Name: method for identifying small molecule inhibitors of the protein-protein interaction between hcn1 and trip8b
Uploaded: 2016-11-11T14:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Method for Identifying Small Molecule Inhibitors of the Protein-protein Interaction Between HCN1 and TRIP8b at JoVE.com

This work was supported by National Institutes of Health Grant R21MH104471 and R01MH106511 (D.M.C.), Brain Research Foundation SG 2012-01 (D.M.C.), Northwestern University Clinical and Translational Sciences Institute 8UL1TR000150 (Y.H.), Chicago Biomedical Consortium HTS-004 (Y.H. and D.M.C.), and National Institutes of Health Grant 2T32MH067564 (K.L.). A part of this work was performed by the Northwestern University Medicinal and Synthetic Chemistry Core (ChemCore) at the Center for Molecular Innovation and Drug Discovery (CMIDD), which is funded by the Chicago Biomedical Consortium with support from the Searle Funds at the Chicago Community Trust and Cancer Center Support Grant P30 CA060553 from the National Cancer Institute awarded to the Robert H. Lurie Comprehensive Cancer Center. The high throughput screen work was performed in the High Throughput Analysis Laboratory which is also a core facility of the Robert H. Lurie Comprehensive Cancer Center.

1. TRIP8b (241-602) प्रोटीन की शुद्धि <ol><li> सक्षम ई में बैक्टीरियल प्रोटीन अभिव्यक्ति वेक्टर pGS21 3 में TRIP8b (241-602) से युक्त प्लाज्मिड रूपांतरण निर्माता के निर्देशों के अनुसार प्रोटीन अभिव्यक्ति के लिए कोलाई।</em...

