Name: method for identifying small molecule inhibitors of the protein-protein interaction between hcn1 and trip8b
Uploaded: 2016-11-11T14:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Method for Identifying Small Molecule Inhibitors of the Protein-protein Interaction Between HCN1 and TRIP8b at JoVE.com

This work was supported by National Institutes of Health Grant R21MH104471 and R01MH106511 (D.M.C.), Brain Research Foundation SG 2012-01 (D.M.C.), Northwestern University Clinical and Translational Sciences Institute 8UL1TR000150 (Y.H.), Chicago Biomedical Consortium HTS-004 (Y.H. and D.M.C.), and National Institutes of Health Grant 2T32MH067564 (K.L.). A part of this work was performed by the Northwestern University Medicinal and Synthetic Chemistry Core (ChemCore) at the Center for Molecular Innovation and Drug Discovery (CMIDD), which is funded by the Chicago Biomedical Consortium with support from the Searle Funds at the Chicago Community Trust and Cancer Center Support Grant P30 CA060553 from the National Cancer Institute awarded to the Robert H. Lurie Comprehensive Cancer Center. The high throughput screen work was performed in the High Throughput Analysis Laboratory which is also a core facility of the Robert H. Lurie Comprehensive Cancer Center.

1. Rening av TRIP8b (241-602) Protein <ol><li> Omvandla plasmiden innehållande TRIP8b (241-602) i den bakteriella proteinexpressionsvek pGS21 3 in i kompetenta E. coli för proteinuttryck enligt tillverkarens anvisningar. Plattan 300 ul av odlingen på Luria-buljong (LB) -agar med 5 | j, g / ml av kloramfenikol och ampicillin. Inkubera plattan vid 37 ° C under 16 h. </li><li> Nästa dag, plocka en enda koloni för att ympa 50 ml LB med 50 | ig / ml kloramfenikol och ampicillin. Inkubera kulturen ...

