Name: induction of accelerated atherosclerosis in mice: the "wire-injury" model
Uploaded: 2020-08-25T13:00:00
Duration: 5 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Induction of Accelerated Atherosclerosis in Mice: The "Wire-Injury" Model at JoVE.com

Dette arbejde blev støttet af Interdisciplinary Centre for Clinical Research IZKF Aachen (junior forskningsgruppe til E.A.L.) inden for det medicinske fakultet på RWTH Aachen University. Vi takker også Fru Roya Soltan for hjælp med immunhisekemi farvning.

Forsøg, der præsenteres i dette dokument, udføres i henhold til den tyske lovgivning og de europæiske retningslinjer for pasning af dyr. Dyrene opdrættes i dyrefaciliteten ved Institute for Laboratory Animal Science, University Hospital Aachen, Tyskland, under tilsyn af professor Dr. R. Tolba og Dr. A. Teubner (dyrevelfærdsofficer).
1. Dyrepleje
<ol><li>Hold musene i en specialiseret plejeenhed, der sikrer korrekt adgang til fødevarer og specialiseret veterinærkontrol og behandling. Hvis dyrene flyttes eller købes hos tredjemand, skal det sikres en opholdsperiode på en uge, før de gennemgår proceduren.</li>
</ol>2. Hyperlipidæmi Inducement
<ol><li>Feed 6 - 8 uger gammel, 18 - 20 g, kvindelig (valgfrit) ApoE-/- mus med en atherogen diæt (21% fedt, 0,15% kolesterol, 19,5% casein, wt/ wt) en uge før den kirurgiske procedure og fortsætte kosten, indtil aterosklerotisk plaque analyse skal udføres.</li>
</ol>3. Kirurgisk forberedelse
<ol><li>Bedøve musene ved hjælp af en intraperitoneal injektion af 100 mg/kg ketamin ved kropsvægt og 10 mg/kg xylazin ved kropsvægt. Bekræft korrekt bedøvelse før operationen ved manglende reflekser og whisker bevægelse. Placer en lille mængde steril øjensyd i øjet for at minimere tørring.</li>
	<li>Sørg for vedligeholdelse af sterile forhold for at undgå infektioner under operationen ved hjælp af sterile materialer og instrumenter.</li>
	<li>Barber musene i den ventrale hals region. Desinficere huden med betadin før snit. Lav en 1 cm hud snit i medianen regionen af halsområdet, på toppen af luftrøret.</li>
	<li>Adskl de to fedtstoffer for at sikre en korrekt udsigt over luftrørsområdet. Brug retraktorer til at holde muskellaget og udsætte halspulsåren. Hvis til stede, udføre stump-dissektion af den tynde muskel lag, der dækker halspulsåren.</li>
	<li>Brug skarpe buede kraftkker til at adskille halspulsåren fra vagus nerve og halspulsåre. Således bør bifurcation område med den interne og eksterne halspulsåren være synlig. Brug 0,9% NaCl for at undgå væv tørhed under den kirurgiske procedure.</li>
</ol>4. Wire-Skade
<ol><li>Placer en 7 cm lang 0/5 silke sutur under halspulsåren, proksimale til aortabuen. Lav en åben løkke, klar til at blive lukket når som helst.</li>
	<li>Placer to 0/7 silkesuturer (hver 1,5 cm lang) omkring den eksterne halspulsåre: en løkke tæt på bifurcationpunktet og en løkke så distalt som muligt. Forbered dem som en åben løkke, klar til at blive lukket til enhver tid.</li>
	<li>Placer en 0/7 silkesutur (1,5 cm lang) under den interne halspulsåre. Forbered det som en åben løkke, klar til at blive lukket til enhver tid.</li>
	<li>Placer musebordet med musehovedet mod operatøren for at sikre korrekt placering af førstyrets indføring under denudationen (Figur 1A).</li>
	<li>Under mikroskopisk visning, stoppe blodgennemstrømningen gennem den fælles halspulsåren ved at holde og trække enderne af 0/5 silke sutur med hemostat kraftæceser.</li>
	<li>Umiddelbart efter den fælles halspulsåreligatur lukkes sutursløjfen, der er placeret på den interne halspulsåre, og den distale sutur på den eksterne halspulsåre stramt (Figur 1B).</li>
