Name: induction of accelerated atherosclerosis in mice: the "wire-injury" model
Uploaded: 2020-08-25T13:00:00
Duration: 5 s
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Questo lavoro è stato sostenuto dal Centro Interdisciplinare per la Ricerca Clinica I-KF Aachen (gruppo di ricerca junior a E.A.L.) all'interno della facoltà di Medicina presso l'Università RWTH Aachen. Ringraziamo anche la signora Roya Soltan per l'aiuto con la colorazione immunostochimica.

Gli esperimenti presentati in questo documento sono eseguiti secondo la legge tedesca e secondo le linee guida europee per la cura degli animali. Gli animali sono allevati nella struttura animale dell'Istituto per la scienza animale di laboratorio, Ospedale universitario Aachen, Germania, sotto la supervisione del prof.
1. Cura degli animali
<ol><li>Tenere i topi in un'unità di cura specializzata, garantendo un adeguato accesso al cibo e il controllo e il trattamento veterinario specializzati. Se gli animali vengono spostati o acquistati da terzi, si prega di assicurarsi un periodo di alloggio di una settimana prima di sottoporsi alla procedura.</li>
</ol>2. Induzione iperlipidemia
<ol><li>Alimentazione 6 - 8 settimane di età, 18 - 20 g, femmina (opzionalmente) ApoE-/- topi con una dieta aterogene (21% di grassi, 0,15% colesterolo, 19,5% caseina, wt/wt) una settimana prima della procedura chirurgica e continuare la dieta fino a quando non deve essere eseguita l'analisi della placca aterosoclerotica.</li>
</ol>3. Preparazione chirurgica
<ol><li>Anestesizzare i topi utilizzando un'iniezione intraperitoneale di 100 mg/kg di ketamina per peso corporeo e 10 mg/kg di xylazina per peso corporeo. Confermare la corretta anesetizzazione prima dell'intervento chirurgico per la mancanza di riflessi e movimento baffi. Mettere una piccola quantità di unguento occhio sterile nell'occhio per ridurre al minimo l'essiccazione.</li>
	<li>Garantire il mantenimento di condizioni sterili per evitare infezioni durante l'intervento chirurgico utilizzando materiali e strumenti sterili.</li>
	<li>Rasare i topi nella regione del collo ventrale. Disinfettare la pelle con betadina prima dell'incisione. Fare un'incisione cutanea di 1 cm nella regione mediana della zona del collo, sopra la trachea.</li>
	<li>Separare i due corpi grassi per garantire una corretta visione della regione tracheale. Utilizzare i retrattili per tenere lo strato muscolare ed esporre l'arteria carotidea. Se presente, eseguire la dissezione smussata dello strato muscolare sottile che copre l'arteria carotidea.</li>
	<li>Utilizzare forti forcepi curvi per separare l'arteria carotide dal nervo vago e dalla vena giugulare. Pertanto, l'area di biforcazione con l'arteria carotide interna ed esterna dovrebbe essere visibile. Utilizzare 0.9% NaCl al fine di evitare la secchezza dei tessuti durante la procedura chirurgica.</li>
</ol>4. Lesione del filo
<ol><li>Mettere una sutura di seta lunga 7 cm 0/5 sotto l'arteria carotide, prossima all'arco aortico. Fare un loop aperto, pronto per essere chiuso in qualsiasi momento.</li>
	<li>Posizionare due suture di seta 0/7 (ciascuna lunga 1,5 cm) intorno all'arteria carotide esterna: un anello vicino al punto di biforcazione e un anello il più distale possibile. Prepararli come un loop aperto, pronto per essere chiuso in qualsiasi momento.</li>
	<li>Mettere una sutura di seta 0/7 (1,5 cm di lunghezza) sotto l'arteria carotide interna. Prepararlo come un loop aperto, pronto per essere chiuso in qualsiasi momento.</li>
	<li>Posizionare la tabella del mouse con la testa del mouse verso l'operatore per garantire il corretto posizionamento per l'inserimento del filo guida durante la denudazione (Figura 1A).</li>
	<li>Sotto la vista microscopica, fermare il flusso sanguigno attraverso l'arteria carotide comune tenendo e tirando le estremità della sutura di seta 0/5 con le force emostatico.</li>
	<li>Immediatamente dopo la legatura comune dell'arteria carotide, chiudere i loop di sutura posizionati sull'arteria carotide interna e la sutura distale sull'arteria carotide esterna strettamente (Figura 1B).</li>
	<li>Eseguire una piccola incisione (arteriotomia, metà del diametro del vaso) distale all'arteria carotide esterna, tra i due anelli, utilizzando piccole forbici (Figura 1C). Se l'incisione è troppo grande, seguire le istruzioni per la risoluzione dei problemi (vedere la discussione).</li>
	<li>Utilizzare fili guida commercialmente lucidati o utilizzare personale specializzato interno per lucidare i fili guida. Disinfettare il filo guida flessibile lucido da 14 pollici con alcool e inumidire in una goccia di 0,9% NaCl per garantire una corretta scivolamento nella nave.</li>
	<li>Inserire il filo guida nell'arteria carotide comune tramite l'arteriotomia trasversale dell'arteria carotide esterna (Figura 1D). Ottenere la denudazione endoteliale passando il filo guida lungo il vaso durante la rotazione. Ripetere questa procedura tre volte. Mantenere la stessa ampiezza del movimento rotazionale in ogni mouse per aumentare la riproducibilità.</li>
	<li>Chiudere saldamente l'anello prossimale sull'arteria carotide esterna. Ripristinare il flusso sanguigno nell'arteria carotide tagliando la sutura intorno all'arteria comune e la sutura intorno all'arteria carotide interna.</li>