<ol>
	<li>Biel, M., Wahl-Schott, C., Michalakis, S., Zong, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hyperpolarization-activated+cation+channels:+from+genes+to+function.">Hyperpolarization-activated cation channels: from genes to function.</a> Physiol Rev. 89 (3), 847-885 (2009).</li><li>Shah, M. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=HCN1+channels:+a+new+therapeutic+target+for+depressive+disorders?.">HCN1 channels: a new therapeutic target for depressive disorders?.</a> Sci Signal. 5 (244), pe44 (2012).</li><li>Han, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+of+Small-Molecule+Inhibitors+of+Hyperpolarization-Activated+Cyclic+Nucleotide-Gated+Channels.">Identification of Small-Molecule Inhibitors of Hyperpolarization-Activated Cyclic Nucleotide-Gated Channels.</a> J Biomol Screen. 20 (9), 1124-1131 (2015).</li><li>Postea, O., Biel, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Exploring+HCN+channels+as+novel+drug+targets.">Exploring HCN channels as novel drug targets.</a> Nat Rev Drug Discov. 10 (12), (2011).</li><li>Stieber, J., Wieland, K., St&#246;ckl, G., Ludwig, A., Hofmann, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bradycardic+and+proarrhythmic+properties+of+sinus+node+inhibitors.">Bradycardic and proarrhythmic properties of sinus node inhibitors.</a> Mol Pharmacol. 69 (4), 1328-1337 (2006).</li><li>Santoro, B., Wainger, B. J., Siegelbaum, S. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regulation+of+HCN+channel+surface+expression+by+a+novel+C-terminal+protein-protein+interaction.">Regulation of HCN channel surface expression by a novel C-terminal protein-protein interaction.</a> J Neurosci. 24 (47), 10750-10762 (2004).</li><li>Lewis, A. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Deletion+of+the+hyperpolarization-activated+cyclic+nucleotide-gated+channel+auxiliary+subunit+TRIP8b+impairs+hippocampal+Ih+localization+and+function+and+promotes+antidepressant+behavior+in+mice.">Deletion of the hyperpolarization-activated cyclic nucleotide-gated channel auxiliary subunit TRIP8b impairs hippocampal Ih localization and function and promotes antidepressant behavior in mice.</a> J Neurosci. 31 (20), 7424-7440 (2011).</li><li>Heuermann, R. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reduction+of+thalamic+and+cortical+Ih+by+deletion+of+TRIP8b+produces+a+mouse+model+of+human+absence+epilepsy.">Reduction of thalamic and cortical Ih by deletion of TRIP8b produces a mouse model of human absence epilepsy.</a> Neurobiol Dis. 85, 81-92 (2016).</li><li>Steru, L., Chermat, R., Thierry, B., Simon, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+tail+suspension+test:+A+new+method+for+screening+antidepressants+in+mice.">The tail suspension test: A new method for screening antidepressants in mice.</a> Psychopharmacology. 85 (3), 367-370 (1985).</li><li>Petit-Demouliere, B., Chenu, F., Bourin, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Forced+swimming+test+in+mice:+a+review+of+antidepressant+activity.">Forced swimming test in mice: a review of antidepressant activity.</a> Psychopharmacology. 177 (3), 245-255 (2004).</li><li>Cryan, J. F., Mombereau, C., Vassout, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+tail+suspension+test+as+a+model+for+assessing+antidepressant+activity:+Review+of+pharmacological+and+genetic+studies+in+mice.">The tail suspension test as a model for assessing antidepressant activity: Review of pharmacological and genetic studies in mice.</a> Neurosci Biobehav Rev. 29 (4-5), 571-625 (2005).