Name: method for identifying small molecule inhibitors of the protein-protein interaction between hcn1 and trip8b
Uploaded: 2016-11-11T14:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Method for Identifying Small Molecule Inhibitors of the Protein-protein Interaction Between HCN1 and TRIP8b at JoVE.com

This work was supported by National Institutes of Health Grant R21MH104471 and R01MH106511 (D.M.C.), Brain Research Foundation SG 2012-01 (D.M.C.), Northwestern University Clinical and Translational Sciences Institute 8UL1TR000150 (Y.H.), Chicago Biomedical Consortium HTS-004 (Y.H. and D.M.C.), and National Institutes of Health Grant 2T32MH067564 (K.L.). A part of this work was performed by the Northwestern University Medicinal and Synthetic Chemistry Core (ChemCore) at the Center for Molecular Innovation and Drug Discovery (CMIDD), which is funded by the Chicago Biomedical Consortium with support from the Searle Funds at the Chicago Community Trust and Cancer Center Support Grant P30 CA060553 from the National Cancer Institute awarded to the Robert H. Lurie Comprehensive Cancer Center. The high throughput screen work was performed in the High Throughput Analysis Laboratory which is also a core facility of the Robert H. Lurie Comprehensive Cancer Center.

טיהור 1. TRIP8b (241-602) חלבון <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להפוך את פלסמיד המכיל TRIP8b (241-602) ב pGS21 וקטור ביטוי חלבון חיידקי 3 לתוך E. המוסמכת coli עבור ביטוי החלבון על פי הוראות היצרן. פלייט 300 μl של התרבות על לוריא מרק (LB) -agar עם 5 מיקרוגרם / מ&quot;ל ?...

