Name: method for identifying small molecule inhibitors of the protein-protein interaction between hcn1 and trip8b
Uploaded: 2016-11-11T14:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Method for Identifying Small Molecule Inhibitors of the Protein-protein Interaction Between HCN1 and TRIP8b at JoVE.com

This work was supported by National Institutes of Health Grant R21MH104471 and R01MH106511 (D.M.C.), Brain Research Foundation SG 2012-01 (D.M.C.), Northwestern University Clinical and Translational Sciences Institute 8UL1TR000150 (Y.H.), Chicago Biomedical Consortium HTS-004 (Y.H. and D.M.C.), and National Institutes of Health Grant 2T32MH067564 (K.L.). A part of this work was performed by the Northwestern University Medicinal and Synthetic Chemistry Core (ChemCore) at the Center for Molecular Innovation and Drug Discovery (CMIDD), which is funded by the Chicago Biomedical Consortium with support from the Searle Funds at the Chicago Community Trust and Cancer Center Support Grant P30 CA060553 from the National Cancer Institute awarded to the Robert H. Lurie Comprehensive Cancer Center. The high throughput screen work was performed in the High Throughput Analysis Laboratory which is also a core facility of the Robert H. Lurie Comprehensive Cancer Center.

TRIP8b (241-602) Protein 1. Saflaştırma <ol><li> Yeterli E. halinde bakteriyel protein ifade vektörü pGS21 3 (241-602) TRIP8b ihtiva eden plazmid Dönüşümü E. coli, üreticinin talimatlarına uygun olarak protein ekspresyonu için. Plaka Luria Broth (LB) kültürün 300 ul kloramfenikol ve Ampisilin 5 ug / ml -agar. 16 saat 37 ° C&#39;de inkübe plakası. </li><li> Sonraki gün, tek bir koloni kloramfenikol, ampisilin 50 ug / ml, 50 ml LB aşılamak için seçin. (Çalkalama ile),...

