Name: method for identifying small molecule inhibitors of the protein-protein interaction between hcn1 and trip8b
Uploaded: 2016-11-11T14:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Method for Identifying Small Molecule Inhibitors of the Protein-protein Interaction Between HCN1 and TRIP8b at JoVE.com

This work was supported by National Institutes of Health Grant R21MH104471 and R01MH106511 (D.M.C.), Brain Research Foundation SG 2012-01 (D.M.C.), Northwestern University Clinical and Translational Sciences Institute 8UL1TR000150 (Y.H.), Chicago Biomedical Consortium HTS-004 (Y.H. and D.M.C.), and National Institutes of Health Grant 2T32MH067564 (K.L.). A part of this work was performed by the Northwestern University Medicinal and Synthetic Chemistry Core (ChemCore) at the Center for Molecular Innovation and Drug Discovery (CMIDD), which is funded by the Chicago Biomedical Consortium with support from the Searle Funds at the Chicago Community Trust and Cancer Center Support Grant P30 CA060553 from the National Cancer Institute awarded to the Robert H. Lurie Comprehensive Cancer Center. The high throughput screen work was performed in the High Throughput Analysis Laboratory which is also a core facility of the Robert H. Lurie Comprehensive Cancer Center.

1. Очистка TRIP8b (241-602) белка <ol><li> Transform плазмиду , содержащую TRIP8b (241-602) в бактериальной экспрессии белка вектора pGS21 3 в компетентные E. палочки для экспрессии белка в соответствии с инструкциями изготовителя. Пластина 300 мкл культуры на Лурии Broth (LB) -agar с добавлением 5 мкг / мл хлор?...

