Name: method for identifying small molecule inhibitors of the protein-protein interaction between hcn1 and trip8b
Uploaded: 2016-11-11T14:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Method for Identifying Small Molecule Inhibitors of the Protein-protein Interaction Between HCN1 and TRIP8b at JoVE.com

This work was supported by National Institutes of Health Grant R21MH104471 and R01MH106511 (D.M.C.), Brain Research Foundation SG 2012-01 (D.M.C.), Northwestern University Clinical and Translational Sciences Institute 8UL1TR000150 (Y.H.), Chicago Biomedical Consortium HTS-004 (Y.H. and D.M.C.), and National Institutes of Health Grant 2T32MH067564 (K.L.). A part of this work was performed by the Northwestern University Medicinal and Synthetic Chemistry Core (ChemCore) at the Center for Molecular Innovation and Drug Discovery (CMIDD), which is funded by the Chicago Biomedical Consortium with support from the Searle Funds at the Chicago Community Trust and Cancer Center Support Grant P30 CA060553 from the National Cancer Institute awarded to the Robert H. Lurie Comprehensive Cancer Center. The high throughput screen work was performed in the High Throughput Analysis Laboratory which is also a core facility of the Robert H. Lurie Comprehensive Cancer Center.

1. تنقية TRIP8b (241-602) البروتين <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تحويل البلازميد التي تحتوي على TRIP8b (241-602) في بكتيريا تعبير البروتين ناقلات pGS21 3 إلى E. المختصة القولونية للتعبير البروتين وفقا لتعليمات الشركة الصانعة. لوحة 300 ميكرولتر من الثق...