</ol>5. Sutura e recupero
<ol><li>Rimuovere i retrattiori e riportare lo strato muscolare e i due corpi grassi alla posizione fisiologica.</li>
	<li>Chiudere la pelle con tre suture separate 0/6, se sono necessarie misurazioni ecocardiografiche. Se non è necessaria alcuna immagine, utilizzare clip metalliche per chiudere la pelle.</li>
	<li>Posizionare il mouse sul lato sinistro sotto la luce infrarossa fino a quando non si sveglia. Non lasciare un animale incustodito né in compagnia di altri animali fino a quando non è completamente guarito.</li>
	<li>Per un'identificazione futura, contrassegnare il mouse utilizzando il sistema locale. Chiedete all'ufficiale di benessere degli animali dell'istituzione locale.</li>
</ol>6. Analisi della placca aterosclerotica
<ol><li>Anestesizzare i topi al punto di fine tempo utilizzando un'iniezione intraperitoneale di 100 mg/kg di ketamina per peso corporeo e 10 mg/kg di xylazina per peso corporeo. Confermare la corretta anesetizzazione per la mancanza di riflessi e movimento baffi.</li>
	<li>Eseguire l'esasperazione da foratura retro-orbitale o cardiaca e raccogliere il sangue per ulteriori analisi2.</li>
	<li>Disinfettare la pelle con betadina. Aprire la cavità toracica e rimuovere l'auricolo destro del cuore. Perfuse fosfato soluzione tamponata attraverso ventricolo sinistro per rimuovere il sangue rimanente dal vaso e quindi perfuse 4% PFA per fissare il tessuto.</li>
	<li>Se non è richiesta alcuna fissazione, esplicare l'arteria carotide subito dopo il lavaggio2,4,11. Eseguire protocolli standard con analisi di interesse: incorporamento di paraffina, criosezione, mRNA o analisi delle proteine, ecc.</li>
	<li>Per le misurazioni morfometriche, esplicare con attenzione l'arteria carotide compresa la biforcazione, con una manipolazione minima, prossima all'arco aortico utilizzando le forcetti curve e piccole forbici.</li>
	<li>Incorporare l'arteria carotide nel blocco di paraffina utilizzando protocolli di incorporamento standard. Per eseguire il sessaggio trasversale, posizionare l'arteria carotide in posizione verticale sulla biforcazione. Tagliare 5 sezioni seriali spesse 5 m a partire dalla biforcazione e raccoglierle tutte su vetrini istologici rivestiti (Figura 2A).</li>
	<li>Macchia ogni 10th sezione utilizzando la colorazione Movat per evidenziare le laminase2,4,11. Dopo aver raccolto immagini microscopiche di tutti i vasi (utilizzando un obiettivo 10X), misurare il lume, così come la lamina interna ed esterna per ogni sezione, utilizzando speciale software progettato2,4,11, come mostrato nella Figura 2B. Calcolare la crescita intima e i media delle navi.</li>
	<li>Analizzare le cellule muscolari lisce e il contenuto di macrofagio, o il recupero endoteliale in sezioni seriali, utilizzando la colorazione immunohistologicausuale 2 (Figura 2C).</li>
</ol>

<ol>
	<li>Simsekyilmaz, S., Liehn, E. A., Militaru, C., Vogt, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Progress+in+interventional+cardiology:+challenges+for+the+future.">Progress in interventional cardiology: challenges for the future.</a> Thromb Haemost. 113 (3), 464-472 (2015).</li><li>Kubo, N., McCurdy, S., Boisvert, W. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Defective+Fas+Expression+on+Bone+Marrow+Derived+Cells+Alters+Atherosclerotic+Plaque+Morphology+in+Hyperlipidemic+Mice.">Defective Fas Expression on Bone Marrow Derived Cells Alters Atherosclerotic Plaque Morphology in Hyperlipidemic Mice.</a> Discoveries. 3 (1), e37 (2015).</li><li>Saffarzadeh, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterization+of+rapid+neutrophil+extracellular+trap+formation+and+its+cooperation+with+phagocytosis+in+human+neutrophils.">Characterization of rapid neutrophil extracellular trap formation and its cooperation with phagocytosis in human neutrophils.</a> Discoveries. 2 (2), e19 (2014).</li><li>Lindner, V., Fingerle, J., Reidy, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mouse+model+of+arterial+injury.">Mouse model of arterial injury.</a> Circ Res. 73 (5), 792-796 (1993).</li><li>Schwartz, R. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Preclinical+evaluation+of+drug-eluting+stents+for+peripheral+applications:+recommendations+from+an+expert+consensus+group.">Preclinical evaluation of drug-eluting stents for peripheral applications: recommendations from an expert consensus group.</a> Circulation. 110 (16), 2498-2505 (2004).</li><li>Schwartz, R. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Restenosis+and+the+proportional+neointimal+response+to+coronary+artery+injury:+results+in+a+porcine+model.">Restenosis and the proportional neointimal response to coronary artery injury: results in a porcine model.</a> J Am Coll Cardiol. 19 (2), 267-274 (1992).</li><li>Curaj, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Noninvasive+molecular+ultrasound+monitoring+of+vessel+healing+after+intravascular+surgical+procedures+in+a+preclinical+setup.">Noninvasive molecular ultrasound monitoring of vessel healing after intravascular surgical procedures in a preclinical setup.</a> Arterioscler Thromb Vasc Biol. 35 (6), 1366-1373 (2015).