Name: method for identifying small molecule inhibitors of the protein-protein interaction between hcn1 and trip8b
Uploaded: 2016-11-11T14:00:00
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This work was supported by National Institutes of Health Grant R21MH104471 and R01MH106511 (D.M.C.), Brain Research Foundation SG 2012-01 (D.M.C.), Northwestern University Clinical and Translational Sciences Institute 8UL1TR000150 (Y.H.), Chicago Biomedical Consortium HTS-004 (Y.H. and D.M.C.), and National Institutes of Health Grant 2T32MH067564 (K.L.). A part of this work was performed by the Northwestern University Medicinal and Synthetic Chemistry Core (ChemCore) at the Center for Molecular Innovation and Drug Discovery (CMIDD), which is funded by the Chicago Biomedical Consortium with support from the Searle Funds at the Chicago Community Trust and Cancer Center Support Grant P30 CA060553 from the National Cancer Institute awarded to the Robert H. Lurie Comprehensive Cancer Center. The high throughput screen work was performed in the High Throughput Analysis Laboratory which is also a core facility of the Robert H. Lurie Comprehensive Cancer Center.

1. Purificación de TRIP8b (241-602) Protein <ol><li> Transformar el plásmido que contiene TRIP8b (241-602) en el vector de expresión de la proteína bacteriana pGS21 3 en E. competente coli para la expresión de proteínas de acuerdo con las instrucciones del fabricante. Plate 300 l de la cultura en Luria Broth (LB) -agar con 5 g / ml de cloranfenicol y ampicilina. Incubar la placa a 37 ° C durante 16 h. </li><li> Al día siguiente, escoge una sola colonia para inocular 50 ml de LB con...

<ol>
	<li>Biel, M., Wahl-Schott, C., Michalakis, S., Zong, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hyperpolarization-activated+cation+channels:+from+genes+to+function.">Hyperpolarization-activated cation channels: from genes to function.</a> Physiol Rev. 89 (3), 847-885 (2009).</li><li>Shah, M. 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Debido a su potencial como diana terapéutica en el TDM 24, ha habido un considerable interés en los enfoques farmacológicos que antagonizan la función del canal de HCN en el sistema nervioso central 4. Sin embargo, estos esfuerzos se han visto afectadas por la importancia del papel de los canales HCN en marcapasos cardíaco y el riesgo de arritmia 25. Pensamos que la interrupción de la interacción entre el HCN y su subunidad auxiliar específicas del cerebro, TRIP8b 8, p...