<ol>
	<li>Biel, M., Wahl-Schott, C., Michalakis, S., Zong, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hyperpolarization-activated+cation+channels:+from+genes+to+function.">Hyperpolarization-activated cation channels: from genes to function.</a> Physiol Rev. 89 (3), 847-885 (2009).</li><li>Shah, M. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=HCN1+channels:+a+new+therapeutic+target+for+depressive+disorders?.">HCN1 channels: a new therapeutic target for depressive disorders?.</a> Sci Signal. 5 (244), pe44 (2012).</li><li>Han, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+of+Small-Molecule+Inhibitors+of+Hyperpolarization-Activated+Cyclic+Nucleotide-Gated+Channels.">Identification of Small-Molecule Inhibitors of Hyperpolarization-Activated Cyclic Nucleotide-Gated Channels.</a> J Biomol Screen. 20 (9), 1124-1131 (2015).</li><li>Postea, O., Biel, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Exploring+HCN+channels+as+novel+drug+targets.">Exploring HCN channels as novel drug targets.</a> Nat Rev Drug Discov. 10 (12), (2011).</li><li>Stieber, J., Wieland, K., St&#246;ckl, G., Ludwig, A., Hofmann, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bradycardic+and+proarrhythmic+properties+of+sinus+node+inhibitors.">Bradycardic and proarrhythmic properties of sinus node inhibitors.</a> Mol Pharmacol. 69 (4), 1328-1337 (2006).</li><li>Santoro, B., Wainger, B. J., Siegelbaum, S. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regulation+of+HCN+channel+surface+expression+by+a+novel+C-terminal+protein-protein+interaction.">Regulation of HCN channel surface expression by a novel C-terminal protein-protein interaction.</a> J Neurosci. 24 (47), 10750-10762 (2004).</li><li>Lewis, A. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Deletion+of+the+hyperpolarization-activated+cyclic+nucleotide-gated+channel+auxiliary+subunit+TRIP8b+impairs+hippocampal+Ih+localization+and+function+and+promotes+antidepressant+behavior+in+mice.">Deletion of the hyperpolarization-activated cyclic nucleotide-gated channel auxiliary subunit TRIP8b impairs hippocampal Ih localization and function and promotes antidepressant behavior in mice.</a> J Neurosci. 31 (20), 7424-7440 (2011).</li><li>Heuermann, R. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reduction+of+thalamic+and+cortical+Ih+by+deletion+of+TRIP8b+produces+a+mouse+model+of+human+absence+epilepsy.">Reduction of thalamic and cortical Ih by deletion of TRIP8b produces a mouse model of human absence epilepsy.</a> Neurobiol Dis. 85, 81-92 (2016).</li><li>Steru, L., Chermat, R., Thierry, B., Simon, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+tail+suspension+test:+A+new+method+for+screening+antidepressants+in+mice.">The tail suspension test: A new method for screening antidepressants in mice.</a> Psychopharmacology. 85 (3), 367-370 (1985).</li><li>Petit-Demouliere, B., Chenu, F., Bourin, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Forced+swimming+test+in+mice:+a+review+of+antidepressant+activity.">Forced swimming test in mice: a review of antidepressant activity.</a> Psychopharmacology. 177 (3), 245-255 (2004).</li><li>Cryan, J. F., Mombereau, C., Vassout, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+tail+suspension+test+as+a+model+for+assessing+antidepressant+activity:+Review+of+pharmacological+and+genetic+studies+in+mice.">The tail suspension test as a model for assessing antidepressant activity: Review of pharmacological and genetic studies in mice.</a> Neurosci Biobehav Rev. 29 (4-5), 571-625 (2005).</li><li>Han, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Trafficking+and+gating+of+hyperpolarization-activated+cyclic+nucleotide-gated+channels+are+regulated+by+interaction+with+tetratricopeptide+repeat-containing+Rab8b-interacting+protein+(TRIP8b)+and+cyclic+AMP+at+distinct+sites.">Trafficking and gating of hyperpolarization-activated cyclic nucleotide-gated channels are regulated by interaction with tetratricopeptide repeat-containing Rab8b-interacting protein (TRIP8b) and cyclic AMP at distinct sites.</a> J Biol Chem. 286 (23), 20823-20834 (2011).</li><li>Hu, L., Santoro, B., Saponaro, A., Liu, H., Moroni, A., Siegelbaum, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Binding+of+the+auxiliary+subunit+TRIP8b+to+HCN+channels+shifts+the+mode+of+action+of+cAMP.">Binding of the auxiliary subunit TRIP8b to HCN channels shifts the mode of action of cAMP.</a> J Gen Physiol. 142 (6), 599-612 (2013).</li><li>Saponaro, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structural+basis+for+the+mutual+antagonism+of+cAMP+and+TRIP8b+in+regulating+HCN+channel+function.">Structural basis for the mutual antagonism of cAMP and TRIP8b in regulating HCN channel function.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 111 (40), 14577-14582 (2014).</li><li>Bankston, J. R., Camp, S. S., DiMaio, F., Lewis, A. S., Chetkovich, D. M., Zagotta, W. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structure+and+stoichiometry+of+an+accessory+subunit+TRIP8b+interaction+with+hyperpolarization-activated+cyclic+nucleotide-gated+channels.">Structure and stoichiometry of an accessory subunit TRIP8b interaction with hyperpolarization-activated cyclic nucleotide-gated channels.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 109 (20), 7899-7904 (2012).</li><li>Gatto, G. J., Geisbrecht, B. V., Gould, S. J., Berg, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Peroxisomal+targeting+signal-1+recognition+by+the+TPR+domains+of+human+PEX5.">Peroxisomal targeting signal-1 recognition by the TPR domains of human PEX5.