</li><li>Liehn, E. A., Schober, A., Weber, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Blockade+of+keratinocyte-derived+chemokine+inhibits+endothelial+recovery+and+enhances+plaque+formation+after+arterial+injury+in+ApoE-deficient+mice.">Blockade of keratinocyte-derived chemokine inhibits endothelial recovery and enhances plaque formation after arterial injury in ApoE-deficient mice.</a> Arterioscler Thromb Vasc Biol. 24 (10), 1891-1896 (2004).</li><li>Liehn, E. A., Zernecke, A., Postea, O., Weber, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chemokines:+inflammatory+mediators+of+atherosclerosis.">Chemokines: inflammatory mediators of atherosclerosis.</a> Arch Physiol Biochem. 112 (4-5), 229-238 (2006).</li><li>Simsekyilmaz, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Role+of+extracellular+RNA+in+atherosclerotic+plaque+formation+in+mice.">Role of extracellular RNA in atherosclerotic plaque formation in mice.</a> Circulation. 129 (5), 598-606 (2014).</li><li>Wu, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rhodamine-loaded+intercellular+adhesion+molecule-1-targeted+microbubbles+for+dual-modality+imaging+under+controlled+shear+stresses.">Rhodamine-loaded intercellular adhesion molecule-1-targeted microbubbles for dual-modality imaging under controlled shear stresses.</a> Circ Cardiovasc Imaging. 6 (6), 974-981 (2013).</li><li>Schober, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Crucial+role+of+the+CCL2/CCR2+axis+in+neointimal+hyperplasia+after+arterial+injury+in+hyperlipidemic+mice+involves+early+monocyte+recruitment+and+CCL2+presentation+on+platelets.">Crucial role of the CCL2/CCR2 axis in neointimal hyperplasia after arterial injury in hyperlipidemic mice involves early monocyte recruitment and CCL2 presentation on platelets.</a> Circ Res. 95 (11), 1125-1133 (2004).</li><li>Ali, Z. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Increased+in-stent+stenosis+in+ApoE+knockout+mice:+insights+from+a+novel+mouse+model+of+balloon+angioplasty+and+stenting.">Increased in-stent stenosis in ApoE knockout mice: insights from a novel mouse model of balloon angioplasty and stenting.</a> Arterioscler Thromb Vasc Biol. 27 (4), 833-840 (2007).</li><li>Chamberlain, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+novel+mouse+model+of+in+situ+stenting.">A novel mouse model of in situ stenting.</a> Cardiovasc Res. 85, 38-44 (2010).</li><li>Rodriguez-Menocal, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+novel+mouse+model+of+in-stent+restenosis.">A novel mouse model of in-stent restenosis.</a> Atherosclerosis. 209 (2), 359-366 (2010).</li><li>Simsekyilmaz, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+murine+model+of+stent+implantation+in+the+carotid+artery+for+the+study+of+restenosis.">A murine model of stent implantation in the carotid artery for the study of restenosis.</a> J Vis Exp. , e50233 (2013).</li><li>Schroder, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=NADPH+oxidase+Nox2+is+required+for+hypoxia-induced+mobilization+of+endothelial+progenitor+cells.">NADPH oxidase Nox2 is required for hypoxia-induced mobilization of endothelial progenitor cells.</a> Circ Res. 105 (6), 537-544 (2009).</li></ol>

Non ci sono rivelazioni da parte degli autori.

In questo documento, forniamo consigli utili per eseguire la procedura di lesioni del filo anche da parte del personale con una minima esperienza negli interventi chirurgici sugli animali. Ci sono due passaggi critici nell'esecuzione di questa procedura: l'incisione dell'arteria carotide esterna e l'inserimento del filo. L'incisione nell'arteria carotide esterna deve essere eseguita il più lontano possibile dalla biforcazione, al fine di garantire abbastanza materiale rimanente (Figura 1C). L'incisione non deve essere troppo grande, a causa del rischio di tagliare l'intero recipiente. Il secondo passo critico è l'alto rischio di sanguinamento durante l'arteriotomia e l'inserimento del filo guida se il flusso sanguigno non viene interrotto in modo efficiente. Inoltre, la denudazione endoteliale potrebbe non avvenire o la rottura arteriosa è possibile se il filo guida non viene introdotto correttamente nel vaso di lume. Per evitare questo, la superficie del filo guida deve essere lucidata con attenzione prima dell'operazione.
Per ottimizzare il protocollo, la posizione del tavolo operatorio con la testa del mouse verso il chirurgo garantisce una migliore visione, accessibilità e controllo per la corretta manipolazione del filo guida. Inoltre, per aumentare la riproducibilità, utilizzare lo stesso filo guida in tutti gli studi. Poiché la dimensione del filo non cambia, è importante considerare ed eliminare tutte le possibili differenze tra i topi utilizzando lo stesso sesso, età e peso per tutti i topi inclusi in uno studio. Successivamente, la colorazione Evans-Blue aiuterà il chirurgo a determinare l'efficienza della denudazione. L'esistenza di attrezzature adeguate è un prerequisito per il successo della procedura. Uno stereomicroscopio 10X è essenziale per eseguire questa procedura. La corretta preparazione del filo guida (ad esempio lucidarlo) è fondamentale. Pertanto, si consiglia vivamente che la preparazione del filo guida sia eseguita da personale tecnico specializzato, ove disponibile.
