Name: method for identifying small molecule inhibitors of the protein-protein interaction between hcn1 and trip8b
Uploaded: 2016-11-11T14:00:00
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This work was supported by National Institutes of Health Grant R21MH104471 and R01MH106511 (D.M.C.), Brain Research Foundation SG 2012-01 (D.M.C.), Northwestern University Clinical and Translational Sciences Institute 8UL1TR000150 (Y.H.), Chicago Biomedical Consortium HTS-004 (Y.H. and D.M.C.), and National Institutes of Health Grant 2T32MH067564 (K.L.). A part of this work was performed by the Northwestern University Medicinal and Synthetic Chemistry Core (ChemCore) at the Center for Molecular Innovation and Drug Discovery (CMIDD), which is funded by the Chicago Biomedical Consortium with support from the Searle Funds at the Chicago Community Trust and Cancer Center Support Grant P30 CA060553 from the National Cancer Institute awarded to the Robert H. Lurie Comprehensive Cancer Center. The high throughput screen work was performed in the High Throughput Analysis Laboratory which is also a core facility of the Robert H. Lurie Comprehensive Cancer Center.

TRIP8b (241-602) 단백질의 정제 (1) <ol><li> 관할 E.으로 박테리아 단백질 발현 벡터 pGS21 3 (241-602) TRIP8b를 포함하는 플라스미드를 변형 대장균 제조업체의 지침에 따라 단백질 발현합니다. 플레이트 루리아 국물 (LB)의 문화 300 μL는 클로람페니콜과 암피실린의 5 ㎍ / ㎖로 -agar. 16 시간 동안 37 ° C에서 접시를 품어. </li><li> 다음 날, 하나의 식민지가 클로람페니콜과 암피실린의 50 μg...

<ol>
	<li>Biel, M., Wahl-Schott, C., Michalakis, S., Zong, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hyperpolarization-activated+cation+channels:+from+genes+to+function.">Hyperpolarization-activated cation channels: from genes to function.</a> Physiol Rev. 89 (3), 847-885 (2009).</li><li>Shah, M. 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때문에 MDD 24 치료 목표로서의 잠재력 중추 신경계 4 HCN 채널 기능을 길항 약물 학적 접근법에 상당한 관심이 있었다. 그러나, 이러한 노력들은 심장 박동 심장에서 HCN 채널의 중요한 역할 및 부정맥 (25)의 위험으로 정체되어왔다. 우리는 HCN과 뇌 특정 보조 단위체 TRIP8b (8) 사이의 상호 작용을 방해하는 것은 심장 HCN 채널 (3)에 영향을주지 않고 항우울제와 ?...

