Name: methods to examine the lymph gland and hemocytes in drosophila larvae
Uploaded: 2016-11-28T14:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Methods to Examine the Lymph Gland and Hemocytes in Drosophila Larvae at JoVE.com

We thank Matthew O'Connell, Maryam Jahanshahi, and Andreas Jenny for assistance. We thank Istv&#225;n And&#243; for plasmatocyte-specific antibodies, Utpal Banerjee for dome-meso-EBFP2 flies, Julian Martinez-Agosto for antp&gt;GFP flies, and Michael O'Connor for ptth and ptth&gt;grim flies. These methods were developed with support by the Kimmel Foundation, the Leukemia &amp; Lymphoma Society, NIH/NCI R01CA140451, NSF 1257939, DOD/NFRP W81XWH-14-1-0059, and NIH/NCI T32CA078207.

1. Circulação Concentração hemócito <ol><li> Para obter larvas de aproximadamente o mesmo estágio de desenvolvimento para este ensaio, restringir coleta de ovos, permitindo que as fêmeas põem ovos por um período de tempo fixo de 2-6 hr. </li><li> Recolhe larvas em dissecar poços cheia com fosfato 1x solução salina tamponada (PBS, Tabela 1). </li><li> Para cada larva, colocar 10 ul de 1x PBS num tubo de microcentrífuga em gelo e 10 ul de PBS 1x sobre uma almofada de dissecação limpo. Col...