	<li>Udfør et lille snit (arterieomi, halvdelen af kardiameteren) distalt for den eksterne halspulsåre, mellem de to sløjfer, ved hjælp af en lille saks (Figur 1C). Hvis snittet er for stort, skal du følge fejlfindingsvejledningen (se diskussionen).</li>
	<li>Brug kommercielt polerede guideledninger eller brug internt specialiseret personale til at pudse guideledningerne. Desinficere den 14 tommer poleret fleksibel guide-wire med alkohol og fugte det i en dråbe på 0,9% NaCl for at sikre korrekt glide ind i beholderen.</li>
	<li>Førføringsledningen indsættes i den almindelige halspulsåre via den udvendige halspulsåres tværgående arterie (Figur 1D). Der opnås endotelbetoning ved at passere styretråden langs beholderen, mens den roterer. Gentag denne procedure tre gange. Opretholde den samme amplitude af roterende bevægelse i hver mus for at øge reproducerbarheden.</li>
	<li>Luk den proksimale løkke på den eksterne halspulsåre stramt. Gendan blodgennemstrømningen i halspulsåren ved at skære suturen omkring almindelig arterie og suturen omkring den interne halspulsåre.</li>
</ol>5. Sutur og nyttiggørelse
<ol><li>Fjern retraktorerne og returnere muskellaget og de to fedt organer til den fysiologiske position.</li>
	<li>Luk huden med tre adskilte suturer 0/6, hvis der er behov for ekkokardiografiske målinger. Hvis der ikke er behov for billeddannelse, skal du bruge metalclips til at lukke huden.</li>
	<li>Læg musen ned på venstre side under det infrarøde lys, indtil den vågner. Efterlad ikke et dyr uden opsyn eller i selskab med andre dyr, før det er fuldt uddrevet.</li>
	<li>Hvis du vil identificere dig i fremtiden, skal du markere musen ved hjælp af det lokale system. Spørg dyrevelfærdsmedarbejderen fra den lokale institution.</li>
</ol>6. Analyse af den aterosklerotiske plaque
<ol><li>Bedøve musene ved sluttidspunktet ved hjælp af en intraperitoneal injektion af 100 mg/kg ketamin ved kropsvægt og 10 mg/kg xylazin ved kropsvægt. Bekræft korrekt bedøvelse af manglen på reflekser og whisker bevægelse.</li>
	<li>Udfør exsanguination ved retro-orbital eller hjerte punktering og indsamle blodet til yderligere analyse2.</li>
	<li>Desinficere huden med betadin. Åbn brysthulen og fjern den rigtige auriculum af hjertet. Se fosfat buffered opløsning gennem venstre hjertekammer for at fjerne det resterende blod fra fartøjet og derefter gennemgå 4% PFA at fastsætte vævet.</li>
	<li>Hvis der ikke kræves fiksering, skal halspulsåren anvendes umiddelbart efter vask2,4,11. Udfør standardprotokoller med analyser af interesse: paraffinindlejring, kryosektion, mRNA eller proteinanalyse osv.</li>
	<li>For morfometriske målinger, omhyggeligt explant halspulsåren, herunder bifurcation, med minimal manipulation, som proksimalt til aortabuen ved hjælp af buede snævler og lille saks.</li>
	<li>Integrer halspulsåren i paraffinblokken ved hjælp af standardindlejringsprotokoller. For at udføre tværgående sektion, placere halspulsåren oprejst på bifurcation. Skær 5 μm tykke serielle sektioner begyndende med bifurcation og indsamle dem alle på belagt histologiske dias (Figur 2A).</li>
	<li>Pletten hver 10th sektion ved hjælp af Movat farvning at fremhæve laminas2,4,11. Efter indsamling mikroskopiske billeder af alle fartøjer (ved hjælp af en 10X mål), måle lumen, samt den interne og eksterne lamina for hver sektion, ved hjælp af specialdesignet software2,4,11, som vist i figur 2B. Beregn de samlede vækst og medier af fartøjerne.</li>
	<li>Analysér glatte muskelceller og makrofagindhold eller endotelgenoprettelse i serielle sektioner ved hjælp af sædvanlig immunohistologiskfarvning 2 (Figur 2C).</li>
</ol>

