tekniker, vilket ger en kompletterande syn på den metaboliska sammansättningen av biologiska prover 6-8. Soga och medarbetare var de första att visa användbarheten av CE-MS för den globala profilering av metaboliter i biologiska prover 9,10. Hittills har möjligheten och nyttan av CE-MS för metabolomik i stor utsträckning visat 11-15.CE är i allmänhet kopplad till MS via en mantel-vätskegränssnittstekniken 16,17; emellertid, på grund av utspädning av den kapillära utflödet genom mantel-vätska, detektionskänsligheten är intimt äventyras. Nyligen visades det att användningen av en sheathless gränssnittet förbättrats avsevärt detekteringstäckning av metaboliter som förekommer i olika biologiska prover jämfört med CE-MS med användning av en klassisk mantel-vätskegränssnittet 5,18,19. Till exempel var circa 900 molekylära funktioner upptäcks i mänsklig urin genom sheathless CE-MS, medan cirka 300 molekylära egenskaper observerades med mantel-flytande CE-MS 5. Den sheathless gränssnitt som användes var baserad på en porös spets emitter, som uppfanns av Moini 20, vilket möjliggör en effektiv användning av den i sig låga flytegenskap av CE i kombination med nano-ESI-MS. För att stimulera användningen av sheathless CE-MS inom metabolomik,ett protokoll presenteras som beskriver hur detta tillvägagångssätt kan användas för analys av mycket polära metaboliter i biologiska prover, såsom exemplifieras för analys av extrakt från den glioblastomcellinje. Det är visat att sheathless CE-MS-metod för profilering av katjoniska metaboliter också kan användas för profilering av anjoniska metaboliter som använder exakt samma kapillär och separationsförhållanden, och därigenom minska analystiden och ge en enda analytisk plattform för den globala profilering av laddade metaboliter. Protokollet beskriver också en strategi för en effektiv inriktning av sheathless porös spets emitter med MS instrument.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="958">
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">CESI 8000 instrument</td>
			<td style="width:167px;">Sciex</td>
			<td style="width:181px;">A98089</td>
			<td style="width:395px;">OptiMS adapter required to couple CESI to MS</td>
		</tr>
		<tr height="61">
			<td height="61" style="height:61px;width:216px;">OptiMS Fused-Silica Cartridge, 30 &#956;m ID x 90 cm total length</td>
			<td style="width:167px;">Sciex</td>
			<td style="width:181px;">B07367</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="41">
			<td height="41" style="height:41px;width:216px;">OptiMS Adapter for Sciex Nanospray III source</td>
			<td style="width:167px;">Sciex</td>
			<td style="width:181px;">B07363</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">CESI vials</td>
			<td style="width:167px;">Sciex</td>
			<td style="width:181px;">B11648</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Micro vials</td>
			<td style="width:167px;">Sciex</td>
			<td style="width:181px;">144709</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Glacial acetic acid</td>
			<td style="width:167px;">Sigma</td>
			<td style="width:181px;">A6283</td>
			<td>Use in fume hood</td>
		</tr>
		<tr height="41">
			<td height="41" style="height:41px;width:216px;">Cationic metabolite mixture</td>
			<td style="width:167px;">Human Metabolome Technologies</td>
			<td style="width:181px;">H3304-3034</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="41">
			<td height="41" style="height:41px;width:216px;">Anionic metabolite mixture</td>
			<td style="width:167px;">Human Metabolome Technologies</td>
			<td style="width:181px;">H3304-1031</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="41">
			<td height="41" style="height:41px;width:216px;">Methanol (LC-MS Ultra Chromasolv)</td>
			<td style="width:167px;">Sigma</td>
			<td style="width:181px;">14262</td>
			<td>Use in fume hood</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Sodium hydroxide solution</td>
			<td style="width:167px;">Sigma</td>
			<td style="width:181px;">72079</td>
			<td>0.1 M</td>
		</tr>
		<tr height="41">
			<td height="41" style="height:41px;width:216px;">U-87 MG Glioblastoma cell line</td>
			<td style="width:167px;">Sigma</td>
			<td>89081402</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Chloroform</td>
			<td style="width:167px;">Sigma</td>
			<td align="right" style="width:181px;">650498</td>
			<td>Toxic; use in fume hood</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

sheathless capillary electrophoresis&#8211;mass spectrometry for metabolic profiling of biological samples