<ol>
	<li>Biel, M., Wahl-Schott, C., Michalakis, S., Zong, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hyperpolarization-activated+cation+channels:+from+genes+to+function.">Hyperpolarization-activated cation channels: from genes to function.</a> Physiol Rev. 89 (3), 847-885 (2009).</li><li>Shah, M. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=HCN1+channels:+a+new+therapeutic+target+for+depressive+disorders?.">HCN1 channels: a new therapeutic target for depressive disorders?.</a> Sci Signal. 5 (244), pe44 (2012).</li><li>Han, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+of+Small-Molecule+Inhibitors+of+Hyperpolarization-Activated+Cyclic+Nucleotide-Gated+Channels.">Identification of Small-Molecule Inhibitors of Hyperpolarization-Activated Cyclic Nucleotide-Gated Channels.</a> J Biomol Screen. 20 (9), 1124-1131 (2015).</li><li>Postea, O., Biel, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Exploring+HCN+channels+as+novel+drug+targets.">Exploring HCN channels as novel drug targets.</a> Nat Rev Drug Discov. 10 (12), (2011).</li><li>Stieber, J., Wieland, K., St&#246;ckl, G., Ludwig, A., Hofmann, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bradycardic+and+proarrhythmic+properties+of+sinus+node+inhibitors.">Bradycardic and proarrhythmic properties of sinus node inhibitors.</a> Mol Pharmacol. 69 (4), 1328-1337 (2006).</li><li>Santoro, B., Wainger, B. J., Siegelbaum, S. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regulation+of+HCN+channel+surface+expression+by+a+novel+C-terminal+protein-protein+interaction.">Regulation of HCN channel surface expression by a novel C-terminal protein-protein interaction.</a> J Neurosci. 24 (47), 10750-10762 (2004).</li><li>Lewis, A. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Deletion+of+the+hyperpolarization-activated+cyclic+nucleotide-gated+channel+auxiliary+subunit+TRIP8b+impairs+hippocampal+Ih+localization+and+function+and+promotes+antidepressant+behavior+in+mice.">Deletion of the hyperpolarization-activated cyclic nucleotide-gated channel auxiliary subunit TRIP8b impairs hippocampal Ih localization and function and promotes antidepressant behavior in mice.</a> J Neurosci. 31 (20), 7424-7440 (2011).</li><li>Heuermann, R. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reduction+of+thalamic+and+cortical+Ih+by+deletion+of+TRIP8b+produces+a+mouse+model+of+human+absence+epilepsy.">Reduction of thalamic and cortical Ih by deletion of TRIP8b produces a mouse model of human absence epilepsy.</a> Neurobiol Dis. 85, 81-92 (2016).</li><li>Steru, L., Chermat, R., Thierry, B., Simon, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+tail+suspension+test:+A+new+method+for+screening+antidepressants+in+mice.">The tail suspension test: A new method for screening antidepressants in mice.</a> Psychopharmacology. 85 (3), 367-370 (1985).</li><li>Petit-Demouliere, B., Chenu, F., Bourin, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Forced+swimming+test+in+mice:+a+review+of+antidepressant+activity.">Forced swimming test in mice: a review of antidepressant activity.</a> Psychopharmacology. 177 (3), 245-255 (2004).</li><li>Cryan, J. F., Mombereau, C., Vassout, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+tail+suspension+test+as+a+model+for+assessing+antidepressant+activity:+Review+of+pharmacological+and+genetic+studies+in+mice.">The tail suspension test as a model for assessing antidepressant activity: Review of pharmacological and genetic studies in mice.</a> Neurosci Biobehav Rev. 29 (4-5), 571-625 (2005).</li><li>Han, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Trafficking+and+gating+of+hyperpolarization-activated+cyclic+nucleotide-gated+channels+are+regulated+by+interaction+with+tetratricopeptide+repeat-containing+Rab8b-interacting+protein+(TRIP8b)+and+cyclic+AMP+at+distinct+sites.">Trafficking and gating of hyperpolarization-activated cyclic nucleotide-gated channels are regulated by interaction with tetratricopeptide repeat-containing Rab8b-interacting protein (TRIP8b) and cyclic AMP at distinct sites.</a> J Biol Chem. 286 (23), 20823-20834 (2011).</li><li>Hu, L., Santoro, B., Saponaro, A., Liu, H., Moroni, A., Siegelbaum, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Binding+of+the+auxiliary+subunit+TRIP8b+to+HCN+channels+shifts+the+mode+of+action+of+cAMP.">Binding of the auxiliary subunit TRIP8b to HCN channels shifts the mode of action of cAMP.</a> J Gen Physiol. 142 (6), 599-612 (2013).</li><li>Saponaro, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structural+basis+for+the+mutual+antagonism+of+cAMP+and+TRIP8b+in+regulating+HCN+channel+function.">Structural basis for the mutual antagonism of cAMP and TRIP8b in regulating HCN channel function.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 111 (40), 14577-14582 (2014).</li><li>Bankston, J. R., Camp, S. S., DiMaio, F., Lewis, A. S., Chetkovich, D. M., Zagotta, W. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structure+and+stoichiometry+of+an+accessory+subunit+TRIP8b+interaction+with+hyperpolarization-activated+cyclic+nucleotide-gated+channels.">Structure and stoichiometry of an accessory subunit TRIP8b interaction with hyperpolarization-activated cyclic nucleotide-gated channels.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 109 (20), 7899-7904 (2012).</li><li>Gatto, G. J., Geisbrecht, B. V., Gould, S. J., Berg, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Peroxisomal+targeting+signal-1+recognition+by+the+TPR+domains+of+human+PEX5.">Peroxisomal targeting signal-1 recognition by the TPR domains of human PEX5.