Name: induction of accelerated atherosclerosis in mice: the "wire-injury" model
Uploaded: 2020-08-25T13:00:00
Duration: 5 s
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이 작품은 임상 연구 IZKF Aachen에 대한 학제 간 센터에 의해 지원되었다 (E.A.L.에 주니어 연구 그룹) RWTH 아헨 대학에서 의학 학부 내에서. 우리는 또한 면역 히스토케토화학 염색에 도움을 준 로야 솔탄 부인에게 감사드립니다.

이 논문에 제시된 실험은 독일 법과 유럽 동물 관리 지침에 따라 수행됩니다. 동물은 실험실 동물 과학 연구소의 동물 시설에서 사육, 대학 병원 Aachen, 독일, 박사 R. 톨바 박사와 박사 A. Teubner의 감독하에 박사 A. Teubner (동물 복지 책임자).
1. 동물 관리
<ol><li>마우스를 전문 의료 실에 보관하여 식품 및 특수 수의학 통제 및 치료에 대한 적절한 접근을 보장합니다. 동물이 제3자로부터 이동하거나 구매하는 경우, 절차를 거치기 전에 1주일의 숙박 기간을 확인하십시오.</li>
</ol>2. 고지혈증 유도
<ol><li>6-8주 생, 18-20g, 암컷(선택적으로)아포에-/- 아포에-/- 외과수술 1주일 전에 아포에-/----19.5% 카제인, wt/wt) 수술 수술 1주일 전에 식이요법을 계속하고 죽상경화 분석 플라크가 수행될 때까지 식단을 계속한다.</li>
</ol>3. 외과 준비
<ol><li>체중별로 100 mg/kg 케타민과 체중별로 10 mg/kg 자일라진의 인트라테코네 주사를 사용하여 마우스를 마취시킵니다. 반사 신경과 수염 운동의 부족에 의해 수술 전에 적절한 마취를 확인합니다. 건조를 최소화하기 위해 소량의 멸균 눈 연고를 눈에 놓습니다.</li>
	<li>멸균 재료와 악기를 사용하여 수술 중 감염을 피하기 위해 멸균 조건의 유지 보수를 보장합니다.</li>
	<li>복부 목 부위에서 마우스를 면도합니다. 절개 하기 전에 베타 딘으로 피부를 소독. 기관 의 상단에 목 영역의 중앙 부위에 1cm 피부 절개를합니다.</li>
	<li>기관 부위에 대한 적절한 전망을 보장하기 위해 두 지방 몸을 분리합니다. 리트랙터를 사용하여 근육 층을 잡고 경동맥을 노출하십시오. 존재하는 경우 경동맥을 덮는 얇은 근육 층의 무딘 해부를 수행하십시오.</li>
	<li>날카로운 곡선 된 집게를 사용하여 경동맥을 미주 신경 및 경정맥에서 분리하십시오. 따라서, 내부 및 외부 경동맥이 있는 분기 영역이 표시되어야 한다. 수술 시 조직 건조를 피하기 위해 0.9%의 NaCl을 사용하십시오.</li>
</ol>4. 와이어 부상
<ol><li>경동맥 아래에 7cm 길이의 0/5 실크 봉합사를 배치하고 대동맥 아치에 근접합니다. 언제든지 닫을 준비가 된 열린 루프를 만듭니다.</li>
	<li>외부 경동맥 주변에 0/7 실크 봉합사(각 1.5cm 길이)를 두 개 놓고, 1개의 루프는 분기점에 가깝고, 가능한 한 하나의 루프를 배치합니다. 언제든지 닫을 준비가 된 열린 루프로 준비합니다.</li>
	<li>내부 경동맥 아래에 0/7 실크 봉합사(길이 1.5cm)를 놓습니다. 언제든지 닫을 준비가 된 열린 루프로 준비합니다.</li>
	<li>마우스 헤드를 연산자 쪽으로 배치하여 반문 시 가이드 와이어 삽입에 적합한 위치를보장합니다(도 1A).</li>
	<li>현미경보기에서, 유지 하 고 hemostat 집게와 0/5 실크 봉합사의 끝을 당겨 서 일반적인 경동맥을 통해 혈류를 중지합니다.</li>
	<li>일반적인 경동맥 합자 직후, 내부 경동맥에 배치된 봉합고와 외부 경동맥에 단부봉을 단단히 닫는다(도1B).</li>
	<li>작은 절개(동맥 절제술, 혈관 직경의 절반)를 외부 경동맥에 하반신, 두 루프 사이에, 작은 가위를 사용하여수행(도 1C). 절개가 너무 큰 경우 문제 해결 지침을 따르십시오(토론 참조).</li>
	<li>상업적으로 연마된 가이드 와이어를 사용하거나 사내 전문 인력을 사용하여 가이드 와이어를 연마하십시오. 14인치 폴리싱형 플렉시블 가이드 와이어를 알코올로 소독하고 0.9% NaCl의 물방울에 적어 용기에 적절한 슬라이딩을 보장합니다.</li>
	<li>외부 경동맥의 횡동맥절제술을 통해 공통경동맥에 가이드와이어를 삽입한다(도1D). 회전하는 동안 선박을 따라 가이드 와이어를 전달하여 내피 성 전증을 얻을 수 있습니다. 이 절차를 세 번 반복합니다. 재현성을 높이기 위해 각 마우스에서 회전 운동의 동일한 진폭을 유지합니다.</li>
	<li>외부 경동맥의 근접 루프를 단단히 닫습니다. 일반적인 동맥 주위의 봉합사와 내부 경동맥 주위의 봉합사를 절단하여 경동맥의 혈류를 복원합니다.</li>
</ol>5. 봉합사 및 회복