<ol>
	<li>Biel, M., Wahl-Schott, C., Michalakis, S., Zong, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hyperpolarization-activated+cation+channels:+from+genes+to+function.">Hyperpolarization-activated cation channels: from genes to function.</a> Physiol Rev. 89 (3), 847-885 (2009).</li><li>Shah, M. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=HCN1+channels:+a+new+therapeutic+target+for+depressive+disorders?.">HCN1 channels: a new therapeutic target for depressive disorders?.</a> Sci Signal. 5 (244), pe44 (2012).</li><li>Han, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+of+Small-Molecule+Inhibitors+of+Hyperpolarization-Activated+Cyclic+Nucleotide-Gated+Channels.">Identification of Small-Molecule Inhibitors of Hyperpolarization-Activated Cyclic Nucleotide-Gated Channels.</a> J Biomol Screen. 20 (9), 1124-1131 (2015).</li><li>Postea, O., Biel, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Exploring+HCN+channels+as+novel+drug+targets.">Exploring HCN channels as novel drug targets.</a> Nat Rev Drug Discov. 10 (12), (2011).</li><li>Stieber, J., Wieland, K., St&#246;ckl, G., Ludwig, A., Hofmann, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bradycardic+and+proarrhythmic+properties+of+sinus+node+inhibitors.">Bradycardic and proarrhythmic properties of sinus node inhibitors.</a> Mol Pharmacol. 69 (4), 1328-1337 (2006).</li><li>Santoro, B., Wainger, B. J., Siegelbaum, S. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regulation+of+HCN+channel+surface+expression+by+a+novel+C-terminal+protein-protein+interaction.">Regulation of HCN channel surface expression by a novel C-terminal protein-protein interaction.</a> J Neurosci. 24 (47), 10750-10762 (2004).</li><li>Lewis, A. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Deletion+of+the+hyperpolarization-activated+cyclic+nucleotide-gated+channel+auxiliary+subunit+TRIP8b+impairs+hippocampal+Ih+localization+and+function+and+promotes+antidepressant+behavior+in+mice.">Deletion of the hyperpolarization-activated cyclic nucleotide-gated channel auxiliary subunit TRIP8b impairs hippocampal Ih localization and function and promotes antidepressant behavior in mice.</a> J Neurosci. 31 (20), 7424-7440 (2011).</li><li>Heuermann, R. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reduction+of+thalamic+and+cortical+Ih+by+deletion+of+TRIP8b+produces+a+mouse+model+of+human+absence+epilepsy.">Reduction of thalamic and cortical Ih by deletion of TRIP8b produces a mouse model of human absence epilepsy.</a> Neurobiol Dis. 85, 81-92 (2016).</li><li>Steru, L., Chermat, R., Thierry, B., Simon, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+tail+suspension+test:+A+new+method+for+screening+antidepressants+in+mice.">The tail suspension test: A new method for screening antidepressants in mice.</a> Psychopharmacology. 85 (3), 367-370 (1985).</li><li>Petit-Demouliere, B., Chenu, F., Bourin, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Forced+swimming+test+in+mice:+a+review+of+antidepressant+activity.">Forced swimming test in mice: a review of antidepressant activity.</a> Psychopharmacology. 177 (3), 245-255 (2004).</li><li>Cryan, J. F., Mombereau, C., Vassout, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+tail+suspension+test+as+a+model+for+assessing+antidepressant+activity:+Review+of+pharmacological+and+genetic+studies+in+mice.">The tail suspension test as a model for assessing antidepressant activity: Review of pharmacological and genetic studies in mice.</a> Neurosci Biobehav Rev. 29 (4-5), 571-625 (2005).</li><li>Han, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Trafficking+and+gating+of+hyperpolarization-activated+cyclic+nucleotide-gated+channels+are+regulated+by+interaction+with+tetratricopeptide+repeat-containing+Rab8b-interacting+protein+(TRIP8b)+and+cyclic+AMP+at+distinct+sites.">Trafficking and gating of hyperpolarization-activated cyclic nucleotide-gated channels are regulated by interaction with tetratricopeptide repeat-containing Rab8b-interacting protein (TRIP8b) and cyclic AMP at distinct sites.</a> J Biol Chem. 286 (23), 20823-20834 (2011).</li><li>Hu, L., Santoro, B., Saponaro, A., Liu, H., Moroni, A., Siegelbaum, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Binding+of+the+auxiliary+subunit+TRIP8b+to+HCN+channels+shifts+the+mode+of+action+of+cAMP.">Binding of the auxiliary subunit TRIP8b to HCN channels shifts the mode of action of cAMP.</a> J Gen Physiol. 142 (6), 599-612 (2013).</li><li>Saponaro, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structural+basis+for+the+mutual+antagonism+of+cAMP+and+TRIP8b+in+regulating+HCN+channel+function.">Structural basis for the mutual antagonism of cAMP and TRIP8b in regulating HCN channel function.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 111 (40), 14577-14582 (2014).</li><li>Bankston, J. R., Camp, S. S., DiMaio, F., Lewis, A. S., Chetkovich, D. M., Zagotta, W. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structure+and+stoichiometry+of+an+accessory+subunit+TRIP8b+interaction+with+hyperpolarization-activated+cyclic+nucleotide-gated+channels.">Structure and stoichiometry of an accessory subunit TRIP8b interaction with hyperpolarization-activated cyclic nucleotide-gated channels.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 109 (20), 7899-7904 (2012).</li><li>Gatto, G. J., Geisbrecht, B. V., Gould, S. J., Berg, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Peroxisomal+targeting+signal-1+recognition+by+the+TPR+domains+of+human+PEX5.">Peroxisomal targeting signal-1 recognition by the TPR domains of human PEX5.