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	<li>Evans, C. J., Hartenstein, V., Banerjee, U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Thicker+than+blood:+conserved+mechanisms+in+Drosophila+and+vertebrate+hematopoiesis.">Thicker than blood: conserved mechanisms in Drosophila and vertebrate hematopoiesis.</a> Dev Cell. 5 (5), 673-690 (2003).</li><li>Crozatier, M., Meister, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Drosophila+haematopoiesis.">Drosophila haematopoiesis.</a> Cell Microbiol. 9 (5), 1117-1126 (2007).</li><li>Crozatier, M., Vincent, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Drosophila:+a+model+for+studying+genetic+and+molecular+aspects+of+haematopoiesis+and+associated+leukaemias.">Drosophila: a model for studying genetic and molecular aspects of haematopoiesis and associated leukaemias.</a> Dis Model Mech. 4 (4), 439-445 (2011).</li><li>Gold, K. S., Bruckner, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Drosophila+as+a+model+for+the+two+myeloid+blood+cell+systems+in+vertebrates.">Drosophila as a model for the two myeloid blood cell systems in vertebrates.</a> Exp Hematol. 42 (8), 717-727 (2014).</li><li>Hartenstein, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Blood+cells+and+blood+cell+development+in+the+animal+kingdom.">Blood cells and blood cell development in the animal kingdom.</a> Annu Rev Cell Dev Biol. 22, 677-712 (2006).</li><li>Ghosh, S., Singh, A., Mandal, S., Mandal, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Active+hematopoietic+hubs+in+Drosophila+adults+generate+hemocytes+and+contribute+to+immune+response.">Active hematopoietic hubs in Drosophila adults generate hemocytes and contribute to immune response.</a> Dev Cell. 33 (4), 478-488 (2015).</li><li>Leitao, A. B., Sucena, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Drosophila+sessile+hemocyte+clusters+are+true+hematopoietic+tissues+that+regulate+larval+blood+cell+differentiation.">Drosophila sessile hemocyte clusters are true hematopoietic tissues that regulate larval blood cell differentiation.</a> Elife. 4, (2015).</li><li>Makhijani, K., Alexander, B., Tanaka, T., Rulifson, E., Bruckner, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+peripheral+nervous+system+supports+blood+cell+homing+and+survival+in+the+Drosophila+larva.">The peripheral nervous system supports blood cell homing and survival in the Drosophila larva.</a> Development. 138 (24), 5379-5391 (2011).</li><li>Crozatier, M., Ubeda, J. M., Vincent, A., Meister, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cellular+immune+response+to+parasitization+in+Drosophila+requires+the+EBF+orthologue+collier.">Cellular immune response to parasitization in Drosophila requires the EBF orthologue collier.</a> PLoS Biol. 2 (8), 196 (2004).</li><li>Markus, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sessile+hemocytes+as+a+hematopoietic+compartment+in+Drosophila+melanogaster.">Sessile hemocytes as a hematopoietic compartment in Drosophila melanogaster.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 106 (12), 4805-4809 (2009).</li><li>Minakhina, S., Steward, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Melanotic+mutants+in+Drosophila:+pathways+and+phenotypes.">Melanotic mutants in Drosophila: pathways and phenotypes.</a> Genetics. 174 (1), 253-263 (2006).</li><li>Bina, S., Wright, V. M., Fisher, K. H., Milo, M., Zeidler, M. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transcriptional+targets+of+Drosophila+JAK/STAT+pathway+signalling+as+effectors+of+haematopoietic+tumour+formation.">Transcriptional targets of Drosophila JAK/STAT pathway signalling as effectors of haematopoietic tumour formation.</a> EMBO Rep. 11 (3), 201-207 (2010).</li><li>Avet-Rochex, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+in+vivo+RNA+interference+screen+identifies+gene+networks+controlling+Drosophila+melanogaster+blood+cell+homeostasis.">An in vivo RNA interference screen identifies gene networks controlling Drosophila melanogaster blood cell homeostasis.</a> BMC Dev Biol. 10, 65 (2010).</li><li>Rodriguez, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+of+immune+system+and+response+genes,+and+novel+mutations+causing+melanotic+tumor+formation+in+Drosophila+melanogaster.">Identification of immune system and response genes, and novel mutations causing melanotic tumor formation in Drosophila melanogaster.</a> Genetics. 143 (2), 929-940 (1996).</li><li>Mandal, L., Banerjee, U., Hartenstein, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evidence+for+a+fruit+fly+hemangioblast+and+similarities+between+lymph-gland+hematopoiesis+in+fruit+fly+and+mammal+aorta-gonadal-mesonephros+mesoderm.">Evidence for a fruit fly hemangioblast and similarities between lymph-gland hematopoiesis in fruit fly and mammal aorta-gonadal-mesonephros mesoderm.</a> Nat Genet. 36 (9), 1019-1023 (2004).</li><li>Grigorian, M., Mandal, L., Hakimi, M., Ortiz, I., Hartenstein, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+convergence+of+Notch+and+MAPK+signaling+specifies+the+blood+progenitor+fate+in+the+Drosophila+mesoderm.">The convergence of Notch and MAPK signaling specifies the blood progenitor fate in the Drosophila mesoderm.</a> Dev Biol. 353 (1), 105-118 (2011).</li><li>Lebestky, T., Jung, S. H., Banerjee, U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+Serrate-expressing+signaling+center+controls+Drosophila+hematopoiesis.">A Serrate-expressing signaling center controls Drosophila hematopoiesis.</a> Genes Dev. 17 (3), 348-353 (2003).</li><li>Krzemien, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Control+of+blood+cell+homeostasis+in+Drosophila+larvae+by+the+posterior+signalling+centre.">Control of blood cell homeostasis in Drosophila larvae by the posterior signalling centre.</a> Nature. 446 (7133), 325-328 (2007).</li><li>Mandal, L., Martinez-Agosto, J. A., Evans, C. J., Hartenstein, V., Banerjee, U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+Hedgehog-+and+Antennapedia-dependent+niche+maintains+Drosophila+haematopoietic+precursors.">A Hedgehog- and Antennapedia-dependent niche maintains Drosophila haematopoietic precursors.