In questo protocollo sono disponibili molti passaggi per la risoluzione dei problemi. Se si increderà l'arteria carotide esterna vicino alla biforcazione, legare con attenzione l'externa, vicino alla biforcazione, in modo che non si verifichi alcun sanguinamento. Durante il taglio, l'arteria carotide esterna non può essere vista. Pertanto, considerare la biforcazione a livello di sutura di seta. Raccogliere sezioni quando la sutura di seta scompare. Se l'incisione nell'arteria carotide esterna è troppo grande e il vaso è rotto, assicurarsi che il flusso sanguigno nei communi della carotide e nell'arteria carotide interna sia effettivamente interrotto e cercare di trovare l'apertura del vaso utilizzando le forcette. Dopo aver introdotto il filo guida ed eseguito la denudazione, legare il vaso vicino alla biforcazione. Durante il taglio, iniziare a raccogliere quando la seta dalla sutura inizia a scomparire. Se la rottura arteriosa si verifica durante la denudazione con il filo guida, controllare al microscopio se il filo guida è correttamente lucidato.
Nonostante la somiglianza del modello wire-injury alle situazioni cliniche, molti gruppi si concentrano sull'aterosclerosi nativa nei topi, o scelgono induzioni invasive di aterosclerosi, come l'angioplastica a palloncino nei ratti o nei conigli, a causa della mancanza di personale addestrato in grado di eseguire piccoli interventi chirurgici animali. Nonostante i vantaggi dell'uso di conigli/ratti, ad esempio senza bisogno di attrezzature miniaturizzate, né i modelli di ratti né i modelli di coniglio offrono una varietà di diversi ceppi knock-out, in termini di studio dei meccanismi molecolari coinvolti nella crescita della neointima e nella trombosi in-stent.
I modelli esistenti per studiare la restenosi in-stent nei topi sono difficili, richiedono elevate abilità chirurgiche e hanno elevati rischi di complicanze come sanguinamento o paralisi. Ad esempio, la lesione meccanica o l'impianto di stent nell'aorta toracica tramite arteria femorale è accompagnata da un alto tasso di mortalità (35%) a causa della paralisi della gamba posteriore osanguinamento 13-15. Descriviamo anche l'impianto di stent nell'arteria carotidea di untopo 16. La procedura è simile; tuttavia, l'elaborazione del tessuto per l'analisi è complicata e non è disponibile per tutti ilaboratori 16. L'arteria carotidea è direttamente accessibile, non solo per le procedure operative, ma anche per i metodi di imaging esistenti come l'imaging ad ultrasuoni. Altre induzioni di lesioni nelle arterie carotidee nei topi possono essere fatte utilizzando dispositivi elettrici17. Questo metodo è facile da eseguire e garantisce un'elevata riproducibilità. Tuttavia, induce lesioni in tutti gli strati del vaso, che non è identico a lesioni meccaniche. Le applicazioni di palloncini hanno benefici, ad esempio la regolazione del diametro del recipiente in linea con la pratica clinica e hanno una forte influenza sull'esito patologico. Anche se i palloncini del mouse sono disponibili, sono molto costosi e quindi non ampiamente utilizzati. Invece, il wire-lesione è il metodo stabilito, imitando stenosi in-stent.
La denudazione viene eseguita sulla normale parete arteriosa, anche se con uno sfondo aterosclerotico. Pertanto, la formazione di neointima sarà moderata rispetto alla situazione clinica. L'elevato numero di modelli preclinici dimostra che nessuno dei modelli soddisfa tutti i criteri necessari per scoprire l'insieme dei meccanismi cellulari e molecolari che portano alla fisiofisiologia nell'uomo (c'è la tabella 2).
Dopo aver eseguito la procedura di lesione del filo, è possibile eseguire altre analisi biologiche e molecolari per identificare cellule, proteine, mRNA, microRNA, geni o altri biomarcatori, che possono essere utilizzati come bersagli terapeutici per sviluppare nuove strategie di trattamento per l'aterosclerosi, e in particolare per la formazione di neointima dopo lesioni vascolari. Se disponibile, la crescita della placca può essere monitorata utilizzando ultrasuoni ad alta frequenza o altre tecniche di imaging ad alta risoluzione. Inoltre, padroneggiare questa tecnica darebbe all'operatore l'opportunità di adattare il protocollo ad altri modelli di incentivazione dell'aterosclerosi invasiva, come il posizionamento del collare, la legatura parziale o persino l'impianto di stent.

L'aterosclerosi è la principale patologia alla base di eventi cardiovascolari come l'infarto miocardico o l'ictus. I principali meccanismi che innescano sindromi cardiovascolari acute sono la rottura della placca, l'erosione superficiale e la formazione di trombo. Ci sono molteplici situazioni cliniche legate allo sviluppo della placca: placca aterosclerotica nativa, restenosi dopo endarterectomia e restenosi dopo angioplastica a palloncino con/senza impianto stent1. Dopo la lesione arteriosa, la soppressionedei processi infiammatori 2,3 e il recupero del compartimento endoteliale sono essenziali per prevenire ulteriori complicazioni1. La ricerca clinica è limitata ai campioni di tessuti e sangue a causa di considerazioni etiche, costi, e una mancanza di conoscenza nei meccanismi di base. Per questi motivi, è necessario studiare i meccanismi molecolari nei modelli animali4-6, che possono ricreare le condizioni cliniche. Il nostro modello di formazione accelerata di neointima nel contesto dell'aterosclerosi è il risultato di molti anni di esperienza nella realizzazione di questi modelli in piccolianimali 7-11. Il modello murino è il modello più attraente per la ricerca, grazie alla sua facilità di manipolazione, alla capacità di avere grandi gruppi di animali a causa dei bassi costi legati all'acquisto e alla cura degli animali e alla disponibilità di vari ceppi transgenici e da urlo.
