Name: method for identifying small molecule inhibitors of the protein-protein interaction between hcn1 and trip8b
Uploaded: 2016-11-11T14:00:00
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This work was supported by National Institutes of Health Grant R21MH104471 and R01MH106511 (D.M.C.), Brain Research Foundation SG 2012-01 (D.M.C.), Northwestern University Clinical and Translational Sciences Institute 8UL1TR000150 (Y.H.), Chicago Biomedical Consortium HTS-004 (Y.H. and D.M.C.), and National Institutes of Health Grant 2T32MH067564 (K.L.). A part of this work was performed by the Northwestern University Medicinal and Synthetic Chemistry Core (ChemCore) at the Center for Molecular Innovation and Drug Discovery (CMIDD), which is funded by the Chicago Biomedical Consortium with support from the Searle Funds at the Chicago Community Trust and Cancer Center Support Grant P30 CA060553 from the National Cancer Institute awarded to the Robert H. Lurie Comprehensive Cancer Center. The high throughput screen work was performed in the High Throughput Analysis Laboratory which is also a core facility of the Robert H. Lurie Comprehensive Cancer Center.

1. TRIP8bの精製（241から602）タンパク質<ol><li>コンピテントE.に細菌タンパク質発現ベクターpGS21 3にTRIP8b（241から602）を含むプラスミドをトランスフォーム製造業者の指示に従って、タンパク質発現のための大腸菌 。プレートルリアブロス（LB）上での培養の300μlをクロラムフェニコールおよびアンピシリン5μg/ mlの-agar。 16時間、37℃でプレートをインキュベートします...