</a> Nature. 446 (7133), 320-324 (2007).</li><li>Benmimoun, B., Polesello, C., Haenlin, M., Waltzer, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+EBF+transcription+factor+Collier+directly+promotes+Drosophila+blood+cell+progenitor+maintenance+independently+of+the+niche.">The EBF transcription factor Collier directly promotes Drosophila blood cell progenitor maintenance independently of the niche.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 112 (29), 9052-9057 (2015).</li><li>Sinenko, S. A., Mandal, L., Martinez-Agosto, J. A., Banerjee, U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dual+role+of+wingless+signaling+in+stem-like+hematopoietic+precursor+maintenance+in+Drosophila.">Dual role of wingless signaling in stem-like hematopoietic precursor maintenance in Drosophila.</a> Dev Cell. 16 (5), 756-763 (2009).</li><li>Pennetier, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Size+control+of+the+Drosophila+hematopoietic+niche+by+bone+morphogenetic+protein+signaling+reveals+parallels+with+mammals.">Size control of the Drosophila hematopoietic niche by bone morphogenetic protein signaling reveals parallels with mammals.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 109 (9), 3389-3394 (2012).</li><li>Dragojlovic-Munther, M., Martinez-Agosto, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Extracellular+matrix-modulated+Heartless+signaling+in+Drosophila+blood+progenitors+regulates+their+differentiation+via+a+Ras/ETS/FOG+pathway+and+target+of+rapamycin+function.">Extracellular matrix-modulated Heartless signaling in Drosophila blood progenitors regulates their differentiation via a Ras/ETS/FOG pathway and target of rapamycin function.</a> Dev Biol. 384 (2), 313-330 (2013).</li><li>Ferguson, G. B., Martinez-Agosto, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Yorkie+and+Scalloped+signaling+regulates+Notch-dependent+lineage+specification+during+Drosophila+hematopoiesis.">Yorkie and Scalloped signaling regulates Notch-dependent lineage specification during Drosophila hematopoiesis.</a> Curr Biol. 24 (22), 2665-2672 (2014).</li><li>Milton, C. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Hippo+pathway+regulates+hematopoiesis+in+Drosophila+melanogaster.">The Hippo pathway regulates hematopoiesis in Drosophila melanogaster.</a> Curr Biol. 24 (22), 2673-2680 (2014).</li><li>Evans, C. J., Liu, T., Banerjee, U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Drosophila+hematopoiesis:+Markers+and+methods+for+molecular+genetic+analysis.">Drosophila hematopoiesis: Markers and methods for molecular genetic analysis.</a> Methods. 68 (1), 242-251 (2014).</li><li>Neyen, C., Bretscher, A. J., Binggeli, O., Lemaitre, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Methods+to+study+Drosophila+immunity.">Methods to study Drosophila immunity.</a> Methods. 68 (1), 116-128 (2014).</li><li>Small, C., Paddibhatla, I., Rajwani, R., Govind, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+introduction+to+parasitic+wasps+of+Drosophila+and+the+antiparasite+immune+response.">An introduction to parasitic wasps of Drosophila and the antiparasite immune response.</a> J Vis Exp. (63), e3347 (2012).</li><li>Petraki, S., Alexander, B., Bruckner, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Assaying+Blood+Cell+Populations+of+the+Drosophila+melanogaster+Larva.">Assaying Blood Cell Populations of the Drosophila melanogaster Larva.</a> J Vis Exp. (105), (2015).</li><li>Rizki, M. T. M., Rizki, R. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Functional+significance+of+the+crystal+cells+in+the+larva+of+Drosophila+mekmogaster.">Functional significance of the crystal cells in the larva of Drosophila mekmogaster.</a> Journal of Biophysical and Biochemical Cytology. 5, 235-240 (1959).</li><li>Kurucz, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Definition+of+Drosophila+hemocyte+subsets+by+cell-type+specific+antigens.">Definition of Drosophila hemocyte subsets by cell-type specific antigens.</a> Acta Biol Hung. 58, 95-111 (2007).</li><li>Jung, S. H., Evans, C. J., Uemura, C., Banerjee, U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Drosophila+lymph+gland+as+a+developmental+model+of+hematopoiesis.">The Drosophila lymph gland as a developmental model of hematopoiesis.</a> Development. 132 (11), 2521-2533 (2005).</li><li>Krzemien, J., Crozatier, M., Vincent, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ontogeny+of+the+Drosophila+larval+hematopoietic+organ,+hemocyte+homeostasis+and+the+dedicated+cellular+immune+response+to+parasitism.">Ontogeny of the Drosophila larval hematopoietic organ, hemocyte homeostasis and the dedicated cellular immune response to parasitism.</a> Int J Dev Biol. 54 (6-7), 1117-1125 (2010).</li><li>Rizki, T. M., Rizki, R. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Properties+of+the+Larval+Hemocytes+of+Drosophila-Melanogaster.">Properties of the Larval Hemocytes of Drosophila-Melanogaster.</a> Experientia. 36 (10), 1223-1226 (1980).</li><li>Lanot, R., Zachary, D., Holder, F., Meister, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Postembryonic+hematopoiesis+in+Drosophila.">Postembryonic hematopoiesis in Drosophila.</a> Dev Biol. 230 (2), 243-257 (2001).</li><li>McBrayer, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Prothoracicotropic+hormone+regulates+developmental+timing+and+body+size+in+Drosophila.">Prothoracicotropic hormone regulates developmental timing and body size in Drosophila.</a> Dev Cell. 13 (6), 857-871 (2007).</li><li>Reimels, T. A., Pfleger, C. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Drosophila+Rabex-5+restricts+Notch+activity+in+hematopoietic+cells+and+maintains+hematopoietic+homeostasis.">Drosophila Rabex-5 restricts Notch activity in hematopoietic cells and maintains hematopoietic homeostasis.</a> J Cell Sci. 128 (24), 4512-4525 (2015).</li></ol>