</li><li>Han, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Trafficking+and+gating+of+hyperpolarization-activated+cyclic+nucleotide-gated+channels+are+regulated+by+interaction+with+tetratricopeptide+repeat-containing+Rab8b-interacting+protein+(TRIP8b)+and+cyclic+AMP+at+distinct+sites.">Trafficking and gating of hyperpolarization-activated cyclic nucleotide-gated channels are regulated by interaction with tetratricopeptide repeat-containing Rab8b-interacting protein (TRIP8b) and cyclic AMP at distinct sites.</a> J Biol Chem. 286 (23), 20823-20834 (2011).</li><li>Hu, L., Santoro, B., Saponaro, A., Liu, H., Moroni, A., Siegelbaum, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Binding+of+the+auxiliary+subunit+TRIP8b+to+HCN+channels+shifts+the+mode+of+action+of+cAMP.">Binding of the auxiliary subunit TRIP8b to HCN channels shifts the mode of action of cAMP.</a> J Gen Physiol. 142 (6), 599-612 (2013).</li><li>Saponaro, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structural+basis+for+the+mutual+antagonism+of+cAMP+and+TRIP8b+in+regulating+HCN+channel+function.">Structural basis for the mutual antagonism of cAMP and TRIP8b in regulating HCN channel function.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 111 (40), 14577-14582 (2014).</li><li>Bankston, J. R., Camp, S. S., DiMaio, F., Lewis, A. S., Chetkovich, D. M., Zagotta, W. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structure+and+stoichiometry+of+an+accessory+subunit+TRIP8b+interaction+with+hyperpolarization-activated+cyclic+nucleotide-gated+channels.">Structure and stoichiometry of an accessory subunit TRIP8b interaction with hyperpolarization-activated cyclic nucleotide-gated channels.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 109 (20), 7899-7904 (2012).</li><li>Gatto, G. J., Geisbrecht, B. V., Gould, S. J., Berg, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Peroxisomal+targeting+signal-1+recognition+by+the+TPR+domains+of+human+PEX5.">Peroxisomal targeting signal-1 recognition by the TPR domains of human PEX5.</a> Nat Struct Biol. 7 (12), 1091-1095 (2000).</li><li>Owicki, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fluorescence+polarization+and+anisotropy+in+high+throughput+screening:+perspectives+and+primer.">Fluorescence polarization and anisotropy in high throughput screening: perspectives and primer.</a> J Biomol Screen. 5 (5), 297-306 (2000).</li><li>Smith, D. S., Eremin, S. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fluorescence+polarization+immunoassays+and+related+methods+for+simple,+high-throughput+screening+of+small+molecules.">Fluorescence polarization immunoassays and related methods for simple, high-throughput screening of small molecules.</a> Anal Bioanal Chem. 391 (5), 1499-1507 (2008).</li><li>Roehrl, M. H. A., Wang, J. Y., Wagner, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+general+framework+for+development+and+data+analysis+of+competitive+high-throughput+screens+for+small-molecule+inhibitors+of+protein-protein+interactions+by+fluorescence+polarization.">A general framework for development and data analysis of competitive high-throughput screens for small-molecule inhibitors of protein-protein interactions by fluorescence polarization.</a> Biochemistry. 43 (51), 16056-16066 (2004).</li><li>Arkin, M. R., Wells, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Small-molecule+inhibitors+of+protein-protein+interactions:+progressing+towards+the+dream.">Small-molecule inhibitors of protein-protein interactions: progressing towards the dream.</a> Nat Rev Drug Discov. 3 (4), 301-317 (2004).</li><li>Zhang, J., Chung, T., Oldenburg, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+Simple+Statistical+Parameter+for+Use+in+Evaluation+and+Validation+of+High+Throughput+Screening+Assays.">A Simple Statistical Parameter for Use in Evaluation and Validation of High Throughput Screening Assays.