<ol>
	<li>Simsekyilmaz, S., Liehn, E. A., Militaru, C., Vogt, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Progress+in+interventional+cardiology:+challenges+for+the+future.">Progress in interventional cardiology: challenges for the future.</a> Thromb Haemost. 113 (3), 464-472 (2015).</li><li>Kubo, N., McCurdy, S., Boisvert, W. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Defective+Fas+Expression+on+Bone+Marrow+Derived+Cells+Alters+Atherosclerotic+Plaque+Morphology+in+Hyperlipidemic+Mice.">Defective Fas Expression on Bone Marrow Derived Cells Alters Atherosclerotic Plaque Morphology in Hyperlipidemic Mice.</a> Discoveries. 3 (1), e37 (2015).</li><li>Saffarzadeh, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterization+of+rapid+neutrophil+extracellular+trap+formation+and+its+cooperation+with+phagocytosis+in+human+neutrophils.">Characterization of rapid neutrophil extracellular trap formation and its cooperation with phagocytosis in human neutrophils.</a> Discoveries. 2 (2), e19 (2014).</li><li>Lindner, V., Fingerle, J., Reidy, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mouse+model+of+arterial+injury.">Mouse model of arterial injury.</a> Circ Res. 73 (5), 792-796 (1993).</li><li>Schwartz, R. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Preclinical+evaluation+of+drug-eluting+stents+for+peripheral+applications:+recommendations+from+an+expert+consensus+group.">Preclinical evaluation of drug-eluting stents for peripheral applications: recommendations from an expert consensus group.</a> Circulation. 110 (16), 2498-2505 (2004).</li><li>Schwartz, R. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Restenosis+and+the+proportional+neointimal+response+to+coronary+artery+injury:+results+in+a+porcine+model.">Restenosis and the proportional neointimal response to coronary artery injury: results in a porcine model.</a> J Am Coll Cardiol. 19 (2), 267-274 (1992).</li><li>Curaj, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Noninvasive+molecular+ultrasound+monitoring+of+vessel+healing+after+intravascular+surgical+procedures+in+a+preclinical+setup.">Noninvasive molecular ultrasound monitoring of vessel healing after intravascular surgical procedures in a preclinical setup.</a> Arterioscler Thromb Vasc Biol. 35 (6), 1366-1373 (2015).</li><li>Liehn, E. A., Schober, A., Weber, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Blockade+of+keratinocyte-derived+chemokine+inhibits+endothelial+recovery+and+enhances+plaque+formation+after+arterial+injury+in+ApoE-deficient+mice.">Blockade of keratinocyte-derived chemokine inhibits endothelial recovery and enhances plaque formation after arterial injury in ApoE-deficient mice.</a> Arterioscler Thromb Vasc Biol. 24 (10), 1891-1896 (2004).</li><li>Liehn, E. A., Zernecke, A., Postea, O., Weber, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chemokines:+inflammatory+mediators+of+atherosclerosis.">Chemokines: inflammatory mediators of atherosclerosis.</a> Arch Physiol Biochem. 112 (4-5), 229-238 (2006).</li><li>Simsekyilmaz, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Role+of+extracellular+RNA+in+atherosclerotic+plaque+formation+in+mice.">Role of extracellular RNA in atherosclerotic plaque formation in mice.</a> Circulation. 129 (5), 598-606 (2014).</li><li>Wu, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rhodamine-loaded+intercellular+adhesion+molecule-1-targeted+microbubbles+for+dual-modality+imaging+under+controlled+shear+stresses.">Rhodamine-loaded intercellular adhesion molecule-1-targeted microbubbles for dual-modality imaging under controlled shear stresses.</a> Circ Cardiovasc Imaging. 6 (6), 974-981 (2013).</li><li>Schober, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Crucial+role+of+the+CCL2/CCR2+axis+in+neointimal+hyperplasia+after+arterial+injury+in+hyperlipidemic+mice+involves+early+monocyte+recruitment+and+CCL2+presentation+on+platelets.">Crucial role of the CCL2/CCR2 axis in neointimal hyperplasia after arterial injury in hyperlipidemic mice involves early monocyte recruitment and CCL2 presentation on platelets.</a> Circ Res. 95 (11), 1125-1133 (2004).</li><li>Ali, Z. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Increased+in-stent+stenosis+in+ApoE+knockout+mice:+insights+from+a+novel+mouse+model+of+balloon+angioplasty+and+stenting.">Increased in-stent stenosis in ApoE knockout mice: insights from a novel mouse model of balloon angioplasty and stenting.</a> Arterioscler Thromb Vasc Biol. 27 (4), 833-840 (2007).</li><li>Chamberlain, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+novel+mouse+model+of+in+situ+stenting.">A novel mouse model of in situ stenting.</a> Cardiovasc Res. 85, 38-44 (2010).</li><li>Rodriguez-Menocal, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+novel+mouse+model+of+in-stent+restenosis.">A novel mouse model of in-stent restenosis.</a> Atherosclerosis. 209 (2), 359-366 (2010).</li><li>Simsekyilmaz, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+murine+model+of+stent+implantation+in+the+carotid+artery+for+the+study+of+restenosis.">A murine model of stent implantation in the carotid artery for the study of restenosis.</a> J Vis Exp. , e50233 (2013).</li><li>Schroder, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=NADPH+oxidase+Nox2+is+required+for+hypoxia-induced+mobilization+of+endothelial+progenitor+cells.">NADPH oxidase Nox2 is required for hypoxia-induced mobilization of endothelial progenitor cells.</a> Circ Res. 105 (6), 537-544 (2009).</li></ol>