</a> Nat Struct Biol. 7 (12), 1091-1095 (2000).</li><li>Owicki, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fluorescence+polarization+and+anisotropy+in+high+throughput+screening:+perspectives+and+primer.">Fluorescence polarization and anisotropy in high throughput screening: perspectives and primer.</a> J Biomol Screen. 5 (5), 297-306 (2000).</li><li>Smith, D. S., Eremin, S. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fluorescence+polarization+immunoassays+and+related+methods+for+simple,+high-throughput+screening+of+small+molecules.">Fluorescence polarization immunoassays and related methods for simple, high-throughput screening of small molecules.</a> Anal Bioanal Chem. 391 (5), 1499-1507 (2008).</li><li>Roehrl, M. H. A., Wang, J. Y., Wagner, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+general+framework+for+development+and+data+analysis+of+competitive+high-throughput+screens+for+small-molecule+inhibitors+of+protein-protein+interactions+by+fluorescence+polarization.">A general framework for development and data analysis of competitive high-throughput screens for small-molecule inhibitors of protein-protein interactions by fluorescence polarization.</a> Biochemistry. 43 (51), 16056-16066 (2004).</li><li>Arkin, M. R., Wells, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Small-molecule+inhibitors+of+protein-protein+interactions:+progressing+towards+the+dream.">Small-molecule inhibitors of protein-protein interactions: progressing towards the dream.</a> Nat Rev Drug Discov. 3 (4), 301-317 (2004).</li><li>Zhang, J., Chung, T., Oldenburg, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+Simple+Statistical+Parameter+for+Use+in+Evaluation+and+Validation+of+High+Throughput+Screening+Assays.">A Simple Statistical Parameter for Use in Evaluation and Validation of High Throughput Screening Assays.</a> J Biomol Screen. 4 (2), 67-73 (1999).</li><li>Eglen, R. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+use+of+AlphaScreen+technology+in+HTS:+current+status.">The use of AlphaScreen technology in HTS: current status.</a> Curr Cheml Genomics. 1 (1), 2-10 (2008).</li><li>Lehninger, A. L., Nelson, D. L., Cox, M. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Lehninger Principles of Biochemistry. , (2000).</li><li>Kim, C. S., Chang, P. Y., Johnston, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Enhancement+of+dorsal+hippocampal+activity+by+knockdown+of+HCN1+channels+leads+to+anxiolytic-+and+antidepressant-like+behaviors.">Enhancement of dorsal hippocampal activity by knockdown of HCN1 channels leads to anxiolytic- and antidepressant-like behaviors.</a> Neuron. 75 (3), 503-516 (2012).</li><li>Wahl-Schott, C., Biel, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=HCN+channels:+structure,+cellular+regulation+and+physiological+function.">HCN channels: structure, cellular regulation and physiological function.</a> Cell Mol Life Sci. 66 (3), 470-494 (2009).</li><li>DeBerg, H. A., Bankston, J. R., Rosenbaum, J. C., Brzovic, P. S., Zagotta, W. N., Stoll, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structural+Mechanism+for+the+Regulation+of+HCN+Ion+Channels+by+the+Accessory+Protein+TRIP8b.">Structural Mechanism for the Regulation of HCN Ion Channels by the Accessory Protein TRIP8b.</a> Structure. 23 (4), 734-744 (2015).</li><li>Weiss, J. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Hill+equation+revisited:+uses+and+misuses.">The Hill equation revisited: uses and misuses.</a> FASEB J. 11 (11), 835-841 (1997).</li><li>Prinz, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hill+coefficients,+dose-response+curves+and+allosteric+mechanisms.">Hill coefficients, dose-response curves and allosteric mechanisms.</a> J Chem Biol. 3 (1), 37-44 (2009).</li><li>Pollard, T. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+Guide+to+Simple+and+Informative+Binding+Assays.">A Guide to Simple and Informative Binding Assays.</a> Mol Biol Cell. 21 (23), 4061-4067 (2010).</li><li>Rossi, A. M., Taylor, C. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Analysis+of+protein-ligand+interactions+by+fluorescence+polarization.">Analysis of protein-ligand interactions by fluorescence polarization.</a> Nat Protoc. 6 (3), (2011).</li><li>Ryan, A. J., Gray, N. M., Lowe, P. N., Chung, C. -. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effect+of+Detergent+on+"Promiscuous"+Inhibitors.">Effect of Detergent on "Promiscuous" Inhibitors.</a> J Med Chem. 46 (16), 3448-3451 (2003).</li><li>McGovern, S. L., Caselli, E., Grigorieff, N., Shoichet, B. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+common+mechanism+underlying+promiscuous+inhibitors+from+virtual+and+high-throughput+screening.">A common mechanism underlying promiscuous inhibitors from virtual and high-throughput screening.</a> J Med Chem. 45 (8), 1712-1722 (2002).</li><li>Hertzberg, R. P., Pope, A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-throughput+screening:+new+technology+for+the+21st+century.">High-throughput screening: new technology for the 21st century.</a> Curr Opin Chem Biol. 4 (4), 445-451 (2000).</li><li>Sundberg, S. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-throughput+and+ultra-high-throughput+screening:+solution-and+cell-based+approaches.">High-throughput and ultra-high-throughput screening: solution-and cell-based approaches.</a> Curr Opin Biotechnol. 11 (1), (2000).</li></ol>