</a> Nat Struct Biol. 7 (12), 1091-1095 (2000).</li><li>Owicki, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fluorescence+polarization+and+anisotropy+in+high+throughput+screening:+perspectives+and+primer.">Fluorescence polarization and anisotropy in high throughput screening: perspectives and primer.</a> J Biomol Screen. 5 (5), 297-306 (2000).</li><li>Smith, D. S., Eremin, S. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fluorescence+polarization+immunoassays+and+related+methods+for+simple,+high-throughput+screening+of+small+molecules.">Fluorescence polarization immunoassays and related methods for simple, high-throughput screening of small molecules.</a> Anal Bioanal Chem. 391 (5), 1499-1507 (2008).</li><li>Roehrl, M. H. A., Wang, J. Y., Wagner, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+general+framework+for+development+and+data+analysis+of+competitive+high-throughput+screens+for+small-molecule+inhibitors+of+protein-protein+interactions+by+fluorescence+polarization.">A general framework for development and data analysis of competitive high-throughput screens for small-molecule inhibitors of protein-protein interactions by fluorescence polarization.</a> Biochemistry. 43 (51), 16056-16066 (2004).</li><li>Arkin, M. R., Wells, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Small-molecule+inhibitors+of+protein-protein+interactions:+progressing+towards+the+dream.">Small-molecule inhibitors of protein-protein interactions: progressing towards the dream.</a> Nat Rev Drug Discov. 3 (4), 301-317 (2004).</li><li>Zhang, J., Chung, T., Oldenburg, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+Simple+Statistical+Parameter+for+Use+in+Evaluation+and+Validation+of+High+Throughput+Screening+Assays.">A Simple Statistical Parameter for Use in Evaluation and Validation of High Throughput Screening Assays.</a> J Biomol Screen. 4 (2), 67-73 (1999).</li><li>Eglen, R. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+use+of+AlphaScreen+technology+in+HTS:+current+status.">The use of AlphaScreen technology in HTS: current status.</a> Curr Cheml Genomics. 1 (1), 2-10 (2008).</li><li>Lehninger, A. L., Nelson, D. L., Cox, M. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Lehninger Principles of Biochemistry. , (2000).</li><li>Kim, C. S., Chang, P. Y., Johnston, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Enhancement+of+dorsal+hippocampal+activity+by+knockdown+of+HCN1+channels+leads+to+anxiolytic-+and+antidepressant-like+behaviors.">Enhancement of dorsal hippocampal activity by knockdown of HCN1 channels leads to anxiolytic- and antidepressant-like behaviors.</a> Neuron. 75 (3), 503-516 (2012).</li><li>Wahl-Schott, C., Biel, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=HCN+channels:+structure,+cellular+regulation+and+physiological+function.">HCN channels: structure, cellular regulation and physiological function.</a> Cell Mol Life Sci. 66 (3), 470-494 (2009).</li><li>DeBerg, H. A., Bankston, J. R., Rosenbaum, J. C., Brzovic, P. S., Zagotta, W. N., Stoll, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structural+Mechanism+for+the+Regulation+of+HCN+Ion+Channels+by+the+Accessory+Protein+TRIP8b.">Structural Mechanism for the Regulation of HCN Ion Channels by the Accessory Protein TRIP8b.</a> Structure. 23 (4), 734-744 (2015).</li><li>Weiss, J. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Hill+equation+revisited:+uses+and+misuses.">The Hill equation revisited: uses and misuses.</a> FASEB J. 11 (11), 835-841 (1997).</li><li>Prinz, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hill+coefficients,+dose-response+curves+and+allosteric+mechanisms.">Hill coefficients, dose-response curves and allosteric mechanisms.</a> J Chem Biol. 3 (1), 37-44 (2009).</li><li>Pollard, T. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+Guide+to+Simple+and+Informative+Binding+Assays.">A Guide to Simple and Informative Binding Assays.</a> Mol Biol Cell. 21 (23), 4061-4067 (2010).</li><li>Rossi, A. M., Taylor, C. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Analysis+of+protein-ligand+interactions+by+fluorescence+polarization.">Analysis of protein-ligand interactions by fluorescence polarization.</a> Nat Protoc. 6 (3), (2011).</li><li>Ryan, A. J., Gray, N. M., Lowe, P. N., Chung, C. -. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effect+of+Detergent+on+"Promiscuous"+Inhibitors.">Effect of Detergent on "Promiscuous" Inhibitors.</a> J Med Chem. 46 (16), 3448-3451 (2003).</li><li>McGovern, S. L., Caselli, E., Grigorieff, N., Shoichet, B. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+common+mechanism+underlying+promiscuous+inhibitors+from+virtual+and+high-throughput+screening.">A common mechanism underlying promiscuous inhibitors from virtual and high-throughput screening.</a> J Med Chem. 45 (8), 1712-1722 (2002).</li><li>Hertzberg, R. P., Pope, A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-throughput+screening:+new+technology+for+the+21st+century.">High-throughput screening: new technology for the 21st century.</a> Curr Opin Chem Biol. 4 (4), 445-451 (2000).</li><li>Sundberg, S. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-throughput+and+ultra-high-throughput+screening:+solution-and+cell-based+approaches.">High-throughput and ultra-high-throughput screening: solution-and cell-based approaches.</a> Curr Opin Biotechnol. 11 (1), (2000).</li></ol>