<ol>
	<li>Biel, M., Wahl-Schott, C., Michalakis, S., Zong, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hyperpolarization-activated+cation+channels:+from+genes+to+function.">Hyperpolarization-activated cation channels: from genes to function.</a> Physiol Rev. 89 (3), 847-885 (2009).</li><li>Shah, M. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=HCN1+channels:+a+new+therapeutic+target+for+depressive+disorders?.">HCN1 channels: a new therapeutic target for depressive disorders?.</a> Sci Signal. 5 (244), pe44 (2012).</li><li>Han, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+of+Small-Molecule+Inhibitors+of+Hyperpolarization-Activated+Cyclic+Nucleotide-Gated+Channels.">Identification of Small-Molecule Inhibitors of Hyperpolarization-Activated Cyclic Nucleotide-Gated Channels.</a> J Biomol Screen. 20 (9), 1124-1131 (2015).</li><li>Postea, O., Biel, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Exploring+HCN+channels+as+novel+drug+targets.">Exploring HCN channels as novel drug targets.</a> Nat Rev Drug Discov. 10 (12), (2011).</li><li>Stieber, J., Wieland, K., St&#246;ckl, G., Ludwig, A., Hofmann, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bradycardic+and+proarrhythmic+properties+of+sinus+node+inhibitors.">Bradycardic and proarrhythmic properties of sinus node inhibitors.</a> Mol Pharmacol. 69 (4), 1328-1337 (2006).</li><li>Santoro, B., Wainger, B. J., Siegelbaum, S. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regulation+of+HCN+channel+surface+expression+by+a+novel+C-terminal+protein-protein+interaction.">Regulation of HCN channel surface expression by a novel C-terminal protein-protein interaction.</a> J Neurosci. 24 (47), 10750-10762 (2004).</li><li>Lewis, A. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Deletion+of+the+hyperpolarization-activated+cyclic+nucleotide-gated+channel+auxiliary+subunit+TRIP8b+impairs+hippocampal+Ih+localization+and+function+and+promotes+antidepressant+behavior+in+mice.">Deletion of the hyperpolarization-activated cyclic nucleotide-gated channel auxiliary subunit TRIP8b impairs hippocampal Ih localization and function and promotes antidepressant behavior in mice.</a> J Neurosci. 31 (20), 7424-7440 (2011).</li><li>Heuermann, R. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reduction+of+thalamic+and+cortical+Ih+by+deletion+of+TRIP8b+produces+a+mouse+model+of+human+absence+epilepsy.">Reduction of thalamic and cortical Ih by deletion of TRIP8b produces a mouse model of human absence epilepsy.</a> Neurobiol Dis. 85, 81-92 (2016).</li><li>Steru, L., Chermat, R., Thierry, B., Simon, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+tail+suspension+test:+A+new+method+for+screening+antidepressants+in+mice.">The tail suspension test: A new method for screening antidepressants in mice.</a> Psychopharmacology. 85 (3), 367-370 (1985).</li><li>Petit-Demouliere, B., Chenu, F., Bourin, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Forced+swimming+test+in+mice:+a+review+of+antidepressant+activity.">Forced swimming test in mice: a review of antidepressant activity.</a> Psychopharmacology. 177 (3), 245-255 (2004).</li><li>Cryan, J. F., Mombereau, C., Vassout, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+tail+suspension+test+as+a+model+for+assessing+antidepressant+activity:+Review+of+pharmacological+and+genetic+studies+in+mice.">The tail suspension test as a model for assessing antidepressant activity: Review of pharmacological and genetic studies in mice.</a> Neurosci Biobehav Rev. 29 (4-5), 571-625 (2005).</li><li>Han, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Trafficking+and+gating+of+hyperpolarization-activated+cyclic+nucleotide-gated+channels+are+regulated+by+interaction+with+tetratricopeptide+repeat-containing+Rab8b-interacting+protein+(TRIP8b)+and+cyclic+AMP+at+distinct+sites.">Trafficking and gating of hyperpolarization-activated cyclic nucleotide-gated channels are regulated by interaction with tetratricopeptide repeat-containing Rab8b-interacting protein (TRIP8b) and cyclic AMP at distinct sites.</a> J Biol Chem. 286 (23), 20823-20834 (2011).</li><li>Hu, L., Santoro, B., Saponaro, A., Liu, H., Moroni, A., Siegelbaum, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Binding+of+the+auxiliary+subunit+TRIP8b+to+HCN+channels+shifts+the+mode+of+action+of+cAMP.">Binding of the auxiliary subunit TRIP8b to HCN channels shifts the mode of action of cAMP.</a> J Gen Physiol. 142 (6), 599-612 (2013).</li><li>Saponaro, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structural+basis+for+the+mutual+antagonism+of+cAMP+and+TRIP8b+in+regulating+HCN+channel+function.">Structural basis for the mutual antagonism of cAMP and TRIP8b in regulating HCN channel function.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 111 (40), 14577-14582 (2014).</li><li>Bankston, J. R., Camp, S. S., DiMaio, F., Lewis, A. S., Chetkovich, D. M., Zagotta, W. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structure+and+stoichiometry+of+an+accessory+subunit+TRIP8b+interaction+with+hyperpolarization-activated+cyclic+nucleotide-gated+channels.">Structure and stoichiometry of an accessory subunit TRIP8b interaction with hyperpolarization-activated cyclic nucleotide-gated channels.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 109 (20), 7899-7904 (2012).</li><li>Gatto, G. J., Geisbrecht, B. V., Gould, S. J., Berg, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Peroxisomal+targeting+signal-1+recognition+by+the+TPR+domains+of+human+PEX5.">Peroxisomal targeting signal-1 recognition by the TPR domains of human PEX5.