<ol>
	<li>Biel, M., Wahl-Schott, C., Michalakis, S., Zong, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hyperpolarization-activated+cation+channels:+from+genes+to+function.">Hyperpolarization-activated cation channels: from genes to function.</a> Physiol Rev. 89 (3), 847-885 (2009).</li><li>Shah, M. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=HCN1+channels:+a+new+therapeutic+target+for+depressive+disorders?.">HCN1 channels: a new therapeutic target for depressive disorders?.</a> Sci Signal. 5 (244), pe44 (2012).</li><li>Han, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+of+Small-Molecule+Inhibitors+of+Hyperpolarization-Activated+Cyclic+Nucleotide-Gated+Channels.">Identification of Small-Molecule Inhibitors of Hyperpolarization-Activated Cyclic Nucleotide-Gated Channels.</a> J Biomol Screen. 20 (9), 1124-1131 (2015).</li><li>Postea, O., Biel, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Exploring+HCN+channels+as+novel+drug+targets.">Exploring HCN channels as novel drug targets.</a> Nat Rev Drug Discov. 10 (12), (2011).</li><li>Stieber, J., Wieland, K., St&#246;ckl, G., Ludwig, A., Hofmann, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bradycardic+and+proarrhythmic+properties+of+sinus+node+inhibitors.">Bradycardic and proarrhythmic properties of sinus node inhibitors.</a> Mol Pharmacol. 69 (4), 1328-1337 (2006).</li><li>Santoro, B., Wainger, B. J., Siegelbaum, S. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regulation+of+HCN+channel+surface+expression+by+a+novel+C-terminal+protein-protein+interaction.">Regulation of HCN channel surface expression by a novel C-terminal protein-protein interaction.</a> J Neurosci. 24 (47), 10750-10762 (2004).</li><li>Lewis, A. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Deletion+of+the+hyperpolarization-activated+cyclic+nucleotide-gated+channel+auxiliary+subunit+TRIP8b+impairs+hippocampal+Ih+localization+and+function+and+promotes+antidepressant+behavior+in+mice.">Deletion of the hyperpolarization-activated cyclic nucleotide-gated channel auxiliary subunit TRIP8b impairs hippocampal Ih localization and function and promotes antidepressant behavior in mice.</a> J Neurosci. 31 (20), 7424-7440 (2011).</li><li>Heuermann, R. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reduction+of+thalamic+and+cortical+Ih+by+deletion+of+TRIP8b+produces+a+mouse+model+of+human+absence+epilepsy.">Reduction of thalamic and cortical Ih by deletion of TRIP8b produces a mouse model of human absence epilepsy.</a> Neurobiol Dis. 85, 81-92 (2016).</li><li>Steru, L., Chermat, R., Thierry, B., Simon, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+tail+suspension+test:+A+new+method+for+screening+antidepressants+in+mice.">The tail suspension test: A new method for screening antidepressants in mice.</a> Psychopharmacology. 85 (3), 367-370 (1985).</li><li>Petit-Demouliere, B., Chenu, F., Bourin, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Forced+swimming+test+in+mice:+a+review+of+antidepressant+activity.">Forced swimming test in mice: a review of antidepressant activity.</a> Psychopharmacology. 177 (3), 245-255 (2004).</li><li>Cryan, J. F., Mombereau, C., Vassout, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+tail+suspension+test+as+a+model+for+assessing+antidepressant+activity:+Review+of+pharmacological+and+genetic+studies+in+mice.">The tail suspension test as a model for assessing antidepressant activity: Review of pharmacological and genetic studies in mice.</a> Neurosci Biobehav Rev. 29 (4-5), 571-625 (2005).</li><li>Han, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Trafficking+and+gating+of+hyperpolarization-activated+cyclic+nucleotide-gated+channels+are+regulated+by+interaction+with+tetratricopeptide+repeat-containing+Rab8b-interacting+protein+(TRIP8b)+and+cyclic+AMP+at+distinct+sites.">Trafficking and gating of hyperpolarization-activated cyclic nucleotide-gated channels are regulated by interaction with tetratricopeptide repeat-containing Rab8b-interacting protein (TRIP8b) and cyclic AMP at distinct sites.</a> J Biol Chem. 286 (23), 20823-20834 (2011).</li><li>Hu, L., Santoro, B., Saponaro, A., Liu, H., Moroni, A., Siegelbaum, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Binding+of+the+auxiliary+subunit+TRIP8b+to+HCN+channels+shifts+the+mode+of+action+of+cAMP.">Binding of the auxiliary subunit TRIP8b to HCN channels shifts the mode of action of cAMP.</a> J Gen Physiol. 142 (6), 599-612 (2013).</li><li>Saponaro, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structural+basis+for+the+mutual+antagonism+of+cAMP+and+TRIP8b+in+regulating+HCN+channel+function.">Structural basis for the mutual antagonism of cAMP and TRIP8b in regulating HCN channel function.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 111 (40), 14577-14582 (2014).</li><li>Bankston, J. R., Camp, S. S., DiMaio, F., Lewis, A. S., Chetkovich, D. M., Zagotta, W. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structure+and+stoichiometry+of+an+accessory+subunit+TRIP8b+interaction+with+hyperpolarization-activated+cyclic+nucleotide-gated+channels.">Structure and stoichiometry of an accessory subunit TRIP8b interaction with hyperpolarization-activated cyclic nucleotide-gated channels.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 109 (20), 7899-7904 (2012).</li><li>Gatto, G. J., Geisbrecht, B. V., Gould, S. J., Berg, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Peroxisomal+targeting+signal-1+recognition+by+the+TPR+domains+of+human+PEX5.">Peroxisomal targeting signal-1 recognition by the TPR domains of human PEX5.