<ol><li>리트랙터를 제거하고 근육 층과 두 지방 몸을 생리적 위치로 되돌려 놓습니다.</li>
	<li>심초음파 측정이 필요한 경우 세 개의 분리된 봉합사 0/6으로 피부를 닫습니다. 이미징이 필요하지 않은 경우 금속 클립을 사용하여 피부를 닫습니다.</li>
	<li>마우스가 깨어날 때까지 적외선 아래 왼쪽에 마우스를 놓습니다. 완전히 회복 될 때까지 동물을 방치하거나 다른 동물의 회사에 두지 마십시오.</li>
	<li>향후 식별을 위해 로컬 시스템을 사용하여 마우스를 표시합니다. 지역 기관에서 동물 복지 담당자에게 문의하십시오.</li>
</ol>6. 죽상 경화성 플라크 분석
<ol><li>체중별로 100 mg/kg 케타민과 체중별로 10 mg/kg 자일라진의 인트라타임 주사를 사용하여 말기 지점에서 마우스를 마취시킵니다. 반사 신경과 수염 운동의 부족에 의해 적절한 마취를 확인합니다.</li>
	<li>레트로 궤도 또는 심장 천자에 의해 전산을 수행하고 추가 분석을 위해 혈액을 수집2.</li>
	<li>베타딘으로 피부를 소독합니다. 흉부 구멍을 열고 심장의 오른쪽 수리를 제거합니다. 혈관에서 남은 혈액을 제거하고 조직을 해결하기 위해 4 % PFA를 perfuse 왼쪽 심실을 통해 인산완충액을 perfuse.</li>
	<li>고정이 필요하지 않은 경우,2,4,11을세척한 직후 경동맥을 절사한다. 파라핀 포함, 저온절, mRNA 또는 단백질 분석 등 관심 있는 분석과 함께 표준 프로토콜을 수행합니다.</li>
	<li>형태 측정을 위해, 분단을 포함한 경동맥을 최소한의 조작으로 조심스럽게 절제하여 곡면집포와 작은 가위를 사용하여 대동맥 아치에 근접하게 한다.</li>
	<li>표준 포함 프로토콜을 사용하여 파라핀 블록에 경동맥을 포함시면 됩니다. 횡단 절위를 수행하려면 경동맥을 양면에 똑바로 놓습니다. 분기로 시작하여 5 μm 두께의 직렬 섹션을 잘라 코팅 된 조직 슬라이드(그림 2A)에모두 수집합니다.</li>
	<li>모바트 스테인딩을 사용하여10번 섹션마다 얼룩을 두어 라미나스2,4,11을 강조합니다. 도 2B에도시된 바와 같이, 모든 선박의 현미경 사진(10X 목표 사용)을 수집한 후, 각 섹션에 대한 루멘뿐만 아니라 내부 및 외부 라미나도2,4,11측정한다. 선박의 친밀감 성장과 미디어를 계산합니다.</li>
	<li>일반적인 면역 조직학적 염색2(도 2C)를사용하여 연재 된 섹션에서 부드러운 근육2 세포 및 대식세포 함량 또는 내피 회복을 분석합니다.</li>
</ol>

<ol>
	<li>Simsekyilmaz, S., Liehn, E. A., Militaru, C., Vogt, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Progress+in+interventional+cardiology:+challenges+for+the+future.">Progress in interventional cardiology: challenges for the future.</a> Thromb Haemost. 113 (3), 464-472 (2015).</li><li>Kubo, N., McCurdy, S., Boisvert, W. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Defective+Fas+Expression+on+Bone+Marrow+Derived+Cells+Alters+Atherosclerotic+Plaque+Morphology+in+Hyperlipidemic+Mice.">Defective Fas Expression on Bone Marrow Derived Cells Alters Atherosclerotic Plaque Morphology in Hyperlipidemic Mice.</a> Discoveries. 3 (1), e37 (2015).</li><li>Saffarzadeh, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterization+of+rapid+neutrophil+extracellular+trap+formation+and+its+cooperation+with+phagocytosis+in+human+neutrophils.">Characterization of rapid neutrophil extracellular trap formation and its cooperation with phagocytosis in human neutrophils.</a> Discoveries. 2 (2), e19 (2014).</li><li>Lindner, V., Fingerle, J., Reidy, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mouse+model+of+arterial+injury.">Mouse model of arterial injury.</a> Circ Res. 73 (5), 792-796 (1993).