과분극 활성화 환상 뉴클레오티드 게이팅 (HCN) 채널은 막 흥분성을 조절하는 하나의 중요한 역할을하는 중심부 및 중추 신경계에 발현된다. HCN 채널 HCN 채널 약리 기능을 제한하는 MDD 3의 신규 한 치료에 효과적 일 수 있음을 제시하는 여러 그룹을 이끌었다 주요 우울 장애 (MDD) 2의 병인에 연루되어있다. 그러나 직접 HCN 채널을 대상 이유로 인해 심장 활동 전위 (4)에서의 중요한 역할의 생존이 아니다. Ivabradine 유일한 FDA는 HCN 채널 길항제를 승인하는 서맥 효과 (5)를 생성하는 심부전의 치료에 사용된다. 따라서, 중추 신경계에서 독점적 HCN 채널 기능을 제한 약리학 적 제제에 대한 필요성이 존재한다. 반복 함유 Tetratricopeptide Rab8b 상호 작용하는 단백질 (TRIP8b하면) 뇌 정시이다HCN 채널 6,7의 표면 발현 및 현지화를 제어 HCN 채널 FIC 보조 서브 유닛. TRIP8b의 유전자 녹아웃 심장 8 HCN의 발현에 영향을주지 않고 뇌 HCN 채널 (7)의 감소를 야기한다. 흥미롭게도, TRIP8b 녹아웃 마우스는 강제 수영 작업과 꼬리 정지 작업 (7), 항우울제 효능 9-11 두 가지 일반적으로 사용되는 선별 검사에 적은 시간 움직이지를 보냅니다. 이 결과는 직접적으로, HCN 채널 함수의 소분자 길항제 HCN 채널 타겟팅 항우울제처럼 행동을 생성하기에 충분할 수있다 TRIP8b HCN과의 상호 작용을 방해 아닌 것을 제안한다. TRIP8b은 두 가지 결합 부위에서 HCN에 결합한다. HCN의주기적인 염기 결합 도메인 (CNBD)는 TRIP8b 12, 13의 TPR 도메인에 TRIP8b있는 N 단말기의 보존 도메인과 상호 작용한다. 이에 관련된 CNBD의 잔류 있지만상호 작용 (14)에 매핑되고, 참여 TRIP8b의 영역은 80 아미노산의 단편을 13 이상으로 좁혀되지 않았다. 두 번째 상호 작용은 TRIP8b의 tetratricopeptide 반복 (TPR) 도메인과 HCN의 C 터미널 트리 펩티드 (HCN1, HCN2 및 HCN4에서 &#39;SNL&#39;,하지만 HCN3에서 &#39;ANM&#39;) 3,12 사이에 발생합니다. 이 C 꼬리 상호 작용의 최근 해결 결정 구조 (15)는도 5 (PEX5) peroxin, 퍼 옥시 솜 오기 수용체 간의 상호 작용과 실질적 구조적 유사성을 계시하고, 그 제 1 형 퍼 옥시 표적 서열 (PTS1) (16)를 포함하는, 파트너 상호 작용. 모두 작용 부위가 HCN 채널 기능이 필요하지만, TRIP8b의 TPR 도메인과 HCN1의 C 단자 트리 펩티드 사이의 상호 작용이 지배적 결합 부위로서 작용하고 HCN 표면 발현을 조절한다. 따라서, 이러한 상호 작용은이 연구에서 타겟팅 사이트로 선택되었다.기준이 TRIP8b HCN과의 상호 작용으로 이루어진다 원고의 나머지를 들어, 언급되는 이러한 상호 작용이다. 이 상호 작용은 그 함유 보존 C 단자 HCN의 C 말단 꼬리 (잔기 TRIP8b의 1A-4의 이성체 241-602)을 3 결합에 필요한 도메인 TPR 대응 TRIP8b 고도로 가용성 단편에 의해 효과적으로 요약된다. 이 상호 작용을 방해 할 수있는 작은 분자를 식별하는 높은 처리량 스크린을 개발하기 위해서는, 형광 편광 (FP)의 분석법을 사용 하였다 (17) 기반. 형광 편광은 편광 방출 된 형광 (18)의 편광도를 측정 형광 표지 된 리간드의 자극에 기초한다. 결합 파트너의 존재 하에서 형광성 리간드의 회전 운동이 제한되며, 편광 (19) 방출된다. 결합 파트너 t가없는그 리간드의 회전 운동은 탈 편광의 발광을 이끈다. 동봉 프로토콜 니켈 니트릴 로트리 아세트산의 니켈 (Ni-NTA) 비드를 사용하여 N 말단 태그 (6xHis) TRIP8b의 정제 (241-602)을위한 방법이 제시된다. 유사한 프로토콜은 프로토콜의 단계 7에서 사용한 글루타치온 S 트랜스퍼 라제 (GST) -tagged HCN1 C 말단 40 개 아미노산 (HCN1 용 C40)를 정제하기 위해 이용 하였다. 공간 고려 사항, 그 절차의 상세한 설명은 생략 하였다. 프로토콜의 7을 통해 2 단계에서, 높은 처리량 검사 작업 흐름 (그림 1 참조) 제공됩니다. 단백질 - 단백질 상호 작용은 높은 처리량 검사에 대한 악명 어려운 목표이며, 독자들은 주제 (20)에 대한 추가 리소스를 추구하는 것이 좋습니다. 2 단계 및 절차의 3 fo를 구축 정제 TRIP8b (241-602)의 체외 친 화성을 특징RA의 형광 이소 티오 시아 네이트 (FITC)의 HCN1 (HCN1 FITC)의 C 말단 테일에 대응 열한 아미노산 펩티드 -tagged. TRIP8b HCN-15 복합체의 결정 구조에 따라이 열한 아미노산 TRIP8b 세그먼트 (241-602)과 결합 생성하기에 충분하다. 2 단계에서, 상호 작용의 K D를 HCN1 FITC의 고정 농도로 (241-602) TRIP8b 적정에 의해 측정된다. 3 단계에서 2 단계에서 사용되는 HCN 펩타이드의 레이블이없는 버전은 FITC 태그가 결합 방해하는 경우 검사 모두 TRIP8b (241-602) 및 HCN1 FITC의 고정 농도로 적정한다. 이러한 실험은 높은 처리량 스크린에 사용 TRIP8b (241-602) 및 HCN1 FITC의 적절한 농도를 선택하는 필수적이다. 높은 처리량 스크린의 전제된다는 십이 생산할 예정 TRIP8b (241-602) 및 HCN1 FITC 사이의 상호 작용을 방해 할 수있는 소분자편광에 rease. 단계 4에서, 분석의 Z 계수 분석은 높은 처리량의 스크리닝 (단계 5)에 적합하도록 TRIP8b (241-602) 및 HCN1 FITC의 소정 농도 (21)를 산출한다. 6, 7 차 높은 처리량 화면에서 식별 된 안타 TRIP8b (241-602) 및 HCN1 FITC 사이가 아닌 비특이적 인 메커니즘을 통해 상호 작용을 방해하여 행동하는 것을 확인하는 검증 분석입니다 단계. 단계 6에서, carboxytetramethylrhodamine (TAMRA)의 HCN1 펩티드 (HCN1 TAMRA)를 FITC 태그를 사용하여 FP 분석법을 손상 형광 화합물 필터링 달리 동일한 형광 편광 검정에 사용되는 표지 된이. 단계 7 큰 HCN1 C 말단 단편 (HCN1 C40)를 이용한 단백질 상호 작용에 의해 서로 가까워 셉터 비드 도너 비드로부터 일 중항 산소의 &quot;터널링&quot;에 기초 비드 기반 근접 분석을 사용 (22).