</a> Nat Struct Biol. 7 (12), 1091-1095 (2000).</li><li>Owicki, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fluorescence+polarization+and+anisotropy+in+high+throughput+screening:+perspectives+and+primer.">Fluorescence polarization and anisotropy in high throughput screening: perspectives and primer.</a> J Biomol Screen. 5 (5), 297-306 (2000).</li><li>Smith, D. S., Eremin, S. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fluorescence+polarization+immunoassays+and+related+methods+for+simple,+high-throughput+screening+of+small+molecules.">Fluorescence polarization immunoassays and related methods for simple, high-throughput screening of small molecules.</a> Anal Bioanal Chem. 391 (5), 1499-1507 (2008).</li><li>Roehrl, M. H. A., Wang, J. Y., Wagner, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+general+framework+for+development+and+data+analysis+of+competitive+high-throughput+screens+for+small-molecule+inhibitors+of+protein-protein+interactions+by+fluorescence+polarization.">A general framework for development and data analysis of competitive high-throughput screens for small-molecule inhibitors of protein-protein interactions by fluorescence polarization.</a> Biochemistry. 43 (51), 16056-16066 (2004).</li><li>Arkin, M. R., Wells, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Small-molecule+inhibitors+of+protein-protein+interactions:+progressing+towards+the+dream.">Small-molecule inhibitors of protein-protein interactions: progressing towards the dream.</a> Nat Rev Drug Discov. 3 (4), 301-317 (2004).</li><li>Zhang, J., Chung, T., Oldenburg, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+Simple+Statistical+Parameter+for+Use+in+Evaluation+and+Validation+of+High+Throughput+Screening+Assays.">A Simple Statistical Parameter for Use in Evaluation and Validation of High Throughput Screening Assays.</a> J Biomol Screen. 4 (2), 67-73 (1999).</li><li>Eglen, R. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+use+of+AlphaScreen+technology+in+HTS:+current+status.">The use of AlphaScreen technology in HTS: current status.</a> Curr Cheml Genomics. 1 (1), 2-10 (2008).</li><li>Lehninger, A. L., Nelson, D. L., Cox, M. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Lehninger Principles of Biochemistry. , (2000).</li><li>Kim, C. S., Chang, P. Y., Johnston, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Enhancement+of+dorsal+hippocampal+activity+by+knockdown+of+HCN1+channels+leads+to+anxiolytic-+and+antidepressant-like+behaviors.">Enhancement of dorsal hippocampal activity by knockdown of HCN1 channels leads to anxiolytic- and antidepressant-like behaviors.</a> Neuron. 75 (3), 503-516 (2012).</li><li>Wahl-Schott, C., Biel, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=HCN+channels:+structure,+cellular+regulation+and+physiological+function.">HCN channels: structure, cellular regulation and physiological function.</a> Cell Mol Life Sci. 66 (3), 470-494 (2009).</li><li>DeBerg, H. A., Bankston, J. R., Rosenbaum, J. C., Brzovic, P. S., Zagotta, W. N., Stoll, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structural+Mechanism+for+the+Regulation+of+HCN+Ion+Channels+by+the+Accessory+Protein+TRIP8b.">Structural Mechanism for the Regulation of HCN Ion Channels by the Accessory Protein TRIP8b.</a> Structure. 23 (4), 734-744 (2015).</li><li>Weiss, J. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Hill+equation+revisited:+uses+and+misuses.">The Hill equation revisited: uses and misuses.</a> FASEB J. 11 (11), 835-841 (1997).</li><li>Prinz, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hill+coefficients,+dose-response+curves+and+allosteric+mechanisms.">Hill coefficients, dose-response curves and allosteric mechanisms.</a> J Chem Biol. 3 (1), 37-44 (2009).</li><li>Pollard, T. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+Guide+to+Simple+and+Informative+Binding+Assays.">A Guide to Simple and Informative Binding Assays.</a> Mol Biol Cell. 21 (23), 4061-4067 (2010).</li><li>Rossi, A. M., Taylor, C. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Analysis+of+protein-ligand+interactions+by+fluorescence+polarization.">Analysis of protein-ligand interactions by fluorescence polarization.</a> Nat Protoc. 6 (3), (2011).</li><li>Ryan, A. J., Gray, N. M., Lowe, P. N., Chung, C. -. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effect+of+Detergent+on+"Promiscuous"+Inhibitors.">Effect of Detergent on "Promiscuous" Inhibitors.</a> J Med Chem. 46 (16), 3448-3451 (2003).</li><li>McGovern, S. L., Caselli, E., Grigorieff, N., Shoichet, B. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+common+mechanism+underlying+promiscuous+inhibitors+from+virtual+and+high-throughput+screening.">A common mechanism underlying promiscuous inhibitors from virtual and high-throughput screening.</a> J Med Chem. 45 (8), 1712-1722 (2002).</li><li>Hertzberg, R. P., Pope, A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-throughput+screening:+new+technology+for+the+21st+century.">High-throughput screening: new technology for the 21st century.</a> Curr Opin Chem Biol. 4 (4), 445-451 (2000).</li><li>Sundberg, S. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-throughput+and+ultra-high-throughput+screening:+solution-and+cell-based+approaches.">High-throughput and ultra-high-throughput screening: solution-and cell-based approaches.</a> Curr Opin Biotechnol. 11 (1), (2000).</li></ol>

