Name: preparation of cd4+ t cells for analysis of gd3 and gd2 ganglioside membrane expression by microscopy
Uploaded: 2016-11-08T13:00:00
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We are grateful to Dr. Jos&#233; Luis Daniotti for comments. We thank the assistance to Dr. J. Arturo Pimentel and the Laboratorio Nacional de Microscop&#236;a Avanzada-UNAM for acquisition of confocal images. I.M.-D. and T.M.V.C. were supported by grants 157634 and 253596 from Consejo Nacional de Ciencia y Tecnolog&#236;a (CONACYT), Sociedad Latinoamericana de Glicobiolog&#236;a, A.C. T.M.V.-C. is recipient of a scholarship (245192) from CONACYT. We also thank the support of the Red Tem&#225;tica Glicociencia en Salud - CONACYT (253596).

健康な男性ドナーからの末梢血を、インフォームドコンセントとセントロ・デ・InvestigaciònアンDinámicaCelular-大学自治デルエスタード・デ・モレロスの生命倫理委員会の承認を得ました。 1.単離およびヒトナイーブCD4 + T細胞の活性化<ol><li>インフォームドコンセントを通して健康なヒトのドナー由来の末梢血の2ミリリットルを採取し、滅菌PBS-EDTAの2ミリリット?...

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	<li>Mazzon, C., Viola, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=From+tango+to+quadrilla:+current+views+of+the+immunological+synapse.">From tango to quadrilla: current views of the immunological synapse.</a> Cell Adh Migr. 1 (1), 7-12 (2007).</li><li>Hamann, D., Pa Baars, ., Hooibrink, B., van Lier, R. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Heterogeneity+of+the+human+CD4++T-cell+population:+two+distinct+CD4++T-cell+subsets+characterized+by+coexpression+of+CD45RA+and+CD45RO+isoforms.">Heterogeneity of the human CD4+ T-cell population: two distinct CD4+ T-cell subsets characterized by coexpression of CD45RA and CD45RO isoforms.</a> Blood. 88 (9), 3513-3521 (1996).</li><li>Zhong, L., Zhang, Z., Lu, X., Liu, S., Chen, C. Y., Chen, Z. 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V., Mart&#236;nez-Duncker, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Activation+of+human+na&#239;ve+Th+cells+increases+surface+expression+of+GD3+and+induces+neoexpression+of+GD2+that+colocalize+with+TCR+clusters.">Activation of human na&#239;ve Th cells increases surface expression of GD3 and induces neoexpression of GD2 that colocalize with TCR clusters.</a> Glycobiology. 25 (12), 1454-1464 (2015).</li><li>M&#252;thing, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=TLC+in+structure+and+recognition+studies+of+glycosphingolipids.">TLC in structure and recognition studies of glycosphingolipids.</a> Methods Mol Biol. 76 (17), 183-195 (1998).</li><li>de Almeida, M. C., Silva, A. 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Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fine+specificity+of+natural+killer+T+cells+against+GD3+ganglioside+and+identification+of+GM3+as+an+inhibitory+natural+killer+T-cell+ligand.">Fine specificity of natural killer T cells against GD3 ganglioside and identification of GM3 as an inhibitory natural killer T-cell ligand.</a> Immunology. 123 (1), 145-155 (2008).</li><li>Simon, B. M., Malisan, F., Testi, R., Nicotera, P., Leist, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Disialoganglioside+GD3+is+released+by+microglia+and+induces+oligodendrocyte+apoptosis.">Disialoganglioside GD3 is released by microglia and induces oligodendrocyte apoptosis.</a> Cell Death Differ. 9 (7), 758-767 (2002).</li><li>Beske, O., Reichelt, M., Taylor, M. 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V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Differentially+regulated+expression+of+9-O-acetyl+GD3+(CD60b)+and+7-O-acetyl-GD3+(CD60c)+during+differentiation+and+maturation+of+human+T+and+B+lymphocytes.">Differentially regulated expression of 9-O-acetyl GD3 (CD60b) and 7-O-acetyl-GD3 (CD60c) during differentiation and maturation of human T and B lymphocytes.</a> Glycobiology. 21 (9), 1161-1172 (2011).</li><li>Pukel, C. S., Lloyd, K. O., Travassos, L. R., Dippold, W. G., Oettgen, H. F., Old, L. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=GD3,+a+prominent+ganglioside+of+human+melanoma.+Detection+and+characterisation+by+mouse+monoclonal+antibody.">GD3, a prominent ganglioside of human melanoma. Detection and characterisation by mouse monoclonal antibody.</a> J Exp Med. 155 (4), 1133-1147 (1982).</li></ol>

説明されたプロトコルは、少数の細胞から出発したCD4 + T細胞または他の免疫細胞（ 例えば 、のPMBC、 図5）の細胞懸濁液中のガングリオシドまたはタンパク質を局在化するために使用することができます。小さなT細胞の大きさや非接着特性のために、貧しい人々の情報や低品質の蛍光顕微鏡像結果の取得細胞が正常に付着していない場合。 そ...