I metabolomik, är ett brett spektrum av analytiska tekniker som används för den globala profilering av (endogena) metaboliter i komplexa prover. I detta papper, är ett protokoll som presenteras för analys av anjoniska och katjoniska metaboliter i biologiska prover genom kapillärelektrofores-masspektrometri (CE-MS). CE är väl lämpad för analys av mycket polära och laddade metaboliter som föreningar separeras på basis av deras laddning till storleksförhållande. En nyligen utvecklad sheathless gränssnitt design, det vill säga, en porös spets gränssnitt, används för att koppla CE att elektrosprayjonisering (ESI) MS. Detta gränssnitt metod möjliggör en effektiv användning av den egen lågt flöde egendom CE i kombination med MS, vilket resulterar i nanomolära gränser för ett brett spektrum av polära metabolit klasser upptäckt. Protokollet presenteras här bygger på att anställa en bar kvarts kapillär med en porös spets emitter vid lågt pH separationsbetingelser för analys av enbrett spektrum av metabolit klasser i biologiska prover. Det kan visas att samma sheathless CE-MS-metod kan användas för profilering av katjoniska metaboliter, inklusive aminosyror, nukleosider och små peptider, eller anjoniska metaboliter, inklusive sockerfosfater, nukleotider och organiska syror, genom att endast koppla om MS-detektion och separation spänning polaritet. Mycket informationsrika metaboliska profiler i olika biologiska prover, såsom urin, cerebrospinalvätska och extrakt av glioblastomcellinje, kan erhållas genom detta protokoll i mindre än en timme av CE-MS-analys.

Den föreslagna sheathless CE-MS-metoden kan ge effektiv, dvs platt siffror mellan 60.000 till 400.000, profiler för anjoniska och katjoniska metaboliter vid nanomolära detektionsgränser med hjälp av 10% ättiksyra (pH 2,2) som BGE. Separations prestanda metod för analys av mycket polära anjoniska metaboliter visas för tre strukturellt besläktade sockerfosfat isomerer (Figur 1). Även en baslinje separation inte erhölls för dessa tre analyter, är tillräcklig för att tillåta sin selektiv detektering av MS eftersom dessa analyter har exakt samma massa en partiell separation. Potentialen för sheathless CE-MS metod för metabolisk profilering av ett begränsat antal celler, dvs motsvarar en 20 nl injektion till 400 celler (celltäthet är cirka 20 celler / nl), visas för analys av katjoniska metaboliter i ett extrakt av glioblastomcellinje (Figur 2), där mer än 300 molekylära egenskaper upptäcktes över en S / N-förhållande ≥ 5. <img alt="Figur 1" src="/files/ftp_upload/54535/54535fig1.jpg" /> Figur 1. Analys av sockerfosfat isomerer genom sheathless CE-MS. Extraherad jon elektroferogram för tre sockerfosfat isomerer (25 pm) som erhållits med sheathless CE-MS i negativ jon-läge. Experimentella förhållanden: BGE, 10% ättiksyra (pH 2,2); separation spänning, -30 kV (0,5 psi appliceras vid inloppet CE kapillär); provinjektion, 2,0 psi under 60 sek. Återges med tillstånd 4. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/54535/54535fig1large.jpg" target="_blank">Klicka här för att se en större version av denna siffra.</a> <img alt="figur 2" src="/files/ftp_upload/54535/54535fig2.jpg" /> Figur 2. Analys av isoleucin och Leucine genom sheathless CE-MS. Extraherad jon elektroferogram över två aminosyra isomerer (25 | iM) erhållna med sheathless CE-MS i positiv jon-läge. Experimentella förhållanden: BGE, 10% ättiksyra (pH 2,2); separationsspänning, 30 kV; provinjektion, 2,0 psi under 60 sekunder. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/54535/54535fig2large.jpg" target="_blank">Klicka här för att se en större version av denna siffra.</a> <img alt="Figur 3" src="/files/ftp_upload/54535/54535fig3.jpg" /> Figur 3. Potential sheathless CE-MS för profilering katjoniska metaboliter i en cellinje extrakt. Metabolic profil (total jon elektroferogram) observerades i ett extrakt av en glioblastomcellinje med sheathless CE-MS i positiv jon-läge. Experimentella förhållanden: BGE, 10% ättiksyra (pH 2,2); separationsspänning, 30 kV; provinjektion, 2,0 psi under 60 sek. Återges med tillstånd 4 </supp&gt;. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/54535/54535fig3large.jpg" target="_blank">Klicka här för att se en större version av denna siffra.</a>

Watch this Scientific Journal Video about Sheathless Capillary ElectrophoresisÃ¢â‚¬â€œMass Spectrometry for Metabolic Profiling of Biological Samples at JoVE.com

Sheathless Capillary ElectrophoresisÃƒÆ’Ã‚Â¢ÃƒÂ¢Ã¢â‚¬Å¡Ã‚Â¬ÃƒÂ¢Ã¢â€šÂ¬Ã…â€œMass Spectrometry for Metabolic Profiling of Biological Samples

Ett protokoll för metaboliska profilering av biologiska prover genom kapillärelektrofores-masspektrometri med hjälp av en sheathless porös spets gränssnittsdesign presenteras.