På grund av dess potential som ett terapeutiskt mål i MDD 24, har det funnits ett stort intresse för farmakologiska metoder som motverkar HCN-kanal funktion i det centrala nervsystemet 4. Emellertid har dessa ansträngningar har stannat av den viktiga roll som HCN kanaler i hjärtPaceMaking och risken för arytmi 25. Vi resonerade att störa interaktionen mellan HCN och dess hjärna specifik auxiliär subenhet, TRIP8b 8, kan vara tillräcklig för att producera antidepressi...

Hyperpolarisation aktiverade cykliska nukleotid-gated (HCN) kanaler uttrycks i hjärtat och centrala nervsystemet där de spelar en viktig roll i regleringen av membran retbarhet en. HCN kanaler har varit inblandade i patogenesen av egentlig depression (MDD) 2, vilket har lett flera grupper att föreslå att begränsa HCN kanalfunktionen farmakologiskt kan vara effektivt som en ny behandling för egentlig depression tre. Men direkt inriktning HCN kanaler är inte lönsamt på grund av deras viktiga roll i hjärtaktionspotentialen 4. Ivabradin godkände enda FDA HCN kanalantagonist, används för behandling av hjärtsvikt för att producera en Bradykardisk effekt 5. Som sådan, finns det ett behov av farmakologiska medel som begränsar HCN kanalfunktionen uteslutande i det centrala nervsystemet. Tetratricopeptide upprepad innehållande Rab8b interagerande protein (TRIP8b) är en hjärna specific auxiliär subenhet av HCN kanaler som styr ytan uttryck och lokalisering av HCN kanaler 6,7. Genetisk knockout av TRIP8b orsakar en minskning av hjärn HCN kanaler 7 utan att påverka HCN uttryck i hjärtat åtta. Intressant TRIP8b knockoutmöss spendera mindre tid orörlig på tvångs simma uppgiften och svans fjädring uppgift 7, två vanliga screeningtest för antidepressiva effekten 9-11. Dessa resultat tyder på att i stället för direkt inriktning på HCN-kanaler med en liten molekyl antagonist av HCN-kanal funktion, störa interaktionen mellan TRIP8b och HCN kan vara tillräcklig för att producera antidepressiva-liknande beteende. TRIP8b binder till HCN vid två distinkta bindningsställen. Den cykliska nukleotid bindande domän (CNBD) av HCN samverkar med en konserverad domän TRIP8b ligger N terminal till RTB domäner TRIP8b 12,13. Även om rester av CNBD som är involverade i dettainteraktion har karte 14, har regionen TRIP8b som är involverad inte har minskat ner förbi en-80-aminosyrafragment 13. En andra interaktion sker mellan tetratricopeptide upprepa (RTB) domänerna av TRIP8b och den C-terminala tripeptiden av HCN ( &quot;SNL&quot; i HCN1, HCN2 och HCN4, men &quot;ANM&quot; i HCN3) 3,12. Den nyligen löst kristallstrukturen 15 i denna C svans interaktion visade betydande strukturell likhet med interaktionen mellan peroxisomal import receptorn, peroxin 5 (PEX5), och dess samverkande partners, som innehåller typ 1 peroxisomala inriktning sekvenser (PTS1) 16. Även om båda interaktionsställen krävs för HCN-kanal funktion, samspelet mellan TPR domänerna av TRIP8b och den C-terminala tripeptiden av HCN1 tjänar som det dominerande bindningsstället och reglerar HCN ytexpression. Därför var denna interaktion valdes som den målriktade plats i denna studie.För resten av manuskriptet, när det hänvisas till samverkan mellan TRIP8b och HCN, är det detta samspel som hänvisas till. Denna interaktion rekapituleras av en lättlöslig fragment av TRIP8b motsvarar dess bevarade C terminal innehållande TPR domäner som krävs för att binda den C-terminala svansen av HCN (resterna 241-602 av 1a-4 isoformer av TRIP8b) 3. För att utveckla en hög genomströmning skärmen för att identifiera små molekyler med förmåga att störa denna växelverkan, ett fluorescenspolarisation (FP) -baserad analys användes 17. Fluorescenspolarisation är baserad på exciteringen av en fluorofor-märkt ligand med polariserat ljus, och att mäta graden av polarisation hos den emitterade fluorescensen 18. I närvaro av en bindningspartner, är den roterande rörelsen hos den fluorescerande liganden begränsas och polariserat ljus emitteras 19. I frånvaro av en bindningspartner, than rotationsrörelse av liganden leder till utsläpp av depolariserade ljus. I den bifogade protokollet, är en metod för rening av N-terminala-taggade (6xHis) TRIP8b (241-602) med användning av