Der er ingen oplysninger fra forfatterne.

I dette papir giver vi nyttige tips til at udføre wire-skade procedure selv af personale med minimal erfaring i dyreoperationer. Der er to kritiske trin i udførelsen af denne procedure: indsnit af den eksterne halspulsåren og indsættelsen af ledningen. Snittet i den eksterne halspulsåre skal udføres så meget som muligt fra bifurcationen for at sikre tilstrækkeligt resterende materiale (Figur 1C). Snittet bør ikke være for stort på grund af risikoen for at skære hele fartøjet. Det andet kritiske trin er den høje risiko for blødning under arterien og indsættelsen af guidewiren, hvis blodgennemstrømningen ikke afbrydes effektivt. Desuden kan endotelbelægning ikke finde sted, eller arteriel brud er muligt, hvis guidewiren ikke er korrekt indført i lumen fartøjet. For at undgå dette skal styreledningens overflade være omhyggeligt poleret, før betjeningen.
For at optimere protokollen sikrer placeringen af operationsbordet med musehovedet mod kirurgen et bedre overblik, tilgængelighed og kontrol for korrekt styretrådmanipulation. For at øge reproducerbarheden skal du desuden bruge den samme styretråd i alle undersøgelserne. Da trådstørrelsen ikke ændres, er det vigtigt at overveje og eliminere alle de mulige forskelle mellem musene ved at bruge samme køn, alder og vægt for alle mus, der indgår i en undersøgelse. Derefter vil Evans-Blue farvning hjælpe kirurgen bestemme effektiviteten af denudationen. Eksistensen af passende udstyr er en forudsætning for, at proceduren kan lykkes. Et 10X stereomikroskop er afgørende for at udføre denne procedure. Korrekt forberedelse af guide-wire (for eksempel polering det) er afgørende. Derfor anbefaler vi på det kraftigste, at guidetråden klargøres af specialiseret teknisk personale, hvor det er muligt.
Der er mange fejlfindingstrin i denne protokol. Hvis du instænerer den eksterne halspulsåre nær bifurcationen, bindes den omhyggeligt externa i nærheden af bifurcationen, så der ikke opstår blødning. Under skæringen kan den eksterne halspulsåre ikke ses. Derfor overveje bifurcation på niveau med silke sutur. Opsaml sektioner, når silkesuturen forsvinder. Hvis snittet i den eksterne halspulsåren er for stort, og fartøjet er bristet, skal du sikre dig, at blodgennemstrømningen til halsgangen og den interne halspulsåre afbrydes effektivt, og forsøge at finde åbningen af fartøjet ved hjælp af scener. Efter indførelse af guidewiren og udførelse af denudationen bindes fartøjet nær bifurcationen. Under skæringen skal du begynde at samle sig, når silke fra suturen begynder at forsvinde. Hvis der opstår brud på arteriel under denudationen med styretråden, skal du kontrollere under mikroskopet, om styreledningen er korrekt poleret.
På trods af ligheden mellem wire-skade model til kliniske situationer, mange grupper er fokuseret på indfødte åreforkalkning i mus, eller de vælger invasive åreforkalkning induktion, såsom ballon angioplastik hos rotter eller kaniner, på grund af manglen på uddannet personale, der kan udføre små dyreoperationer. På trods af fordelene ved at bruge kaniner/rotter, fx ikke behov for miniaturiseret udstyr, tilbyder hverken rottemodeller eller kaninmodeller en række forskellige knock-out-stammer med hensyn til at studere molekylære mekanismer, der er involveret i neointimavækst og in-stenttrombose.
De eksisterende modeller for at studere in-stentose resten mus er vanskelige, kræver høje kirurgiske færdigheder, og har stor risiko for komplikationer såsom blødning eller lammelse. For eksempel ledsages den mekaniske skade eller stentimplantatation i thorax aorta via lårpulsåren af en høj dødelighed (35 %) på grund af bagbenslammelse ellerblødning 13-15. Vi beskriver også stentimplantatisering i halspulsåren på en mus16. Proceduren er den samme; vævsbehandling til analyse er imidlertid kompliceret og er ikke tilgængelig for alle laboratorier16. Halspulsåren er direkte tilgængelig, ikke kun for driftsprocedurer, men også for eksisterende billeddannelsesmetoder såsom ultralydsscanning. Andre skade induktioner i halspulsårerne i mus kan gøres ved hjælp af elektriske enheder17. Denne metode er nem at udføre og sikrer høj reproducerbarhed. Den medfører imidlertid skade i alle karlag, som ikke er identiske med mekanisk skade. Ballonapplikationer har fordele, f.eks. Selv om musen balloner er tilgængelige, de er meget dyre og derfor ikke udbredt. I stedet wire-skade er den etablerede metode, efterligne in-stent stenose.
Denudationen udføres på den normale arteriel væg, men med en aterosklerotisk baggrund. Derfor vil neointimadannelsen være moderat sammenlignet med den kliniske situation. Det høje antal prækliniske modeller viser, at ingen af modellerne opfylder alle de kriterier, der er nødvendige for at afdække hele de cellulære og molekylære mekanismer, der fører til patofysiologi hos mennesker (se tabel 2).
Efter udførelse af wire-skade procedure, kan andre biologiske og molekylære analyse udføres for at identificere celler, proteiner, mRNAs, microRNAs, gener eller andre biomarkører, som kan bruges som terapeutiske mål til at udvikle nye behandlingsstrategier for åreforkalkning, og især for neointima dannelse efter vaskulær skade. Hvis det er muligt, kan plaque vækst overvåges ved hjælp af højfrekvent ultralyd eller andre høj opløsning billeddannelse teknikker. Desuden ville beherske denne teknik give operatøren mulighed for at tilpasse protokollen til andre invasive åreforkalkningsanledningsmodeller, såsom kraveplacering, delvis ligation eller endda stentimplantatation.

