Name: preparation of cd4+ t cells for analysis of gd3 and gd2 ganglioside membrane expression by microscopy
Uploaded: 2016-11-08T13:00:00
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We are grateful to Dr. Jos&#233; Luis Daniotti for comments. We thank the assistance to Dr. J. Arturo Pimentel and the Laboratorio Nacional de Microscop&#236;a Avanzada-UNAM for acquisition of confocal images. I.M.-D. and T.M.V.C. were supported by grants 157634 and 253596 from Consejo Nacional de Ciencia y Tecnolog&#236;a (CONACYT), Sociedad Latinoamericana de Glicobiolog&#236;a, A.C. T.M.V.-C. is recipient of a scholarship (245192) from CONACYT. We also thank the support of the Red Tem&#225;tica Glicociencia en Salud - CONACYT (253596).

건강한 남성 기증자로부터 말초 혈액 동의하고 센트로 드 Investigaciòn 엔 DINAMICA Celular- 대학교 자치시 델 에스 타도 데 모렐 로스의 생명 윤리위원회의 승인을 얻었다. 1. 분리 및 인간 나이브 CD4 + T 세포의 활성화 <ol><li> 동의서를 통해 건강한 인간 기증자로부터 유래 말초 혈액 2 ㎖를 수집하고 멸균 PBS-EDTA 2 ㎖로 희석 (1 배 인산염 완충 식염수 (PBS), 2 mM의 EDTA, pH를 7.4...

<ol>
	<li>Mazzon, C., Viola, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=From+tango+to+quadrilla:+current+views+of+the+immunological+synapse.">From tango to quadrilla: current views of the immunological synapse.</a> Cell Adh Migr. 1 (1), 7-12 (2007).</li><li>Hamann, D., Pa Baars, ., Hooibrink, B., van Lier, R. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Heterogeneity+of+the+human+CD4++T-cell+population:+two+distinct+CD4++T-cell+subsets+characterized+by+coexpression+of+CD45RA+and+CD45RO+isoforms.">Heterogeneity of the human CD4+ T-cell population: two distinct CD4+ T-cell subsets characterized by coexpression of CD45RA and CD45RO isoforms.</a> Blood. 88 (9), 3513-3521 (1996).</li><li>Zhong, L., Zhang, Z., Lu, X., Liu, S., Chen, C. Y., Chen, Z. 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Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fine+specificity+of+natural+killer+T+cells+against+GD3+ganglioside+and+identification+of+GM3+as+an+inhibitory+natural+killer+T-cell+ligand.">Fine specificity of natural killer T cells against GD3 ganglioside and identification of GM3 as an inhibitory natural killer T-cell ligand.</a> Immunology. 123 (1), 145-155 (2008).</li><li>Simon, B. M., Malisan, F., Testi, R., Nicotera, P., Leist, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Disialoganglioside+GD3+is+released+by+microglia+and+induces+oligodendrocyte+apoptosis.">Disialoganglioside GD3 is released by microglia and induces oligodendrocyte apoptosis.</a> Cell Death Differ. 9 (7), 758-767 (2002).</li><li>Beske, O., Reichelt, M., Taylor, M. 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V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Differentially+regulated+expression+of+9-O-acetyl+GD3+(CD60b)+and+7-O-acetyl-GD3+(CD60c)+during+differentiation+and+maturation+of+human+T+and+B+lymphocytes.">Differentially regulated expression of 9-O-acetyl GD3 (CD60b) and 7-O-acetyl-GD3 (CD60c) during differentiation and maturation of human T and B lymphocytes.</a> Glycobiology. 21 (9), 1161-1172 (2011).</li><li>Pukel, C. S., Lloyd, K. O., Travassos, L. R., Dippold, W. G., Oettgen, H. F., Old, L. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=GD3,+a+prominent+ganglioside+of+human+melanoma.+Detection+and+characterisation+by+mouse+monoclonal+antibody.">GD3, a prominent ganglioside of human melanoma. Detection and characterisation by mouse monoclonal antibody.</a> J Exp Med. 155 (4), 1133-1147 (1982).</li></ol>

기술 된 프로토콜은 CD4 + T 세포 또는 세포의 수가 적은부터 다른 면역 세포 (예 PMBCs,도 5)의 세포 현탁액 갱글 또는 단백질 지역화하는데 사용될 수있다. 때문에 T 세포 비 접착 특성의 작은 크기의 불량 정보 또는 낮은 품질의 형광 현미경 사진의 결과를 취득 셀이 올바르게 부착되지 않은 경우. 이 선도, 치료 중 강글리오사이드의 공간 지역화 및 ?...