nickel-nitrilotriättiksyra (Ni-NTA) pärlor presenteras. Ett liknande protokoll användes för att rena glutation-S-transferas (GST)-märkt C terminala 40 aminosyrorna i HCN1 (HCN1 C40) användes i steg 7 i protokollet. För utrymmesskäl, har en detaljerad beskrivning av detta förfarande utelämnas. I steg 2 till 7 i protokollet, är en high throughput screening arbetsflöde presenteras (se figur 1). Protein-proteininteraktioner är ett notoriskt svårt mål för high throughput screening och läsare uppmanas att söka ytterligare resurser på ämnet 20. Steg 2 och 3 i proceduren karakterisera affiniteten av det renade TRIP8b (241-602) in vitro konstruera fora fluorescein isotiocyanat (FITC)-märkt elva aminosyror lång peptid som motsvarar den C-terminala svansen av HCN1 (HCN1 FITC). Baserat på kristallstrukturen för den TRIP8b-HCN-komplex 15, detta elva aminosyrasegment är tillräcklig för att producera bindning med TRIP8b (241-602). I steg 2, är Kd för interaktionen mäts genom att titrera TRIP8b (241-602) till en fixerad koncentration av HCN1 FITC. I steg 3, är en omärkt version av HCN peptiden som används i steg 2 titreras till en fast koncentration av både TRIP8b (241-602) och HCN1 FITC att undersöka om FITC-tagg stör bindningen. Dessa experiment är viktigt att välja lämpliga koncentrationer av TRIP8b (241-602) och HCN1 FITC används i hög genomströmning skärm. Utgångspunkten för hög genomströmning skärm är att en liten molekyl som kan störa interaktionen mellan TRIP8b (241-602) och HCN1 FITC kommer att producera en Decemberrease i polariserat ljus. I steg 4 är Z-faktorn hos analysen beräknad 21 för en given koncentration av TRIP8b (241-602) och HCN1 FITC att säkerställa att analysen är lämplig för högeffektiv screening (steg 5). Steg 6 och 7 är validerings analyser för att bekräfta att de träffar som identifierats i den primära hög genomströmning skärm agerar genom att störa växelverkan mellan TRIP8b (241-602) och HCN1 FITC snarare än genom en ospecifik mekanism. I steg 6, carboxytetramethylrhodamine (TAMRA) -märkt HCN1 peptid (HCN1 TAMRA) används i en i övrigt identisk fluorescenspolarisationsanalys att filtrera fluorescerande föreningar som äventyrar FP-analys med hjälp av FITC-taggen. Steg 7 utnyttjar en större HCN1 C-terminala fragment (HCN1 C40) och sysselsätter en vulst baserad närhetsanalys, som är baserad på den &quot;tunnling&quot; av en singlett-syre från en donator vulst till en acceptor bead bringas nära varandra genom interagerande proteiner 22.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Ni-NTA agarose&#160;</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>30210</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dialysis cassette&#160;</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>66456</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Isopropyl b-D-1-thiogalactopyranoside&#160;</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>I5502-1G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>384 Well Black plate&#160;</td>
			<td>Corning</td>
			<td>3820</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Proxiplate&#160;</td>
			<td>Perkin-Elmer&#160;</td>
			<td>6008289</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-GST Acceptor beads&#160;</td>
			<td>Perkin-Elmer&#160;</td>
			<td>6760603C</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NiChelate</td>
			<td>Perkin-Elmer&#160;</td>
			<td>AS101D</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pGS21-a</td>
			<td>Genscript</td>
			<td>SD0121</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PMSF</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>10837091001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Coomassie Kit</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>23200</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Protein concentrator</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>88527</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Perkin Elmer Enspire Multimode Plate reader</td>
			<td>Perkin-Elmer&#160;</td>
			<td>#2300-001M</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BL21 (DE3) Competent Cells</td>
			<td>Agilent</td>
			<td>200131</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