Из - за своего потенциала в качестве терапевтической мишени в MDD 24, наблюдается значительный интерес к фармакологическим подходам , которые противодействуют функции канала HCN в центральной нервной системе 4. Тем не менее, эти усилия были тормозится важной роли каналов HCN в се?...

Гиперполяризации активированный циклических нуклеотидов закрытого канала (HCN) выражаются в сердце и центральной нервной системы , где они играют важную роль в регуляции мембранной возбудимости 1. HCN каналы участвуют в патогенезе большого депрессивного расстройства (MDD) 2, что привело несколько групп , чтобы предложить , что ограничение HCN функционального канала представляет собой фармакологически может быть эффективным в качестве нового лечения MDD 3. Тем не менее, непосредственно ориентации HCN каналов не является жизнеспособным из - за их важную роль в сердечной потенциала действия 4. Ивабрадин, единственный FDA одобрил антагонист канала HCN, используется для лечения сердечной недостаточности , чтобы произвести брадикардией эффект 5. Таким образом, существует потребность в фармакологическими агентами, которые ограничивают функцию канала HCN исключительно в центральной нервной системе. Tetratricopeptide повторить содержащих Rab8b взаимодействующий белок (TRIP8b) является SPECI мозгаFIC вспомогательной субъединицей HCN каналов , которые контролирует экспрессию поверхности и локализации HCN каналов 6,7. Генетический нокаут TRIP8b приводит к уменьшению мозга HCN каналов 7 , не затрагивая экспрессию HCN в сердце 8. Интересно, что TRIP8b нокаутные мыши проводят меньше времени неподвижности на принудительного плавания задачи и хвост подвески задачи 7, два наиболее часто используемых скрининговых тестов для антидепрессивной эффективности 9-11. Эти результаты свидетельствуют о том, что вместо того, чтобы непосредственно ориентации HCN каналов с малой молекулы антагониста функции канала ГКН, нарушая взаимодействие между TRIP8b и HCN, может быть достаточным для получения антидепрессантом типа поведения. TRIP8b связывается с HCN в двух различных участков связывания. Циклический нуклеотид связывающий домен (CNBD) ГКН взаимодействует с сохраняющимся доменом TRIP8b расположенного N терминала к TPR доменов TRIP8b 12,13. Хотя остатков CNBD, которые участвуют в этомвзаимодействие были отображены 14, область TRIP8b , который вовлечен не был сужен за пределы фрагмента 13-кислоты с 80-амино. Второе взаимодействие происходит между tetratricopeptide повтора (TPR) областях TRIP8b и терминала трипептида C ГКН ( &#39;SNL&#39; в HCN1, HCN2 и HCN4, но «АОД» в HCN3) 3,12. Недавно решена кристаллическая структура 15 этого C хвоста взаимодействия выявлено существенное структурное сходство с взаимодействием между пероксисомальной рецептором импорта, peroxin 5 (PEX5), и его взаимодействие партнеров, содержащие типа 1 пероксисом таргетинга последовательности (PTS1) 16. Хотя оба сайта взаимодействия необходимы для функционального канала, HCN, взаимодействие между ТПВ доменами TRIP8b и терминалом трипептид С HCN1 служит в качестве сайта связывания доминантного и регулирует поверхностную экспрессию HCN. Таким образом, это взаимодействие было выбрано в качестве места прицеливания в данном исследовании.