</a> Nat Struct Biol. 7 (12), 1091-1095 (2000).</li><li>Owicki, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fluorescence+polarization+and+anisotropy+in+high+throughput+screening:+perspectives+and+primer.">Fluorescence polarization and anisotropy in high throughput screening: perspectives and primer.</a> J Biomol Screen. 5 (5), 297-306 (2000).</li><li>Smith, D. S., Eremin, S. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fluorescence+polarization+immunoassays+and+related+methods+for+simple,+high-throughput+screening+of+small+molecules.">Fluorescence polarization immunoassays and related methods for simple, high-throughput screening of small molecules.</a> Anal Bioanal Chem. 391 (5), 1499-1507 (2008).</li><li>Roehrl, M. H. A., Wang, J. Y., Wagner, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+general+framework+for+development+and+data+analysis+of+competitive+high-throughput+screens+for+small-molecule+inhibitors+of+protein-protein+interactions+by+fluorescence+polarization.">A general framework for development and data analysis of competitive high-throughput screens for small-molecule inhibitors of protein-protein interactions by fluorescence polarization.</a> Biochemistry. 43 (51), 16056-16066 (2004).</li><li>Arkin, M. R., Wells, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Small-molecule+inhibitors+of+protein-protein+interactions:+progressing+towards+the+dream.">Small-molecule inhibitors of protein-protein interactions: progressing towards the dream.</a> Nat Rev Drug Discov. 3 (4), 301-317 (2004).</li><li>Zhang, J., Chung, T., Oldenburg, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+Simple+Statistical+Parameter+for+Use+in+Evaluation+and+Validation+of+High+Throughput+Screening+Assays.">A Simple Statistical Parameter for Use in Evaluation and Validation of High Throughput Screening Assays.</a> J Biomol Screen. 4 (2), 67-73 (1999).</li><li>Eglen, R. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+use+of+AlphaScreen+technology+in+HTS:+current+status.">The use of AlphaScreen technology in HTS: current status.</a> Curr Cheml Genomics. 1 (1), 2-10 (2008).</li><li>Lehninger, A. L., Nelson, D. L., Cox, M. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Lehninger Principles of Biochemistry. , (2000).</li><li>Kim, C. S., Chang, P. Y., Johnston, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Enhancement+of+dorsal+hippocampal+activity+by+knockdown+of+HCN1+channels+leads+to+anxiolytic-+and+antidepressant-like+behaviors.">Enhancement of dorsal hippocampal activity by knockdown of HCN1 channels leads to anxiolytic- and antidepressant-like behaviors.</a> Neuron. 75 (3), 503-516 (2012).</li><li>Wahl-Schott, C., Biel, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=HCN+channels:+structure,+cellular+regulation+and+physiological+function.">HCN channels: structure, cellular regulation and physiological function.</a> Cell Mol Life Sci. 66 (3), 470-494 (2009).</li><li>DeBerg, H. A., Bankston, J. R., Rosenbaum, J. C., Brzovic, P. S., Zagotta, W. N., Stoll, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structural+Mechanism+for+the+Regulation+of+HCN+Ion+Channels+by+the+Accessory+Protein+TRIP8b.">Structural Mechanism for the Regulation of HCN Ion Channels by the Accessory Protein TRIP8b.</a> Structure. 23 (4), 734-744 (2015).</li><li>Weiss, J. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Hill+equation+revisited:+uses+and+misuses.">The Hill equation revisited: uses and misuses.</a> FASEB J. 11 (11), 835-841 (1997).</li><li>Prinz, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hill+coefficients,+dose-response+curves+and+allosteric+mechanisms.">Hill coefficients, dose-response curves and allosteric mechanisms.</a> J Chem Biol. 3 (1), 37-44 (2009).</li><li>Pollard, T. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+Guide+to+Simple+and+Informative+Binding+Assays.">A Guide to Simple and Informative Binding Assays.</a> Mol Biol Cell. 21 (23), 4061-4067 (2010).</li><li>Rossi, A. M., Taylor, C. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Analysis+of+protein-ligand+interactions+by+fluorescence+polarization.">Analysis of protein-ligand interactions by fluorescence polarization.</a> Nat Protoc. 6 (3), (2011).</li><li>Ryan, A. J., Gray, N. M., Lowe, P. N., Chung, C. -. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effect+of+Detergent+on+"Promiscuous"+Inhibitors.">Effect of Detergent on "Promiscuous" Inhibitors.</a> J Med Chem. 46 (16), 3448-3451 (2003).</li><li>McGovern, S. L., Caselli, E., Grigorieff, N., Shoichet, B. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+common+mechanism+underlying+promiscuous+inhibitors+from+virtual+and+high-throughput+screening.">A common mechanism underlying promiscuous inhibitors from virtual and high-throughput screening.</a> J Med Chem. 45 (8), 1712-1722 (2002).</li><li>Hertzberg, R. P., Pope, A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-throughput+screening:+new+technology+for+the+21st+century.">High-throughput screening: new technology for the 21st century.</a> Curr Opin Chem Biol. 4 (4), 445-451 (2000).</li><li>Sundberg, S. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-throughput+and+ultra-high-throughput+screening:+solution-and+cell-based+approaches.">High-throughput and ultra-high-throughput screening: solution-and cell-based approaches.</a> Curr Opin Biotechnol. 11 (1), (2000).</li></ol>