method for identifying small molecule inhibitors of the protein-protein interaction between hcn1 and trip8b

Hyperpolarisation aktiverade cykliska nukleotid-gated (HCN) kanaler uttrycks ubiquitously i hela hjärnan, där de fungerar för att reglera retbarhet av nervceller. Subcellulära fördelningen av dessa kanaler i pyramidala nervceller i hippocampus område CA1 regleras av tetratricopeptide upprepad innehållande Rab8b interagerande protein (TRIP8b), en hjälpenhet. Genetisk knockout av HCN porbildande subenheter eller TRIP8b, båda leder till en ökning av antidepressiv-liknande beteende, vilket antyder att begränsa funktionen av HCN-kanaler kan vara användbara som en behandling för egentlig depression (MDD). Trots betydande terapeutiskt intresse är HCN kanaler också uttrycks i hjärtat, där de reglerar rhythmicity. För att kringgå off-target frågor i samband med att blockera hjärt HCN kanaler, har vårt labb nyligen föreslagit inriktning på protein-proteininteraktion mellan HCN och TRIP8b för att specifikt störa HCN-kanal funktion i hjärnan.TRIP8b binder till HCN porbildande subenheter vid två distinkta interaktionsställen, men här ligger fokus på samspelet mellan tetratricopeptide upprepa (RTB) domänerna av TRIP8b och den C-terminala svansen av HCN1. I detta protokoll ett expanderat beskrivning av en metod för att rena TRIP8b och exekvering av en hög genomströmning skärmen för att identifiera småmolekylära inhibitorer av interaktionen mellan HCN och TRIP8b, beskrivs. Metoden för high throughput screening utnyttjar en Fluorescence Polarization (FP) -baserad analys för att övervaka bindningen av en stor TRIP8b fragmentet till en fluorofor-märkta elva aminosyror lång peptid som motsvarar den HCN1 C-terminala svansen. Denna metod tillåter &quot;träff&quot; föreningar som skall identifieras baserat på förändringen i polarisationen av emitterat ljus. Validerings analyser utförs sedan för att se till att &quot;slå&quot; föreningar är inte artefakter.

För att undvika upphovsrättsfrågor med vår tidigare publikation, var en TAMRA-märkt sond HCN1 TAMRA används för att generera figurerna 2 och 3. Observera att denna substitution inte göra en märkbar skillnad i resultaten, och protokollen är identiska med de som beskrivs ovan med HCN1 FITC. För att bedöma interaktionen med HCN1 TAMRA, TRIP8b (241-602) titrerades till en fast koncentration av HCN1 TAMRA</sub...

Watch this Scientific Journal Video about Method for Identifying Small Molecule Inhibitors of the Protein-protein Interaction Between HCN1 and TRIP8b at JoVE.com

Method for Identifying Small Molecule Inhibitors of the Protein-protein Interaction Between HCN1 and TRIP8b

Samspelet mellan HCN kanaler och deras hjälp subenhet har identifierats som ett terapeutiskt mål i egentlig depression. Här, en fluorescenspolariserings-baserad metod för att identifiera småmolekylära hämmare av detta protein-proteininteraktion, presenteras.