Lo svantaggio principale del modello murino è la piccola dimensione delle arterie principali sottoposte a malattia aterosclerotica (l'arteria carotide, l'aorta e l'arteria femorale), che richiede competenze chirurgiche qualificate e competenze per manipolare i vasi e indurre in modo invasivo una placca aterosclerotica. Pertanto, il modello di formazione accelerata di neointima, nel contesto della restenosi dopo l'endarterectomia o l'impianto di stent, proposto in questo documento è presentato con una linea guida passo-passo e suggerimenti per facilitare l'introduzione per il personale interessato. Un altro svantaggio è che la denudazione è fatta sulla normale parete arteriosa, e quindi, la formazione neo-intima sarà moderata rispetto alla situazione clinica. L'alto livello di colesterolo plasmatico raggiunto nei topi apolipoproteina E knockout (Apoe-/-) alimentati con un'alta dieta grassa crea un ambiente pro-infiammatorio adeguato necessario per la formazione neo-intima.
L'intervento viene eseguito sotto stereomicroscopio. L'arteria carotidea è esposta da un'incisione mediana nella zona cervicale ventrale. Le strutture anatomiche sopra e intorno all'arteria carotide sono minimamente manipolate per ridurre l'infiammazione post-chirurgica. La biforcazione dell'arteria carotide è esposta. Per indurre la formazione accelerata di neointima, le arterie carotide interne ed esterne vengono preparate per la cessazione del flusso sanguigno e la successiva denudazione dell'arteria carotidea. In conclusione, il metodo può essere appreso dal personale con una minima esperienza negli interventi chirurgici sugli animali.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Stereomicroscope</td>
			<td>Olympus</td>
			<td>SZ/X9</td>
			<td>-</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Forceps</td>
			<td>FST, Germany</td>
			<td>91197-00</td>
			<td>standard tip curved 0,17 mm</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hemostat forceps</td>
			<td>FST, Germany</td>
			<td>13007-12</td>
			<td>curved</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Scissors</td>
			<td>FST, Germany</td>
			<td>91460-11</td>
			<td>Straight</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vannas scissor</td>
			<td>Aesculap, Germany</td>
			<td>OC 498 R</td>
			<td>-</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Retractors</td>
			<td>FST, Germany</td>
			<td>18200-10</td>
			<td>2.5mm wide</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Retractors</td>
			<td>FST, Germany</td>
			<td>18200-11</td>
			<td>5mm wide</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ketamine 10%</td>
			<td>CEVA, Germany</td>
			<td>-</td>
			<td>-</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Xylazine 2%</td>
			<td>Medistar, Germany</td>
			<td>-</td>
			<td>-</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bepanthene eye and nose cream</td>
			<td>Bayer, Germany</td>
			<td>-</td>
			<td>-</td>
		</tr>
		<tr>
			<td rowspan="3">Silicon tube</td>
			<td rowspan="3">IFK Isofluor, Germany</td>
			<td rowspan="3">custom-made&#160; product</td>
			<td>diameter 500&#181;m,</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>section thickness 100 &#181;m,</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>polytetrafluorethylene catheter</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PROLENE Suture 6/0&#160;</td>
			<td>ETHICON</td>
			<td>8707H&#160;</td>
			<td>polypropylene monofilament suture, unresorbable, needle CC-1, 13mm, 3/8 Circle&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>7/0 Silk</td>
			<td>Seraflex</td>
			<td>IC 1005171Z</td>
			<td>-</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Michel Suture Clips</td>
			<td>FST, Germany</td>
			<td>12040-01&#160;</td>
			<td>&#160;-&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Clip Applying Forcep</td>
			<td>FST, Germany</td>
			<td>12018-12&#160;</td>
			<td>&#160;-&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>14&#8221;Wire for Catheter</td>
			<td>Abbot</td>
			<td>1000462H</td>
			<td>Use 10 cm from stiff part and equalize the ends</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mice</td>
			<td>Charles River</td>
			<td>Apolipoprotein E -/- mice with C57/Bl6 background</td>
			<td>&#160;-&#160;</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

induction of accelerated atherosclerosis in mice: the "wire-injury" model

L'aterosclerosi è una malattia fibro-infiammatoria proliferotale che si sviluppa nella parete arteriosa, inducendo un flusso sanguigno carente o una mancanza di flusso sanguigno. Inoltre, con la rottura della parete vascolare difettosa, l'aterosclerosi induce la formazione di trombo occlusivo, che rappresenta la causa principale dell'infarto o dell'ictus miocardico e la causa più frequente di morte. Nonostante i progressi nel campo cardiovascolare, molte domande rimangono senza risposta, e ulteriori ricerche di base sono essenziali per migliorare la nostra comprensione dei meccanismi molecolari durante l'aterosclerosi e i suoi effetti. A causa di studi clinici limitati, vi è la necessità di modelli animali rappresentativi che ricreano condizioni aterosclerotiche come la formazione di neointima dopo l'impianto di stent, l'angioplastica a palloncino o l'endarterectomia. Poiché il topo presenta molti vantaggi ed è il modello più utilizzato per studiare i processi molecolari, lo studio attuale propone una procedura invasiva di denudazione endoteliale, nota anche come modello wire-injury, che è rappresentativa della condizione umana della formazione neointima nelle arterie dopo le procedure di revascolazione.

