Name: method for identifying small molecule inhibitors of the protein-protein interaction between hcn1 and trip8b
Uploaded: 2016-11-11T14:00:00
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This work was supported by National Institutes of Health Grant R21MH104471 and R01MH106511 (D.M.C.), Brain Research Foundation SG 2012-01 (D.M.C.), Northwestern University Clinical and Translational Sciences Institute 8UL1TR000150 (Y.H.), Chicago Biomedical Consortium HTS-004 (Y.H. and D.M.C.), and National Institutes of Health Grant 2T32MH067564 (K.L.). A part of this work was performed by the Northwestern University Medicinal and Synthetic Chemistry Core (ChemCore) at the Center for Molecular Innovation and Drug Discovery (CMIDD), which is funded by the Chicago Biomedical Consortium with support from the Searle Funds at the Chicago Community Trust and Cancer Center Support Grant P30 CA060553 from the National Cancer Institute awarded to the Robert H. Lurie Comprehensive Cancer Center. The high throughput screen work was performed in the High Throughput Analysis Laboratory which is also a core facility of the Robert H. Lurie Comprehensive Cancer Center.

1. Purificazione di TRIP8b (241-602) Proteine <ol><li> Trasformare il plasmide contenente TRIP8b (241-602) nella espressione della proteina batterica vettore pGS21 3 in E. competente coli per l&#39;espressione della proteina in base alle istruzioni del produttore. Piastra 300 ml di cultura su Luria Broth (LB) -agar con 5 mg / ml di cloramfenicolo e ampicillina. Incubare la piastra a 37 ° C per 16 h. </li><li> Il giorno successivo, scegliere una singola colonia per inoculare 50 ml LB con 5...

<ol>
	<li>Biel, M., Wahl-Schott, C., Michalakis, S., Zong, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hyperpolarization-activated+cation+channels:+from+genes+to+function.">Hyperpolarization-activated cation channels: from genes to function.</a> Physiol Rev. 89 (3), 847-885 (2009).</li><li>Shah, M. 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A causa della sua potenziale come un bersaglio terapeutico in MDD 24, c&#39;è stato un considerevole interesse per gli approcci farmacologici che antagonizzano funzione del canale HCN nel sistema nervoso centrale 4. Tuttavia, questi sforzi sono stati in fase di stallo per l&#39;importante ruolo dei canali HCN in pacemaking cardiaco e il rischio di aritmia 25. Abbiamo ragionato che interrompere l&#39;interazione tra HCN e la sua subunità ausiliaria specifica del cervello, TRIP8b 8,...