</a> J Biomol Screen. 4 (2), 67-73 (1999).</li><li>Eglen, R. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+use+of+AlphaScreen+technology+in+HTS:+current+status.">The use of AlphaScreen technology in HTS: current status.</a> Curr Cheml Genomics. 1 (1), 2-10 (2008).</li><li>Lehninger, A. L., Nelson, D. L., Cox, M. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Lehninger Principles of Biochemistry. , (2000).</li><li>Kim, C. S., Chang, P. Y., Johnston, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Enhancement+of+dorsal+hippocampal+activity+by+knockdown+of+HCN1+channels+leads+to+anxiolytic-+and+antidepressant-like+behaviors.">Enhancement of dorsal hippocampal activity by knockdown of HCN1 channels leads to anxiolytic- and antidepressant-like behaviors.</a> Neuron. 75 (3), 503-516 (2012).</li><li>Wahl-Schott, C., Biel, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=HCN+channels:+structure,+cellular+regulation+and+physiological+function.">HCN channels: structure, cellular regulation and physiological function.</a> Cell Mol Life Sci. 66 (3), 470-494 (2009).</li><li>DeBerg, H. A., Bankston, J. R., Rosenbaum, J. C., Brzovic, P. S., Zagotta, W. N., Stoll, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structural+Mechanism+for+the+Regulation+of+HCN+Ion+Channels+by+the+Accessory+Protein+TRIP8b.">Structural Mechanism for the Regulation of HCN Ion Channels by the Accessory Protein TRIP8b.</a> Structure. 23 (4), 734-744 (2015).</li><li>Weiss, J. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Hill+equation+revisited:+uses+and+misuses.">The Hill equation revisited: uses and misuses.</a> FASEB J. 11 (11), 835-841 (1997).</li><li>Prinz, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hill+coefficients,+dose-response+curves+and+allosteric+mechanisms.">Hill coefficients, dose-response curves and allosteric mechanisms.</a> J Chem Biol. 3 (1), 37-44 (2009).</li><li>Pollard, T. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+Guide+to+Simple+and+Informative+Binding+Assays.">A Guide to Simple and Informative Binding Assays.</a> Mol Biol Cell. 21 (23), 4061-4067 (2010).</li><li>Rossi, A. M., Taylor, C. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Analysis+of+protein-ligand+interactions+by+fluorescence+polarization.">Analysis of protein-ligand interactions by fluorescence polarization.</a> Nat Protoc. 6 (3), (2011).</li><li>Ryan, A. J., Gray, N. M., Lowe, P. N., Chung, C. -. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effect+of+Detergent+on+"Promiscuous"+Inhibitors.">Effect of Detergent on "Promiscuous" Inhibitors.</a> J Med Chem. 46 (16), 3448-3451 (2003).</li><li>McGovern, S. L., Caselli, E., Grigorieff, N., Shoichet, B. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+common+mechanism+underlying+promiscuous+inhibitors+from+virtual+and+high-throughput+screening.">A common mechanism underlying promiscuous inhibitors from virtual and high-throughput screening.</a> J Med Chem. 45 (8), 1712-1722 (2002).</li><li>Hertzberg, R. P., Pope, A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-throughput+screening:+new+technology+for+the+21st+century.">High-throughput screening: new technology for the 21st century.</a> Curr Opin Chem Biol. 4 (4), 445-451 (2000).</li><li>Sundberg, S. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-throughput+and+ultra-high-throughput+screening:+solution-and+cell-based+approaches.">High-throughput and ultra-high-throughput screening: solution-and cell-based approaches.</a> Curr Opin Biotechnol. 11 (1), (2000).</li></ol>