CD4 + T 세포는 항원 제시 세포에 의해 활성화 한 후 자신의 이펙터 기능을 통해 면역 반응을 조율. 활성화 과정에서 변조 된 세포 메커니즘 연구는 면역 기능의 기본 과정에 대한 통찰력을 할 수 있습니다. 그들이 주변 혈액이 세포의 매우 작은 모집단을 대표하기 때문에, 나이브 CD4 + T 세포의 연구는 복잡해질 수있다. 형광 현미경을 통해 여러보고 CD4 + T 세포 활성화에 관여하는 다른 분자 플라즈마 막 (3)에 주로 연관 단백질의 위치 파악을 연구 하였다. 강글리오사이드는 시알 산 함유 글리 고스되어 있으며 광범위가 같은 면역 세포로서 풍부한 다른 세포 인 신경 세포 연구되었지만 또한 생물학적으로 중요한 기능과 4,5- 강글리오사이드를 표현한다. 우리는 이전에 그쪽을보고ST8Sia 1 (GD3 합성 효소)과 GM2 / GD2 합성 효소 시알 산 전이 효소 α2,8의 상향 조절이 인간의 순진한 CD4 + T 세포의 활성화 동안 t, 즉 GD2의 중요한 표면 neoexpression 및 GD3의 강글 리오 시드 (6)의 상향 조절을 유도한다. 면역 세포 GD3, GD2 강글 리오 시드 등의 추가의 연구는 면역 기능의 단백질 기반의 부분도를 보완 할 필요가있다. 일반적 갱글 발현 연구는 박층 크로마토 그래피 (TLC) (7)과 같은 기술에 기초하지만, 이러한 기술은 생물학적 분석을 제한하는 세포막 또는 세포 내 구획 강글리오사이드의 공간적 위치 파악을 허용하지 않는다. 이 작품에서 우리는 항 CD3 / 안티 CD28 활성화 후 인간의 순진한 CD4 + T 세포와 PBMC를에 GD3 및 GD2 강글리오사이드의 항체 매개 식별 및 위치 파악을위한 프로토콜을 설명합니다. 이 프로토콜의 IT 내가 함께림프구의 작은 크기 (9 μm의)을 고려하여, 고품질의 화상 (6)의 획득과, 현탁액 중의 세포의 낮은 숫자의 강글리오사이드의 유전자 발현 및 분자를 분석하는 것도 가능하다.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="1052">
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:481px;">Advanced RPMI 1640&#160;</td>
			<td style="width:241px;">Thermo Fisher Scientific</td>
			<td style="width:137px;">12633-012</td>
			<td style="width:193px;">Suplemented with 3% FBS</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">mouse anti human CD3 antibody</td>
			<td>eBioscience</td>
			<td>16-0037-81</td>
			<td>OKT3 clone</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">mouse anti human CD28 antibody</td>
			<td>ebioscience</td>
			<td>16-0288-81</td>
			<td>CD28.6 clone</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">mouse anti human GD3&#160; antibody</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>ab11779</td>
			<td>R24 clone</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">mouse anti human GD2 antibody</td>
			<td>Santa Cruz Biotechnology</td>
			<td>sc-53831</td>
			<td>14G2a clone</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:481px;">FITC-conjugated anti-mouse IgG3 
			antibody</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>ab97259</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Alexa Fluor 488 conjugated antimouse</td>
			<td>Thermo Fisher Scieni&#161;tific</td>
			<td>A-21131</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">IgG2a antibody</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Alexa Fluor 647 conjugated antimouse</td>
			<td>Thermo Fisher Scieni&#161;tific</td>
			<td>A-21241</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">IgG2a antibody</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Hoechst 333258</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>861405</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">&#160;Ficoll Paque-Plus</td>
			<td>GE</td>
			<td>17-1440-02&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Trizol Reagent</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>15596-026</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Naive CD4+ T Cell Isolation Kit II, human</td>
			<td>MACS Miltenyi Biotec</td>
			<td>130-094-131</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">BD FACSAria II</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td></td>
			<td>Sorting&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Nunc Lab-tek chamber slide system</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>C7182</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Olympus FV 1000 Laser Confocal Microscope (Olympus)&#160;</td>
			<td>Olympus</td>
			<td></td>
			<td>Upright BX61WI and IX81&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Forward sequence primer GD3 synthase</td>
			<td>5&#180;-GAGCGTTCAGGAAACAAATGG- 3&#180;</td>
			<td></td>
			<td>Ref. 7</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Reverse sequence primer GD3 synthase</td>
			<td>5&#180;-CCTGTGGGAAGAGAGAGTAAG-3&#180;</td>
			<td></td>
			<td>Ref. 7</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Forward sequence primer GM2/GD2 synthase</td>
			<td>5&#180;-CAACACAGCAGACACAGTCC-3&#180;</td>
			<td></td>
			<td>Ref. 7</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Reverse sequence primer GM2/GD2 synthase</td>
			<td>5&#180;-GTGGCAATCGTGACTAGAGC-3&#180;</td>
			<td></td>
			<td>Ref. 7</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