</li><li>Schwartz, R. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Preclinical+evaluation+of+drug-eluting+stents+for+peripheral+applications:+recommendations+from+an+expert+consensus+group.">Preclinical evaluation of drug-eluting stents for peripheral applications: recommendations from an expert consensus group.</a> Circulation. 110 (16), 2498-2505 (2004).</li><li>Schwartz, R. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Restenosis+and+the+proportional+neointimal+response+to+coronary+artery+injury:+results+in+a+porcine+model.">Restenosis and the proportional neointimal response to coronary artery injury: results in a porcine model.</a> J Am Coll Cardiol. 19 (2), 267-274 (1992).</li><li>Curaj, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Noninvasive+molecular+ultrasound+monitoring+of+vessel+healing+after+intravascular+surgical+procedures+in+a+preclinical+setup.">Noninvasive molecular ultrasound monitoring of vessel healing after intravascular surgical procedures in a preclinical setup.</a> Arterioscler Thromb Vasc Biol. 35 (6), 1366-1373 (2015).</li><li>Liehn, E. 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A., Zernecke, A., Postea, O., Weber, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chemokines:+inflammatory+mediators+of+atherosclerosis.">Chemokines: inflammatory mediators of atherosclerosis.</a> Arch Physiol Biochem. 112 (4-5), 229-238 (2006).</li><li>Simsekyilmaz, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Role+of+extracellular+RNA+in+atherosclerotic+plaque+formation+in+mice.">Role of extracellular RNA in atherosclerotic plaque formation in mice.</a> Circulation. 129 (5), 598-606 (2014).</li><li>Wu, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rhodamine-loaded+intercellular+adhesion+molecule-1-targeted+microbubbles+for+dual-modality+imaging+under+controlled+shear+stresses.">Rhodamine-loaded intercellular adhesion molecule-1-targeted microbubbles for dual-modality imaging under controlled shear stresses.</a> Circ Cardiovasc Imaging. 6 (6), 974-981 (2013).</li><li>Schober, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Crucial+role+of+the+CCL2/CCR2+axis+in+neointimal+hyperplasia+after+arterial+injury+in+hyperlipidemic+mice+involves+early+monocyte+recruitment+and+CCL2+presentation+on+platelets.">Crucial role of the CCL2/CCR2 axis in neointimal hyperplasia after arterial injury in hyperlipidemic mice involves early monocyte recruitment and CCL2 presentation on platelets.