בגלל הפוטנציאל שלה כיעד טיפולי ב MDD 24, חלה התעניינות רבה בגישות תרופתיות כי להרגיז פונקצית ערוץ HCN במערכת העצבים המרכזית 4. עם זאת, מאמצים אלה היו עוכבו על ידי התפקיד החשוב של ערוצי HCN ב pacemaking לב ואת הסיכון של הפרעות קצב 25. סברנו כי לשבש את יחסי הגומלין ב...

ערוצי נוקלאוטיד-מגודר מחזוריים מופעל hyperpolarization (HCN) באים לידי ביטוי על הלב ועל מערכת עצבים מרכזית, שם הם ממלאים תפקיד חשוב בויסות קרום רגישות 1. ערוצי HCN היו מעורבים בפתוגנזה של הפרעת דיכאון מג&#39;ורי (MDD) 2, אשר הובילה מספר קבוצות להציע כי הגבלת פרמקולוגית פונקצית ערוץ HCN עשויה להיות יעילה כמו טיפול חדשני MDD 3. עם זאת, מיקוד HCN ערוצים ישירות אינו בת קיימא בגלל התפקיד החשוב שלהם פוטנציאל הפעולה של לב 4. Ivabradine, ה- FDA אישר רק אנטגוניסט ערוץ HCN, משמש לטיפול באי ספיקת לב לייצר אפקט bradycardic 5. ככזה, יש צורך הסוכנים תרופתיים המגבילים פונקצית ערוץ HCN בלעדי במערכת העצבים המרכזית. Tetratricopeptide לחזור המכילים חלבון אינטראקציה Rab8b (TRIP8b) הוא ספציפי במוחFIC למקטע עזר של ערוצי HCN שולט ביטוי המשטח והלוקליזציה של ערוצי HCN 6,7. נוקאאוט גנטי של TRIP8b גורמת לירידה של ערוצי המוח HCN 7 מבלי להשפיע ביטוי HCN בלב 8. מעניין, עכברים בנוקאאוט TRIP8b להשקיע פחות נייחי זמן על משימת לשחות בכפיית השעית זנב המשימה 7, שתי בדיקות סינון נפוצות עבור יעילות נגד דיכאון 9-11. תוצאות אלו מצביעות כי במקום ישירות מיקוד ערוצי HCN עם אנטגוניסט מולקולה קטן של פונקצית ערוץ HCN, לשבש את יחסי הגומלין בין TRIP8b ו HCN עשוי להיות מספיק כדי לייצר התנהגות נוגדת דיכאון דמוי. TRIP8b נקשר HCN בשני אתרים מחייב ברורים. תחום המחייב המחזורי נוקלאוטיד (CNBD) של HCN אינטראקציה עם תחום שימור של מסוף TRIP8b ממוקם N אל תחומי TPR של 12,13 TRIP8b. למרות השאריות של CNBD כי הם מעורבים זהאינטראקציה מופתה 14, באזור של TRIP8b כי הוא מעורב לא הצטמצם מעבר AN-80-אמינו שבר חומצה 13. אינטראקציה שנייה מתרחשת בין חוזרות tetratricopeptide (TPR) התחומים של TRIP8b ואת tripeptide מסוף C של HCN ( &quot;SNL&quot; ב HCN1, HCN2, ו HCN4, אבל &#39;ANM&#39; ב HCN3) 3,12. המבנה הגבישי נפתר לאחרונה 15 אינטראקצית זנב C זה חשף דמיון מבני מהותי באינטראקציה בין הקולטן יבוא peroxisomal, peroxin 5 (PEX5), ועל אינטראקצית שותפים, המכילה סוג 1 רצפי מיקוד peroxisomal (PTS1) 16. למרות ששני אתרי האינטראקציה נדרשים לתפקוד ערוץ HCN, האינטראקציה בין תחומי TPR של TRIP8b ואת tripeptide מסוף C של HCN1 משמשת אתר הקישור הדומיננטי מסדיר ביטוי משטח HCN. לכן, אינטראקציה זו נבחרה כאתר המיקוד במחקר זה.במשך שארית של כתב היד, כאשר הפניה נעשית כדי האינטראקציה בין TRIP8b ו HCN, זה אינטראקציה זו שאליה מתייחס אליהם. אינטראקציה זו הוא סכם מרסיס מסיס מאוד של TRIP8b המתאים מסוף C המשומר שלה המכיל את תחומי TPR הנדרשים מחייב זנב C המסוף של HCN (שאריות 241-602 של 1a-4 isoforms של TRIP8b) 3. על מנת לפתח מסך תפוקה גבוה לזהות מולקולות קטנות מסוגלות לשבש את האינטראקציה הזאת, קיטוב קרינה (FP) מבוסס assay הועסק 17. קיטוב הקרינה מבוסס על עירור של ליגנד מתויג fluorophore עם אור מקוטב, ומדידת מידת הקיטוב של הקרינה הנפלטת 18. בנוכחות שותף מחייב, התנועה הסיבובית של ליגנד הניאון מוגבלת ואור מקוטב נפלט 19. בהיעדר שותף מחייב, tהוא תנועה סיבובית של ליגנד מוביל פליטת אור depolarized. בפרוטוקול המצורף, שיטה לטיהור מתויג מסוף N (6xHis) TRIP8b (241-602) באמצעות חומצה ניקל-nitrilotriacetic (Ni-נ.ת.