بسبب إمكاناتها كهدف علاجي في MDD 24، كان هناك اهتمام كبير في النهج الدوائية التي تعادي HCN وظيفة القناة في الجهاز العصبي المركزي (4). ومع ذلك، فقد تعثرت هذه الجهود من خلال الدور الهام للقنوات HCN في pacemaking القلب وخطر عدم انتظام ضربات القلب 25. نحن مسبب أن تعطي...

وأعرب (HCN) قنوات بوابات النوكليوتيدات دوري تنشيط فرط في القلب والجهاز العصبي المركزي حيث أنها تلعب دورا هاما في تنظيم غشاء استثارة 1. قد تورطت قنوات HCN في التسبب في اضطراب اكتئابي (MDD) 2، مما أدى إلى عدة مجموعات أقترح أن الحد HCN قناة ظيفة دواء قد يكون فعالا لعلاج جديدة لMDD 3. ومع ذلك، تستهدف بشكل مباشر قنوات HCN ليس قابلا للتطبيق بسبب دورها الهام في العمل إمكانية القلب 4. ايفابرادين، وافقت ادارة الاغذية والعقاقير الوحيدة HCN قناة خصم، ويستخدم لعلاج قصور القلب لإحداث تأثير بطيء القلب 5. على هذا النحو، هناك حاجة لوكلاء الصيدلانية التي تحد من HCN وظيفة القناة حصريا في الجهاز العصبي المركزي. Tetratricopeptide أكرر التي تحتوي على Rab8b التفاعل البروتين (TRIP8b) هو SPECI الدماغالمرورية فرعية المساعدة من القنوات HCN التي تسيطر على التعبير السطحية وتوطين قنوات HCN 6،7. خروج المغلوب الجيني للTRIP8b يؤدي إلى الحد من القنوات HCN الدماغ 7 دون أن يؤثر ذلك التعبير HCN في قلب 8. ومن المثير للاهتمام، TRIP8b الفئران خروج المغلوب تنفق أقل وقت متحرك على المهمة مهمة السباحة القسري وتعليق الذيل 7، وهما تستخدم عادة اختبارات الكشف عن فعالية المضادة للاكتئاب 9-11. وتشير هذه النتائج أنه بدلا من استهداف مباشر قنوات HCN مع خصم جزيء صغير من وظيفة قناة HCN، وتعطيل التفاعل بين TRIP8b وHCN قد تكون كافية لإنتاج مضادات الاكتئاب مثل السلوك. TRIP8b يربط HCN في موقعين ملزمة متميزة. المجال ملزم النوكليوتيدات الحلقية (CNBD) من HCN يتفاعل مع المجال المحافظ في محطة N TRIP8b تقع إلى المجالات TPR من TRIP8b 12،13. على الرغم من أن بقايا من CNBD التي تشارك في هذاالتفاعل تم تعيين 14، لم يتم تضييق منطقة TRIP8b التي تشارك أسفل إلى أبعد من-80-الأحماض الأمينية جزء 13. يحدث التفاعل الثاني بين tetratricopeptide تكرار (TPR) مجالات TRIP8b وC ثلاثي الببتيد من محطة HCN ( &#39;SNL &quot;في HCN1، HCN2، وHCN4، ولكن&quot; ANM &quot;في HCN3) 3،12. التركيب البلوري حلها مؤخرا 15 من هذا التفاعل C ذيل كشف التشابه الهيكلي الكبير للتفاعل بين مستقبلات استيراد peroxisomal، peroxin 5 (PEX5)، والشركاء التفاعل فيها، تتضمن نوع 1 peroxisomal تستهدف تسلسل (PTS1) 16. على الرغم من أن كلا الموقعين التفاعل المطلوب من أجل وظيفة قناة HCN، والتفاعل بين المجالات TPR من TRIP8b وC محطة ثلاثي الببتيد من HCN1 بمثابة موقع ملزم المهيمن وينظم التعبير سطح HCN. لذلك، وقد تم اختيار هذا التفاعل كموقع الاستهداف في هذه الدراسة.للفترة المتبقية من المخطوطة، عندما يتم إشارة إلى التفاعل بين TRIP8b وHCN، وهذا هو التفاعل الذي يتم المشار إليها. ولخص هذا التفاعل بشظية للذوبان عالية من TRIP8b المقابلة لمحطة لها C المحفوظة التي تحتوي على مجالات TPR اللازمة لربط C الذيل من محطة HCN (بقايا 241-602 من 1A-4 الإسوية من TRIP8b) 3. من أجل تطوير شاشة إنتاجية عالية لتحديد جزيئات صغيرة قادرة على تعطيل هذا التفاعل، والاستقطاب مضان (FP) القائم على الفحص كان يعمل 17. ويستند الاستقطاب مضان على الإثارة ليجند الموسومة fluorophore مع الضوء المستقطب، وقياس درجة الاستقطاب في مضان المنبعثة 18. في وجود شريك ملزمة، يتم تقييد الحركة الدورانية ليجند الفلورسنت والضوء المستقطب ينبعث 19. في حالة عدم وجود شريك ملزم، رانه الحركة الدورانية ليجند يؤدي إلى انبعاث الضوء استقطابها. في البروتوكول المرفق، يتم تقديم وسيلة لتنقية N الموسومة محطة (6xHis) TRIP8b (241-602) باستخدام حمض النيكل Nitrilotriacetic (ني NTA) الخرز. كان يعمل بروتوكول مماثل لتنقية الجلوتاثيون-S ترانسفراس (GST) -tagged C محطة 40 الأحماض الأمينية من HCN1 (HCN1 C40) المستخدمة في الخطوة 7 من البروتوكول. لاعتبارات الفضاء، تم حذف وصفا مفصلا لهذا الإجراء. في