CD4 + T細胞は、抗原提示細胞1による活性化の後、それらのエフェクター機能を介して、免疫応答を調整します。活性化の間に変調された細胞メカニズムの研究は、免疫機能の基本的なプロセスへの洞察を可能にします。それらは血液周辺2のセルの非常に小さな集団を表すしかし、ナイーブCD4 + T細胞の研究では、複雑になることができます。 蛍光顕微鏡を介していくつかの報告は、CD4 + T細胞の活性化に関与する異なる分子、細胞膜3に関連した主にタンパク質の局在を研究しました。ガングリオシドは、スフィンゴ糖脂質を含むシアル酸であり、それらは広く、彼らは豊富にある神経細胞で研究されているが、そのような免疫細胞のような他の細胞もまた、生物学的に関連する機能4,5でガングリオシドを発現します。我々は以前に股関節を報告しましたST8Sia 1（GD3シンターゼ）およびGM2 / GD2シンターゼシアリルトランスフェラーゼα2,8のアップレギュレーションがヒトナイーブCD4 + T細胞の活性化中tは、それは、GD2の著しい表面neoexpression及びGD3ガングリオシド6のアップレギュレーションを誘導します。免疫細胞におけるGD3、GD2およびその他のガングリオシドのさらなる研究は、免疫機能のタンパク質ベースの部分図を補完する必要があります。 一般的に、ガングリオシド発現の研究は、このような薄層クロマトグラフィー（TLC）7などの技術に基づいているが、この技術は、生物学的分析を制限し、原形質膜で、または細胞内区画にガングリオシドの空間的局在を許可していません。 本研究では、抗CD3 /抗CD28活性化後のヒトナイーブCD4 + T細胞およびPBMCにおけるGD3およびGD2ガングリオシドの抗体媒介性の同定および局在化のためのプロトコルについて説明します。このプロトコルのそれの私とリンパ球の小サイズ（10マイクロメートル）を考慮すると、高品質の画像6を取得して、懸濁液中の細胞の数が少ないにガングリオシドの遺伝子及び分子の発現を分析することも可能です。

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="1052">
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:481px;">Advanced RPMI 1640&#160;</td>
			<td style="width:241px;">Thermo Fisher Scientific</td>
			<td style="width:137px;">12633-012</td>
			<td style="width:193px;">Suplemented with 3% FBS</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">mouse anti human CD3 antibody</td>
			<td>eBioscience</td>
			<td>16-0037-81</td>
			<td>OKT3 clone</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">mouse anti human CD28 antibody</td>
			<td>ebioscience</td>
			<td>16-0288-81</td>
			<td>CD28.6 clone</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">mouse anti human GD3&#160; antibody</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>ab11779</td>
			<td>R24 clone</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">mouse anti human GD2 antibody</td>
			<td>Santa Cruz Biotechnology</td>
			<td>sc-53831</td>
			<td>14G2a clone</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:481px;">FITC-conjugated anti-mouse IgG3 
			antibody</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>ab97259</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Alexa Fluor 488 conjugated antimouse</td>
			<td>Thermo Fisher Scieni&#161;tific</td>
			<td>A-21131</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">IgG2a antibody</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Alexa Fluor 647 conjugated antimouse</td>
			<td>Thermo Fisher Scieni&#161;tific</td>
			<td>A-21241</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">IgG2a antibody</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Hoechst 333258</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>861405</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">&#160;Ficoll Paque-Plus</td>
			<td>GE</td>
			<td>17-1440-02&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Trizol Reagent</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>15596-026</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Naive CD4+ T Cell Isolation Kit II, human</td>
			<td>MACS Miltenyi Biotec</td>
			<td>130-094-131</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">BD FACSAria II</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td></td>
			<td>Sorting&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Nunc Lab-tek chamber slide system</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>C7182</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Olympus FV 1000 Laser Confocal Microscope (Olympus)&#160;</td>
			<td>Olympus</td>
			<td></td>
			<td>Upright BX61WI and IX81&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Forward sequence primer GD3 synthase</td>
			<td>5&#180;-GAGCGTTCAGGAAACAAATGG- 3&#180;</td>
			<td></td>
			<td>Ref. 7</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Reverse sequence primer GD3 synthase</td>
			<td>5&#180;-CCTGTGGGAAGAGAGAGTAAG-3&#180;</td>
			<td></td>
			<td>Ref. 7</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Forward sequence primer GM2/GD2 synthase</td>
			<td>5&#180;-CAACACAGCAGACACAGTCC-3&#180;</td>
			<td></td>
			<td>Ref. 7</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Reverse sequence primer GM2/GD2 synthase</td>
			<td>5&#180;-GTGGCAATCGTGACTAGAGC-3&#180;</td>
			<td></td>
			<td>Ref. 7</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