La procedura di induzione della placca aterosclerotica richiede 15 - 20 minuti e mostra un tasso di mortalità minimo, principalmente a causa del sanguinamento che si verifica durante la procedura. Dopo l'intervento chirurgico, i topi si riprendono dall'anestesia entro 20 - 25 min. Dopo l'intervento chirurgico non è stata osservata alcuna compromissione fisica, come la paralisi o disturbo dell'alimentazione.
La lesione del filo induce una de-endotelializzazione, imitando le lesioni vascolari dopo la denudazione del palloncino o l'impianto di stent. Immediatamente dopo l'infortunio, la parete vascolare denudata sarà coperta da uno strato di trombociti, che media e favorisce l'adesione dei monociti12. Le cellule muscolari lisce attivate dai media proliferano e migrano negli spazi intimali, formando il neointima. Altri progenitori per le cellule muscolari lisce miseranno dal sangue (stimato al 40%) e contribuire alla crescita del neointima. La formazione della placca terminerà dopo la completa re-endotelializzazione, di solito 4 settimane dopo l'infortunio al filo.
La formazione di neointima può essere valutata utilizzando la colorazione Movat. La dimensione della placca viene calcolata per ogni diapositiva utilizzando il software, come illustrato nella figura 2B. La dimensione totale della placca (arteria carotide sinistra) può variare tra 70.000 e 100.000 m2, mentre la dimensione del vaso di controllo (arteria carotidea destra) può variare tra 7.000 e 8.000 m2. Questi valori dipendono in gran parte dal chirurgo. Pertanto, si consiglia vivamente di utilizzare lo stesso chirurgo durante gli esperimenti per lo stesso studio.
La placca sviluppata assomiglia alla restenosi stent, che consiste prevalentemente di cellule muscolari levigate proliferate e migrate dai media. La composizione cellulare determinata dalle procedure di colorazione immunologica mostra che il contenuto di cellule muscolari lisce è di circa il 30 - 40%, mentre i macrofagi si trovano nel 15 - 25% del neointima del vaso ferito. La re-endotelializzazione può essere misurata dopo la colorazione per un marcatore endoteliale, e calcolata come percentuale di circonferenza macchiata sull'intera circonferenza del lume. Di solito la re-endotelializzazione raggiunge 80 - 90% dopo 3 settimane, e dovrebbe quasi essere completa dopo 4 settimane (Figura 2C). Per monitorare la crescita della placca durante il suo sviluppo, la stessa analisi può essere ripetuta per ogni momento dopo la lesione del filo, a seconda dell'interesse e dell'argomento studiato (c'è la tabella 1).
<img alt="Figure 1" src="/files/ftp_upload/54571/54571fig1.jpg"> come illustrato nella figura 1. Rappresentazione schematica della procedura operativa. (A) Il posizionamento della tabella operativa verso l'operatore durante la procedura di lesione del filo (B) Vista ingrandita dell'arteria carotide comune e dei suoi rami, come appare sotto il microscopio a 10X ingrandimento (C) La dimensione dell'incisione nell'arteria carotide esterna al microscopio a 10X ingrandimento (D) rappresentazione schematica della procedura di ingrandimento del filo-lesione utilizzando il filo guida da 14 pollici. <a href="http://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/54571/54571fig1large.jpg" target="_blank">Si prega di fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a>
<img alt="Figure 2" src="/files/ftp_upload/54571/54571fig2.jpg"> come illustrato nella Figura 2. Analisi della placca di Restenosi. (A) Rappresentazione schematica dell'analisi della placca nell'arteria carotide comune, 4 settimane dopo l'induzione di un filo-lesione (B) Formazione Neointima 4 settimane dopo la lesione del filo e la rappresentazione schematica dei parametri principali utilizzati per l'analisi. Intima (area verde) è la differenza tra il lumen (rosso) e il lamina interna (linea verde). Il supporto (area gialla) è la differenza tra la lamina externa (linea gialla) e interna (linea verde). Barra di scala 100 m ( C) Immaginirappresentative della colorazione dei principali tipi di cellule coinvolte nella formazione di neointima. Cellule muscolari lisce (agiina muscolare liscia -rosso, barra scala 100 m), macrofagi (Mac 2- verde, barra scala 100 m) e cellule endoteliali (CD31- rosso, frecce, barra della scala 50 m). <a href="http://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/54571/54571fig2large.jpg" target="_blank">Si prega di fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a>
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody>
<tr>
<td>Ore</td>
			<td>Trombo</td>
			<td>Placca (m2)</td>
			<td>
Macrofagi (% da placca)
</td>
			<td>
Cellule muscolari lisce (% da placca)
</td>
			<td>
Re-endotelializzazione (% circonferenza lumen)
</td>
		</tr>
<tr>
<td>1 giorno</td>
			<td>Presente</td>
			<td>0</td>
			<td>0</td>
			<td>0</td>
			<td>0</td>
		</tr>
<tr>
<td>1 settimana</td>
			<td>-</td>
			<td>< 30 000 ></td>
			<td>> 10</td>
			<td>< 50</td>
			<td>< 50</td>
		</tr>
<tr>
<td>2 settimane</td>
			<td>-</td>
			<td>< 50 000 ></td>
			<td>> 10</td>
			<td>< 50</td>
			<td>> 50</td>
		</tr>
<tr>
<td>3 settimane</td>
			<td>-</td>
			<td>< 70 000 ></td>
			<td>15-25</td>
			<td>30-40</td>
			<td>80-90</td>
		</tr>
<tr>
<td>4 settimane</td>
			<td>-</td>
			<td>70 000 – 100 000</td>
			<td>15-25</td>
			<td>30-40</td>
			<td>Completo</td>
		</tr>
</tbody></table>Tabella 1. Sviluppo della placca dipendente dal tempo.