MDD 24 में एक चिकित्सकीय लक्ष्य के रूप में अपनी क्षमता की वजह से, वहाँ औषधीय दृष्टिकोण है कि केंद्रीय तंत्रिका तंत्र में 4 HCN चैनल समारोह के विरोध में काफी रुचि रही है। हालांकि, इन प्रयासों हृदय pacemaking ?...

Hyperpolarization सक्रिय चक्रीय न्यूक्लियोटाइड-गेटेड (HCN) चैनलों दिल और केंद्रीय तंत्रिका तंत्र, जहां वे झिल्ली excitability 1 विनियमित करने में एक महत्वपूर्ण भूमिका निभा में व्यक्त कर रहे हैं। HCN चैनलों मेजर अवसाद विकार (MDD) 2, जो प्रस्ताव है कि सीमित HCN चैनल समारोह औषधीय MDD 3 के लिए एक उपन्यास उपचार के रूप में प्रभावी हो सकता है कई समूहों के लिए प्रेरित किया है के रोगजनन में फंसाया गया है। हालांकि, सीधे HCN चैनलों को लक्षित हृदय की संभावित कार्रवाई 4 में उनकी महत्वपूर्ण भूमिका की वजह से व्यवहार्य नहीं है। Ivabradine, केवल एफडीए HCN चैनल प्रतिपक्षी को मंजूरी दे दी, दिल की विफलता एक bradycardic प्रभाव 5 का उत्पादन करने के इलाज के लिए प्रयोग किया जाता है। जैसे, pharmacologic एजेंटों कि केंद्रीय तंत्रिका तंत्र में HCN चैनल समारोह में विशेष रूप से सीमा के लिए एक की जरूरत है। Tetratricopeptide दोहराने युक्त Rab8b बातचीत प्रोटीन (TRIP8b) एक मस्तिष्क विशिष्ट हैएफआईसी HCN चैनलों कि सतह अभिव्यक्ति और HCN चैनलों 6.7 के स्थानीयकरण नियंत्रण के सहायक सबयूनिट। TRIP8b की जेनेटिक पीटकर दिल 8 में HCN अभिव्यक्ति को प्रभावित किए बिना मस्तिष्क HCN चैनलों 7 की कमी का कारण बनता है। दिलचस्प बात यह है TRIP8b पीटा चूहों मजबूर तैरना कार्य और पूंछ निलंबन कार्य 7, एंटी प्रभावकारिता 9-11 के लिए दो आमतौर पर इस्तेमाल किया स्क्रीनिंग परीक्षणों पर कम समय स्थिर खर्च करते हैं। इन परिणामों के सीधे HCN चैनल समारोह का एक छोटा सा अणु प्रतिपक्षी के साथ HCN चैनलों को लक्षित, TRIP8b और HCN के बीच बातचीत में खलल न डालें एंटी-तरह व्यवहार का निर्माण करने के लिए पर्याप्त हो सकता है बजाय कि सुझाव देते हैं। TRIP8b दो अलग बाध्यकारी साइटों पर HCN को बांधता है। HCN की चक्रीय न्यूक्लियोटाइड बाध्यकारी डोमेन (CNBD) TRIP8b 12,13 के TPR डोमेन के लिए TRIP8b स्थित एन टर्मिनल के एक संरक्षित डोमेन के साथ सूचना का आदान प्रदान। हालांकि CNBD के अवशेषों कि इस में शामिल कर रहे हैंबातचीत 14 मैप किया गया है, कि इसमें शामिल है TRIP8b के क्षेत्र में एक-80-एमिनो एसिड टुकड़ा 13 परे नीचे संकुचित नहीं किया गया है। एक दूसरा बातचीत TRIP8b की tetratricopeptide दोहराने (TPR) डोमेन और HCN के सी टर्मिनल tripeptide (HCN1, HCN2, और HCN4 में &#39;एसएनएल&#39;, लेकिन HCN3 में &#39;एएनएम&#39;) 3,12 के बीच होता है। इस सी पूंछ बातचीत की हाल ही सुलझ क्रिस्टल संरचना 15, peroxisomal आयात रिसेप्टर के बीच बातचीत के लिए पर्याप्त संरचनात्मक समानता का पता चला peroxin 5 (PEX5), और उसके सहयोगियों बातचीत के दौरान, टाइप 1 peroxisomal को निशाना दृश्यों (PTS1) 16 से युक्त। हालांकि दोनों बातचीत साइटों HCN चैनल समारोह के लिए आवश्यक हैं, TRIP8b की TPR डोमेन और HCN1 के सी टर्मिनल tripeptide के बीच बातचीत के प्रमुख बाध्यकारी साइट के रूप में कार्य करता है और नियंत्रित करता है HCN सतह अभिव्यक्ति। इसलिए, इस बातचीत के इस अध्ययन में लक्ष्य-निर्धारण स्थल के रूप में चुना गया था।