В течение оставшейся части рукописи, когда делается ссылка на взаимодействие между TRIP8b и HCN, то это взаимодействие, которое идет речь. Это взаимодействие с помощью воспроизводятся высоко растворимого фрагмента TRIP8b , соответствующей его законсервированной терминалу C , содержащего TPR домены , необходимые для связывания концевой хвост С HCN (остатки 241-602 1а-4 изоформ TRIP8b) 3. Для разработки высокой пропускной способности экрана , чтобы идентифицировать малые молекулы , способные нарушить это взаимодействие, поляризация флуоресценции (FP) основе анализа использовали 17. Флуоресцентная поляризация основана на возбуждении флуорофора-меченый лиганд с поляризованным светом, и измерения степени поляризации излучаемого флуоресценции 18. В присутствии связывающего партнера, вращательное движение флуоресцентного лиганда ограничена и поляризованный свет излучается 19. При отсутствии обязательного партнера, тон вращательное движение лиганда приводит к излучению деполяризованного света. В прилагаемом протоколе, способ очистки N-концевой помечаются (6xHis) TRIP8b (241-602) с использованием никель-нитрилтриуксусная кислоты (Ni-NTA) бусинки представлено. Аналогичный протокол был использован для очистки глутатион-S-трансферазы (GST) , -tagged С терминальные 40 аминокислот HCN1 (HCN1 C40) , используемый на шаге 7 протокола. Для космических соображений, подробное описание этой процедуры было опущено. На этапах 2 -й по 7 - протокола, скрининговое рабочий процесс с высокой пропускной способностью представлен (см рисунок 1). Белок-белковые взаимодействия являются крайне сложно мишенью для высокопроизводительного скрининга и читателям рекомендуется искать дополнительные ресурсы по этой теме 20. Шаги 2 и 3 процедуры характеризуют сродством в пробирке очищенного TRIP8b (241-602) построить FOра флуоресцеинизотиоцианатом (FITC) -tagged одиннадцать аминокислот пептид , соответствующий концевой хвост С HCN1 (HCN1 FITC). На основе кристаллической структуры TRIP8b-HCN комплекс 15, этот сегмент одиннадцать аминокислоты является достаточным для получения связывания с TRIP8b (241-602). На этапе 2, K d взаимодействия измеряется титрованием TRIP8b (241-602) в фиксированной концентрации HCN1 FITC. На шаге 3, непомеченная версия пептида HCN , используемого на стадии 2 титруют в фиксированной концентрации обоих TRIP8b (241-602) и HCN1 FITC изучить , если тег FITC препятствует связыванию. Эти эксперименты имеют важное значение для выбора соответствующих концентраций TRIP8b (241-602) и HCN1 FITC , используемые в высокой пропускной способности экрана. Помещение экрана с высокой пропускной способностью является то , что небольшая молекула , способная привести к нарушению взаимодействия между TRIP8b (241-602) и HCN1 FITC произведет разлrease в поляризованном свете. На шаге 4, коэффициент Z из анализа вычисляется 21 для заданной концентрации TRIP8b (241-602) и HCN1 FITC , чтобы гарантировать , что анализ подходит для высокопроизводительного скрининга (этап 5). Шаги 6 и 7 тесты проверки для подтверждения того, что хиты , определенные в высокой пропускной способности первичного скрининга действуют путем нарушения взаимодействия между TRIP8b (241-602) и HCN1 FITC , а не через неспецифического механизма. На этапе 6, carboxytetramethylrhodamine (TAMRA) меченных HCN1 пептид (HCN1 Tamra) используется в идентичной в остальном анализе поляризации флуоресценции для фильтрации флуоресцентные соединения , которые ставят под угрозу анализа FP с помощью тега FITC. Шаг 7 использует больший HCN1 C концевой фрагмент (HCN1 C40) и использует бесконтактный анализ бусинки на основе, которая основана на «туннелирования» синглетного кислорода от донора шарика к акцепторной шарика приближены друг с другом взаимодействующих белков 22,