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody>
<tr>
<td>Modello</td>
			<td>Animali</td>
			<td>Vantaggi</td>
			<td>Disuvanti</td>
		</tr>
<tr>
<td rowspan="2">Aterosclerosi autoctone indotta dalla dieta</td>
			<td>Piccolo</td>
			<td>
			<ul>
<li>imita la patologia dell'aterosclerosi</li>
				<li>facilità di gestione</li>
				<li>nessun intervento chirurgico</li>
				<li>senza stress per gli animali</li>
				<li>bassi costi legati all'acquisto e alla cura degli animali</li>
				<li>disponibilità di vari ceppi transgenici e knockout</li>
			</ul>
</td>
			<td>
			<ul>
<li>bassa produttività</li>
				<li>varianza elevata</li>
				<li>aumento del numero di animali richiesto</li>
				<li>aumento del tempo di attesa</li>
			</ul>
</td>
		</tr>
<tr>
<td>Grande</td>
			<td>
			<ul>
<li>imita la patologia dell'aterosclerosi</li>
				<li>facilità di gestione</li>
				<li>nessun intervento chirurgico</li>
				<li>senza stress per gli animali</li>
			</ul>
</td>
			<td>
			<ul>
<li>bassa produttività</li>
				<li>varianza elevata</li>
				<li>aumento del numero di animali richiesto</li>
			</ul>
</td>
		</tr>
<tr>
<td rowspan="2">Dilatazione a palloncino</td>
			<td>Piccolo</td>
			<td>
			<ul>
<li>imita la restenosi dopo l'angioplastica del palloncino</li>
				<li>bassi costi legati all'acquisto e alla cura degli animali</li>
				<li>disponibilità di vari ceppi transgenici e knockout</li>
			</ul>
</td>
			<td>
			<ul>
<li>piccole dimensioni delle arterie principali</li>
				<li>richiede competenze chirurgiche qualificate</li>
				<li>palloncini molto costosi</li>
				<li>denudazione è fatta sulla parete arteriosa normale</li>
				<li>l'esistenza di attrezzature adeguate</li>
				<li>rischi di complicanze come sanguinamento o paralisi</li>
			</ul>
</td>
		</tr>
<tr>
<td>Grande</td>
			<td>
			<ul>
<li>imita la restenosi dopo l'angioplastica del palloncino</li>
				<li>facilità di gestione</li>
				<li>l'uso di dispositivi per gli esseri umani</li>
			</ul>
</td>
			<td>
			<ul>
<li>denudazione è fatta sulla parete arteriosa normale</li>
			</ul>
</td>
		</tr>
<tr>
<td>Lesione del filo</td>
			<td>Piccolo</td>
			<td>
			<ul>
<li>imita la restenosi dopo l'angioplastica del palloncino</li>
				<li>facilità di gestione</li>
				<li>tasso di mortalità minimo</li>
				<li>bassi costi legati all'acquisto e alla cura degli animali</li>
				<li>disponibilità di vari ceppi transgenici e knockout</li>
				<li>nessuna compromissione fisica</li>
			</ul>
</td>
			<td>
			<ul>
<li>piccole dimensioni delle arterie principali</li>
				<li>richiede meno competenze chirurgiche qualificate</li>
				<li>denudazione è fatta sulla parete arteriosa normale</li>
				<li>l'esistenza di attrezzature adeguate</li>
			</ul>
</td>
		</tr>
<tr>
<td rowspan="2">Impianto stent</td>
			<td>Piccolo</td>
			<td>
			<ul>
<li>imita la riposo e la trombosi dopo l'impianto dello stent</li>
				<li>bassi costi legati all'acquisto e alla cura degli animali</li>
				<li>disponibilità di vari ceppi transgenici e knockout</li>
			</ul>
</td>
			<td>
			<ul>
<li>piccole dimensioni delle arterie principali</li>
				<li>richiede competenze chirurgiche qualificate</li>
				<li>piccoli stent non disponibili</li>
				<li>denudazione è fatta sulla parete arteriosa normale</li>
				<li>aumento della mortalità</li>
				<li>l'esistenza di attrezzature adeguate</li>
				<li>rischi di complicanze come sanguinamento o paralisi</li>
			</ul>
</td>
		</tr>
<tr>
<td>Grande</td>
			<td>
			<ul>
<li>imita la riposo e trombosi dopo l'impianto di stent</li>
				<li>facilità di gestione</li>
				<li>l'uso di dispositivi per gli esseri umani</li>
			</ul>
</td>
			<td>
			<ul>
<li>denudazione è fatta sulla parete arteriosa normale</li>
			</ul>
</td>
		</tr>
</tbody></table>Tabella 2. Vantaggi e svantaggi dei modelli esistenti di lesioni arteriose.