Metod för att identifiera små molekylhämmare av protein-proteininteraktion Mellan HCN1 och TRIP8b

Hyperpolarization-activated cyclic nucleotide-gated (HCN) channels are expressed ubiquitously throughout the brain, where they function to regulate the ...

Research

JoVE Journal

Biochemistry

Using Scaffold Liposomes to Reconstitute Lipid-proximal Protein-protein Interactions In Vitro

Using Scaffold Liposomes to Reconstitute Lipid-proximal Protein-protein Interactions In Vitro

Använda Scaffold Liposomer att återskapa Lipid-proximala protein-proteininteraktioner<em&gt; In Vitro</em

Studies of integral membrane proteins in vitro are frequently complicated by the presence of a hydrophobic transmembrane domain. Further complicating ...

Visualization of Protein-protein Interaction in Nuclear and Cytoplasmic Fractions by Co-immunoprecipitation and In Situ Proximity Ligation Assay

Visualization of Protein-protein Interaction in Nuclear and Cytoplasmic Fractions by Co-immunoprecipitation and In Situ Proximity Ligation Assay

Visualisering av protein-proteininteraktion i nukleära och cytoplasmiska fraktioner av Co-immunoprecipitation och<em&gt; In Situ</em&gt; Proximity Ligation Assay

Protein-protein interactions are involved in thousands of cellular processes and occur in distinct spatial context. Traditionally, co-immunoprecipitation ...

Capturing the Interaction Kinetics of an Ion Channel Protein with Small Molecules by the Bio-layer Interferometry Assay

Fånga interaktion kineticsen av en jonkanal Protein med små molekyler av Bio-lager interferometri analysen

The bio-layer interferometry (BLI) assay is a valuable tool for measuring protein-protein and protein-small molecule interactions. Here, we first describe ...

Titration ELISA as a Method to Determine the Dissociation Constant of Receptor Ligand Interaction

Titrering ELISA som en metod för att bestämma konstanten Dissociation av Receptor Ligand interaktion

The dissociation constant describes the interaction between two partners in the binding equilibrium and is a measure of their affinity. It is a crucial ...

Covalent Immobilization of Proteins for the Single Molecule Force Spectroscopy

Kovalent immobilisering av proteiner för den enda molekyl kraft spektroskopin

In recent years, atomic force microscopy (AFM) based single molecule force spectroscopy (SMFS) extended our understanding of molecular properties and ...

Proteome-wide Quantification of Labeling Homogeneity at the Single Molecule Level

Proteom-wide kvantifiering av märkning homogenitet på nivån enda molekyl

Cell proteomes are often characterized using electrophoresis assays, where all species of proteins in the cells are non-specifically labeled with a ...

A Semi-High-Throughput Adaptation of the NADH-Coupled ATPase Assay for Screening Small Molecule Inhibitors

En semi-High-genomströmning anpassning av NADH-kopplad ATPas-analys för screening av småmolekylära hämmare

ATPase enzymes utilize the free energy stored in adenosine triphosphate to catalyze a wide variety of endergonic biochemical processes in vivo that would ...

Native Cell Membrane Nanoparticles System for Membrane Protein-Protein Interaction Analysis

Inbyggt cellmembrannanopartiklar system för membranprotein-protein interaktionsanalys

Protein-protein interactions in cell membrane systems play crucial roles in a wide range of biological processes- from cell-to-cell interactions to signal ...

Identifying the Binding Proteins of Small Ligands with the Differential Radial Capillary Action of Ligand Assay (DRaCALA)

Identifying the Binding Proteins of Small Ligands with the Differential Radial Capillary Action of Ligand Assay DRaCALA

Identifiera de bindande proteinerna i små ligands med ligands differentialradiella kapillärverkan (DRaCALA)

The past decade has seen tremendous progress in the understanding of small signaling molecules in bacterial physiology. In particular, the target proteins ...

A High-Throughput Enzyme-Coupled Activity Assay to Probe Small Molecule Interaction with the dNTPase SAMHD1

Sterile alpha motif and HD domain-containing protein 1 (SAMHD1) is a pivotal regulator of intracellular deoxynucleoside triphosphate (dNTP) pools, as this ...