Åreforkalkning er den vigtigste patologi underliggende kardiovaskulære hændelser såsom myokardieinfarkt eller slagtilfælde. De vigtigste mekanismer, der udløser akutte hjerte-kar-syndromer er plaque brud, overfladisk erosion, og trombe dannelse. Der er flere kliniske situationer forbundet med plaque udvikling: indfødte aterosklerotisk plaque, restenosis efter endarterektomi, og restenosis efter ballon ballonudvidelse med / uden stent implantation1. Efter arteriel skade, undertrykkelse af de inflammatoriskeprocesser 2,3 og inddrivelse af endotelrummet er afgørende for at forhindre yderligere komplikationer1. Klinisk forskning er begrænset til væv og blodprøver på grund af etiske overvejelser, omkostninger, og manglende viden i grundlæggende mekanismer. Af disse grunde er der behov for at studere molekylære mekanismer i dyremodeller4-6, som kan genskabe de kliniske forhold. Vores model for accelereret neointima dannelse i forbindelse med åreforkalkning er resultatet af mange års erfaring i gennemførelsen af disse modeller i små dyr7-11. Musemodellen er den mest attraktive model for forskning, på grund af sin nemme håndtering, evnen til at have store dyregrupper på grund af lave omkostninger i forbindelse med køb og pleje af dyr, og tilgængeligheden af forskellige transgene og knockout stammer.
Den største ulempe ved musemodellen er den lille størrelse af de vigtigste arterier udsat for aterosklerotisk sygdom (halspulsåren, aorta, og lårpulsåren), som kræver kvalificeret kirurgisk ekspertise og færdigheder til at manipulere fartøjer og invasivt fremkalde en aterosklerotisk plaque. Derfor er modellen med accelereret neointima dannelse, i forbindelse med restenosis efter endarterektomi eller stent implantation, foreslået i dette papir præsenteres med en trin-for-trin retningslinje og forslag til at lette indførelsen for interesserede personale. En anden ulempe er, at denudationen foretages på den normale arteriel væg, og derfor vil neo-intima formationen være moderat sammenlignet med den kliniske situation. Det høje niveau af plasma kolesterol nået i apolipoprotein E knockout (Apoe-/-) mus fodret med et højt fedtindhold-kost skaber en ordentlig pro-inflammatorisk miljø er nødvendige for neo-intima dannelse.
Operationen udføres under et stereomikroskop. Halspulsåren eksponeres ved et midterindsnit i det ventrale livmoderhalshalsbunds område. Anatomiske strukturer på toppen af og omkring halspulsåren er minimalt manipuleret til at reducere post-kirurgisk inflammation. Halspulsåren bifurcation er udsat. At fremkalde accelereret neointima dannelse, interne og eksterne halspulsårer er forberedt til blodgennemstrømning ophør og efterfølgende fælles halspulsåren denudation. Afslutningsvis kan metoden læres af personale med minimal erfaring i dyreoperationer.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Stereomicroscope</td>
			<td>Olympus</td>
			<td>SZ/X9</td>
			<td>-</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Forceps</td>
			<td>FST, Germany</td>
			<td>91197-00</td>
			<td>standard tip curved 0,17 mm</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hemostat forceps</td>
			<td>FST, Germany</td>
			<td>13007-12</td>
			<td>curved</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Scissors</td>
			<td>FST, Germany</td>
			<td>91460-11</td>
			<td>Straight</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vannas scissor</td>
			<td>Aesculap, Germany</td>
			<td>OC 498 R</td>
			<td>-</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Retractors</td>
			<td>FST, Germany</td>
			<td>18200-10</td>
			<td>2.5mm wide</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Retractors</td>
			<td>FST, Germany</td>
			<td>18200-11</td>
			<td>5mm wide</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ketamine 10%</td>
			<td>CEVA, Germany</td>
			<td>-</td>
			<td>-</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Xylazine 2%</td>
			<td>Medistar, Germany</td>
			<td>-</td>
			<td>-</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bepanthene eye and nose cream</td>
			<td>Bayer, Germany</td>
			<td>-</td>
			<td>-</td>
		</tr>
		<tr>
			<td rowspan="3">Silicon tube</td>
			<td rowspan="3">IFK Isofluor, Germany</td>
			<td rowspan="3">custom-made&#160; product</td>
			<td>diameter 500&#181;m,</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>section thickness 100 &#181;m,</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>polytetrafluorethylene catheter</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PROLENE Suture 6/0&#160;</td>
			<td>ETHICON</td>
			<td>8707H&#160;</td>
			<td>polypropylene monofilament suture, unresorbable, needle CC-1, 13mm, 3/8 Circle&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>7/0 Silk</td>
			<td>Seraflex</td>
			<td>IC 1005171Z</td>
			<td>-</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Michel Suture Clips</td>
			<td>FST, Germany</td>
			<td>12040-01&#160;</td>
			<td>&#160;-&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Clip Applying Forcep</td>
			<td>FST, Germany</td>
			<td>12018-12&#160;</td>
			<td>&#160;-&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>14&#8221;Wire for Catheter</td>
			<td>Abbot</td>
			<td>1000462H</td>
			<td>Use 10 cm from stiff part and equalize the ends</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mice</td>
			<td>Charles River</td>
			<td>Apolipoprotein E -/- mice with C57/Bl6 background</td>
			<td>&#160;-&#160;</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

induction of accelerated atherosclerosis in mice: the "wire-injury" model

Åreforkalkning er en proliferativ fibro-inflammatorisk sygdom udvikler sig i arterievæggen, inducerer en mangelfuld blodgennemstrømning eller en mangel på blodgennemstrømning. Desuden, ved brud på den defekte vaskulære væg, åreforkalkning inducerer okklusiv trombe dannelse, som repræsenterer den vigtigste årsag til myokardieinfarkt eller slagtilfælde og den hyppigste dødsårsag. På trods af fremskridtene på det kardiovaskulære område er mange spørgsmål stadig ubesvarede, og yderligere grundforskning er afgørende for at forbedre vores forståelse af de molekylære mekanismer under åreforkalkning og dens virkninger. På grund af begrænsede kliniske undersøgelser er der behov for repræsentative dyremodeller, der genskaber aterosklerotiske tilstande såsom neointimadannelse efter stentimplantatation, ballonensgioplastik eller endarterektomi. Da musen præsenterer mange fordele og er den hyppigst anvendte model for at studere molekylære processer, den nuværende undersøgelse foreslår en invasiv procedure for endotel denudalisering, også kendt som wire-skade model, som er repræsentativ for den menneskelige tilstand neointima dannelse i arterierne efter revaskularisering procedurer.