<ol>
	<li>Biel, M., Wahl-Schott, C., Michalakis, S., Zong, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hyperpolarization-activated+cation+channels:+from+genes+to+function.">Hyperpolarization-activated cation channels: from genes to function.</a> Physiol Rev. 89 (3), 847-885 (2009).</li><li>Shah, M. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=HCN1+channels:+a+new+therapeutic+target+for+depressive+disorders?.">HCN1 channels: a new therapeutic target for depressive disorders?.</a> Sci Signal. 5 (244), pe44 (2012).</li><li>Han, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+of+Small-Molecule+Inhibitors+of+Hyperpolarization-Activated+Cyclic+Nucleotide-Gated+Channels.">Identification of Small-Molecule Inhibitors of Hyperpolarization-Activated Cyclic Nucleotide-Gated Channels.</a> J Biomol Screen. 20 (9), 1124-1131 (2015).</li><li>Postea, O., Biel, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Exploring+HCN+channels+as+novel+drug+targets.">Exploring HCN channels as novel drug targets.</a> Nat Rev Drug Discov. 10 (12), (2011).</li><li>Stieber, J., Wieland, K., St&#246;ckl, G., Ludwig, A., Hofmann, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bradycardic+and+proarrhythmic+properties+of+sinus+node+inhibitors.">Bradycardic and proarrhythmic properties of sinus node inhibitors.</a> Mol Pharmacol. 69 (4), 1328-1337 (2006).</li><li>Santoro, B., Wainger, B. J., Siegelbaum, S. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regulation+of+HCN+channel+surface+expression+by+a+novel+C-terminal+protein-protein+interaction.">Regulation of HCN channel surface expression by a novel C-terminal protein-protein interaction.</a> J Neurosci. 24 (47), 10750-10762 (2004).</li><li>Lewis, A. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Deletion+of+the+hyperpolarization-activated+cyclic+nucleotide-gated+channel+auxiliary+subunit+TRIP8b+impairs+hippocampal+Ih+localization+and+function+and+promotes+antidepressant+behavior+in+mice.">Deletion of the hyperpolarization-activated cyclic nucleotide-gated channel auxiliary subunit TRIP8b impairs hippocampal Ih localization and function and promotes antidepressant behavior in mice.</a> J Neurosci. 31 (20), 7424-7440 (2011).</li><li>Heuermann, R. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reduction+of+thalamic+and+cortical+Ih+by+deletion+of+TRIP8b+produces+a+mouse+model+of+human+absence+epilepsy.">Reduction of thalamic and cortical Ih by deletion of TRIP8b produces a mouse model of human absence epilepsy.</a> Neurobiol Dis. 85, 81-92 (2016).</li><li>Steru, L., Chermat, R., Thierry, B., Simon, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+tail+suspension+test:+A+new+method+for+screening+antidepressants+in+mice.">The tail suspension test: A new method for screening antidepressants in mice.</a> Psychopharmacology. 85 (3), 367-370 (1985).</li><li>Petit-Demouliere, B., Chenu, F., Bourin, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Forced+swimming+test+in+mice:+a+review+of+antidepressant+activity.">Forced swimming test in mice: a review of antidepressant activity.</a> Psychopharmacology. 177 (3), 245-255 (2004).</li><li>Cryan, J. F., Mombereau, C., Vassout, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+tail+suspension+test+as+a+model+for+assessing+antidepressant+activity:+Review+of+pharmacological+and+genetic+studies+in+mice.">The tail suspension test as a model for assessing antidepressant activity: Review of pharmacological and genetic studies in mice.</a> Neurosci Biobehav Rev. 29 (4-5), 571-625 (2005).</li><li>Han, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Trafficking+and+gating+of+hyperpolarization-activated+cyclic+nucleotide-gated+channels+are+regulated+by+interaction+with+tetratricopeptide+repeat-containing+Rab8b-interacting+protein+(TRIP8b)+and+cyclic+AMP+at+distinct+sites.">Trafficking and gating of hyperpolarization-activated cyclic nucleotide-gated channels are regulated by interaction with tetratricopeptide repeat-containing Rab8b-interacting protein (TRIP8b) and cyclic AMP at distinct sites.