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Ni-NTA agarose&#160;</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>30210</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dialysis cassette&#160;</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>66456</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Isopropyl b-D-1-thiogalactopyranoside&#160;</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>I5502-1G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>384 Well Black plate&#160;</td>
			<td>Corning</td>
			<td>3820</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Proxiplate&#160;</td>
			<td>Perkin-Elmer&#160;</td>
			<td>6008289</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-GST Acceptor beads&#160;</td>
			<td>Perkin-Elmer&#160;</td>
			<td>6760603C</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NiChelate</td>
			<td>Perkin-Elmer&#160;</td>
			<td>AS101D</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pGS21-a</td>
			<td>Genscript</td>
			<td>SD0121</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PMSF</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>10837091001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Coomassie Kit</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>23200</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Protein concentrator</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>88527</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Perkin Elmer Enspire Multimode Plate reader</td>
			<td>Perkin-Elmer&#160;</td>
			<td>#2300-001M</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BL21 (DE3) Competent Cells</td>
			<td>Agilent</td>
			<td>200131</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

method for identifying small molecule inhibitors of the protein-protein interaction between hcn1 and trip8b

Гиперполяризации активированные циклическими нуклеотидами селекцией каналов (HCN) выражаются повсеместно по всему мозгу, где они функционируют, чтобы регулировать возбудимость нейронов. Внутриклеточное распределение этих каналов в пирамидальных нейронов гиппокампа CA1 области регулируется tetratricopeptide повтора содержащих Rab8b белок, взаимодействующий (TRIP8b), вспомогательной субъединицей. Генетическая выбивание HCN порообразующего субъединиц или TRIP8b, оба ведут к увеличению антидепрессант-подобного поведения, предполагая, что ограничение функции каналов HCN может быть полезным в качестве средства для лечения большого депрессивного расстройства (MDD). Несмотря на значительный терапевтический интерес, HCN каналы также выражены в сердце, где они регулируют ритмичность. Для того, чтобы обойти вне цели вопросы, связанные с блокированием каналы сердца HCN, в нашей лаборатории недавно предложил нацеливание на белок-белкового взаимодействия между HCN и TRIP8b для того, чтобы специально нарушить функцию канала HCN в головном мозге.TRIP8b связывается с HCN порообразующего субъединиц на двух различных участках взаимодействия, хотя и здесь основное внимание уделяется взаимодействию между tetratricopeptide повтор (TPR) областях TRIP8b и терминального хвоста С HCN1. В этом протоколе, расширенное описание метода для очистки TRIP8b и выполнения высокой пропускной способности экрана, чтобы идентифицировать низкомолекулярные ингибиторы взаимодействия между HCN и TRIP8b, описан. Метод высокопроизводительного скрининга использует дл пол ризации флуоресценции (FP) основе анализа для мониторинга связывания большого фрагмента TRIP8b к флуорофора меченных одиннадцати аминокислот пептид, соответствующий концевой хвост HCN1 C. Этот метод позволяет &quot;хит&quot; соединения, которые будут определены на основе изменения поляризации излучаемого света. Validation анализы затем выполнены, чтобы гарантировать, что &quot;хит&quot; соединения не являются артефактом.

Для того, чтобы избежать вопросов авторского права с нашей предыдущей публикации, A TAMRA-меченый зонд HCN1 TAMRA был использован для создания рисунках 2 и 3. Обратите внимание , что эта замена не сделал заметную разницу в результатах, и протоколы иденти...

Watch this Scientific Journal Video about Method for Identifying Small Molecule Inhibitors of the Protein-protein Interaction Between HCN1 and TRIP8b at JoVE.com

Method for Identifying Small Molecule Inhibitors of the Protein-protein Interaction Between HCN1 and TRIP8b

Взаимодействие между HCN каналов и их вспомогательной субъединицей был идентифицирован как мишень терапевтического воздействия большого депрессивного расстройства. Здесь, метод поляризации на основе флуоресценции для идентификации низкомолекулярные ингибиторы этого белок-белкового взаимодействия, представлен.

Способ идентификации низкомолекулярных соединений ингибиторов белок-белкового взаимодействия между HCN1 и TRIP8b

Hyperpolarization-activated cyclic nucleotide-gated (HCN) channels are expressed ubiquitously throughout the brain, where they function to regulate the ...