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Induction of Accelerated Atherosclerosis in Mice: The "Wire-Injury" Model

Questo studio descrive una procedura invasiva per l'induzione dell'aterosclerosi accelerata nei topi. Rispetto ad altri metodi che utilizzano lesioni indotte da elettricità o crioindotti, la lesione indotta dalla meccanica imita la condizione umana di mentonosi dopo le terapie di revascolazione ed è ideale per lo studio dei meccanismi molecolari coinvolti.

Induzione di aterosclerosi accelerata nei topi: il modello "Wire-Injury"

Atherosclerosis is a proliferative fibro-inflammatory disease developing in the arterial wall, inducing a deficient blood flow or a lack of blood flow. ...

L'obiettivo generale di questa procedura è imitare la condizione umana di restenosi dopo la terapia di rivascolarizzazione nei topi per studiare i meccanismi molecolari coinvolti nella risposta alle lesioni. I principali vantaggi di queste tecniche sono che è altamente riproducibile e facilmente eseguibile, consentendo al ricercatore con un'esperienza anche minima di applicare il metodo in piccoli modelli animali. A dimostrare la procedura sarà Adelina Curaj, postdoc del mio laboratorio.Per indurre l'iperlipidemia, nutrire da sei a otto settimane da 18 a 20 grammi Topi knockout Apoe una dieta aterogenica una settimana prima della procedura chirurgica e fino all'analisi della placca aterosclerotica. Il giorno dell'intervento, dopo aver confermato una mancanza di risposta al dito del piedi, radere il topo anestetizzato nella regione del collo ventrale e disinfettare la pelle esposta con Betadine. Fare un'incisione cutanea di un centimetro nella regione mediana del collo sulla trachea e separare i due corpi grassi per ottenere una visione completa della regione tracheale.Usando un riavvolgitore per tenere aperto lo strato muscolare, esporre l'arteria carotide e utilizzare forcep curve affilate per separare l'arteria dal nervo vago e dalla vena giugulare fino a quando l'area di biforcazione dell'arteria carotide interna ed esterna è visibile. Liberamente, posizionare una sutura di seta lunga sette centimetri e lunga 0-5 sotto l'arteria carotide prossimale all'arco aortico, seguita da una sutura di seta lunga 1,5 centimetri 0-7 vagamente posizionata intorno all'arteria carotide esterna vicino al punto di biforcazione e da un anello di sutura di seta lungo 1,5 centimetri il più distale possibile dalla biforcazione. Posizionare un'altra sutura di seta aperta lunga 1,5 centimetri 0-7 sotto l'arteria carotide interna.Quindi posizionare l'animale con la testa a ore sei. Immediatamente, chiudere saldamente gli anelli di sutura sull'arteria carotide interna e la sutura distale sull'arteria carotide esterna. Usa le forcep emostat per tirare sulle estremità della sutura 0-5 per fermare il flusso sanguigno attraverso la comune arteria carotide.Utilizzando piccole forbici, fare una piccola arteriotomia della metà del diametro del vaso distale all'arteria carotide esterna tra i due anelli e inserire un filo guida flessibile lucidato alcool da 14 pollici inumidito con una goccia di cloruro di sodio dello 0,9% nell'arteria carotide comune attraverso l'incisione. Per evitare l'eruzione arteriosa durante l'incisione Y, utilizzare un filo guida accuratamente lucidato. Ottenere la denudazione endoteliale passando il filo lungo il vaso ruotando tre volte, quindi chiudere saldamente l'anello prossimale sull'arteria carotide esterna e tagliare le suture attorno alle arterie carotidi comuni ed interne per ripristinare il flusso sanguigno.Quindi, rimuovere i retrattiri e riportare lo strato muscolare e i due corpi grassi nella posizione fisiologica. Chiudere la pelle con clip metalliche, quindi lasciare che il mouse si riprenda sul lato sinistro sotto una luce infrarossa con monitoraggio fino a quando non è completamente reclinato. La formazione neointima può essere valutata usando la colorazione Movat.La dimensione totale della placca, che può variare tra 70.000 e 100.000 micron al quadrato, a seconda dell'abilità del chirurgo, può quindi essere calcolata per ogni campione utilizzando il software appropriato. La placca sviluppata assomiglia alla restenosi istantanea, che consiste prevalentemente di cellule muscolari lisce proliferate e migrate dal mezzo. Il contenuto liscio delle cellule muscolari rappresenta circa il 30-40% della placca, mentre i macrofagi trovati all'interno del neointima del vaso ferito covano dal 15 al 25% del numero totale di cellule.La remotelializzazione raggiunge in genere l'80-90% dopo tre settimane e dovrebbe essere quasi completa dopo quattro settimane. Per tracciare la crescita della placca durante il suo sviluppo, l'analisi può essere ripetuta in più punti di tempo dopo la lesione del filo a seconda della domanda sperimentale. Una volta padroneggiata, questa tecnica può essere completata in 15 minuti se viene eseguita correttamente.Durante il tentativo di questa procedura, è importante ricordare che l'area chirurgica deve essere costantemente idratata per prevenire l'essiccazione e facilitare la manipolazione del filo.

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