Den aterosklerotiske plaque induktion procedure tager 15 - 20 min og viser en minimal dødelighed, for det meste på grund af blødningen forekommer under proceduren. Efter operationen, musene komme sig efter anæstesi inden for 20 - 25 min. Ingen fysisk svækkelse, såsom lammelse, eller fodring forstyrrelse blev observeret efter operationen.
Wire-skade inducerer en de-endotelisering, efterligne vaskulære læsioner efter ballon denudation eller stent-implantation. Umiddelbart efter skaden, denuded vaskulære væg vil blive dækket med et lag af trombocytter, som formidler og favoriserer vedhæftning af monocytter12. Aktiveret glatte muskelceller fra medierne vil formere sig og migrere ind i intimal rum, danner neointima. Andre stamfædre til glatte muskelceller vil migrere fra blodet (skønnes at være 40%) og bidrage til neointimavæksten. Plakdannelsen slutter efter den fuldstændige re-endotelisering, normalt 4 uger efter wire-skade.
Neointima-formationen kan vurderes ved hjælp af Movat-farvning. Plakstørrelsen beregnes for hvert dias ved hjælp af software som vist i figur 2B. Den samlede plakstørrelse (venstre halspulsåre) kan variere mellem 70.000 - 100.000 μm², mens kontrolbeholderens størrelse (højre halspulsåre) kan variere mellem 7.000 - 8.000 μm². Disse værdier afhænger i høj grad af kirurgen. Derfor anbefaler vi på det kraftigste, at du bruger den samme kirurg under forsøgene til samme undersøgelse.
Den udviklede plak ligner i stentose, som overvejende består af formeret og migreret glatte muskelceller fra medierne. Den cellulære sammensætning bestemt af immunologiske farvning procedurer viser, at den glatte muskel celleindhold er ca 30 - 40%, mens makrofager findes i 15 - 25% af neointima af den tilskadekomne beholder. Re-endoteliseringen kan måles efter farvning for en endotelmarkør og beregnes som den procentdel af omkredsen, der farves over hele lumenens omkreds. Normalt re-endotelisering når 80 - 90% efter 3 uger, og bør næsten være komplet efter 4 uger(Figur 2C). For at spore plaquevæksten under dens udvikling kan den samme analyse gentages for hvert tidspunkt efter wire-skade, afhængigt af interesse og det undersøgte emne (se tabel 1).
<img alt="Figure 1" src="/files/ftp_upload/54571/54571fig1.jpg"> Figur 1. Skematisk repræsentation af den operative procedure. (A) Placeringen af operationsbordet mod operatøren under wire-skade procedure(B) Forstørret visning af den fælles halspulsåren og dens grene, som det fremgår under mikroskopet ved 10X forstørrelse(C) Størrelsen af snittet i den eksterne halspulsåren under mikroskopet ved 10X forstørrelse(D) Skematisk repræsentation af wire-skade procedure ved hjælp af 14 tommer guide wire. <a href="http://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/54571/54571fig1large.jpg" target="_blank">Klik her for at se en større version af dette tal.</a>
<img alt="Figure 2" src="/files/ftp_upload/54571/54571fig2.jpg"> Figur 2. Analyse af Restenosis Plaque. A) Skematisk repræsentation af plakanalyse i den almindelige halspulsåre, 4 uger efter induktion aftrådskader (B) Neointima-formationen 4 uger efter trådskaden og skematisk repræsentation af de vigtigste parametre, der anvendes til analyse. Intima (grønt område) er forskellen mellem lumen (rød) og lamina interna (grøn linje). Medier (gult område) er forskellen mellem lamina externa (gul linje) og interna (grøn linje). Skalabar 100 μm (C) Repræsentative billeder af farvning af de vigtigste celletyper, der er involveret i neointimadannelse. Glatte muskelceller (glat muskel actin-rød, skala bar 100 μm), makrofager (Mac 2- grøn, skala bar 100 μm) og endotelceller (CD31- rød, pile, skala bar 50 μm). <a href="http://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/54571/54571fig2large.jpg" target="_blank">Klik her for at se en større version af dette tal.</a>
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody>
<tr>
<td>Tidspunkt</td>
			<td>Trombus</td>
			<td>Plak (μm²)</td>
			<td>
Makrofager (% fra Plaque)
</td>
			<td>
Glatte muskelceller (% fra Plaque)
</td>
			<td>
Re-endotelialisering (% lumen omkreds)
</td>
		</tr>
<tr>
<td>1 dag</td>
			<td>Stede</td>
			<td>0</td>
			<td>0</td>
			<td>0</td>