الخطوات من 2 إلى 7 من البروتوكول، وقدم فحص سير العمل عالية الإنتاجية (انظر الشكل 1). تفاعلات البروتين البروتين هي هدف بالغ الصعوبة لارتفاع فحص الإنتاجية وننصح القراء للبحث عن موارد إضافية حول هذا الموضوع 20. الخطوات 2 و 3 من الإجراء تميز تقارب في المختبر من TRIP8b تنقيته (241-602) بناء FOرا فلوريسئين ثيوسيانات (FITC) -tagged أحد عشر الببتيد من الأحماض الأمينية الموافق الذيل C محطة من HCN1 (HCN1 FITC). وبناء على التركيب البلوري للTRIP8b-HCN معقد 15، وهذا جزء حمض أميني أحد عشر كافية لإنتاج ملزم مع TRIP8b (241-602). في الخطوة 2، يتم قياس K د من التفاعل من قبل المعايرة TRIP8b (241-602) في تركيز ثابت من HCN1 FITC. في الخطوة 3، ومعاير نسخة الخالي من الملصقات من الببتيد HCN المستخدمة في الخطوة 2 إلى تركيز ثابت من كل من TRIP8b (241-602) وHCN1 FITC لفحص إذا العلامة FITC يتداخل مع ملزمة. هذه التجارب ضرورية لاختيار التركيزات المناسبة من TRIP8b (241-602) وHCN1 FITC المستخدمة في شاشة إنتاجية عالية. فرضية الشاشة عالية الإنتاجية هو أن جزيء صغير قادر على تعطيل التفاعل بين (241-602) TRIP8b وHCN1 FITC سوف تنتج ديسمبرrease في الضوء المستقطب. في الخطوة 4، يتم حساب عامل Z للمقايسة 21 لتركيز معين من TRIP8b (241-602) وHCN1 FITC للتأكد من أن الاختبار هو المناسب لفحص إنتاجية عالية (الخطوة 5). الخطوات 6 و 7 فحوصات التحقق للتأكد من أن يضرب المحددة في الشاشة الرئيسية إنتاجية عالية يعملون عن طريق تعطيل التفاعل بين TRIP8b (241-602) وHCN1 FITC وليس من خلال آلية غير محددة. في الخطوة 6، carboxytetramethylrhodamine (طمرة) -labeled HCN1 الببتيد (HCN1 طمرة) هي المستخدمة في فحص مضان الاستقطاب خلاف مماثل لتصفية مركبات الفلورسنت التي تؤثر سلبا على فحص FP باستخدام علامة FITC. خطوة 7 تستخدم أكبر HCN1 C محطة جزء (HCN1 C40) ويعمل فحص قرب القائم على حبة، والتي تقوم على &#39;الأنفاق&#39; من الأكسجين القميص من حبة المانحة إلى حبة متقبل إلى ما يقرب من واحد آخر من خلال التفاعل البروتينات 22.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Ni-NTA agarose&#160;</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>30210</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dialysis cassette&#160;</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>66456</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Isopropyl b-D-1-thiogalactopyranoside&#160;</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>I5502-1G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>384 Well Black plate&#160;</td>
			<td>Corning</td>
			<td>3820</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Proxiplate&#160;</td>
			<td>Perkin-Elmer&#160;</td>
			<td>6008289</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-GST Acceptor beads&#160;</td>
			<td>Perkin-Elmer&#160;</td>
			<td>6760603C</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NiChelate</td>
			<td>Perkin-Elmer&#160;</td>
			<td>AS101D</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pGS21-a</td>
			<td>Genscript</td>
			<td>SD0121</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PMSF</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>10837091001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Coomassie Kit</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>23200</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Protein concentrator</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>88527</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Perkin Elmer Enspire Multimode Plate reader</td>
			<td>Perkin-Elmer&#160;</td>
			<td>#2300-001M</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BL21 (DE3) Competent Cells</td>
			<td>Agilent</td>
			<td>200131</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