</a> J Biol Chem. 286 (23), 20823-20834 (2011).</li><li>Hu, L., Santoro, B., Saponaro, A., Liu, H., Moroni, A., Siegelbaum, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Binding+of+the+auxiliary+subunit+TRIP8b+to+HCN+channels+shifts+the+mode+of+action+of+cAMP.">Binding of the auxiliary subunit TRIP8b to HCN channels shifts the mode of action of cAMP.</a> J Gen Physiol. 142 (6), 599-612 (2013).</li><li>Saponaro, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structural+basis+for+the+mutual+antagonism+of+cAMP+and+TRIP8b+in+regulating+HCN+channel+function.">Structural basis for the mutual antagonism of cAMP and TRIP8b in regulating HCN channel function.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 111 (40), 14577-14582 (2014).</li><li>Bankston, J. 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M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+use+of+AlphaScreen+technology+in+HTS:+current+status.">The use of AlphaScreen technology in HTS: current status.</a> Curr Cheml Genomics. 1 (1), 2-10 (2008).</li><li>Lehninger, A. L., Nelson, D. L., Cox, M. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Lehninger Principles of Biochemistry. , (2000).</li><li>Kim, C. S., Chang, P. Y., Johnston, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Enhancement+of+dorsal+hippocampal+activity+by+knockdown+of+HCN1+channels+leads+to+anxiolytic-+and+antidepressant-like+behaviors.">Enhancement of dorsal hippocampal activity by knockdown of HCN1 channels leads to anxiolytic- and antidepressant-like behaviors.</a> Neuron. 75 (3), 503-516 (2012).</li><li>Wahl-Schott, C., Biel, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=HCN+channels:+structure,+cellular+regulation+and+physiological+function.">HCN channels: structure, cellular regulation and physiological function.</a> Cell Mol Life Sci. 66 (3), 470-494 (2009).</li><li>DeBerg, H. A., Bankston, J. R., Rosenbaum, J. C., Brzovic, P. S., Zagotta, W. N., Stoll, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structural+Mechanism+for+the+Regulation+of+HCN+Ion+Channels+by+the+Accessory+Protein+TRIP8b.">Structural Mechanism for the Regulation of HCN Ion Channels by the Accessory Protein TRIP8b.</a> Structure. 23 (4), 734-744 (2015).</li><li>Weiss, J. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Hill+equation+revisited:+uses+and+misuses.">The Hill equation revisited: uses and misuses.</a> FASEB J. 11 (11), 835-841 (1997).</li><li>Prinz, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hill+coefficients,+dose-response+curves+and+allosteric+mechanisms.">Hill coefficients, dose-response curves and allosteric mechanisms.</a> J Chem Biol. 3 (1), 37-44 (2009).</li><li>Pollard, T. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+Guide+to+Simple+and+Informative+Binding+Assays.">A Guide to Simple and Informative Binding Assays.</a> Mol Biol Cell. 21 (23), 4061-4067 (2010).</li><li>Rossi, A. M., Taylor, C. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Analysis+of+protein-ligand+interactions+by+fluorescence+polarization.">Analysis of protein-ligand interactions by fluorescence polarization.</a> Nat Protoc. 6 (3), (2011).</li><li>Ryan, A. J., Gray, N. M., Lowe, P. N., Chung, C. -. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effect+of+Detergent+on+"Promiscuous"+Inhibitors.">Effect of Detergent on "Promiscuous" Inhibitors.</a> J Med Chem. 46 (16), 3448-3451 (2003).</li><li>McGovern, S. L., Caselli, E., Grigorieff, N., Shoichet, B. 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A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-throughput+and+ultra-high-throughput+screening:+solution-and+cell-based+approaches.">High-throughput and ultra-high-throughput screening: solution-and cell-based approaches.</a> Curr Opin Biotechnol. 11 (1), (2000).</li></ol>