</a> Nat Struct Biol. 7 (12), 1091-1095 (2000).</li><li>Owicki, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fluorescence+polarization+and+anisotropy+in+high+throughput+screening:+perspectives+and+primer.">Fluorescence polarization and anisotropy in high throughput screening: perspectives and primer.</a> J Biomol Screen. 5 (5), 297-306 (2000).</li><li>Smith, D. S., Eremin, S. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fluorescence+polarization+immunoassays+and+related+methods+for+simple,+high-throughput+screening+of+small+molecules.">Fluorescence polarization immunoassays and related methods for simple, high-throughput screening of small molecules.</a> Anal Bioanal Chem. 391 (5), 1499-1507 (2008).</li><li>Roehrl, M. H. A., Wang, J. Y., Wagner, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+general+framework+for+development+and+data+analysis+of+competitive+high-throughput+screens+for+small-molecule+inhibitors+of+protein-protein+interactions+by+fluorescence+polarization.">A general framework for development and data analysis of competitive high-throughput screens for small-molecule inhibitors of protein-protein interactions by fluorescence polarization.</a> Biochemistry. 43 (51), 16056-16066 (2004).</li><li>Arkin, M. R., Wells, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Small-molecule+inhibitors+of+protein-protein+interactions:+progressing+towards+the+dream.">Small-molecule inhibitors of protein-protein interactions: progressing towards the dream.</a> Nat Rev Drug Discov. 3 (4), 301-317 (2004).</li><li>Zhang, J., Chung, T., Oldenburg, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+Simple+Statistical+Parameter+for+Use+in+Evaluation+and+Validation+of+High+Throughput+Screening+Assays.">A Simple Statistical Parameter for Use in Evaluation and Validation of High Throughput Screening Assays.</a> J Biomol Screen. 4 (2), 67-73 (1999).</li><li>Eglen, R. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+use+of+AlphaScreen+technology+in+HTS:+current+status.">The use of AlphaScreen technology in HTS: current status.</a> Curr Cheml Genomics. 1 (1), 2-10 (2008).</li><li>Lehninger, A. L., Nelson, D. L., Cox, M. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Lehninger Principles of Biochemistry. , (2000).</li><li>Kim, C. S., Chang, P. Y., Johnston, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Enhancement+of+dorsal+hippocampal+activity+by+knockdown+of+HCN1+channels+leads+to+anxiolytic-+and+antidepressant-like+behaviors.">Enhancement of dorsal hippocampal activity by knockdown of HCN1 channels leads to anxiolytic- and antidepressant-like behaviors.</a> Neuron. 75 (3), 503-516 (2012).</li><li>Wahl-Schott, C., Biel, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=HCN+channels:+structure,+cellular+regulation+and+physiological+function.">HCN channels: structure, cellular regulation and physiological function.</a> Cell Mol Life Sci. 66 (3), 470-494 (2009).</li><li>DeBerg, H. A., Bankston, J. R., Rosenbaum, J. C., Brzovic, P. S., Zagotta, W. N., Stoll, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structural+Mechanism+for+the+Regulation+of+HCN+Ion+Channels+by+the+Accessory+Protein+TRIP8b.">Structural Mechanism for the Regulation of HCN Ion Channels by the Accessory Protein TRIP8b.</a> Structure. 23 (4), 734-744 (2015).</li><li>Weiss, J. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Hill+equation+revisited:+uses+and+misuses.">The Hill equation revisited: uses and misuses.</a> FASEB J. 11 (11), 835-841 (1997).</li><li>Prinz, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hill+coefficients,+dose-response+curves+and+allosteric+mechanisms.">Hill coefficients, dose-response curves and allosteric mechanisms.</a> J Chem Biol. 3 (1), 37-44 (2009).</li><li>Pollard, T. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+Guide+to+Simple+and+Informative+Binding+Assays.">A Guide to Simple and Informative Binding Assays.</a> Mol Biol Cell. 21 (23), 4061-4067 (2010).</li><li>Rossi, A. M., Taylor, C. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Analysis+of+protein-ligand+interactions+by+fluorescence+polarization.">Analysis of protein-ligand interactions by fluorescence polarization.</a> Nat Protoc. 6 (3), (2011).</li><li>Ryan, A. J., Gray, N. M., Lowe, P. N., Chung, C. -. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effect+of+Detergent+on+"Promiscuous"+Inhibitors.">Effect of Detergent on "Promiscuous" Inhibitors.</a> J Med Chem. 46 (16), 3448-3451 (2003).</li><li>McGovern, S. L., Caselli, E., Grigorieff, N., Shoichet, B. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+common+mechanism+underlying+promiscuous+inhibitors+from+virtual+and+high-throughput+screening.">A common mechanism underlying promiscuous inhibitors from virtual and high-throughput screening.</a> J Med Chem. 45 (8), 1712-1722 (2002).</li><li>Hertzberg, R. P., Pope, A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-throughput+screening:+new+technology+for+the+21st+century.">High-throughput screening: new technology for the 21st century.</a> Curr Opin Chem Biol. 4 (4), 445-451 (2000).</li><li>Sundberg, S. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-throughput+and+ultra-high-throughput+screening:+solution-and+cell-based+approaches.">High-throughput and ultra-high-throughput screening: solution-and cell-based approaches.</a> Curr Opin Biotechnol. 11 (1), (2000).</li></ol>