Após a alteração genética ou ambiental, os quatro métodos descritos aqui podem ser utilizados individualmente ou em conjunto para analisar processos distintos durante a hematopoiese, tais como sinalização, a sobrevivência, a proliferação, a diferenciação e a hematopoiese de Drosophila é um processo dinâmico.; o número de hemócitos por animal aumenta 35 e a expressão do gene e a estrutura do gânglio linfático muda 32 durante o desenvolvimento. Antes da realização do ens...

Os complexos mecanismos que regulam os factores de transcrição e as vias de sinalização que coordenam o desenvolvimento do sistema hematopoiético e que o mau funcionamento nas doenças hematológicas permanecem pouco compreendidos. Estes factores de transcrição e as vias de sinalização, bem como a sua regulação, são altamente conservados entre mamíferos a Drosophila e hematopoiese 1-5. Assim, o sistema hematopoiético de Drosophila representa um excelente modelo genético para definir os mecanismos moleculares que controlam a hematopoiese e doenças hematológicas subjacentes. Semelhante a mamíferos, Drosophila gerar células sanguíneas, chamados hemócitos, em espacial e temporalmente distintas fases da hematopoiese. Tradicionalmente, a hematopoiese de Drosophila foi pensado para ser limitada a fases na mesoderme embrionária e no gânglio linfático larvar. Estudos recentes fornecem evidências de que a hematopoiese também ocorre em Clu sésseis larvalsters e no abdômen adulto 6-8. Todas as fases hematopoiéticas produzem dois tipos de hemócitos maduros: plasmatócitos e células de cristal. Plasmatócitos são células de macrófagos-like envolvidos na fagocitose, a imunidade inata, e cicatrização de feridas. células de cristal conter pro-fenoloxidases necessários para melanização, uma reacção utilizado nas respostas imunes de insectos e cicatrização de feridas. Hematopoiese larval pode gerar um terceiro tipo de hemócitos madura, um chamado lamellocyte, em resposta a certos desafios imunológicos tais como infecção parasitóides vespa 9,10. Lamellocytes são células grandes e aderentes que funcionam, em conjunto com plasmatócitos e células de cristal, para encapsular e neutralizar os ovos de vespa estabelecidas em larvas de Drosophila. Na ausência de parasitismo, lamellocytes não são encontradas no tipo selvagem larvas. massas melanotic assemelham melanizadas, ovos de vespa encapsulados; muitas estirpes mutantes de Drosophila desenvolver massas melanóticos na ausência de parasitismo. A presença de Lamellocitos e / ou massas melanóticos pode ser indicativo de anormalidades hematopoiéticas. Na verdade, o fenótipo de massa melanóticos foi usado para identificar genes e vias envolvidas na hematopoiese 11-14. O sistema hematopoiético larval é a mais estudada até o momento. É composto de hemócitos circulantes na hemolinfa, aglomerados de hemócitos sésseis modelado sob a cutícula, e hemócitos residente no gânglio linfático. O gânglio linfático é uma série de lóbulos bilaterais ligados ao vaso dorsal. Cada lóbulo principal da glândula linfa é dividido em três zonas principais. A zona mais externa é conhecida como a zona cortical e contém amadurecimento hemócitos. A zona mais interior é chamado a zona medular e é composta de precursores de hemócitos quiescentes. A terceira zona, o centro de sinalização posterior, é um pequeno grupo de células na base do gânglio linfático que actuam como um nicho de células-tronco como. Os primeiros trabalhos estabelecida funções críticas para Notch 15-18 </sup&gt;, Hedgehog 19,20, JAK-STAT 18 e atividade Wingless 21 para regular o desenvolvimento da glândula linfática larval. Estudos mais recentes têm demonstrado que a BMP 22, FGF-23 de Ras, e Hipopótamo 24,25 sinalização também funcionar dentro do gânglio linfático larvar. Quatro ensaios hematopoiéticas larvais descritas aqui descrever 1) de medição de circulação concentração de hemócitos, definida como o número de células por unidade de volume, 2) isolamento e fixação hemócitos circulantes para imuno-histoquímica, 3) a visualização de células de cristal in vivo, e 4) de dissecação, de fixação e de montagem gânglios linfáticos para imuno-histoquímica. Estes ensaios podem ser usados ​​como leituras hematopoiéticas para avaliar as funções e os regulamentos de vias de sinalização no sistema hematopoiético das larvas. Embora estes métodos tenham sido utilizados anteriormente no campo, documentação visual destes ensaios só recentemente começou 8,26-30. Várias publicações citadas aqui são de ajudaful recursos que descrevem métodos semelhantes e marcadores hematopoiéticas 26,31-33. Além disso, Trol e Viking são marcadores úteis da membrana linfático glândula porão.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="804">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:229px;">PBS tablets</td>
			<td style="width:176px;">MP Biomedicals</td>
			<td style="width:163px;">2810305</td>
			<td style="width:236px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:229px;">dissecting dish</td>
			<td style="width:176px;">Corning</td>
			<td style="width:163px;">7220-85</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:229px;">microcentrifuge tube</td>
			<td style="width:176px;">Denville</td>