पांडुलिपि, जब एक संदर्भ TRIP8b और HCN के बीच बातचीत के लिए किया जाता है के शेष के लिए, यह इस बातचीत है कि करने के लिए भेजा जा रहा है। इस बातचीत TRIP8b के एक उच्च घुलनशील टुकड़ा युक्त इसकी संरक्षित सी टर्मिनल के लिए इसी TPR सी टर्मिनल HCN के 3 पूंछ (अवशेषों 1 ए -4 TRIP8b की isoforms की 241-602) बाइंडिंग के लिए आवश्यक डोमेन के द्वारा recapitulated है। आदेश छोटे इस बातचीत में खलल न डालें करने में सक्षम अणुओं की पहचान करने के लिए एक उच्च throughput स्क्रीन विकसित करने के लिए, एक प्रतिदीप्ति ध्रुवीकरण (एफपी) आधारित परख 17 कार्यरत था। प्रतिदीप्ति ध्रुवीकरण ध्रुवीकृत प्रकाश, और उत्सर्जित प्रतिदीप्ति 18 के ध्रुवीकरण की डिग्री को मापने के साथ एक fluorophore टैग ligand की उत्तेजना पर आधारित है। एक बाध्यकारी साथी की उपस्थिति में, फ्लोरोसेंट ligand की घूर्णी गति विवश है और ध्रुवीकरण प्रकाश 19 उत्सर्जित होता है। एक बाध्यकारी साथी, टी के अभाव मेंवह ligand की घूर्णी गति depolarized प्रकाश का उत्सर्जन होता है। संलग्न प्रोटोकॉल में, एन टर्मिनल टैग (6xHis) TRIP8b की शुद्धि (241-602) निकल Nitrilotriacetic एसिड (नी NTA) मनकों का उपयोग के लिए एक विधि प्रस्तुत किया है। इसी तरह की एक प्रोटोकॉल Glutathione-S-ट्रांसफेरेज़ (जीएसटी) -tagged सी HCN1 के टर्मिनल 40 अमीनो एसिड (HCN1 C40) प्रोटोकॉल के 7 चरण में इस्तेमाल किया शुद्ध करने के लिए नियुक्त किया गया था। अंतरिक्ष विचार के लिए, उस प्रक्रिया का विस्तृत विवरण छोड़ा गया था। प्रोटोकॉल के माध्यम से 7 कदम 2 में, एक उच्च throughput स्क्रीनिंग कार्यप्रवाह प्रस्तुत किया जाता है (चित्रा 1 देखें)। प्रोटीन, प्रोटीन बातचीत उच्च throughput प्रदर्शन के लिए एक बेहद मुश्किल लक्ष्य कर रहे हैं और पाठकों के विषय पर 20 अतिरिक्त संसाधनों की तलाश करने के लिए सलाह दी जाती है। 2 कदम और प्रक्रिया के 3 शुद्ध TRIP8b (241-602) की इन विट्रो समानता की विशेषताएँ के लिए निर्माणरा fluorescein आइसोथियोसाइनेट (FITC) -tagged ग्यारह एमिनो एसिड पेप्टाइड HCN1 (HCN1 FITC) के सी टर्मिनल पूंछ के लिए इसी। TRIP8b-HCN जटिल 15, क्रिस्टल संरचना के आधार पर इस ग्यारह एमिनो एसिड खंड TRIP8b (241-602) के साथ बंधन का निर्माण करने के लिए पर्याप्त है। चरण 2 में, बातचीत का कश्मीर घ HCN1 FITC की एक निश्चित एकाग्रता में TRIP8b (241-602) titrating द्वारा मापा जाता है। चरण 3 में, चरण 2 में इस्तेमाल किया HCN पेप्टाइड का एक लेबल हटाया गया संस्करण है, तो FITC टैग बंधन के साथ हस्तक्षेप की जांच के लिए दोनों TRIP8b (241-602) और HCN1 FITC की एक निश्चित एकाग्रता में titrated है। इन प्रयोगों TRIP8b (241-602) और HCN1 FITC की उचित सांद्रता उच्च throughput स्क्रीन में इस्तेमाल के चयन के लिए आवश्यक हैं। उच्च throughput स्क्रीन के आधार यह है कि एक छोटा सा अणु TRIP8b (241-602) और HCN1 FITC के बीच बातचीत में खलल न डालें एक दिसम्बर उत्पादन होगा करने में सक्षमध्रुवीकृत प्रकाश में rease। चरण 4 में, परख के Z कारक TRIP8b (241-602) और HCN1 FITC का एक दिया एकाग्रता के लिए 21 गणना की जाती है कि यह सुनिश्चित करने परख उच्च throughput प्रदर्शन (5 कदम) के लिए उपयुक्त है। चरण 6 और 7 पुष्टि करने के लिए कि हिट प्राथमिक उच्च throughput स्क्रीन में पहचान TRIP8b (241-602) और HCN1 FITC के बीच के बजाय एक अविशिष्ट तंत्र के माध्यम से बातचीत में खलल न डालें से अभिनय कर रहे हैं सत्यापन assays हैं। चरण 6 में, carboxytetramethylrhodamine (Tamra) HCN1 पेप्टाइड (HCN1 Tamra) एक अन्यथा समान प्रतिदीप्ति ध्रुवीकरण परख में इस्तेमाल किया फ्लोरोसेंट यौगिकों कि FITC टैग का उपयोग कर एफपी परख समझौता फिल्टर करने के लिए है -labeled। चरण 7 एक बड़ा HCN1 सी टर्मिनल टुकड़ा (HCN1 C40) का इस्तेमाल करता है और एक मनका-आधारित निकटता परख, जो प्रोटीन बातचीत के द्वारा एक दूसरे के करीब लाया एक स्वीकर्ता मनका के लिए एक दाता मनका से एक स्वेटर ऑक्सीजन की &#39;टनलिंग&#39; पर आधारित है को रोजगार 22।