Çünkü MDD 24 bir tedavi hedefi olarak potansiyeli, merkezi sinir sisteminde 4 HCN kanal fonksiyonunu antagonize farmakolojik yaklaşımlar önemli ilgi olmuştur. Ancak bu çabalar kalp kalp vurusu HCN kanallarının önemli rolü ve aritmi 25 riski ile durmuş durumda. Biz HCN ve beyin özel yardımcı alt birimi, TRIP8b 8 arasındaki etkileşimi kesintiye kardiyak HCN kanalları 3 etkilemeden antidepresan benzeri etkiler üretmek için yeterli olabileceğini ge...

Hiperpolarizasyon aktive siklik nükleotid-kapılı (HCN) kanallar zarı uyarılımında 1 düzenlenmesinde önemli bir rol oynadıkları kalp ve merkezi sinir sisteminde ifade edilmiştir. HCN kanalları HCN kanal fonksiyonu farmakolojik açıdan sınırlayan MDD 3 için yeni bir tedavi olarak etkili olabileceğini önermek için çeşitli gruplar yol açmıştır Majör Depresif Bozukluk (MDB) 2, patogenezinde sorumlu tutulmuştur. Ancak, doğrudan HCN kanalları hedefleyen, çünkü kalp aksiyon potansiyeli 4 önemli rolleri bir canlı değildir. İvabradin, tek FDA HCN kanalı antagonisti onaylanmış bir bradikardik etki 5 üretilmesi için, kalp yetmezliğinin tedavisi için kullanılır. Bu nedenle, merkezi sinir sisteminde, sadece HCN kanalı fonksiyonunu sınırlar farmakolojik maddeler için bir ihtiyaç vardır. tekrar içeren tetratricopeptide Rab8b etkileşen protein (TRIP8b) beyin spesifik olanHCN kanalları 6,7 yüzey ekspresyonunu ve yerelleştirme kontrol HCN kanalları fic yardımcı alt birimi. TRIP8b genetik nakavt kalp 8 HCN ifade etkilemeden beyin HCN kanalları 7 bir azalmaya neden olur. İlginçtir, TRIP8b nakavt fareler zorla yüzmeye görev ve kuyruk süspansiyon görevi 7, antidepresan etkinliği 9-11 için iki yaygın olarak kullanılan tarama testlerinde daha az zaman hareketsiz geçirirler. Bu sonuçlar, doğrudan, HCN kanal işlevinin küçük bir molekül antagonisti ile HCN kanalları, hedefleme antidepresan benzeri bir davranış üretilmesi için yeterli olabilir TRIP8b ve HCN arasındaki etkileşimi kesintiye yerine işaret etmektedir. TRIP8b iki farklı bağlanma bölgelerinde HCN bağlanır. HCN&#39;nin siklik nükleotid bağlama alanı (CNBD) TRIP8b 12,13 TPR alanlarına TRIP8b bulunan N terminal korunmuş bir alan ile etkileşime girer. Bu katılan CNBD kalıntıları rağmenetkileşim 14 haritalanmıştır, ilgilenmektedir TRIP8b bölgesi bir-80-amino asit fragmanı 13 ötesinde daralmış edilmemiştir. İkinci etkileşim TRIP8b ve tetratricopeptide tekrar (TPR) etki ve HCN C terminal tripeptit (HCN1, HCN2 ve HCN4 içinde &#39;SNL&#39;, ama HCN3 içinde &#39;ANM&#39;) 3,12 arasında oluşur. Bu C kuyruk etkileşimin son zamanlarda çözülmüş kristal yapısı 15 5 (PEX5) peroxin, peroksizomal ithalat reseptörü arasındaki etkileşim için önemli yapısal benzerlik ortaya koymuştur ve onun tip 1 Peroksizomal hedefleyen dizileri (PTS1) 16 içeren, ortakları etkileşim. Her iki etkileşim siteleri HCN kanal fonksiyonu için gerekli olmasına rağmen, TRIP8b TPR etki ve HCN1 C terminali tripeptid arasındaki etkileşim baskın bağlanma yeri olarak hizmet vermektedir ve HCN yüzey ekspresyonunu düzenler. Bu nedenle, bu etkileşimin bu çalışmada hedefleme site olarak seçildi.Bir referans TRIP8b ve HCN arasındaki etkileşim yapılır yazının, geri kalanı için, o sevk edilirken bu etkileşimdir. Bu etkileşim içeren onun korunmuş Cı terminaline HCN C terminal kuyruğu (kalıntılar TRIP8b 1a-4 izoform 241-602) 3 bağlanması için gerekli TPR etki gelen TRIP8b bir yüksek derecede çözünür bir parçası tarafından değinmeyecek. Bu etkileşimini bozabildiklerini küçük molekülleri tanımlamak için bir yüksek girdi boyunca araştırma geliştirmek için bir floresan polarizasyon (FP) deneyi 17 kullanılmıştır tabanlı. Floresan polarizasyon polarize ışık ve yayılan floresan 18 polarizasyon derecesinin ölçülmesi ile florofor-etiketli ligandın uyarım dayanır. Bir bağlanma partneri varlığında, floresan ligandının dönme hareketi kısıtlanır ve polarize ışık 19 çıkar. bir bağlanma partneri, T yokluğundaO ligandın dönme hareketi depolarize ışığın yayılmasına neden olur. Kapalı protokol, Nikel nitrilotriasetik asit (Ni-NTA) boncuklar kullanılarak N-terminal-etiketli (6xHis) TRIP8b saflaştırılması (241-602) için bir yöntem sunulmaktadır. Benzer bir protokol protokolü aşama 7&#39;de kullanılan glutation-S-transferaz (GST) etiketli Cı HCN1 terminal 40 amino asitleri (HCN1 C40) saflaştırmak için kullanıldı. uzay hususlar için bu prosedürün ayrıntılı bir açıklaması ihmal edildi. Protokol 7. adımda 2&#39;de, yüksek verimli tarama akışı (Şekil 1 e bakınız) verilmiştir. Protein-protein etkileşimleri yüksek verimli tarama için oldukça zordur hedef ve okuyucular konu 20 ek kaynak bulmak için tavsiye edilir. 