			<td style="width:163px;">C2170</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="84">
			<td height="84" style="height:84px;width:229px;">silicone dissecting pad, made from Sylgard 184 kit</td>
			<td style="width:176px;">Krayden (distributed through Fisher)</td>
			<td style="width:163px;">NC9644388 (Fisher catalog number)</td>
			<td style="width:236px;">Made in petri dish by mixing components of Sylgard elastomer kit according to manufacturer instructions.</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:229px;">stereomicroscope</td>
			<td style="width:176px;">Morrell Instruments (Nikon distributor)</td>
			<td>mna42000, mma36300</td>
			<td>Nikon models SMZ1000 and SMZ645</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:229px;">tissue wipe</td>
			<td style="width:176px;">VWR</td>
			<td style="width:163px;">82003-820</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:229px;">forceps</td>
			<td style="width:176px;">Electron Microscopy Sciences</td>
			<td style="width:163px;">72700-DZ</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:229px;">p200 pipette</td>
			<td style="width:176px;">Eppendorf</td>
			<td>3120000054</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:229px;">Countess Automated Cell Counter</td>
			<td style="width:176px;">Invitrogen</td>
			<td style="width:163px;">C10227</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:229px;">Countess cell counting chamber slides</td>
			<td style="width:176px;">Invitrogen</td>
			<td style="width:163px;">C10283</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:229px;">hemocytometer</td>
			<td style="width:176px;">Hausser Scientific</td>
			<td style="width:163px;">3200</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:229px;">trypan blue stain</td>
			<td style="width:176px;">Life Technologies</td>
			<td style="width:163px;">T10282</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:229px;">formaldehyde</td>
			<td style="width:176px;">Fisher</td>
			<td style="width:163px;">BP531-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:229px;">Triton</td>
			<td style="width:176px;">Fisher</td>
			<td style="width:163px;">BP151-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:229px;">Tween 20</td>
			<td style="width:176px;">Fisher</td>
			<td style="width:163px;">BP337-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:229px;">bovine serum albumin</td>
			<td style="width:176px;">Rocky Mountain Biologicals</td>
			<td style="width:163px;">BSA-BSH-01K</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:229px;">normal goat serum</td>
			<td style="width:176px;">Sigma</td>
			<td style="width:163px;">G9023-10ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:229px;">normal donkey serum</td>
			<td style="width:176px;">Sigma</td>
			<td style="width:163px;">D9663-10ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:229px;">200 proof ethanol</td>
			<td style="width:176px;">VWR</td>
			<td style="width:163px;">V1001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:229px;">N-propyl gallate</td>
			<td style="width:176px;">MP Biomedicals</td>
			<td style="width:163px;">102747</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:229px;">glycerol</td>
			<td style="width:176px;">VWR</td>
			<td style="width:163px;">EM-4750</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:229px;">DAPI (4&#8217;,6-diamidino-2-phenylindole)</td>
			<td style="width:176px;">Fisher</td>
			<td>62248</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:229px;">6-well plate</td>
			<td style="width:176px;">Corning</td>
			<td style="width:163px;">351146</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:229px;">12-well plate</td>
			<td style="width:176px;">Corning</td>
			<td style="width:163px;">351143</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:229px;">microscope cover glass, 22 mm square</td>
			<td style="width:176px;">Fisher</td>
			<td style="width:163px;">12-544-10</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:229px;">microscope cover glass, 18mm circular</td>
			<td style="width:176px;">Fisher</td>
			<td style="width:163px;">12-545-100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:229px;">glass microscope slides</td>
			<td style="width:176px;">Fisher</td>
			<td style="width:163px;">22-034-980</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:229px;">thermal cycler</td>
			<td style="width:176px;">Eppendorf</td>
			<td>E950010037</td>
			<td>Mastercycler EP Gradient S</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:229px;">PCR tubes</td>
			<td style="width:176px;">USA Scientific</td>
			<td style="width:163px;">1402-2700</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:229px;">24-well plate</td>
			<td style="width:176px;">Corning</td>
			<td style="width:163px;">351147</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:229px;">disposable transfer pipet</td>
			<td style="width:176px;">Fisher</td>
			<td style="width:163px;">13-711-9AM</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:229px;">fluorescence microscope</td>
			<td style="width:176px;">Zeiss</td>
			<td style="width:163px;"></td>
			<td>Axio Imager.Z1</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