Sheathless kapillärelektrofores-masspektrometri för Metabolic Profiling av biologiska prover

In metabolomics, a wide range of analytical techniques is used for the global profiling of (endogenous) metabolites in complex samples. In this paper, a ...

Research

JoVE Journal

Biochemistry

Sheathless Capillary Electrophoresis&#8211;Mass Spectrometry for Metabolic Profiling of Biological Samples

Multimer-PAGE: A Method for Capturing and Resolving Protein Complexes in Biological Samples

Multimer-PAGE: Ett förfarande för infångning och Lösa proteinkomplex i biologiska prover

There are many well-developed methods for purifying and studying single proteins and peptides. However, most cellular functions are carried out by ...

Resolving Affinity Purified Protein Complexes by Blue Native PAGE and Protein Correlation Profiling

Lösa affinitetsrenat proteinkomplex av Blue Native PAGE och protein Korrelation profilering

Most proteins act in association with others; hence, it is crucial to characterize these functional units in order to fully understand biological ...

Mass Spectrometry and Luminogenic-based Approaches to Characterize Phase I Metabolic Competency of In Vitro Cell Cultures

Mass Spectrometry and Luminogenic-based Approaches to Characterize Phase I Metabolic Competency of In Vitro Cell Cultures

Masspektrometri och luminogent baserade metoder för att karaktärisera Fas I Metabolic kompetens<em&gt; In Vitro</em&gt; Cellkulturer

Xenobiotic metabolizing enzymes play a key function in the biotransformation of medicines and toxicants by adding functional groups that increase ...

Deep Proteome Profiling by Isobaric Labeling, Extensive Liquid Chromatography, Mass Spectrometry, and Software-assisted Quantification

Djupa proteomet profilering av isobariska märkning, omfattande vätskekromatografi, masspektrometri och programvara-assisted kvantifiering

Many exceptional advances have been made in mass spectrometry (MS)-based proteomics, with particular technical progress in liquid chromatography (LC) ...

Optimal Preparation of Formalin Fixed Samples for Peptide Based Matrix Assisted Laser Desorption/Ionization Mass Spectrometry Imaging Workflows

Optimal förberedelse av formalinbeständiga prover för peptid baserat Matrix assisterad Laser Desorption/jonisering masspektrometri Imaging arbetsflöden

The use of matrix-assisted laser desorption/ionization, mass spectrometry imaging (MALDI MSI) has rapidly expanded, since this technique analyzes a host ...

Polysome Profiling in Leishmania, Human Cells and Mouse Testis

Polysome Profiling in Leishmania, Human Cells and Mouse Testis

Polysome profilering i Leishmania, mänskliga celler och mus Testis

Proper protein expression at the right time and in the right amounts is the basis of normal cell function and survival in a fast-changing environment. For ...

Use of Electron Paramagnetic Resonance in Biological Samples at Ambient Temperature and 77 K

Användning av elektron paramagnetiska resonans i biologiska prover vid omgivningstemperatur och 77 K

The accurate and specific detection of reactive oxygen species (ROS) in different cellular and tissue compartments is essential to the study of ...

Nitropeptide Profiling and Identification Illustrated by Angiotensin II

Nitropeptid profilering och identifiering illustrerad av angiotensin II

Protein nitration is one of the most important post-translational modifications (PTM) on tyrosine residues and it can be induced by chemical actions of ...

Extremely Rapid and Specific Metabolic Labelling of RNA In Vivo with 4-Thiouracil (Ers4tU)

Extremely Rapid and Specific Metabolic Labelling of RNA In Vivo with 4-Thiouracil Ers4tU

Extremt snabb och specifik metabolisk märkning av RNA in vivo med 4-Thiouracil (Ers4tU)

The nucleotide analogue, 4-thiouracil (4tU), is readily taken up by cells and incorporated into RNA as it is transcribed in vivo, allowing isolation of ...

Label-Free Immunoprecipitation Mass Spectrometry Workflow for Large-scale Nuclear Interactome Profiling

Label-fri immunoprecipitation masspektrometri arbetsflöde för storskalig nukleär Interactome profilering

Immunoaffinity purification mass spectrometry (IP-MS) has emerged as a robust quantitative method of identifying protein-protein interactions. This ...