そのためMDD 24における治療標的としての可能性のため、中枢神経系4にHCNチャネル機能を拮抗薬理学的アプローチにかなりの関心が集まっています。しかし、これらの努力は、心臓ペースメーカーや不整脈25のリスクのHCNチャネルの重要な役割によってストールされています。私たちは、TRIP8b 8、HCNおよびその脳の特定の補助サブユニットとの間の相互作用を破...

過分極活性化環状ヌクレオチド依存性（HCN）チャネルは、それらが膜興奮1の調節において重要な役割を果たし、心臓および中枢神経系で発現されます。 HCNチャネルは、薬理学的にHCNチャネル機能を制限することがMDD 3のための新規治療法として有効であることを提案するいくつかのグループをリードしてきた大うつ病性障害（MDD）2、の病因に関与しています。しかし、直接HCNチャネルを標的とするため、心臓の活動電位4におけるそれらの重要な役割で実行可能でありません。イバブラジン、唯一のFDAは、HCNチャネル拮抗薬を承認し、徐脈効果5を生成する心不全の治療のために使用されます。このように、中枢神経系でのみHCNチャネル機能を制限する薬理学的薬剤の必要性があります。 テトラトリコペプチドリピート含有Rab8b相互作用タンパク質（TRIP8b）脳特異ですHCNチャネル6,7の表面発現と局在を制御するHCNチャネルのFIC補助サブユニット。 TRIP8bの遺伝子ノックアウトは、心臓8におけるHCNの発現に影響を与えることなく、脳のHCNチャネル7の減少を引き起こします。興味深いことに、TRIP8bノックアウトマウスは、強制水泳タスクと尾懸垂タスク7、抗うつ効果9-11のための2つの一般的に使用されるスクリーニング検査に少ない時間の不動を費やしています。これらの結果は直接、HCNチャネル機能の小分子アンタゴニストとHCNチャネルを標的とする抗うつ様行動を生成するのに十分であり得るTRIP8bとHCNとの間の相互作用を破壊するのではなく、それを示唆しています。 TRIP8bは、2つの異なる結合部位でHCNに結合します。 HCNの環状ヌクレオチド結合ドメイン（CNBD）はTRIP8b 12,13のTPRドメインにTRIP8b位置するN末端の保存されたドメインと相互作用します。このに関与しているCNBDの残基が、相互作用が関与しているTRIP8bの領域は、80アミノ酸の断片13を越えて絞られていない、14にマッピングされています。第二の相互作用がTRIP8bのテトラトリコペプチド反復（TPR）ドメインおよびHCNのC末端トリペプチド（HCN1、HCN2、およびHCN4の「SNL」が、HCN3の「ANM &#39;）3,12との間で発生します。このCテール相互作用の最近解明結晶構造15は、5（PEX5）peroxin、ペルオキシソーム輸入受容体との間の相互作用に実質的な構造類似性を明らかにし、その1型ペルオキシソームターゲティング配列（PTS1）16を含む、相互作用パートナー。 両方の相互作用部位は、HCNチャネル機能のために必要とされるが、TRIP8bのTPRドメインおよびHCN1のC末端トリペプチドとの間の相互作用が支配的な結合部位として機能し、HCNの表面発現を調節します。従って、この相互作用は、この研究における標的部位として選択しました。参照がTRIP8bとHCNとの間の相互作用に言及するとき、原稿の残りの部分については、それが参照されているこの相互作用です。この相互作用は、HCN（残基TRIP8bの1A-4アイソフォームの241から602）3のC末端尾部を結合するために必要TPRドメインを含むその保存C末端に対応するTRIP8bの高度に可溶性断片によって再現されます。 この相互作用を破壊することができる小分子を同定するためのハイスループットスクリーニングを開発するために、蛍光偏光（FP）は、アッセイは17を用いたベース。蛍光偏光は、偏光を有するフルオロフォアタグ化リガンドの励起に基づいて、放出された蛍光18の偏光度を測定しています。結合パートナーの存在下では、蛍光リガンドの回転運動が拘束され、偏光19を出射します。結合パートナーTの非存在下で彼は、リガンドの回転運動は、脱分極光の放出をもたらします。 囲まれたプロトコルでは、ニッケル - ニトリロ三酢酸（のNi-NTA）ビーズを用いたN末端タグ（の6xHis）TRIP8bの精製（241から602）のための方法が提供されます。同様のプロトコルは、プロトコルのステップ7で使用されるグルタチオン-S-トランスフェラーゼ（GST） -タグC HCN1の末端40アミノ酸（HCN1のC40）を精製するために使用されました。スペースの考慮事項については、その手順の詳細な説明は省略されました。 プロトコルの7〜ステップ2において、ハイスループットスクリーニングワークフロー（ 図1参照）が提示されます。タンパク質-タンパク質相互作用は、ハイスループットスクリーニングのために難しいことで知らターゲットであり、読者は、トピック20に追加のリソースを模索することをお勧めします。 手順のステップ2と3、精製TRIP8b（241から602）のin vitroでの親和性を特徴付けるには、FOを構築しますRAフルオレセインイソチオシアネート（FITC）HCN1（HCN1 FITC）のC末端尾部に対応する11アミノ酸ペプチドをタグ付き。 TRIP8b-HCN複合体15の結晶構造に基づいて、この11アミノ酸セグメントはTRIP8b（241から602）との結合生成するのに十分です。ステップ2において、相互作用のK dは 、HCN1 FITCの一定濃度にTRIP8b（241から602）を滴定することによって測定されます。ステップ3では、ステップ2で使用したHCNペプチドの非標識バージョンは、FITCタグが結合を妨害するかどうかを調べるために、両方のTRIP8b（241から602）とHCN1 FITCの一定濃度に滴定します。これらの実験は、ハイスループットスクリーニングに使用TRIP8b（241から602）とHCN1 FITCの適切な濃度を選択するには不可欠です。 ハイスループットスクリーニングの前提はTRIP8b（241から602）とHCN1 FITCとの間の相互作用を破壊することができる小分子が12月に生産することです偏光でrease。ステップ4において、アッセイのZ因子は、アッセイは、ハイスループットスクリーニング（ステップ5）のために適切であることを保証するためにTRIP8b（241から602）とHCN1 FITCの所与の濃度について21を算出します。ステップ6および7は、一次ハイスループットスクリーニングで同定されたヒットはTRIP8b（241から602）とHCN1 FITCの間ではなく非特異的な機構を介して相互作用を破壊することにより作用していることを確認する検証アッセイです。ステップ6において、カルボキシ（TAMRA）は（HCN1 TAMRA）HCN1ペプチドを標識FITCタグを用いてFPアッセイを損なう蛍光化合物をフィルタリングするためにそうでなければ同一の蛍光偏光アッセイで使用されています。ステップ7は、より大きなHCN1 C末端断片（HCN1 C40）を利用し、タンパク質相互作用によって相互に近づけたアクセプタービーズへのドナービーズから一重項酸素の「トンネル」に基づいているビーズに基づく近接アッセイを採用します22。