2. adımları ve prosedürün 3 fo inşa saflaştırılmış TRIP8b (241-602) in vitro afinite karakterizeRA floresein izotiosiyanat (FITC) HCN1 (HCN1 FITC) C terminal kuyruğu tekabül eden on bir amino asit peptidi etiketli. TRIP8b-HCN kompleksi 15 kristal yapısına göre, bu on bir amino asit segmenti TRIP8b (241-602) bağlanma sağlamak için yeterlidir. Adım 2&#39;de, etkileşim Kd HCN1 FITC sabit bir konsantrasyonu (241-602) TRIP8b titre ile ölçülür. Aşama 3&#39;te, aşama 2&#39;de kullanılan HCN peptidin etiketlenmemiş versiyonu FITC etiketi bağlanmasını engellemeye, incelemek için her iki TRIP8b (241-602) ve HCN1 FITC sabit bir konsantrasyonu titre edilir. Bu deneyler, yüksek girdi boyunca kullanılan TRIP8b (241-602) ve HCN1 FITC uygun konsantrasyonlarının seçilmesinde için gereklidir. Yüksek girdi boyunca araştırma öncül bir dec üretecek TRIP8b (241-602) ile HCN1 FITC arasındaki etkileşimi kesintiye yeteneğine sahip küçük moleküllüPolarize ışık içinde artma. Aşama 4&#39;te, tahlil Z faktörü deneyi yüksek verimli tarama teknikleri (aşama 5) için uygun olduğundan emin olmak için TRIP8b (241-602) ve HCN1 FITC belirli bir konsantrasyonu için 21 hesaplanmıştır. 6 ve 7 ilköğretim yüksek kapasiteli ekranında tanımlanan isabet TRIP8b (241-602) ve HCN1 FITC arasında yerine spesifik olmayan mekanizma yoluyla etkileşim bozarak hareket onaylamak için doğrulama deneyleri vardır Adımları. Adım 6&#39;da, carboxytetramethylrhodamine (TAMRA) HCN1 peptit (HCN1 TAMRA) FITC etiketi kullanılarak AP deneyi tehlikeye floresan bileşikler filtre bir başka benzer floresan polarizasyon tahlili kullanılan bir etiketli. Adım 7 daha büyük bir HCN1 Cı terminal parçası (HCN1 C40) kullanır ve proteinler etkileşerek birbirine yaklaştırılır bir alıcı boncuk bir takviye kordonu bir tekli oksijen &#39;tünel&#39; göre bir tane bazlı yakınlığı deneyi kullanmaktadır 22.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Ni-NTA agarose&#160;</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>30210</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dialysis cassette&#160;</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>66456</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Isopropyl b-D-1-thiogalactopyranoside&#160;</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>I5502-1G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>384 Well Black plate&#160;</td>
			<td>Corning</td>
			<td>3820</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Proxiplate&#160;</td>
			<td>Perkin-Elmer&#160;</td>
			<td>6008289</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-GST Acceptor beads&#160;</td>
			<td>Perkin-Elmer&#160;</td>
			<td>6760603C</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NiChelate</td>
			<td>Perkin-Elmer&#160;</td>
			<td>AS101D</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pGS21-a</td>
			<td>Genscript</td>
			<td>SD0121</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PMSF</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>10837091001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Coomassie Kit</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>23200</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Protein concentrator</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>88527</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Perkin Elmer Enspire Multimode Plate reader</td>
			<td>Perkin-Elmer&#160;</td>
			<td>#2300-001M</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BL21 (DE3) Competent Cells</td>
			<td>Agilent</td>
			<td>200131</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