(HCN) canales de nucleótidos cíclicos activado por hiperpolarización se expresan en el corazón y el sistema nervioso central donde juegan un papel importante en la regulación de la excitabilidad de la membrana 1. Los canales HCN han sido implicados en la patogénesis del trastorno depresivo mayor (MDD) 2, que se ha llevado a varios grupos a proponer que la limitación de la función del canal de HCN farmacológicamente puede ser eficaz como un nuevo tratamiento para la MDD 3. Sin embargo, atacando directamente a los canales HCN no es viable debido a su importante papel en el potencial de acción cardíaco 4. La ivabradina, el único aprobado por la FDA antagonista de los canales HCN, se utiliza para el tratamiento de la insuficiencia cardíaca para producir un efecto bradicárdico 5. Como tal, hay una necesidad de agentes farmacológicos que limitan la función del canal de HCN exclusivamente en el sistema nervioso central. Tetratricopeptide repetir que contienen proteínas que interactúan Rab8b (TRIP8b) es una especificación del cerebroFIC subunidad auxiliar de los canales HCN que controla la expresión de la superficie y la localización de los canales HCN 6,7. Knockout genético de TRIP8b provoca una reducción de los canales HCN cerebrales 7 sin afectar a la expresión de HCN en el corazón 8. Curiosamente, los ratones knockout TRIP8b pasan menos tiempo inmóvil en la tarea tarea de natación forzada y la suspensión por la cola 7, dos pruebas de detección de uso común para la eficacia antidepresiva 9-11. Estos resultados sugieren que en lugar de centrarse directamente los canales HCN con una pequeña molécula antagonista de la función del canal de HCN, lo que altera la interacción entre TRIP8b y HCN puede ser suficiente para producir un comportamiento antidepresivo. TRIP8b une a HCN en dos sitios de unión distintos. El dominio de unión de nucleótidos cíclicos (CNBD) de HCN interactúa con un dominio conservado de la terminal N TRIP8b situada a los dominios TPR de TRIP8b 12,13. Aunque los residuos de la CNBD que están involucrados en esteinteracción han sido mapeado 14, la región de TRIP8b que está implicado no se ha reducido más allá de un-80-amino fragmento de ácido 13. Una segunda interacción se produce entre los dominios tetratricopeptide repetición (TPR) de TRIP8b y el tripéptido C-terminal de HCN ( &#39;Saturday Night Live&#39; en HCN1, HCN2 y HCN4, pero &#39;ANM&#39; en HCN3) 3,12. La estructura cristalina recientemente resuelto 15 de esta interacción C cola reveló similitud estructural sustancial a la interacción entre el receptor de importación peroxisomal, Peroxin 5 (PEX5), y sus socios interactuar, que contiene de tipo 1 peroxisomal secuencias dirigidas (PTS1) 16. Aunque se requieren ambos sitios de interacción para la función de los canales HCN, la interacción entre los dominios TPR de TRIP8b y el terminal de tripéptido C de HCN1 sirve como el sitio de unión dominante y regula la expresión de superficie de HCN. Por lo tanto, esta interacción fue elegido como el sitio de segmentación en este estudio.Para el resto del manuscrito, cuando se hace una referencia a la interacción entre TRIP8b y HCN, es esta interacción que se hace referencia. Esta interacción se recapitula por un fragmento altamente soluble de TRIP8b correspondiente a su terminal conservado C que contiene los dominios TPR requeridas para la unión de la cola C terminal del HCN (residuos 241 a 602 de las 1A-4 isoformas de TRIP8b) 3. Con el fin de desarrollar una pantalla de alto rendimiento para identificar moléculas pequeñas capaces de interrumpir esta interacción, una polarización de fluorescencia (FP) a base de ensayo se empleó 17. La polarización de fluorescencia se basa en la excitación de un ligando de fluoróforo-etiquetados con luz polarizada, y la medición del grado de polarización de la fluorescencia emitida 18. En presencia de una pareja de unión, el movimiento de rotación del ligando fluorescente está limitada y la luz polarizada se emite 19. En ausencia de una pareja de unión, tque el movimiento de rotación del ligando conduce a la emisión de luz despolarizada. En el protocolo adjunto, se presenta un método para la purificación de N terminal etiquetado (6xHis) TRIP8b (241-602) usando níquel-ácido nitrilotriacético (Ni-NTA) perlas. Un protocolo similar se empleó para purificar la glutatión-S-transferasa (GST)-etiquetados C terminal de 40 aminoácidos de HCN1 (c40 HCN1) usado en la etapa 7 del protocolo. Por consideraciones de espacio, se omitirá una descripción detallada de este procedimiento. En los pasos 2 a 7 del protocolo, se presenta un flujo de trabajo cribado de alto rendimiento (véase la Figura 1). Interacciones proteína-proteína son un objetivo muy difíciles para la selección de alto rendimiento y se aconseja a los lectores a buscar recursos adicionales sobre el tema 20. Los pasos 2 y 3 del procedimiento caracterizan la afinidad in vitro de la TRIP8b purificada (241-602) construir foisotiocianato ra de fluoresceína (FITC)-etiquetados once péptido de aminoácidos correspondiente a la cola C terminal de HCN1 (HCN1 FITC). Sobre la base de la estructura cristalina de la TRIP8b-HCN complejo 15, este segmento de once aminoácidos es suficiente para producir la unión con TRIP8b (241-602). En el paso 2, la Kd de la interacción se mide por titulación TRIP8b (241-602) en una concentración fija de HCN1 FITC. En el paso 3, una versión no marcada del péptido HCN utilizado en la etapa 2 se valora en una concentración fija de tanto TRIP8b (241-602) y HCN1 FITC para examinar si la etiqueta FITC interfiere con la unión. Estos experimentos son esenciales para la selección de las concentraciones apropiadas de TRIP8b (241-602) y HCN1 FITC utilizados en la pantalla de alto rendimiento. La premisa de la pantalla de alto rendimiento es que una pequeña molécula capaz de interrumpir la interacción entre TRIP8b (241-602) y HCN1 FITC producirá decRease en luz polarizada. En el paso 4, el factor Z del ensayo se calcula 21 para una concentración dada de TRIP8b (241-602) y HCN1 FITC para asegurar que el ensayo es adecuado para el cribado de alto rendimiento de (paso 5). Los pasos 6 y 7 son ensayos de validación para confirmar que los accesos identificados en la pantalla principal de alto rendimiento están actuando mediante la interrupción de la interacción entre TRIP8b (241-602) y HCN1 FITC en lugar de a través de un mecanismo inespecífico. En el paso 6, carboxytetramethylrhodamine (TAMRA) marcado con HCN1 péptido (HCN1 TAMRA) es utilizado en un ensayo de polarización de fluorescencia por lo demás idéntica para filtrar compuestos fluorescentes que comprometen el ensayo de FP mediante la etiqueta FITC. Paso 7 utiliza un fragmento terminal más grande HCN1 C (HCN1 C40) y emplea un ensayo de proximidad basado en perlas, que se basa en el &quot;túnel&quot; de un oxígeno singlete de un cordón de donantes para un cordón aceptor traído cerca uno del otro por las proteínas que interactúan 22.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Ni-NTA agarose&#160;</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>30210</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dialysis cassette&#160;</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>66456</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Isopropyl b-D-1-thiogalactopyranoside&#160;</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>I5502-1G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>384 Well Black plate&#160;</td>
			<td>Corning</td>
			<td>3820</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Proxiplate&#160;</td>
			<td>Perkin-Elmer&#160;</td>
			<td>6008289</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-GST Acceptor beads&#160;</td>
			<td>Perkin-Elmer&#160;</td>
			<td>6760603C</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NiChelate</td>
			<td>Perkin-Elmer&#160;</td>
			<td>AS101D</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pGS21-a</td>
			<td>Genscript</td>
			<td>SD0121</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PMSF</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>10837091001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Coomassie Kit</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>23200</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Protein concentrator</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>88527</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Perkin Elmer Enspire Multimode Plate reader</td>
			<td>Perkin-Elmer&#160;</td>
			<td>#2300-001M</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BL21 (DE3) Competent Cells</td>
			<td>Agilent</td>
			<td>200131</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