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Ni-NTA agarose&#160;</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>30210</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dialysis cassette&#160;</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>66456</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Isopropyl b-D-1-thiogalactopyranoside&#160;</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>I5502-1G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>384 Well Black plate&#160;</td>
			<td>Corning</td>
			<td>3820</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Proxiplate&#160;</td>
			<td>Perkin-Elmer&#160;</td>
			<td>6008289</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-GST Acceptor beads&#160;</td>
			<td>Perkin-Elmer&#160;</td>
			<td>6760603C</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NiChelate</td>
			<td>Perkin-Elmer&#160;</td>
			<td>AS101D</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pGS21-a</td>
			<td>Genscript</td>
			<td>SD0121</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PMSF</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>10837091001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Coomassie Kit</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>23200</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Protein concentrator</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>88527</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Perkin Elmer Enspire Multimode Plate reader</td>
			<td>Perkin-Elmer&#160;</td>
			<td>#2300-001M</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BL21 (DE3) Competent Cells</td>
			<td>Agilent</td>
			<td>200131</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

method for identifying small molecule inhibitors of the protein-protein interaction between hcn1 and trip8b

過分極活性化環状ヌクレオチド依存性（HCN）チャネルは、それらが神経細胞の興奮性を調節するように機能脳全体に遍在的に発現されています。海馬領域CA1の錐体神経細胞におけるこれらのチャネルの細胞内分布は、テトラトリコペプチドリピート含有Rab8b相互作用タンパク質（TRIP8b）、補助サブユニットによって制御されています。 HCNの遺伝子ノックアウトは、両方がHCNチャネルの機能を制限することが大うつ病性障害（MDD）の治療薬として有用であり得ることを示唆し、抗うつ様行動の増加につながる、形成サブユニットまたはTRIP8b細孔。有意な治療上の関心にもかかわらず、HCNチャンネルはまた、リズムを調節する心臓において発現されます。心臓HCNチャネルを遮断することに関連したオフターゲットの問題を回避するために、私たちの研究室は最近、特に脳内のHCNチャネルの機能を破壊するために、HCNとTRIP8b間のタンパク質 - タンパク質相互作用を標的と提案しています。ここでの焦点はTRIP8bのテトラトリコペプチド反復（TPR）ドメインおよびHCN1のC末端尾部との間の相互作用にあるもののTRIP8bは、二つの異なる相互作用部位でのサブユニットを形成するHCN孔に結合します。このプロトコルでは、TRIP8bを精製し、HCNとTRIP8bとの間の相互作用の小分子阻害剤を同定するためのハイスループットスクリーニングを実行するための方法の拡大説明は、記載されています。ハイスループットスクリーニングのための方法は、蛍光偏光（FP）は、HCN1 C末端尾部に対応するフルオロフォアタグ11アミノ酸ペプチドに大きなTRIP8bフラグメントの結合をモニターするためのアッセイをベース利用します。この方法は可能に「ヒット」化合物は、放射された光の偏光の変化に基づいて同定することができます。検証アッセイは、その後、「ヒット」化合物は、人為的でないことを確認するために行われています。

私たちの以前の出版物に著作権の問題を回避するには、TAMRAタグ付きプローブHCN1 TAMRAは、 図2と図 3を生成するために使用されました。この置換は、結果にかなりの違いを行っていないことに注意してください、とプロトコルがHCN1 FITCして上に概説したものと同一です。 HCN1 TAMRA、TRIP8b（241から602）との相?...