(HCN) canali nucleotide-gated cicliche iperpolarizzazione attivato sono espressi nel cuore e sistema nervoso centrale dove giocano un ruolo importante nella regolazione dell&#39;eccitabilità di membrana 1. Canali HCN sono stati implicati nella patogenesi del Disturbo Depressivo Maggiore (MDD) 2, che ha portato diversi gruppi di proporre che la limitazione HCN funzione del canale farmacologicamente può essere efficace come un trattamento innovativo per MDD 3. Tuttavia, il targeting direttamente canali HCN non è praticabile a causa del loro ruolo importante nella cardiaca potenziale d&#39;azione 4. Ivabradina, l&#39;unico approvato dalla FDA antagonista dei canali HCN, viene utilizzato per il trattamento dell&#39;insufficienza cardiaca per produrre un effetto bradicardia 5. Come tale, vi è la necessità di agenti farmacologici che limitano la funzione del canale HCN esclusivamente nel sistema nervoso centrale. Tetratricopeptide ripetere contenenti Rab8b proteine ​​che interagiscono (TRIP8b) è una specifica del cervellofic subunità accessoria dei canali HCN che controlla l&#39;espressione di superficie e la localizzazione dei canali HCN 6,7. Knockout genetica di TRIP8b provoca una riduzione del cervello canali HCN 7 senza influenzare l&#39;espressione HCN nel cuore 8. È interessante notare che, topi knockout TRIP8b passano meno tempo immobile sul forzata compito nuotata e sospensioni di coda compito 7, due test di screening comunemente usati per efficacia antidepressiva 9-11. Questi risultati suggeriscono che, piuttosto che prendere di mira direttamente i canali HCN con una piccola molecola di antagonisti funzione del canale HCN, interrompendo l&#39;interazione tra TRIP8b e HCN può essere sufficiente a produrre un comportamento antidepressivo-simile. TRIP8b lega al HCN a due siti di legame. Il dominio di legame ciclico nucleotide (CNBD) di HCN interagisce con un dominio conservato di terminale TRIP8b situata N per i domini TPR di TRIP8b 12,13. Sebbene i residui della CNBD che sono coinvolti in questointerazione sono stati mappati 14, la regione di TRIP8b che è coinvolto non è stato ristretto al di là di un-80-amino frammento di acido 13. Una seconda interazione avviene tra i tetratricopeptide ripetizione (TPR) domini di TRIP8b e del tripeptide terminal C di HCN ( &#39;SNL&#39; in HCN1, HCN2, e HCN4, ma &#39;ANM&#39; in HCN3) 3,12. La struttura cristallina di recente risolto 15 di questa interazione C coda rivelato notevole somiglianza strutturale con l&#39;interazione tra il recettore importazione peroxisomal, peroxin 5 (PEX5), e la sua interazione partner, contenente tipo 1 perossisomiali di targeting sequenze (PTS1) 16. Sebbene entrambi i siti di interazione sono necessari per la funzione del canale HCN, l&#39;interazione tra i domini TPR di TRIP8b e terminale tripeptide C di HCN1 serve come sito di legame dominante e regola l&#39;espressione di superficie HCN. Pertanto, questa interazione è stata scelta come sito di targeting in questo studio.Per il resto del manoscritto, quando si fa riferimento all&#39;interazione tra TRIP8b e HCN, è questa interazione che viene indicato. Questa interazione è ricapitolato da un frammento altamente solubile di TRIP8b corrispondente al suo terminale conservata C contenente i domini TPR richiesti per il legame della coda C terminale HCN (residui 241-602 della 1A-4 isoforme di TRIP8b) 3. Per sviluppare uno schermo ad alta produttività per identificare piccole molecole in grado di interrompere questa interazione, una polarizzazione di fluorescenza (FP) a base di dosaggio è stato impiegato 17. Fluorescenza polarizzata è basata sull&#39;eccitazione di un ligando fluoroforo-contrassegnate con luce polarizzata, e misurando il grado di polarizzazione della fluorescenza emessa 18. In presenza di un partner legante, il moto di rotazione del ligando fluorescente viene vincolata e la luce polarizzata viene emessa 19. In assenza di un partner legante, tegli moto di rotazione del ligando porta alla emissione di luce depolarizzata. Nel protocollo allegato, un metodo per la purificazione di N terminale-tag (6xHis) TRIP8b (241-602) con acido nitrilotriacetico nichel (Ni-NTA) perline è presentato. Un protocollo simile è stato impiegato per purificare il glutatione-S-transferasi (GST) -tagged C terminale di 40 amminoacidi di HCN1 (HCN1 C40) utilizzato nel passaggio 7 del protocollo. Per ragioni di spazio, una descrizione dettagliata di tale procedura è stata omessa. Nei passaggi da 2 a 7 del protocollo, un flusso di lavoro screening ad alto rendimento è presentato (vedi Figura 1). Interazioni proteina-proteina sono un obiettivo notoriamente difficile per lo screening ad alto rendimento ed i lettori sono invitati a cercare ulteriori risorse sul tema 20. I punti 2 e 3 della procedura caratterizzano l&#39;affinità in vitro della TRIP8b purificato (241-602) costruire fora fluoresceina isotiocianato (FITC) -tagged undici peptide amminoacido corrispondente alla coda terminal C di HCN1 (HCN1 FITC). Sulla base della struttura cristallina del TRIP8b-HCN complesso 15, questo segmento acido undici aminoacidi è sufficiente a produrre vincolante con TRIP8b (241-602). Nella fase 2, la K D dell&#39;interazione viene misurata per titolazione TRIP8b (241-602) in una concentrazione fissa di HCN1 FITC. Al punto 3, una versione senza etichetta del peptide HCN utilizzata al punto 2 viene titolato in una concentrazione fissa di entrambi TRIP8b (241-602) e HCN1 FITC di esaminare se il tag FITC interferisce con il legame. Questi esperimenti sono essenziali per la selezione delle concentrazioni adeguate di TRIP8b (241-602) e HCN1 FITC utilizzati nella schermata di throughput elevato. La premessa dello schermo throughput elevato è che una piccola molecola in grado di interrompere l&#39;interazione tra TRIP8b (241-602) e HCN1 FITC produrrà un DECRease in luce polarizzata. Nel passo 4, il fattore Z del dosaggio è calcolata 21 per una data concentrazione di TRIP8b (241-602) e HCN1 FITC per assicurare che il saggio è appropriato per screening ad alta (fase 5). I punti 6 e 7 sono saggi di convalida per confermare che i colpi individuati nella schermata principale throughput elevato agiscono interrompendo l&#39;interazione tra TRIP8b (241-602) e HCN1 FITC piuttosto che attraverso un meccanismo non specifico. Al punto 6, carboxytetramethylrhodamine (TAMRA) -labeled HCN1 peptide (HCN1 TAMRA) è utilizzato in un polarizzazione di fluorescenza altrimenti identica a filtrare i composti fluorescenti che compromettono il test FP utilizzando il tag FITC. Fase 7 utilizza un frammento più ampio terminale HCN1 C (HCN1 C40) e impiega un saggio di prossimità bead-based, che si basa sul &#39;tunneling&#39; di ossigeno singoletto da un tallone donatore per tallone accettore avvicinato tra loro da proteine interagenti 22.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Ni-NTA agarose&#160;</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>30210</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dialysis cassette&#160;</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>66456</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Isopropyl b-D-1-thiogalactopyranoside&#160;</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>I5502-1G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>384 Well Black plate&#160;</td>
			<td>Corning</td>
			<td>3820</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Proxiplate&#160;</td>
			<td>Perkin-Elmer&#160;</td>
			<td>6008289</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-GST Acceptor beads&#160;</td>
			<td>Perkin-Elmer&#160;</td>
			<td>6760603C</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NiChelate</td>
			<td>Perkin-Elmer&#160;</td>
			<td>AS101D</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pGS21-a</td>
			<td>Genscript</td>
			<td>SD0121</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PMSF</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>10837091001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Coomassie Kit</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>23200</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Protein concentrator</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>88527</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Perkin Elmer Enspire Multimode Plate reader</td>
			<td>Perkin-Elmer&#160;</td>
			<td>#2300-001M</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BL21 (DE3) Competent Cells</td>
			<td>Agilent</td>
			<td>200131</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