preparation of cd4+ t cells for analysis of gd3 and gd2 ganglioside membrane expression by microscopy

懸濁液中のナイーブCD4 + T細胞の活性化のために本明細書に記載される方法および共焦点顕微鏡分析のためにカバースリップでの付着が、プロファイリング実験その補体の発現はフローサイトメトリーのようなCD4 + T細胞の活性化に関与するガングリオシドの空間的な局在化および可視化を可能にする、西部ブロッティングまたはリアルタイムPCR。フローサイトメトリーおよび顕微鏡検査を介してそれらの細胞内局在を介しガングリオシド発現の定量化は、高い親和性および特異性を有する抗ガングリオシド抗体の使用によって得ることができます。それにもかかわらず、懸濁液中の細胞の適切な取り扱いは、蛍光または共焦点顕微鏡の取得に必要な必要な接着を促進するための培養プレートの処理を含みます。本研究では、ナイーブCD4 + T細胞の活性化の際にGD3およびGD2ガングリオシドの発現とTCRと共局在を決定するためのプロトコルについて説明します。また、リアルタイムT&lt;40,000細胞を使用してIME PCR実験は、細胞の数が少ないとし、追加の低入力RNAキットを必要とせずに行うことができる遺伝子解析実験を実証し、GD3およびGM2 / GD2合成酵素遺伝子の決意に記載されています。

この原稿に記載されているプロトコルは、培養の良い品質と接着し、休止し、活性化されたヒトナイーブCD4 + T細胞（ 図1）をレンダリングします。活性化CD4 + T細胞は、休止状態（ 図1A）と比較して特徴的な増殖プロフィール（ 図1B）を示します。 CD25後期活性化マーカーは、共焦点顕微鏡（ 図1C）に?...

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Preparation of CD4+ T Cells for Analysis of GD3 and GD2 Ganglioside Membrane Expression by Microscopy

我々は、休止中のガングリオシドの膜発現と局在を決定するために顕微鏡で使用するための標準的な抗体染色プロトコルを記述し、ヒトナイーブCD4 + T細胞を活性化します。また、説明&lt;追加の低入力RNAキットを必要としない40,000個の細胞を用いたリアルタイムPCR実験です。

CD4の調製<sup&gt; +</sup&gt;顕微鏡によるGD3およびGD2ガングリオシドの膜発現の分析のためのT細胞

The methods described herein for activation of na&#239;ve CD4+ T cells in suspension and their adherence in coverslips for confocal microscopy analysis ...

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Preparation of CD4+ T Cells for Analysis of GD3 and GD2 Ganglioside Membrane Expression by Microscopy

Preparation and Use of HIV-1 Infected Primary CD4+ T-Cells as Target Cells in Natural Killer Cell Cytotoxic Assays

ナチュラルキラー細胞傷害性アッセイにおけるHIV - 1感染プライマリCD4 + T細胞を標的細胞としての準備と使用

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糖尿病CD4の養子移入+ T細胞によるマウスの加速された1型糖尿病の誘導

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エフェクターCD4の養子移入によるマウス腸の炎症の誘導<sup&gt; +</sup&gt; CD45RB<sup&gt;高い</sup&gt;免疫不全マウスへのT細胞

There are many different animal models available for studying the pathogenesis of human inflammatory bowel diseases (IBD), each with its own advantages ...

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解析<em&gt;腸炎エルシニア</em&gt;エフェクター転β-ラクタマーゼエフェクター融合を用いて宿主細胞に

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