			<td>0</td>
		</tr>
<tr>
<td>1 uge</td>
			<td>-</td>
			<td>< 30 000</td>
			<td>> 10</td>
			<td>< 50</td>
			<td>< 50</td>
		</tr>
<tr>
<td>2 uger</td>
			<td>-</td>
			<td>< 50 000</td>
			<td>> 10</td>
			<td>< 50</td>
			<td>> 50</td>
		</tr>
<tr>
<td>3 uger</td>
			<td>-</td>
			<td>< 70 000</td>
			<td>15-25</td>
			<td>30-40</td>
			<td>80-90</td>
		</tr>
<tr>
<td>4 uger</td>
			<td>-</td>
			<td>70 000 – 100 000</td>
			<td>15-25</td>
			<td>30-40</td>
			<td>Komplet</td>
		</tr>
</tbody></table>Tabel 1. Tidsafhængig plaque's udvikling.
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody>
<tr>
<td>Model</td>
			<td>Dyr</td>
			<td>Fordele</td>
			<td>Disanvantages</td>
		</tr>
<tr>
<td rowspan="2">Kost-induceret indfødte åreforkalkning</td>
			<td>Lille</td>
			<td>
			<ul>
<li>efterligner åreforkalkning patologi</li>
				<li>nem håndtering</li>
				<li>ingen operation</li>
				<li>ingen stress for dyrene</li>
				<li>lave omkostninger i forbindelse med køb og pleje af dyr</li>
				<li>tilgængeligheden af forskellige transgene og knockout stammer</li>
			</ul>
</td>
			<td>
			<ul>
<li>lav reproducerbarhed</li>
				<li>høj varians</li>
				<li>øget antal dyr kræves</li>
				<li>øget ventetid</li>
			</ul>
</td>
		</tr>
<tr>
<td>Store</td>
			<td>
			<ul>
<li>efterligner åreforkalkning patologi</li>
				<li>nem håndtering</li>
				<li>ingen operation</li>
				<li>ingen stress for dyrene</li>
			</ul>
</td>
			<td>
			<ul>
<li>lav reproducerbarhed</li>
				<li>høj varians</li>
				<li>øget antal dyr kræves</li>
			</ul>
</td>
		</tr>
<tr>
<td rowspan="2">Ballondilatation</td>
			<td>Lille</td>
			<td>
			<ul>
<li>mimicsosis resten efter ballon angioplastik</li>
				<li>lave omkostninger i forbindelse med køb og pleje af dyr</li>
				<li>tilgængeligheden af forskellige transgene og knockout stammer</li>
			</ul>
</td>
			<td>
			<ul>
<li>lille størrelse af de vigtigste arterier</li>
				<li>kræver kvalificeret kirurgisk ekspertise</li>
				<li>balloner meget dyrt</li>
				<li>denudation er lavet på den normale arteriel væg</li>
				<li>eksistensen af passende udstyr</li>
				<li>risikoen for komplikationer som blødning eller lammelse</li>
			</ul>
</td>
		</tr>
<tr>
<td>Store</td>
			<td>
			<ul>
<li>mimicsosis resten efter ballon angioplastik</li>
				<li>nem håndtering</li>
				<li>brug af udstyr til mennesker</li>
			</ul>
</td>
			<td>
			<ul>
<li>denudation er lavet på den normale arteriel væg</li>
			</ul>
</td>
		</tr>
<tr>
<td>Wire Skade</td>
			<td>Lille</td>
			<td>
			<ul>
<li>mimicsosis resten efter ballon angioplastik</li>
				<li>nem håndtering</li>
				<li>minimal dødelighed</li>
				<li>lave omkostninger i forbindelse med køb og pleje af dyr</li>
				<li>tilgængeligheden af forskellige transgene og knockout stammer</li>
				<li>ingen fysisk svækkelse</li>
			</ul>
</td>
			<td>
			<ul>
<li>lille størrelse af de vigtigste arterier</li>
				<li>kræver mindre kvalificeret kirurgisk ekspertise</li>
				<li>denudation er lavet på den normale arteriel væg</li>
				<li>eksistensen af passende udstyr</li>
			</ul>
</td>
		</tr>
<tr>
<td rowspan="2">Stentimplantatering</td>
			<td>Lille</td>
			<td>
			<ul>
<li>efterligner restenose og trombose efter stentimplantatation</li>
				<li>lave omkostninger i forbindelse med køb og pleje af dyr</li>
				<li>tilgængeligheden af forskellige transgene og knockout stammer</li>
			</ul>
</td>
			<td>
			<ul>
<li>lille størrelse af de vigtigste arterier</li>
				<li>kræver kvalificeret kirurgisk ekspertise</li>
				<li>små stenter ikke tilgængelig</li>
				<li>denudation er lavet på den normale arteriel væg</li>
				<li>øget dødelighed</li>
				<li>eksistensen af passende udstyr</li>
				<li>risikoen for komplikationer som blødning eller lammelse</li>
			</ul>
</td>
		</tr>
<tr>
<td>Store</td>
			<td>
			<ul>
<li>efterligner restenosis og trombose efter stentimplantatation</li>
				<li>nem håndtering</li>
				<li>brug af udstyr til mennesker</li>
			</ul>
</td>
			<td>
			<ul>
<li>denudation er lavet på den normale arteriel væg</li>
			</ul>
</td>
		</tr>
</tbody></table>Tabel 2. Fordele og ulemper ved eksisterende modeller af arteriel skade.