preparation of cd4+ t cells for analysis of gd3 and gd2 ganglioside membrane expression by microscopy

서스펜션의 순진한 CD4 + T 세포의 활성화를 위해 본원에 기술 된 방법 및 공 초점 현미경 분석 된 커버에서의 준수는 실험을 프로파일 링하는 보수 표현 유동 세포 계측법 등의 CD4 + T 세포 활성화에 관여하는 강글리오사이드의 공간 현지화 및 시각화를 허용, 서부 블 롯팅 또는 실시간 PCR. 유동 세포 계측법 및 현미경을 통해 세포 지역화 통해 강글리오사이드 발현의 정량화는 높은 친화력과 특이성 안티 - 강글리오사이드 항체의 사용에 의해 얻을 수있다. 그럼에도 불구하고, 현탁액 중의 세포의 적절한 처리가 형광 또는 초점 현미경 취득 요구 필요한 접착 성을 촉진하는 배양 플레이트의 치료를 포함한다. 이 작품에서 우리는 순진한 CD4 + T 세포 활성화하는 동안 GD3 및 GD2 강글 리오 시드의 표현과 TCR와 colocalization을 결정하기위한 프로토콜을 설명합니다. 또한, 리얼 t&lt;40,000 세포를 사용 IME PCR 실험은 세포의 낮은 숫자 및 추가 저 입력 RNA 키트의 필요없이 수행 될 수있는 유전자 분석 실험을 보여주는 상기 GD3 및 GM2 / GD2 합성 효소 유전자의 결정을 위해 설명된다.

이 논문에 기술 된 프로토콜은 배양의 좋은 품질과 접착 휴식 및 활성화 인간의 순진한 CD4 + T 세포 (그림 1) 렌더링합니다. 활성화 된 CD4 + T 세포는 휴면 상태 (도 1A)와 비교하여 특징적인 증식 프로파일 (도 1B)를 도시한다. CD25 늦은 활성화 마커 공 초점 현미경 (그림 1C)에 의해 관찰 72 시간의 효율적인 활?...

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Preparation of CD4+ T Cells for Analysis of GD3 and GD2 Ganglioside Membrane Expression by Microscopy

우리는 쉬고 강글리오사이드 활성화 인간 나이브 CD4 + T 세포의 세포막 발현 및 위치 파악을 결정 현미경에 사용하기위한 표준 항체 염색 프로토콜을 설명한다. 또한 실시간 PCR 실험은 &lt;추가 낮은 입력 RNA 키트를 필요로하지 않는 40,000 세포를 사용하는 기술.

CD4의 준비<sup&gt; +</sup&gt; 현미경으로 GD3 및 GD2 강글 리오 시드 멤브레인 식의 분석을위한 T 세포

The methods described herein for activation of na&#239;ve CD4+ T cells in suspension and their adherence in coverslips for confocal microscopy analysis ...