methods to examine the lymph gland and hemocytes in drosophila larvae

Existem muitos paralelos entre os sistemas hematopoiéticas de mamífero Drosophila e, apesar de Drosophila não têm a linhagem linfóide que caracterizam a imunidade adaptativa mamíferos. Drosophila e hematopoiese mamíferos ocorrem em espacial e temporalmente fases distintas para produzir várias linhagens de células sanguíneas. Ambos os sistemas manter reservatórios de progenitores de células de sangue com que se expandem ou substituem linhagens maduros. O sistema hematopoiético permite Drosophila e mamíferos para responder e se adaptar aos desafios do sistema imunológico. Mais importante, os reguladores de transcrição e de vias de sinalização que controlam a geração, manutenção e funcionamento do sistema hematopoiético são conservados a partir de moscas para mamíferos. Estas semelhanças Drosophila permitem a ser utilizado para o desenvolvimento hematopoiético e geneticamente modelo de doença. Aqui nós ensaios detalhe para examinar o sistema hematopoiético de larvas de Drosophila. Dentroem particular, descrevemos métodos para medir o número de células de sangue e concentração, visualizar uma linhagem madura específica in vivo e realizar imuno-histoquímica em células sanguíneas em circulação e no órgão hematopoiético. Estes ensaios podem revelar alterações na expressão de genes e processos celulares, incluindo a sinalização, a sobrevivência, a proliferação, a diferenciação e a e podem ser utilizados para investigar uma variedade de questões relacionadas com a hematopoiese. Combinado com as ferramentas genéticas disponíveis em Drosophila, estes ensaios podem ser utilizados para avaliar o sistema hematopoiético em cima alterações genéticas definidas. Embora não seja especificamente descrito aqui, estes ensaios também podem ser utilizados para examinar o efeito de alterações ambientais, tais como infecção ou dieta, do sistema hematopoiético.

Circulando hemócito Concentração Números de hemócitos aumentar ao longo do desenvolvimento larval 35. Para ilustrar que este método detecta diferenças nos números de hemócitos e concentração, independentemente da causa biológica, medimos as concentrações de hemócitos de larvas retardada e não retardada. Perda de hormona prothoracicotropic (PTTH) por ablação genética de neurônios produtores de PTTH (...

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Methods to Examine the Lymph Gland and Hemocytes in Drosophila Larvae

Sistemas hematopoiéticas de mamífero Drosophila e compartilham muitas características comuns, tornando Drosophila um modelo genético atraente para estudar hematopoiese. Aqui demonstramos dissecção e montagem do principal órgão hematopoiético larval para imuno-histoquímica. Descrevemos também métodos para ensaiar vários compartimentos hematopoiéticos larvais incluindo hemócitos circulantes e células de cristal sésseis.