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Ni-NTA agarose&#160;</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>30210</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dialysis cassette&#160;</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>66456</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Isopropyl b-D-1-thiogalactopyranoside&#160;</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>I5502-1G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>384 Well Black plate&#160;</td>
			<td>Corning</td>
			<td>3820</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Proxiplate&#160;</td>
			<td>Perkin-Elmer&#160;</td>
			<td>6008289</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-GST Acceptor beads&#160;</td>
			<td>Perkin-Elmer&#160;</td>
			<td>6760603C</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NiChelate</td>
			<td>Perkin-Elmer&#160;</td>
			<td>AS101D</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pGS21-a</td>
			<td>Genscript</td>
			<td>SD0121</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PMSF</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>10837091001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Coomassie Kit</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>23200</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Protein concentrator</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>88527</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Perkin Elmer Enspire Multimode Plate reader</td>
			<td>Perkin-Elmer&#160;</td>
			<td>#2300-001M</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BL21 (DE3) Competent Cells</td>
			<td>Agilent</td>
			<td>200131</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

method for identifying small molecule inhibitors of the protein-protein interaction between hcn1 and trip8b

Hyperpolarization सक्रिय चक्रीय न्यूक्लियोटाइड-गेटेड (HCN) चैनलों मस्तिष्क, जहां वे न्यूरॉन्स की उत्तेजना को विनियमित करने के लिए समारोह के दौरान सर्वत्र व्यक्त कर रहे हैं। हिप्पोकैम्पस क्षेत्र सीए 1 के पिरामिड न्यूरॉन्स में इन चैनलों की subcellular वितरण tetratricopeptide दोहराने युक्त Rab8b बातचीत प्रोटीन (TRIP8b), एक सहायक उप-इकाई द्वारा विनियमित है। HCN की जेनेटिक पीटकर सब यूनिटों या TRIP8b, एंटी-तरह के व्यवहार में वृद्धि करने के लिए दोनों के नेतृत्व गठन ताकना, सुझाव है कि HCN चैनलों के समारोह में सीमित मेजर अवसाद विकार (MDD) के लिए एक इलाज के रूप में उपयोगी हो सकता है। महत्वपूर्ण चिकित्सीय रुचि होने के बावजूद, HCN चैनलों को भी दिल है, जहां वे rhythmicity विनियमित में व्यक्त कर रहे हैं। हृदय HCN चैनलों को अवरुद्ध करने के साथ जुड़े बंद लक्ष्य मुद्दों को दरकिनार करने के लिए, हमारी प्रयोगशाला हाल ही में आदेश विशेष रूप से मस्तिष्क में HCN चैनल समारोह को बाधित करने में HCN और TRIP8b के बीच प्रोटीन, प्रोटीन बातचीत को निशाना बनाने का प्रस्ताव किया है।TRIP8b, HCN ताकना दो अलग-अलग बातचीत स्थलों पर सब यूनिटों के गठन को बांधता है, हालांकि यहां ध्यान देने के tetratricopeptide दोहराने (TPR) TRIP8b के डोमेन और HCN1 के सी टर्मिनल पूंछ के बीच बातचीत पर है। इस प्रोटोकॉल, TRIP8b सफ़ाई और HCN और TRIP8b के बीच बातचीत के छोटे अणु अवरोधकों की पहचान करने के लिए एक उच्च throughput स्क्रीन को क्रियान्वित करने के लिए एक विधि की एक विस्तृत विवरण में वर्णित है। उच्च throughput प्रदर्शन के लिए विधि एक प्रतिदीप्ति ध्रुवीकरण (एफपी) एसिड पेप्टाइड HCN1 सी टर्मिनल पूंछ को इसी एमिनो एक fluorophore टैग ग्यारह के लिए एक बड़ा टुकड़ा TRIP8b के बंधन की निगरानी के लिए परख आधारित का इस्तेमाल करता है। इस विधि की अनुमति देता है &#39;हिट&#39; यौगिकों उत्सर्जित प्रकाश का ध्रुवीकरण में परिवर्तन के आधार पर पहचान की जा सके। मान्यकरण assays तो यह सुनिश्चित करें कि &#39;हिट&#39; यौगिकों artifactual नहीं हैं प्रदर्शन कर रहे हैं।

हमारे पिछले प्रकाशन के साथ कॉपीराइट मुद्दों से बचने के लिए, एक Tamra टैग जांच HCN1 Tamra आंकड़े 2 और 3 उत्पन्न करने के लिए इस्तेमाल किया गया था। ध्यान दें कि यह प्रतिस्थापन परिणामों म?...

Watch this Scientific Journal Video about Method for Identifying Small Molecule Inhibitors of the Protein-protein Interaction Between HCN1 and TRIP8b at JoVE.com

Method for Identifying Small Molecule Inhibitors of the Protein-protein Interaction Between HCN1 and TRIP8b

HCN चैनलों और उनके सहायक सबयूनिट के बीच बातचीत मेजर अवसाद विकार में एक चिकित्सकीय लक्ष्य के रूप में पहचान की गई है। इधर, इस प्रोटीन, प्रोटीन बातचीत के छोटे अणु अवरोधकों की पहचान करने के लिए एक प्रतिदीप्ति ध्रुवीकरण आधारित पद्धति, प्रस्तुत किया है।

HCN1 और TRIP8b बीच प्रोटीन, प्रोटीन बातचीत के छोटे अणु inhibitors की पहचान के लिए विधि

Hyperpolarization-activated cyclic nucleotide-gated (HCN) channels are expressed ubiquitously throughout the brain, where they function to regulate the ...