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Preparation of CD4+ T Cells for Analysis of GD3 and GD2 Ganglioside Membrane Expression by Microscopy

Preparation and Use of HIV-1 Infected Primary CD4+ T-Cells as Target Cells in Natural Killer Cell Cytotoxic Assays

준비 및 사용 HIV - 1 차 감염된 CD4 + 대상 세포로 T 세포 자연 킬러 세포 세포 독성 Assays에서

 Natural killer (NK) cells are a vital component of the innate immune response to virus-infected cells. It is important to understand the ability of NK ...

연구

면역학 및 감염병학

Accelerated Type 1 Diabetes Induction in Mice by Adoptive Transfer of Diabetogenic CD4+ T Cells

Diabetogenic CD4의 입양 전송하여 마우스의 가속 제 1 형 당뇨병 유도 + T 세포

The nonobese diabetic (NOD) mouse spontaneously develops autoimmune diabetes after 12 weeks of age and is the most extensively studied animal model of ...

Adenoviral Transduction of Naive CD4 T Cells to Study Treg Differentiation

나이브 CD4의 아데노 바이러스 형질은 Treg의 분화를 연구하는 세포를 T

Regulatory T cells (Tregs) are essential to provide immune tolerance to self as well as to certain foreign antigens. Tregs can be generated from naive CD4 ...

Isolation and Th17 Differentiation of Na&iuml;ve CD4 T Lymphocytes

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분리 및 나이브 CD4 T 림프구의 TH17 분화

Th17 cells are a distinct subset of T cells that have been found to produce interleukin 17 (IL-17), and differ in function from the other T cell subsets ...

Assessing the Innate Sensing of HIV-1 Infected CD4+ T Cells by Plasmacytoid Dendritic Cells Using an Ex vivo Co-culture System.

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HIV-1 감염 CD4의 타고난 감지 평가<sup&gt; +</sup&gt;를 사용하여 형질 수지상 세포에 의한 T 세포<em&gt; 예 생체 내</em&gt; 공동 문화 시스템.

HIV-1 innate sensing requires direct contact of infected CD4+ T cells with plasmacytoid dendritic cells (pDCs). In order to study this process, the ...

In Situ Detection of Autoreactive CD4 T Cells in Brain and Heart Using Major Histocompatibility Complex Class II Dextramers

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주요 조직 적합성 복잡한 클래스 II Dextramers을 사용하여 뇌와 심장에있는자가 반응 CD4 T 세포의 제자리 탐지에

This report demonstrates the use of major histocompatibility complex (MHC) class II dextramers for detection of autoreactive CD4 T cells in situ in myelin ...

Induction of Murine Intestinal Inflammation by Adoptive Transfer of Effector CD4+CD45RBhigh T Cells into Immunodeficient Mice

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이펙터 CD4의 입양 전송하여 쥐과 장내 염증의 유도<sup&gt; +</sup&gt; CD45RB<sup&gt; 높은</sup&gt; 면역 결핍 마우스에게 T 세포

There are many different animal models available for studying the pathogenesis of human inflammatory bowel diseases (IBD), each with its own advantages ...

Analysis of Yersinia enterocolitica Effector Translocation into Host Cells Using Beta-lactamase Effector Fusions

Analysis of Yersinia enterocolitica Effector Translocation into Host Cells Using Beta-lactamase Effector Fusions

분석<em&gt; 예 르시 니아의 enterocolitica</em숙주 세포 내로&gt; 이펙터 전좌 베타 - 락타 마제 이펙터의 용해 사용

Many gram-negative bacteria including pathogenic Yersinia spp. employ type III secretion systems to translocate effector proteins into eukaryotic target ...

Imaging CD4 T Cell Interstitial Migration in the Inflamed Dermis

염증이 진피의 이미징 CD4 T 세포 간질 마이그레이션

The ability of CD4 T cells to carry out effector functions is dependent upon the rapid and efficient migration of these cells in inflamed peripheral ...

Cortical Actin Flow in T Cells Quantified by Spatio-temporal Image Correlation Spectroscopy of Structured Illumination Microscopy Data

구조화 조명 현미경 데이터의 시공간적 이미지 상관 분광학에 의해 정량화 T 세포에서 대뇌 피질 굴지 흐름

Filamentous-actin plays a crucial role in a majority of cell processes including motility and, in immune cells, the formation of a key cell-cell ...