method for identifying small molecule inhibitors of the protein-protein interaction between hcn1 and trip8b

يتم التعبير عن دوري (HCN) قنوات بوابات النوكليوتيدات تنشيط فرط بتواجد مطلق في جميع أنحاء الدماغ، حيث أنها تعمل على تنظيم استثارة الخلايا العصبية. وينظم توزيع التحت خلوية من هذه القنوات في الخلايا العصبية الهرمية من منطقة قرن آمون CA1 من tetratricopeptide التي تحتوي على تكرار Rab8b التفاعل البروتين (TRIP8b)، وهي فرعية مساعدة. خروج المغلوب الجيني للHCN المسام تشكيل مفارز أو TRIP8b، سواء تؤدي إلى زيادة في المضادة للاكتئاب مثل السلوك، مما يشير إلى أن الحد من وظيفة من القنوات HCN قد يكون من المفيد لعلاج اكتئابي اضطراب (MDD). على الرغم من الاهتمام كبيرة العلاجية، ويتم التعبير عن قنوات HCN أيضا في القلب، حيث أنها تنظم النظمية. للتحايل على القضايا بعيدا عن الهدف المرتبطة بسد قنوات HCN القلب، واقترحت مختبرنا مؤخرا استهداف تفاعل البروتين البروتين بين HCN وTRIP8b من أجل تعطيل تحديدا HCN وظيفة القناة في الدماغ.TRIP8b يربط المسام HCN تشكيل مفارز في موقعين التفاعل متميزة، على الرغم من هنا يتم التركيز على التفاعل بين تكرار tetratricopeptide (TPR) مجالات TRIP8b وC ذيل محطة من HCN1. في هذا البروتوكول، وصفا وسعت من طريقة لتنقية TRIP8b وتنفيذ شاشة إنتاجية عالية للتعرف على مثبطات جزيء صغير من التفاعل بين HCN وTRIP8b، يوصف. طريقة لفحص عالية الإنتاجية يستخدم لالإسفار الاستقطاب (اف ب) المستندة إلى الفحص لمراقبة ربط جزء TRIP8b كبير إلى أحد عشر الموسومة fluorophore الأمينية الببتيد حمض المقابلة لمحطة ذيل HCN1 مئوية. هذه الطريقة تسمح للمركبات &#39;ضرب&#39; الكشف عن هويته بناء على التغير في استقطاب الضوء المنبعث. ثم يتم إجراء فحوصات التحقق للتأكد من أن &#39;ضرب&#39; المركبات ليست مصطنعة.

لتجنب قضايا حق المؤلف مع المنشور السابق، تم استخدام مسبار الموسومة طمرة-HCN1 طمرة لتوليد أرقام 2 و 3. لاحظ أن هذا الاستبدال لم تسهم في إحداث فرق ملموس في النتائج، وبروتوكولات مماثلة لتلك المبينة أعلاه مع HCN1 FITC. لتقييم تفاع...

Watch this Scientific Journal Video about Method for Identifying Small Molecule Inhibitors of the Protein-protein Interaction Between HCN1 and TRIP8b at JoVE.com

Method for Identifying Small Molecule Inhibitors of the Protein-protein Interaction Between HCN1 and TRIP8b

وقد تم التعرف على التفاعل بين القنوات HCN وحدة فرعية المعاونة لها كهدف العلاجية في اضطراب اكتئابي. هنا، وهي طريقة القائم على الاستقطاب مضان لتحديد مثبطات جزيء صغير من هذا التفاعل البروتين البروتين، ويرد.