method for identifying small molecule inhibitors of the protein-protein interaction between hcn1 and trip8b

Hiperpolarizasyon aktive siklik nükleotid kapılı (HCN) kanallar nöron heyecanlanma düzenleyen işlev beyin boyunca yayg ifade edilmiştir. hipokamp alanı CA1 piramidal nöronlarda bu kanallar hücre içi dağılımı tetratricopeptide tekrar içeren Rab8b etkileşen protein (TRIP8b), bir yardımcı alt birimi tarafından kontrol edilir. HCN genetik nakavt HCN kanallarının işlevini sınırlayan Majör Depresif Bozukluk (MDB) için bir tedavi olarak yararlı olabileceğini düşündüren, alt birimler veya TRIP8b, antidepresan benzeri davranışlar artışa hem de kurşun oluşturan gözenek. önemli terapötik ilgiye rağmen, HCN kanalları da onlar ritmini düzenleyen kalp, ifade edilmektedir. Kalp HCN kanalları bloke ile ilişkili hedef dışı sorunları aşmak için, bizim laboratuvar son zamanlarda özellikle beyinde HCN kanal fonksiyonunu bozabilir için HCN ve TRIP8b arasında protein-protein etkileşimi hedef önerdi.Burada odak noktası TRIP8b ve tetratricopeptide tekrar (TPR) etki ve HCN1 C terminal kuyruğu arasındaki etkileşim üzerinde olmasına rağmen TRIP8b, iki farklı etkileşim siteleri alt birimlerini oluşturan HCN gözenek bağlanır. Bu protokol, TRIP8b saflaştırılması ve HCN ve TRIP8b arasındaki etkileşimin küçük moleküllü inhibitörleri belirlemek için bir yüksek girdi boyunca araştırma gerçekleştirilmesi için bir yöntemin bir genişletilmiş tarifinde tarif edilmektedir. yüksek veri akışı tarama yöntemi olup floresan polarizasyon (FP) HCN1 Cı terminal kuyruğu tekabül eden asit peptidi, amino, bir florofor ile işaretlenmiş olan on bir büyük TRIP8b fragmanının bağlanmasını izlemek için tahlil tabanlı kullanmaktadır. Bu yöntem, izin verir &#39;hit&#39; bileşikler yayılan ışığın polarizasyon değişikliği dayalı tespit edilecek. Doğrulama deneyleri sonra bileşikler artefakt değildir &#39;hit&#39; emin olmak için yapılır.