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Ni-NTA agarose&#160;</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>30210</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dialysis cassette&#160;</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>66456</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Isopropyl b-D-1-thiogalactopyranoside&#160;</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>I5502-1G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>384 Well Black plate&#160;</td>
			<td>Corning</td>
			<td>3820</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Proxiplate&#160;</td>
			<td>Perkin-Elmer&#160;</td>
			<td>6008289</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-GST Acceptor beads&#160;</td>
			<td>Perkin-Elmer&#160;</td>
			<td>6760603C</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NiChelate</td>
			<td>Perkin-Elmer&#160;</td>
			<td>AS101D</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pGS21-a</td>
			<td>Genscript</td>
			<td>SD0121</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PMSF</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>10837091001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Coomassie Kit</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>23200</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Protein concentrator</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>88527</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Perkin Elmer Enspire Multimode Plate reader</td>
			<td>Perkin-Elmer&#160;</td>
			<td>#2300-001M</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BL21 (DE3) Competent Cells</td>
			<td>Agilent</td>
			<td>200131</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

method for identifying small molecule inhibitors of the protein-protein interaction between hcn1 and trip8b

과분극 활성화 주기적 뉴클레오티드 - 게이트 (HCN) 채널들이 신경 세포의 흥분성을 조절하는 기능을 뇌 전체에 보편적으로 표현된다. 해마 영역 CA1의 피라미드 뉴런이 채널의 세포 내 분포는 tetratricopeptide 반복 함유 Rab8b 상호 작용하는 단백질 (TRIP8b), 보조 서브 유닛에 의해 조절된다. HCN의 유전자 녹아웃은 HCN 채널의 기능을 제한하는 주요 우울 장애 (MDD)에 대한 치료로서 유용 할 수 있음을 시사 서브 유닛 또는 TRIP8b, 항우울제 같은 행동의 증가에 모두 리드 기공 형성. 중요한 치료 적 관심에도 불구하고, HCN 채널은 또한 그들이의 리듬을 조절 중심부에 표현된다. 심장 HCN 채널 차단과 관련된 오프 대상 문제를 회피하기 위해, 본 연구실은 최근 특히 뇌 HCN 채널 기능을 방해하기 위하여 HCN과 TRIP8b 사이의 단백질 - 단백질 상호 작용을 표적으로 제안 하였다.여기에 초점이 TRIP8b의 tetratricopeptide 반복 (TPR) 도메인 및 HCN1의 C 터미널 꼬리 사이의 상호 작용에 있지만 TRIP8b는 두 가지 상호 작용 사이트의 서브 유닛을 형성 HCN의 기공에 결합한다. 이 프로토콜 TRIP8b 정제 및 HCN과 TRIP8b 사이의 상호 작용의 소분자 억제제를 식별하는 높은 처리량 스크린을 실행하는 방법의 확장의 설명에서 설명한다. 높은 처리량의 선별 방법은 형광 편광 (FP)는 HCN1 C 말단 테일에 상응하는 산 펩티드 아미노 ㄱ 형광 표지 된 11 개의 큰 TRIP8b 단편의 결합을 모니터링하는 분석 기반 이용한다. 이 방법은 수 &#39;히트&#39;화합물은 출사 광의 편광 변화에 기초하여 식별된다. 유효성 검사 분석은 다음 화합물을 인공적 아닌 &#39;히트&#39;있는지 확인하기 위해 수행된다.

이전 출판과 저작권 문제를 방지하기 위해, TAMRA 태그가 프로브 HCN1 TAMRA는 그림 2와 3을 생성하는 데 사용되었다. 이 대체가 결과에 상당한 차이를하지 않았 음을 참고하고, 프로토콜 HCN1 FITC와 위에서 설명한 것과 동일하다. HCN1 TAMRA, TRIP8b (241-602)과의 상호 작용을 평가하기 위해 2 단계 (그림 2)에 설명 된 프로?...