method for identifying small molecule inhibitors of the protein-protein interaction between hcn1 and trip8b

(HCN) canales de nucleótidos cíclicos activado por hiperpolarización se expresan ubicuamente por todo el cerebro, donde funcionan para regular la excitabilidad de las neuronas. La distribución subcelular de estos canales en las neuronas piramidales de la zona CA1 del hipocampo es regulada por tetratricopeptide proteína repetir que contienen Rab8b interactuar (TRIP8b), una subunidad auxiliar. knockout genético de HCN formador de poros subunidades o TRIP8b, ambos conducen a un aumento en el comportamiento antidepresivo, lo que sugiere que la limitación de la función de los canales HCN puede ser útil como tratamiento para el trastorno depresivo mayor (MDD). A pesar del interés terapéutico significativo, los canales HCN se expresan también en el corazón, donde regulan la ritmicidad. Para evitar problemas fuera de objetivo asociados con el bloqueo de los canales HCN cardíacos, nuestro laboratorio ha propuesto recientemente la orientación de la interacción proteína-proteína entre HCN y TRIP8b el fin de perturbar específicamente la función del canal de HCN en el cerebro.TRIP8b se une a los poros formando subunidades HCN en dos sitios de interacción distintos, aunque en este caso la atención se centra en la interacción entre los dominios de la repetición tetratricopeptide (TPR) de TRIP8b y la cola C terminal de HCN1. En este protocolo, una descripción ampliada de un método para purificar TRIP8b y ejecución de una pantalla de alto rendimiento para identificar inhibidores de molécula pequeña de la interacción entre el HCN y TRIP8b, se describe. El método para la selección de alto rendimiento utiliza una polarización de la fluorescencia (FP) a base de ensayo para monitorizar la unión de un fragmento de TRIP8b grande a un once fluoróforo de etiquetado amino péptido ácido correspondiente al terminal de la cola C HCN1. Permite que los compuestos &#39;hit&#39; a este método para ser identificados en base al cambio en la polarización de la luz emitida. Los ensayos de validación se realizan a continuación para asegurarse de que &#39;golpean&#39; compuestos no son artefactos.

Para evitar problemas de derechos de autor con nuestra publicación anterior, una sonda marcada con TAMRA HCN1 TAMRA se utilizó para generar las Figuras 2 y 3. Tenga en cuenta que esta sustitución no hizo una diferencia apreciable en los resultados, y los protocolos son idénticos a los descritos anteriormente con HCN1 FITC. Para evaluar la interacción con HCN1 TAMRA, TRIP8b (241-602) se tituló en una concentración f...