Daha önceki yayın ile telif hakkı sorunları önlemek için, bir TAMRA-etiketli sonda HCN1 TAMRA Şekil 2 ve 3 üretmek için kullanıldı. Bu ikame sonuçlarında kayda değer bir fark olmadığını unutmayın ve protokoller HCN1 FITC ile yukarıda özetlenen aynıdır. HCN1 TAMRA, TRIP8b (241-602) ile etkileşimi ölçmek için Adım 2 (Şekil 2) belirtilen protokol kullanılarak HCN1 TAMRA</su...

Watch this Scientific Journal Video about Method for Identifying Small Molecule Inhibitors of the Protein-protein Interaction Between HCN1 and TRIP8b at JoVE.com

Method for Identifying Small Molecule Inhibitors of the Protein-protein Interaction Between HCN1 and TRIP8b

HCN kanalları ve bunların yardımcı alt birimi arasındaki etkileşim Majör Depresif Bozukluk bir tedavi hedefi olarak tespit edilmiştir. Burada, bu protein-protein etkileşimi, küçük molekül inhibitörleri belirlemek için bir floresan polarizasyon tabanlı bir yöntem sunulmuştur.

Yöntem HCN1 ve TRIP8b arasında protein-protein etkileşimi küçük molekül önleyicilerinin tespit edilmesi için

Hyperpolarization-activated cyclic nucleotide-gated (HCN) channels are expressed ubiquitously throughout the brain, where they function to regulate the ...

Research

JoVE Journal

Biochemistry

Using Scaffold Liposomes to Reconstitute Lipid-proximal Protein-protein Interactions In Vitro

Using Scaffold Liposomes to Reconstitute Lipid-proximal Protein-protein Interactions In Vitro

İskele Lipozomlar kullanarak Lipid-proksimal protein-protein etkileşimleri Sulandırın için<em&gt; İn Vitro</em

Studies of integral membrane proteins in vitro are frequently complicated by the presence of a hydrophobic transmembrane domain. Further complicating ...