Research

JoVE Journal

Biochemistry

Using Scaffold Liposomes to Reconstitute Lipid-proximal Protein-protein Interactions In Vitro

Using Scaffold Liposomes to Reconstitute Lipid-proximal Protein-protein Interactions In Vitro

पाड़ Liposomes का उपयोग लिपिड-समीपस्थ प्रोटीन, प्रोटीन बातचीत पुनर्गठित करने<em&gt; इन विट्रो</em

Studies of integral membrane proteins in vitro are frequently complicated by the presence of a hydrophobic transmembrane domain. Further complicating ...

Visualization of Protein-protein Interaction in Nuclear and Cytoplasmic Fractions by Co-immunoprecipitation and In Situ Proximity Ligation Assay

Visualization of Protein-protein Interaction in Nuclear and Cytoplasmic Fractions by Co-immunoprecipitation and In Situ Proximity Ligation Assay

सह-immunoprecipitation द्वारा परमाणु और cytoplasmic भागों में प्रोटीन, प्रोटीन बातचीत के दृश्य और<em&gt; बगल में</em&gt; निकटता Ligation परख

Protein-protein interactions are involved in thousands of cellular processes and occur in distinct spatial context. Traditionally, co-immunoprecipitation ...

Capturing the Interaction Kinetics of an Ion Channel Protein with Small Molecules by the Bio-layer Interferometry Assay

जैव परत Interferometry परख द्वारा छोटे अणुओं के साथ एक आयन चैनल प्रोटीन के संपर्क कैनेटीक्स पर कब्जा

The bio-layer interferometry (BLI) assay is a valuable tool for measuring protein-protein and protein-small molecule interactions. Here, we first describe ...

Titration ELISA as a Method to Determine the Dissociation Constant of Receptor Ligand Interaction

एक विधि के रूप में अनुमापन एलिसा रिसेप्टर Ligand बातचीत के पृथक्करण स्थिरांक निर्धारित करने के लिए

The dissociation constant describes the interaction between two partners in the binding equilibrium and is a measure of their affinity. It is a crucial ...

Covalent Immobilization of Proteins for the Single Molecule Force Spectroscopy

एकल अणु बल स्पेक्ट्रोस्कोपी के लिए प्रोटीन की आबंध स्थिरीकरण

In recent years, atomic force microscopy (AFM) based single molecule force spectroscopy (SMFS) extended our understanding of molecular properties and ...

Proteome-wide Quantification of Labeling Homogeneity at the Single Molecule Level

प्रोसिटोम एकल अणु स्तर पर लेबलिंग एकरूपता का व्यापक परिमाणन

Cell proteomes are often characterized using electrophoresis assays, where all species of proteins in the cells are non-specifically labeled with a ...

A Semi-High-Throughput Adaptation of the NADH-Coupled ATPase Assay for Screening Small Molecule Inhibitors

स्क्रीनिंग छोटे अणु अवरोधकों के लिए NADH-युग्मित ATPase परख के एक अर्द्ध उच्च Throughput अनुकूलन

ATPase enzymes utilize the free energy stored in adenosine triphosphate to catalyze a wide variety of endergonic biochemical processes in vivo that would ...

Native Cell Membrane Nanoparticles System for Membrane Protein-Protein Interaction Analysis

झिल्ली प्रोटीन-प्रोटीन इंटरैक्शन विश्लेषण के लिए देशी सेल झिल्ली नैनोकण प्रणाली

Protein-protein interactions in cell membrane systems play crucial roles in a wide range of biological processes- from cell-to-cell interactions to signal ...

Identifying the Binding Proteins of Small Ligands with the Differential Radial Capillary Action of Ligand Assay (DRaCALA)

Identifying the Binding Proteins of Small Ligands with the Differential Radial Capillary Action of Ligand Assay DRaCALA

लिगांड परख (DRaCALA) के अंतर रेडियल केशिलरी एक्शन के साथ छोटे लिगांड के बाध्यकारी प्रोटीन की पहचान करना

The past decade has seen tremendous progress in the understanding of small signaling molecules in bacterial physiology. In particular, the target proteins ...

A High-Throughput Enzyme-Coupled Activity Assay to Probe Small Molecule Interaction with the dNTPase SAMHD1

Sterile alpha motif and HD domain-containing protein 1 (SAMHD1) is a pivotal regulator of intracellular deoxynucleoside triphosphate (dNTP) pools, as this ...