Research

JoVE Journal

Biochemistry

Using Scaffold Liposomes to Reconstitute Lipid-proximal Protein-protein Interactions In Vitro

Using Scaffold Liposomes to Reconstitute Lipid-proximal Protein-protein Interactions In Vitro

Используя строительные леса, липосом Развести липидами проксимальный белок-белковых взаимодействий<em&gt; In Vitro</em

Studies of integral membrane proteins in vitro are frequently complicated by the presence of a hydrophobic transmembrane domain. Further complicating ...

Visualization of Protein-protein Interaction in Nuclear and Cytoplasmic Fractions by Co-immunoprecipitation and In Situ Proximity Ligation Assay

Visualization of Protein-protein Interaction in Nuclear and Cytoplasmic Fractions by Co-immunoprecipitation and In Situ Proximity Ligation Assay

Визуализация белокбелковых взаимодействия в ядерной и цитоплазматических фракций Co-иммунопреципитации и<em&gt; В Ситу</em&gt; Пробирной Расстояние Лигирование

Protein-protein interactions are involved in thousands of cellular processes and occur in distinct spatial context. Traditionally, co-immunoprecipitation ...

Capturing the Interaction Kinetics of an Ion Channel Protein with Small Molecules by the Bio-layer Interferometry Assay

Захват кинетика взаимодействия ионного канала белка с малых молекул в Assay интерферометрии био слоя

The bio-layer interferometry (BLI) assay is a valuable tool for measuring protein-protein and protein-small molecule interactions. Here, we first describe ...

Titration ELISA as a Method to Determine the Dissociation Constant of Receptor Ligand Interaction

Титрование ELISA как метод, чтобы определить константу диссоциации взаимодействия лигандов рецепторов

The dissociation constant describes the interaction between two partners in the binding equilibrium and is a measure of their affinity. It is a crucial ...

Covalent Immobilization of Proteins for the Single Molecule Force Spectroscopy

Ковалентной иммобилизации белков для одной молекулы силой спектроскопии

In recent years, atomic force microscopy (AFM) based single molecule force spectroscopy (SMFS) extended our understanding of molecular properties and ...

Proteome-wide Quantification of Labeling Homogeneity at the Single Molecule Level

Количественная оценка протеома общесистемной маркировки однородность на уровне одной молекулы

Cell proteomes are often characterized using electrophoresis assays, where all species of proteins in the cells are non-specifically labeled with a ...

A Semi-High-Throughput Adaptation of the NADH-Coupled ATPase Assay for Screening Small Molecule Inhibitors

Полу-высокой пропускной адаптации NADH-связанных АТПас анализ для скрининга малых ингибиторы молекулы

ATPase enzymes utilize the free energy stored in adenosine triphosphate to catalyze a wide variety of endergonic biochemical processes in vivo that would ...

Native Cell Membrane Nanoparticles System for Membrane Protein-Protein Interaction Analysis

Родная клеточная мембрана наночастицы системы membrane белка-белкового взаимодействия анализа

Protein-protein interactions in cell membrane systems play crucial roles in a wide range of biological processes- from cell-to-cell interactions to signal ...

Identifying the Binding Proteins of Small Ligands with the Differential Radial Capillary Action of Ligand Assay (DRaCALA)

Identifying the Binding Proteins of Small Ligands with the Differential Radial Capillary Action of Ligand Assay DRaCALA

Идентификация связывающих белков малых лигандов с дифференциальным радиальным капиллярным действием лигандного анализа (DRaCALA)

The past decade has seen tremendous progress in the understanding of small signaling molecules in bacterial physiology. In particular, the target proteins ...

A High-Throughput Enzyme-Coupled Activity Assay to Probe Small Molecule Interaction with the dNTPase SAMHD1

Sterile alpha motif and HD domain-containing protein 1 (SAMHD1) is a pivotal regulator of intracellular deoxynucleoside triphosphate (dNTP) pools, as this ...