Visualization of Protein-protein Interaction in Nuclear and Cytoplasmic Fractions by Co-immunoprecipitation and In Situ Proximity Ligation Assay

Visualization of Protein-protein Interaction in Nuclear and Cytoplasmic Fractions by Co-immunoprecipitation and In Situ Proximity Ligation Assay

Co-immunoprecipitation tarafından Nükleer ve Sitoplazmik Kesirler Protein-protein Etkileşim görselleştirme ve<em&gt; In Situ</em&gt; Proximity ligasyon Testi

Protein-protein interactions are involved in thousands of cellular processes and occur in distinct spatial context. Traditionally, co-immunoprecipitation ...

Capturing the Interaction Kinetics of an Ion Channel Protein with Small Molecules by the Bio-layer Interferometry Assay

Bir iyon kanal protein biyo-katman Interferometry tahlil tarafından küçük molekülleri ile etkileşimi Kinetik yakalama

The bio-layer interferometry (BLI) assay is a valuable tool for measuring protein-protein and protein-small molecule interactions. Here, we first describe ...

Titration ELISA as a Method to Determine the Dissociation Constant of Receptor Ligand Interaction

Titrasyon ELISA reseptör Ligand etkileşim ayrışma sabiti belirlemek için bir yöntem olarak

The dissociation constant describes the interaction between two partners in the binding equilibrium and is a measure of their affinity. It is a crucial ...

Covalent Immobilization of Proteins for the Single Molecule Force Spectroscopy

Proteinler kovalent immobilizasyon için tek molekül kuvvet spektroskopisi

In recent years, atomic force microscopy (AFM) based single molecule force spectroscopy (SMFS) extended our understanding of molecular properties and ...

Proteome-wide Quantification of Labeling Homogeneity at the Single Molecule Level

Proteom çapında Quantification maddelerinin homojenliği tek molekül düzeyinde etiketlenmesi

Cell proteomes are often characterized using electrophoresis assays, where all species of proteins in the cells are non-specifically labeled with a ...

A Semi-High-Throughput Adaptation of the NADH-Coupled ATPase Assay for Screening Small Molecule Inhibitors

Küçük Molekül Inhibitörlerinin Taranması için NADH-Coupled ATPase Tsay'ın Yarı-Yüksek İş-İşLenme Adaptasyonu

ATPase enzymes utilize the free energy stored in adenosine triphosphate to catalyze a wide variety of endergonic biochemical processes in vivo that would ...

Native Cell Membrane Nanoparticles System for Membrane Protein-Protein Interaction Analysis

Membran Protein-Protein Etkileşim Analizi için Yerli Hücreli Membran Nanopartiküller Sistemi

Protein-protein interactions in cell membrane systems play crucial roles in a wide range of biological processes- from cell-to-cell interactions to signal ...

Identifying the Binding Proteins of Small Ligands with the Differential Radial Capillary Action of Ligand Assay (DRaCALA)

Identifying the Binding Proteins of Small Ligands with the Differential Radial Capillary Action of Ligand Assay DRaCALA

Ligand Tahlilinin Diferansiyel Radyal Kılcal Etkisi ile Küçük Ligandların Bağlayıcı Proteinlerinin Tanımlanması (DRaCALA)

The past decade has seen tremendous progress in the understanding of small signaling molecules in bacterial physiology. In particular, the target proteins ...

A High-Throughput Enzyme-Coupled Activity Assay to Probe Small Molecule Interaction with the dNTPase SAMHD1

Sterile alpha motif and HD domain-containing protein 1 (SAMHD1) is a pivotal regulator of intracellular deoxynucleoside triphosphate (dNTP) pools, as this ...