Watch this Scientific Journal Video about Induction of Accelerated Atherosclerosis in Mice: The "Wire-Injury" Model at JoVE.com

Induction of Accelerated Atherosclerosis in Mice: The "Wire-Injury" Model

Denne undersøgelse beskriver en invasiv procedure for induktion af accelereret åreforkalkning hos mus. I forhold til andre metoder, der anvender elektrisk- eller kryo-induceret skade, mekanisk-induceret skade efterligner den menneskelige tilstand af restenosis efter revaskularisering behandlinger og er ideel til undersøgelse af de molekylære involverede mekanismer.

Induktion af accelereret åreforkalkning i Mus: Den "Wire-Skade" Model

Atherosclerosis is a proliferative fibro-inflammatory disease developing in the arterial wall, inducing a deficient blood flow or a lack of blood flow. ...

Det overordnede mål med denne procedure er at efterligne den menneskelige tilstand af restenosis efter revaskularisering terapi i mus til at studere de molekylære mekanismer, der er involveret i skadesreaktion. De største fordele ved disse teknikker er, at det er meget reproducerbart og let udføres, så forsker med selv minimal erfaring til at anvende metoden i små dyremodeller. Demonstration af proceduren vil være Adelina Curaj, en postdoc for mit laboratorium.At fremkalde hyperlipidæmi, foder seks til otte uger gamle 18 til 20 gram Apoe knockout mus en atherogen diæt en uge før den kirurgiske procedure, og indtil aterosklerotisk plaque analyse. På dagen for operationen, efter at have bekræftet en manglende reaktion på tå knivspids, barbere bedøvet mus i ventrale hals regionen og desinficere den eksponerede hud med Betadine. Lav en en centimeter hud snit i medianen regionen af halsen over luftrøret og adskille de to fedt organer for at opnå et komplet overblik over luftrøret regionen.Ved hjælp af en retractor til at holde muskellaget åbent, udsætte halspulsåren og bruge skarpe buede kraftgrene til at adskille arterien fra vagus nerve og halspulsåre, indtil bifurcation område af den interne og eksterne halspulsåren er synlig. Løst, placere en syv centimeter lang 0-5 silke sutur under halspulsåren proksimale til aorta bue, efterfulgt af en løst placeret 1,5 centimeter lang 0-7 silke sutur omkring den eksterne halspulsåren tæt på bifurcation punkt, og en løst placeret 1,5 centimeter lang 0-7 silke sutur loop som distal fra bifurcation som muligt. Placer en anden åben 1,5 centimeter lang 0-7 silke sutur under den interne halspulsåren.Placer derefter dyret med hovedet på klokken seks position. Luk straks sutursløjferne tæt på den interne halspulsåre og den distale sutur på den eksterne halspulsåre. Brug hemostat kraftbetoner til at trække på enderne af 0-5 sutur at stoppe blodgennemstrømningen gennem den fælles halspulsåren.Ved hjælp af små saks, lave en lille arteriel af halvdelen af kardiameter distalt til den eksterne halspulsåren mellem de to sløjfer og indsætte en 14 tommer alkohol poleret fleksibel guidewire fugtet med en dråbe på 0,9% natriumchlorid i den fælles halspulsåren via snittet. For at undgå arteriel udbrud under Y-snit, bruge en omhyggeligt poleret guidewire. Opnå endotel denudation ved at passere wiren langs fartøjet, mens du roterer tre gange, derefter tæt lukke den proksimale løkke på den eksterne halspulsåren og skære suturer omkring den fælles og interne halspulsårer for at genoprette blodgennemstrømningen.Dernæst fjerne retraktorer og returnere muskel lag og de to fedt organer til den fysiologiske position. Luk huden med metalliske clips, og lad derefter musen komme sig på sin venstre side under et infrarødt lys med overvågning, indtil den er helt liggende. Neointima-formationen kan vurderes ved hjælp af Movat-farvning.Den samlede plak størrelse, som kan variere mellem 70, 000 og 100, 000 mikron kvadreret, afhængigt af dygtighed kirurgen, kan derefter beregnes for hver prøve ved hjælp af den relevante software. Den udviklede plak ligner øjeblikkelig restenose, som overvejende består af spredt og migreret glatte muskelceller fra mediet. Det glatte muskelcelleindhold repræsenterer ca. 30 til 40% af plak, mens de makrofager, der findes i neointima af den skadede beholder, udgør 15 til 25% af det samlede celletal.Den re-endotelialisering typisk når 80 til 90% efter tre uger og bør være næsten komplet efter fire uger. For at spore plaque vækst under sin udvikling, kan analysen gentages på flere tidspunkter efter wiren skade afhængigt af det eksperimentelle spørgsmål. Når mastered, kan denne teknik afsluttes i 15 minutter, hvis det udføres korrekt.Mens du forsøger denne procedure, er det vigtigt at huske, at det kirurgiske område bør konstant hydreres for at forhindre tørring og for at gøre wiren manipulation lettere.

Research

JoVE Journal

Medicine

Implantation of a Carotid Cuff for Triggering Shear-stress Induced Atherosclerosis in Mice

Implantation af en carotis Cuff til udløsning af shear-stress Induced Åreforkalkning i Mus

It is widely accepted that alterations in vascular shear stress trigger the expression of inflammatory genes in endothelial cells and thereby induce ...

Pharmacologic Induction of Epidermal Melanin and Protection Against Sunburn in a Humanized Mouse Model

Farmakologisk Induktion af epidermal Melanin og beskyttelse mod solskoldning i et humaniseret musemodel

Fairness of skin, UV sensitivity and skin cancer  risk all correlate with the physiologic function of the melanocortin 1  receptor, a Gs-coupled signaling ...

Induction of Invasive Transitional Cell Bladder Carcinoma in Immune Intact Human MUC1 Transgenic Mice:  A Model for Immunotherapy Development

Induktion af Invasive Transitional Cell blærecarcinom i Immune intakt humant MUC1 transgene mus: En model for immunterapi Development

A preclinical model of invasive bladder cancer was developed in human mucin 1 (MUC1) transgenic (MUC1.Tg) mice for the purpose of evaluating immunotherapy ...

Quantitative Analysis and Characterization of Atherosclerotic Lesions in the Murine Aortic Sinus

Atherosclerosis is a disease of the large arteries and a major underlying cause of myocardial infarction and stroke. Several different mouse models have ...

Inducing Myointimal Hyperplasia Versus Atherosclerosis in Mice: An Introduction of Two Valid Models

Inducerende myointimal Hyperplasi Versus Åreforkalkning i Mus: En introduktion af to gyldige modeller

Various in vivo laboratory rodent models for the induction of artery stenosis have been established to mimic diseases that include arterial plaque ...

Murine Model of Femoral Artery Wire Injury with Implantation of a Perivascular Drug Delivery Patch

Musemodel af lårarterien Wire Skade med implantation af en Perivaskulær Drug Delivery Patch

Percutaneous interventions including balloon angioplasty and stenting have been used to restore blood flow in vessels with occlusive vascular disease. ...

A Murine Model of Arterial Restenosis: Technical Aspects of Femoral Wire Injury

En murin model af arteriel restenose: Tekniske aspekter af Femoral Wire Skade

Cardiovascular disease caused by atherosclerosis is the leading cause of death in the developed world. Narrowing of the vessel lumen, due to ...

The Rabbit Model of Accelerated Atherosclerosis: A Methodological Perspective of the Iliac Artery Balloon Injury

Kanin modellen af accelereret åreforkalkning: en metodologisk perspektiv iliaca arterie ballon skade

Acute coronary syndrome resulting from coronary occlusion following atherosclerotic plaque development and rupture is the leading cause of death in the ...

Isometric Contractility Measurement of the Mouse Mesenteric Artery Using Wire Myography

Isometrisk kontraktilitet måling af musen mesenterica arterie ved hjælp af Wire blodkar

The wire myograph technique is used to assess the contractility of vascular smooth muscles in response to depolarization, GPCR agonists/inhibitors and ...