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Method for Identifying Small Molecule Inhibitors of the Protein-protein Interaction Between HCN1 and TRIP8b

La interacción entre los canales HCN y su subunidad auxiliar ha sido identificado como un objetivo terapéutico en el trastorno depresivo mayor. Aquí, un método basado en la polarización de fluorescencia para identificar inhibidores de molécula pequeña de esta interacción proteína-proteína, se presenta.

Método para la identificación de inhibidores de moléculas pequeñas de la interacción proteína-proteína entre HCN1 y TRIP8b

Hyperpolarization-activated cyclic nucleotide-gated (HCN) channels are expressed ubiquitously throughout the brain, where they function to regulate the ...

Research

JoVE Journal

Biochemistry

Using Scaffold Liposomes to Reconstitute Lipid-proximal Protein-protein Interactions In Vitro

Using Scaffold Liposomes to Reconstitute Lipid-proximal Protein-protein Interactions In Vitro

El uso de andamios liposomas para reconstituir las interacciones proteína-proteína-lípidos proximal<em&gt; In Vitro</em

Studies of integral membrane proteins in vitro are frequently complicated by the presence of a hydrophobic transmembrane domain. Further complicating ...

Investigación

Bioquímica

Visualization of Protein-protein Interaction in Nuclear and Cytoplasmic Fractions by Co-immunoprecipitation and In Situ Proximity Ligation Assay

Visualization of Protein-protein Interaction in Nuclear and Cytoplasmic Fractions by Co-immunoprecipitation and In Situ Proximity Ligation Assay

La visualización de la interacción proteína-proteína en las fracciones nucleares y citoplasmáticas de Co-inmunoprecipitación y<em&gt; In Situ</em&gt; Ligadura ensayo de proximidad

Protein-protein interactions are involved in thousands of cellular processes and occur in distinct spatial context. Traditionally, co-immunoprecipitation ...

Capturing the Interaction Kinetics of an Ion Channel Protein with Small Molecules by the Bio-layer Interferometry Assay

Captura de la cinética de la interacción de una proteína de canal iónico con moléculas pequeñas por el ensayo de interferometría de la Bio-capa

The bio-layer interferometry (BLI) assay is a valuable tool for measuring protein-protein and protein-small molecule interactions. Here, we first describe ...

Titration ELISA as a Method to Determine the Dissociation Constant of Receptor Ligand Interaction

Valoración de ELISA como método para determinar la constante de disociación de la interacción del ligando del Receptor

The dissociation constant describes the interaction between two partners in the binding equilibrium and is a measure of their affinity. It is a crucial ...

Covalent Immobilization of Proteins for the Single Molecule Force Spectroscopy

Inmovilización covalente de las proteínas para la espectroscopia de fuerza sola molécula

In recent years, atomic force microscopy (AFM) based single molecule force spectroscopy (SMFS) extended our understanding of molecular properties and ...

Proteome-wide Quantification of Labeling Homogeneity at the Single Molecule Level

Cuantificación de todo el proteoma de etiquetado homogeneidad en el nivel de molécula única

Cell proteomes are often characterized using electrophoresis assays, where all species of proteins in the cells are non-specifically labeled with a ...

A Semi-High-Throughput Adaptation of the NADH-Coupled ATPase Assay for Screening Small Molecule Inhibitors

Una adaptación de semi-alto rendimiento del ensayo ATPase acoplado a NADH para la detección de inhibidores de moléculas pequeñas

ATPase enzymes utilize the free energy stored in adenosine triphosphate to catalyze a wide variety of endergonic biochemical processes in vivo that would ...

Native Cell Membrane Nanoparticles System for Membrane Protein-Protein Interaction Analysis

Sistema de nanopartículas de membrana celular nativa para análisis de interacción proteína-proteína de membrana

Protein-protein interactions in cell membrane systems play crucial roles in a wide range of biological processes- from cell-to-cell interactions to signal ...

Identifying the Binding Proteins of Small Ligands with the Differential Radial Capillary Action of Ligand Assay (DRaCALA)

Identifying the Binding Proteins of Small Ligands with the Differential Radial Capillary Action of Ligand Assay DRaCALA

Identificación de las proteínas de unión de pequeños ligandos con la acción capilar radial diferencial del ensayo de ligandos (DRaCALA)

The past decade has seen tremendous progress in the understanding of small signaling molecules in bacterial physiology. In particular, the target proteins ...

A High-Throughput Enzyme-Coupled Activity Assay to Probe Small Molecule Interaction with the dNTPase SAMHD1

Sterile alpha motif and HD domain-containing protein 1 (SAMHD1) is a pivotal regulator of intracellular deoxynucleoside triphosphate (dNTP) pools, as this ...