طريقة لتحديد الصغيرة جزيء مثبطات التفاعل البروتين البروتين بين HCN1 وTRIP8b

Hyperpolarization-activated cyclic nucleotide-gated (HCN) channels are expressed ubiquitously throughout the brain, where they function to regulate the ...

Research

JoVE Journal

Biochemistry

Using Scaffold Liposomes to Reconstitute Lipid-proximal Protein-protein Interactions In Vitro

Using Scaffold Liposomes to Reconstitute Lipid-proximal Protein-protein Interactions In Vitro

باستخدام سقالة الليبوزومات لإعادة تفاعلات البروتين البروتين، الدهون القريب<em&gt; في المختبر</em

Studies of integral membrane proteins in vitro are frequently complicated by the presence of a hydrophobic transmembrane domain. Further complicating ...

Visualization of Protein-protein Interaction in Nuclear and Cytoplasmic Fractions by Co-immunoprecipitation and In Situ Proximity Ligation Assay

Visualization of Protein-protein Interaction in Nuclear and Cytoplasmic Fractions by Co-immunoprecipitation and In Situ Proximity Ligation Assay

تصور التفاعل البروتين البروتين في هيولي النووية والكسور بواسطة شركة مناعي و<em&gt; في الموقع</em&gt; القرب من ربط الفحص

Protein-protein interactions are involved in thousands of cellular processes and occur in distinct spatial context. Traditionally, co-immunoprecipitation ...

Capturing the Interaction Kinetics of an Ion Channel Protein with Small Molecules by the Bio-layer Interferometry Assay

التقاط حركية التفاعل البروتين قناة أيون مع جزيئات صغيرة بمقايسة التداخلي بيو-طبقة

The bio-layer interferometry (BLI) assay is a valuable tool for measuring protein-protein and protein-small molecule interactions. Here, we first describe ...

Titration ELISA as a Method to Determine the Dissociation Constant of Receptor Ligand Interaction

معايرة أليسا كأسلوب لتحديد ثابت تفكك مستقبلات يجند التفاعل

The dissociation constant describes the interaction between two partners in the binding equilibrium and is a measure of their affinity. It is a crucial ...

Covalent Immobilization of Proteins for the Single Molecule Force Spectroscopy

تجميد التساهمية من البروتينات للتحليل الطيفي قوة جزيء واحد

In recent years, atomic force microscopy (AFM) based single molecule force spectroscopy (SMFS) extended our understanding of molecular properties and ...

Proteome-wide Quantification of Labeling Homogeneity at the Single Molecule Level

تحديد كمية البروتين على نطاق المنظومة وسم التجانس على مستوى جزيء واحد

Cell proteomes are often characterized using electrophoresis assays, where all species of proteins in the cells are non-specifically labeled with a ...

A Semi-High-Throughput Adaptation of the NADH-Coupled ATPase Assay for Screening Small Molecule Inhibitors

تكييف شبه عالي الإنتاجية لفحص ATPase المقترن بـ NADH لفحص مثبطات الجزيئات الصغيرة

ATPase enzymes utilize the free energy stored in adenosine triphosphate to catalyze a wide variety of endergonic biochemical processes in vivo that would ...

Native Cell Membrane Nanoparticles System for Membrane Protein-Protein Interaction Analysis

غشاء الخلية الأصلية نظام الجسيمات النانوية لتحليل التفاعل البروتينية الغشاء

Protein-protein interactions in cell membrane systems play crucial roles in a wide range of biological processes- from cell-to-cell interactions to signal ...

Identifying the Binding Proteins of Small Ligands with the Differential Radial Capillary Action of Ligand Assay (DRaCALA)

Identifying the Binding Proteins of Small Ligands with the Differential Radial Capillary Action of Ligand Assay DRaCALA

تحديد البروتينات الملزمة للليجاندات الصغيرة مع العمل الشعيرات الدموية الشعاعية التفاضلية من المقايسة ليغاند (DRaCALA)

The past decade has seen tremendous progress in the understanding of small signaling molecules in bacterial physiology. In particular, the target proteins ...

A High-Throughput Enzyme-Coupled Activity Assay to Probe Small Molecule Interaction with the dNTPase SAMHD1

Sterile alpha motif and HD domain-containing protein 1 (SAMHD1) is a pivotal regulator of intracellular deoxynucleoside triphosphate (dNTP) pools, as this ...