method for identifying small molecule inhibitors of the protein-protein interaction between hcn1 and trip8b

canali nucleotide-gated cicliche iperpolarizzazione attivato (HCN) sono espressi ubiquitariamente in tutto il cervello, dove funzionano per regolare l&#39;eccitabilità dei neuroni. La distribuzione subcellulare di questi canali nei neuroni piramidali dell&#39;ippocampo CA1 di superficie è regolata da tetratricopeptide Rab8b proteina repeat-contenenti interagenti (TRIP8b), subunità accessoria. knockout genetica di HCN poro formare subunità o TRIP8b, sia portare ad un aumento dei comportamenti antidepressivo-like, suggerendo che la limitazione della funzione dei canali HCN può essere utile come trattamento per il disturbo depressivo maggiore (MDD). Nonostante rilevante interesse terapeutico, canali HCN sono anche espressi nel cuore, dove regolano ritmicità. Per aggirare i problemi fuori bersaglio associati con il blocco canali HCN cardiaci, il nostro laboratorio ha recentemente proposto mira l&#39;interazione proteina-proteina tra HCN e TRIP8b al fine di interrompere specificamente la funzione di canale HCN nel cervello.TRIP8b lega al HCN pori formando subunità a due siti di interazione distinti, anche se qui l&#39;attenzione è rivolta all&#39;interazione tra la ripetizione tetratricopeptide (TPR) domini di TRIP8b e la coda del terminale C di HCN1. In questo protocollo, una descrizione estesa di un metodo per purificare TRIP8b e l&#39;esecuzione di uno schermo ad alta produttività per identificare piccole molecole inibitrici della interazione fra HCN e TRIP8b, è descritto. Il metodo di screening ad alto rendimento utilizza un fluorescenza polarizzata (FP) a base di test per monitorare il legame di un grande frammento TRIP8b ad un undici fluoroforo-tag amino peptide acido corrispondente alla coda terminale HCN1 C. Questo metodo permette composti HIT per essere identificati sulla base della variazione della polarizzazione della luce emessa. test di convalida vengono poi eseguiti per garantire che &#39;colpiscono&#39; composti non sono artefatta.

Per evitare problemi di copyright con la nostra precedente pubblicazione, una sonda TAMRA-tag HCN1 TAMRA è stato utilizzato per generare figure 2 e 3. Si noti che questa sostituzione non ha fatto una differenza apprezzabile nei risultati, ed i protocolli sono identiche a quelle descritte sopra, con HCN1 FITC. Per valutare l&#39;interazione con HCN1 TAMRA, TRIP8b (241-602) è stato titolato in una concentrazione fissa di ...

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Method for Identifying Small Molecule Inhibitors of the Protein-protein Interaction Between HCN1 and TRIP8b

L&#39;interazione tra i canali HCN e la loro subunità accessoria è stato identificato come un obiettivo terapeutico nel Disturbo Depressivo Maggiore. Qui, un metodo di polarizzazione basato fluorescenza per identificare piccole molecole inibitrici di questa interazione proteina-proteina, è presentato.

Metodo per identificare piccole molecole inibitori della interazione proteina-proteina tra HCN1 e TRIP8b

Hyperpolarization-activated cyclic nucleotide-gated (HCN) channels are expressed ubiquitously throughout the brain, where they function to regulate the ...

Research

JoVE Journal

Biochemistry

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Utilizzando impalcatura liposomi per ricostituire interazioni proteina-proteina lipidi-prossimale<em&gt; In Vitro</em

Studies of integral membrane proteins in vitro are frequently complicated by the presence of a hydrophobic transmembrane domain. Further complicating ...

Ricerca

Biochimica

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