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Method for Identifying Small Molecule Inhibitors of the Protein-protein Interaction Between HCN1 and TRIP8b

HCN 채널과 보조 서브 유닛 사이의 상호 작용은 주요 우울 장애의 치료 대상으로 확인되었습니다. 여기서,이 단백질 - 단백질 상호 작용의 소분자 억제제를 식별하기위한 형광 편광 - 기반 방법이 제공된다.

방법 및 HCN1 TRIP8b 간의 단백질 - 단백질 상호 작용의 작은 분자 억제제 식별

Hyperpolarization-activated cyclic nucleotide-gated (HCN) channels are expressed ubiquitously throughout the brain, where they function to regulate the ...

Research

JoVE Journal

Biochemistry

Using Scaffold Liposomes to Reconstitute Lipid-proximal Protein-protein Interactions In Vitro

Using Scaffold Liposomes to Reconstitute Lipid-proximal Protein-protein Interactions In Vitro

비계 리포좀을 사용하여 근위 지질 단백질 - 단백질 상호 작용을 재구성<em&gt; 체외</em

Studies of integral membrane proteins in vitro are frequently complicated by the presence of a hydrophobic transmembrane domain. Further complicating ...

연구

생화학

Visualization of Protein-protein Interaction in Nuclear and Cytoplasmic Fractions by Co-immunoprecipitation and In Situ Proximity Ligation Assay

Visualization of Protein-protein Interaction in Nuclear and Cytoplasmic Fractions by Co-immunoprecipitation and In Situ Proximity Ligation Assay

공동 면역 침전에 의한 핵 및 세포질 분수에서 단백질 - 단백질 상호 작용의 시각화 및<em&gt; 현장에서</em&gt; 근접 내고 분석

Protein-protein interactions are involved in thousands of cellular processes and occur in distinct spatial context. Traditionally, co-immunoprecipitation ...

Capturing the Interaction Kinetics of an Ion Channel Protein with Small Molecules by the Bio-layer Interferometry Assay

바이오-레이어 간섭계 분석 결과 의해 작은 분자와 이온 채널 단백질의 상호 작용 활동을 캡처

The bio-layer interferometry (BLI) assay is a valuable tool for measuring protein-protein and protein-small molecule interactions. Here, we first describe ...

Titration ELISA as a Method to Determine the Dissociation Constant of Receptor Ligand Interaction

적정 수용 체 Ligand 상호 작용의 분리 상수를 결정 하는 방법으로 ELISA

The dissociation constant describes the interaction between two partners in the binding equilibrium and is a measure of their affinity. It is a crucial ...

Covalent Immobilization of Proteins for the Single Molecule Force Spectroscopy

단일 분자 힘 분광학에 대 한 단백질의 화학식 동원 정지

In recent years, atomic force microscopy (AFM) based single molecule force spectroscopy (SMFS) extended our understanding of molecular properties and ...

Proteome-wide Quantification of Labeling Homogeneity at the Single Molecule Level

단일 분자 수준에서 동질성을 라벨의 프로테옴 와이드 정량화

Cell proteomes are often characterized using electrophoresis assays, where all species of proteins in the cells are non-specifically labeled with a ...

A Semi-High-Throughput Adaptation of the NADH-Coupled ATPase Assay for Screening Small Molecule Inhibitors

소분자 억제제 스크리닝을 위한 NADH 결합 ATPase 분석의 반 높은 처리량 적응

ATPase enzymes utilize the free energy stored in adenosine triphosphate to catalyze a wide variety of endergonic biochemical processes in vivo that would ...

Native Cell Membrane Nanoparticles System for Membrane Protein-Protein Interaction Analysis

멤브레인 단백질-단백질 상호 작용 분석을 위한 기본 세포막 나노입자 시스템

Protein-protein interactions in cell membrane systems play crucial roles in a wide range of biological processes- from cell-to-cell interactions to signal ...

Identifying the Binding Proteins of Small Ligands with the Differential Radial Capillary Action of Ligand Assay (DRaCALA)

Identifying the Binding Proteins of Small Ligands with the Differential Radial Capillary Action of Ligand Assay DRaCALA

리간드 분석의 차동 방사형 모세관 작용으로 작은 리간드의 결합 단백질 식별 (DRaCALA)

The past decade has seen tremendous progress in the understanding of small signaling molecules in bacterial physiology. In particular, the target proteins ...

A High-Throughput Enzyme-Coupled Activity Assay to Probe Small Molecule Interaction with the dNTPase SAMHD1

Sterile alpha motif and HD domain-containing protein 1 (SAMHD1) is a pivotal regulator of intracellular deoxynucleoside triphosphate (dNTP) pools, as this ...