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Method for Identifying Small Molecule Inhibitors of the Protein-protein Interaction Between HCN1 and TRIP8b

HCNチャネルとそれらの補助サブユニット間の相互作用は、大うつ病性障害における治療標的として同定されています。ここで、このタンパク質 - タンパク質相互作用の小分子阻害剤を同定するための蛍光偏光ベースの方法が提供されます。

HCN1とTRIP8bの間のタンパク質 - タンパク質相互作用の小分子阻害剤を同定するための方法

Hyperpolarization-activated cyclic nucleotide-gated (HCN) channels are expressed ubiquitously throughout the brain, where they function to regulate the ...

Research

JoVE Journal

Biochemistry

Using Scaffold Liposomes to Reconstitute Lipid-proximal Protein-protein Interactions In Vitro

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足場リポソームを使用することにより、脂質近位タンパク質 - タンパク質相互作用を再構成します<em&gt;インビトロ</em

Studies of integral membrane proteins in vitro are frequently complicated by the presence of a hydrophobic transmembrane domain. Further complicating ...

Visualization of Protein-protein Interaction in Nuclear and Cytoplasmic Fractions by Co-immunoprecipitation and In Situ Proximity Ligation Assay

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共免疫沈降により核および細胞質画分中のタンパク質間相互作用の可視化と<em&gt;その場で</em&gt;近接ライゲーションアッセイ

Protein-protein interactions are involved in thousands of cellular processes and occur in distinct spatial context. Traditionally, co-immunoprecipitation ...

Capturing the Interaction Kinetics of an Ion Channel Protein with Small Molecules by the Bio-layer Interferometry Assay

バイオ層干渉法による小分子とイオン チャネル蛋白質の相互作用の動力学をキャプチャ

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Titration ELISA as a Method to Determine the Dissociation Constant of Receptor Ligand Interaction

受容体リガンドの相互作用の解離定数の決定法として elisa 法の滴定

The dissociation constant describes the interaction between two partners in the binding equilibrium and is a measure of their affinity. It is a crucial ...

Covalent Immobilization of Proteins for the Single Molecule Force Spectroscopy

力の単一分子分光法のための蛋白質の共有結合固定

In recent years, atomic force microscopy (AFM) based single molecule force spectroscopy (SMFS) extended our understanding of molecular properties and ...

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A Semi-High-Throughput Adaptation of the NADH-Coupled ATPase Assay for Screening Small Molecule Inhibitors

低分子阻害剤スクリーニングのためのNADH結合ATPaseアッセイの半高スループット適応

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Native Cell Membrane Nanoparticles System for Membrane Protein-Protein Interaction Analysis

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Identifying the Binding Proteins of Small Ligands with the Differential Radial Capillary Action of Ligand Assay (DRaCALA)

Identifying the Binding Proteins of Small Ligands with the Differential Radial Capillary Action of Ligand Assay DRaCALA

リガンドアッセイの微小径毛管作用による小リガンドの結合タンパク質の同定(DRaCALA)

The past decade has seen tremendous progress in the understanding of small signaling molecules in bacterial physiology. In particular, the target proteins ...

A High-Throughput Enzyme-Coupled Activity Assay to Probe Small Molecule Interaction with the dNTPase SAMHD1

Sterile alpha motif and HD domain-containing protein 1 (SAMHD1) is a pivotal regulator of intracellular deoxynucleoside triphosphate (dNTP) pools, as this ...