ע) חרוזים מוצג. פרוטוקול דומה הועסק לטהר את גלוטתיון-S-transferase (GST) -tagged C מסוף 40 חומצות אמינו של HCN1 (C40 HCN1) המשמש בשלב 7 של הפרוטוקול. משיקולי שטח, תיאור מפורט של ההליך שהושמט. בשנת צעדים 2 עד 7 של הפרוטוקול, עבודת הקרנת תפוקה גבוהה מוצגת (ראה איור 1). אינטראקציות בין חלבונים הן מטרה קשה לשמצה לסינון תפוקה גבוהה וקוראים מומלצים לחפש משאבים נוספים בנושא 20. שלבי 2 ו -3 לפקודת הפרוצדורה לאפיין את הזיקה במבחנה של TRIP8b המטוהר (241-602) לבנות FOra isothiocyanate והעמסת (FITC) -tagged עשרה פפטיד החומצות האמיניות המתאים הזנב מסוף C של HCN1 (HCN1 FITC). בהתבסס על המבנה הגבישי של TRIP8b-HCN 15 מורכבות, רצף חומצות האמינו עשר זה מספיק כדי לייצר מחייב עם TRIP8b (241-602). בשלב 2, ד K של האינטראקציה נמדדת על ידי titrating TRIP8b (241-602) לתוך ריכוז קבוע של HCN1 FITC. בשלב 3, גרסה ללא תווית של הפפטיד HCN בשימוש בשלב 2 הוא טיטרציה לתוך ריכוז קבוע של שני TRIP8b (241-602) ו HCN1 FITC לבחון אם תג FITC מפריע מחייב. ניסויים אלה חיוניים בחירת הריכוזים המתאימים של TRIP8b (241-602) ו HCN1 FITC המשמשים במסך קצב העברת נתונים הגבוה. נחת היסוד של מסך התפוקה הגבוהה היא מולקולה קטנה מסוגלת לשבש את יחסי הגומלין בין TRIP8b (241-602) ו HCN1 FITC יפיק דצמברrease לאור מקוטב. בשלב 4, הגורם Z של assay מחושב 21 עבור ריכוז נתון של TRIP8b (241-602) ו HCN1 FITC כדי להבטיח כי assay מתאים להקרנה תפוקה גבוהה (שלב 5). שלבי 6 ו -7 הם מבחני אימות כדי לאשר כי הנפילות במסך התפוקה הגבוהה העיקרי פועלות ע&quot;י שיבוש האינטראקציה בין TRIP8b (241-602) ו HCN1 FITC ולא באמצעות מנגנון ספציפי. בשלב 6, carboxytetramethylrhodamine (טמרה) -labeled HCN1 פפטיד (HCN1 טמרה) משמש ב assay קיטוב הקרינה זהה אחרת לסנן תרכובות פלורסנט שמסכנת את assay FP שימוש בתג FITC. שלב 7 מנצל שבר מסוף HCN1 C גדול (HCN1 C40) ומעסיק assay קרב מבוסס חרוז, אשר מבוססת על &quot;מינהור&quot; של חמצן גופייה מן חרוז תורמות חרוז acceptor הביא קרובים אחד לשני על ידי אינטראקצית חלבונים 22.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Ni-NTA agarose&#160;</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>30210</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dialysis cassette&#160;</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>66456</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Isopropyl b-D-1-thiogalactopyranoside&#160;</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>I5502-1G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>384 Well Black plate&#160;</td>
			<td>Corning</td>
			<td>3820</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Proxiplate&#160;</td>
			<td>Perkin-Elmer&#160;</td>
			<td>6008289</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-GST Acceptor beads&#160;</td>
			<td>Perkin-Elmer&#160;</td>
			<td>6760603C</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NiChelate</td>
			<td>Perkin-Elmer&#160;</td>
			<td>AS101D</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pGS21-a</td>
			<td>Genscript</td>
			<td>SD0121</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PMSF</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>10837091001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Coomassie Kit</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>23200</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Protein concentrator</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>88527</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Perkin Elmer Enspire Multimode Plate reader</td>
			<td>Perkin-Elmer&#160;</td>
			<td>#2300-001M</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BL21 (DE3) Competent Cells</td>
			<td>Agilent</td>
			<td>200131</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