Métodos para examinar a linfa Gland e Hemócitos em<em&gt; Drosophila</em&gt; Larvas

Many parallels exist between the Drosophila and mammalian hematopoietic systems, even though Drosophila lack the lymphoid lineage that characterize ...

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

Methods to Examine the Lymph Gland and Hemocytes in Drosophila Larvae

Analysis of Zebrafish Larvae Skeletal Muscle Integrity with Evans Blue Dye

Análise de Zebrafish larvas Músculo Esquelético Integrity com Evans Blue Dye

The zebrafish model is an emerging system for the study of neuromuscular disorders.  In the study of neuromuscular diseases, the integrity of the muscle ...

Biologia do Desenvolvimento

Dissection and Immunofluorescent Staining of Mushroom Body and Photoreceptor Neurons in Adult Drosophila melanogaster Brains

Dissection and Immunofluorescent Staining of Mushroom Body and Photoreceptor Neurons in Adult Drosophila melanogaster Brains

Dissecção e imunofluorescência coloração de cogumelo corpo e fotoreceptor neurônios em cérebros adultos Drosophila melanogaster

Nervous system development involves a sequential series of events that are coordinated by several signaling pathways and regulatory networks. Many of the ...

Methods for Imaging Intracellular pH of the Follicle Stem Cell Lineage in Live Drosophila Ovarian Tissue

Methods for Imaging Intracellular pH of the Follicle Stem Cell Lineage in Live Drosophila Ovarian Tissue

Métodos para o pH intracelular Imaging da linhagem de células-tronco do folículo em tecido ovariano de Drosophila

Changes in intracellular pH (pHi) play important roles in the regulation of many cellular functions, including metabolism, proliferation, and ...

Cell Aggregation Assays to Evaluate the Binding of the Drosophila Notch with Trans-Ligands and its Inhibition by Cis-Ligands

Cell Aggregation Assays to Evaluate the Binding of the Drosophila Notch with Trans-Ligands and its Inhibition by Cis-Ligands

Celular agregação ensaios para avaliar a vinculação do entalhe drosófila com Trans-ligantes e sua inibição pelo Cis-ligantes

Notch signaling is an evolutionarily conserved cell-cell communication system used broadly in animal development and adult maintenance. Interaction of the ...

Methods for the Study of Regeneration in Stentor

Methods for the Study of Regeneration in Stentor

Métodos para o estudo da regeneração em Stentor

Cells need to be able to regenerate their parts to recover from external perturbations. The unicellular ciliate Stentor coeruleus is an excellent model ...

Thawing, Culturing, and Cryopreserving Drosophila Cell Lines

Thawing, Culturing, and Cryopreserving Drosophila Cell Lines

Descongelamento, cultivo e Cryopreserving linhas de células de Drosophila

There are currently over 160 distinct Drosophila cell lines distributed by the Drosophila Genomics Resource Center (DGRC). With genome engineering, the ...

Methods to Test Endocrine Disruption in Drosophila melanogaster

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Métodos para testar a perturbação endócrina na Drosophila melanogaster

In recent years there has been growing evidence that all organisms and the environment are exposed to hormone-like chemicals, known as endocrine disruptor ...

Whole Mount Immunohistochemistry in Zebrafish Embryos and Larvae

Imunohistoquímica do Monte Inteiro em Embriões e Larvas de Zebrafish

Immunohistochemistry is a widely used technique to explore protein expression and localization during both normal developmental and disease states. ...

Using Alizarin Red Staining to Detect Chemically Induced Bone Loss in Zebrafish Larvae

Chemically induced bone loss due to lead (Pb) exposure could trigger an array of adverse impacts on both human and animal skeletal systems. However, the ...

Eye Removal in Living Zebrafish Larvae to Examine Innervation-dependent Growth and Development of the Visual System

Remoção de olhos em larvas de zebrafish vivos para examinar o crescimento e desenvolvimento dependentes da inervação do sistema visual

Zebrafish exhibit remarkable life-long growth and regenerative abilities. For example, specialized stem cell niches established during embryogenesis ...