method for identifying small molecule inhibitors of the protein-protein interaction between hcn1 and trip8b

ערוצי נוקלאוטיד-מגודר מחזוריים מופעל hyperpolarization (HCN) באים לידי ביטוי בכל מקום בגוף בכל רחבי המוח, שם הם מתפקדים להסדיר את הרגישות של נוירונים. חלוקת subcellular של הערוצים הללו עצב פירמידליים של האזור בהיפוקמפוס CA1 מוסדרת tetratricopeptide חלבון אינטראקציה חוזר המכיל Rab8b (TRIP8b), גידול למקטע עזר. נוקאאוט גנטי של HCN נקבובית להרכיב יחידות משנה או TRIP8b, הוא להוביל לעלייה בהתנהגות נגד דיכאון דמוי, דבר המצביע כי הגבלת הפונקציה של ערוצי HCN עשויה להיות שימושית כטיפול בהפרעת דיכאון מג&#39;ורית (MDD). למרות עניין טיפולי משמעותי, ערוצי HCN באים לידי ביטוי גם בלב, שם הם מווסתים מקצב. כדי לעקוף בעיות מחוץ יעד הקשורים חסימת ערוצי HCN לב, במעבדה שלנו הציעה לאחרונה מיקוד האינטראקציה בין החלבונים בין HCN ו TRIP8b כדי להפריע לפעילות של ערוץ HCN במיוחד במוח.TRIP8b נקשר נקבובי HCN להרכיב יחידות משנה בשני אתרי אינטראקציה מובהקים, אף כאן הדגש הוא על האינטראקציה בין חוזרות tetratricopeptide (TPR) תחומים של TRIP8b ואת זנב C המסוף של HCN1. בפרוטוקול זה, תיאור מורחב של שיטה לטיהור TRIP8b וביצוע מסך תפוקה גבוהה לזהות מעכבי מולקולה קטנה של האינטראקציה בין HCN ו TRIP8b, מתואר. השיטה לסינון תפוקה גבוהה מנצלת קיטוב קרינה (FP) מבוסס assay לפקח על כריכה של שבר TRIP8b גדול על אחת עשר-tagged fluorophore אמינו פפטיד החומצה מתאים זנב מסוף HCN1 C. שיטה זו מאפשרת &#39;מכה&#39; תרכובות כדי לזהות המבוססת על שינוי הקיטוב של האור הנפלט. מבחני אימות מבוצעים ואז לבטח &#39;מכה&#39; תרכובות אינן artifactual.

כדי למנוע בעיות זכויות יוצרים עם בפרסום הקודם שלנו, בדיקה מתויגת-טמרה HCN1 טמרה הייתה השתמשה כדי ליצור איורים 2 ו -3. שים לב החלפה זה לא עשתה הבדל ניכר בתוצאות, והפרוטוקולים זהים לאלה שתוארו לעיל עם HCN1 FITC. כדי להעריך את האינ?...

Watch this Scientific Journal Video about Method for Identifying Small Molecule Inhibitors of the Protein-protein Interaction Between HCN1 and TRIP8b at JoVE.com

Method for Identifying Small Molecule Inhibitors of the Protein-protein Interaction Between HCN1 and TRIP8b

האינטראקציה בין ערוצי HCN ו למקטע העזר שלהם זוהה כיעד טיפולי הפרעת דיכאון מג&#39;ורית. כאן, שיטת קרינה מבוססת קיטוב לזיהוי מעכבי מולקולה קטנים של אינטראקציה בין חלבונים זה, מוצגת.

שיטה לזיהוי מולקולה קטנה מעכבים של האינטראקציה בין החלבונים בין HCN1 ו TRIP8b

Hyperpolarization-activated cyclic nucleotide-gated (HCN) channels are expressed ubiquitously throughout the brain, where they function to regulate the ...

Research

JoVE Journal

Biochemistry

Using Scaffold Liposomes to Reconstitute Lipid-proximal Protein-protein Interactions In Vitro

Using Scaffold Liposomes to Reconstitute Lipid-proximal Protein-protein Interactions In Vitro

באמצעות הפיגום ליפוזומים כדי לשקם אינטראקציות ליפידים-הפרוקסימלי חלבונים<em&gt; במבחנה</em

Studies of integral membrane proteins in vitro are frequently complicated by the presence of a hydrophobic transmembrane domain. Further complicating ...

Visualization of Protein-protein Interaction in Nuclear and Cytoplasmic Fractions by Co-immunoprecipitation and In Situ Proximity Ligation Assay

Visualization of Protein-protein Interaction in Nuclear and Cytoplasmic Fractions by Co-immunoprecipitation and In Situ Proximity Ligation Assay

ויזואליזציה של אינטראקציה בין חלבונים ב גרעיני cytoplasmic שברים על ידי Co-immunoprecipitation ו<em&gt; באתרו</em&gt; Assay קשירת הסמיכות

Protein-protein interactions are involved in thousands of cellular processes and occur in distinct spatial context. Traditionally, co-immunoprecipitation ...

Capturing the Interaction Kinetics of an Ion Channel Protein with Small Molecules by the Bio-layer Interferometry Assay

לכידת את האינטראקציה קינטיקה החלבון תעלת יונים עם מולקולות קטנות על ידי וזמינותו אינטרפרומטריה ביו-שכבה

The bio-layer interferometry (BLI) assay is a valuable tool for measuring protein-protein and protein-small molecule interactions. Here, we first describe ...

Titration ELISA as a Method to Determine the Dissociation Constant of Receptor Ligand Interaction

טיטור אליסה כשיטה לקבוע את קבוע דיסוציאציה של קולטן ליגנד אינטראקציה

The dissociation constant describes the interaction between two partners in the binding equilibrium and is a measure of their affinity. It is a crucial ...

Covalent Immobilization of Proteins for the Single Molecule Force Spectroscopy

קיבעון קוולנטיות של חלבונים על ספקטרוסקופיה כוח מולקולה בודדת

In recent years, atomic force microscopy (AFM) based single molecule force spectroscopy (SMFS) extended our understanding of molecular properties and ...

Proteome-wide Quantification of Labeling Homogeneity at the Single Molecule Level

פרוטאום ברוחב כימות של תיוג הומוגניות ברמת מולקולה בודדת

Cell proteomes are often characterized using electrophoresis assays, where all species of proteins in the cells are non-specifically labeled with a ...

A Semi-High-Throughput Adaptation of the NADH-Coupled ATPase Assay for Screening Small Molecule Inhibitors

הסתגלות למחצה בתפוקה גבוהה של מעכבי הנדח ביחד לסינון מולקולה קטנה

ATPase enzymes utilize the free energy stored in adenosine triphosphate to catalyze a wide variety of endergonic biochemical processes in vivo that would ...

Native Cell Membrane Nanoparticles System for Membrane Protein-Protein Interaction Analysis

מערכת חלקיקי קרום התא המקורי לניתוח אינטראקציה של חלבון-חלבון קרום

Protein-protein interactions in cell membrane systems play crucial roles in a wide range of biological processes- from cell-to-cell interactions to signal ...

Identifying the Binding Proteins of Small Ligands with the Differential Radial Capillary Action of Ligand Assay (DRaCALA)

Identifying the Binding Proteins of Small Ligands with the Differential Radial Capillary Action of Ligand Assay DRaCALA

זיהוי החלבונים המחייבים של ליגנדים קטנים עם הפעולה הרדיאלית הרדיאלית הדיפרנציאלית של ליגנד אסאי (DRaCALA)

The past decade has seen tremendous progress in the understanding of small signaling molecules in bacterial physiology. In particular, the target proteins ...

A High-Throughput Enzyme-Coupled Activity Assay to Probe Small Molecule Interaction with the dNTPase SAMHD1

Sterile alpha motif and HD domain-containing protein 1 (SAMHD1) is a pivotal regulator of intracellular deoxynucleoside triphosphate (dNTP) pools, as this ...