</a> Circ Res. 95 (11), 1125-1133 (2004).</li><li>Ali, Z. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Increased+in-stent+stenosis+in+ApoE+knockout+mice:+insights+from+a+novel+mouse+model+of+balloon+angioplasty+and+stenting.">Increased in-stent stenosis in ApoE knockout mice: insights from a novel mouse model of balloon angioplasty and stenting.</a> Arterioscler Thromb Vasc Biol. 27 (4), 833-840 (2007).</li><li>Chamberlain, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+novel+mouse+model+of+in+situ+stenting.">A novel mouse model of in situ stenting.</a> Cardiovasc Res. 85, 38-44 (2010).</li><li>Rodriguez-Menocal, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+novel+mouse+model+of+in-stent+restenosis.">A novel mouse model of in-stent restenosis.</a> Atherosclerosis. 209 (2), 359-366 (2010).</li><li>Simsekyilmaz, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+murine+model+of+stent+implantation+in+the+carotid+artery+for+the+study+of+restenosis.">A murine model of stent implantation in the carotid artery for the study of restenosis.</a> J Vis Exp. , e50233 (2013).</li><li>Schroder, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=NADPH+oxidase+Nox2+is+required+for+hypoxia-induced+mobilization+of+endothelial+progenitor+cells.">NADPH oxidase Nox2 is required for hypoxia-induced mobilization of endothelial progenitor cells.</a> Circ Res. 105 (6), 537-544 (2009).</li></ol>

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이 논문에서는 동물 수술 경험이 부족한 인력에 의해서도 와이어 부상 절차를 수행하는 유용한 팁을 제공합니다. 외부 경동맥의 절개와 와이어 삽입이라는 두 가지 중요한 단계가 있습니다. 외부 경동맥의 절개는 충분한 잔류 물질을 보장하기 위해, 분기로부터 가능한 한 수행되어야한다(도 1C). 절개는 전체 선박을 절단할 위험이 있기 때문에 너무 커서는 안됩니다. 두 번째 중요한 단계는 혈류가 효율적으로 중단되지 않으면 동맥 절제술 과 가이드 와이어의 삽입 중에 출혈의 위험이 높다. 더욱이, 내피 성약이 일어나지 않거나 가이드 와이어가 루멘 용기에 제대로 도입되지 않으면 동맥 파열이 가능할 수 있다. 이를 방지하기 위해 가이드 와이어의 표면은 작동 전에 신중하게 연마되어야 합니다.
프로토콜을 최적화하기 위해 마우스 헤드가 있는 수술대의 위치가 적절한 가이드 와이어 조작에 대한 더 나은 보기, 접근성 및 제어를 보장합니다. 또한 재현성을 높이기 위해 모든 연구에서 동일한 가이드 와이어를 사용하십시오. 와이어 크기는 변하지 않기 때문에 연구에 포함된 모든 마우스에 대해 동일한 성별, 연령 및 체중을 사용하여 마우스 간의 가능한 모든 차이를 고려하고 제거하는 것이 중요합니다. 그 후, 에반스 블루 염색은 외과 의사가 부인의 효율성을 결정하는 데 도움이 될 것입니다. 적절한 장비의 존재는 절차의 성공을위한 전제 조건입니다. 10X 스테레오현미경은 이 절차를 수행하는 데 필수적입니다. 가이드 와이어의 적절한 준비 (예 : 연마)가 중요합니다. 따라서 가이드 와이어 준비를 가능한 전문 기술 인력에 의해 수행하는 것이 좋습니다.
이 프로토콜에는 많은 문제 해결 단계가 있습니다. 분기 부근의 외부 경동맥을 절개하면, 분기 부근의 엑스터를 조심스럽게 묶기 때문에 출혈이 발생하지 않도록 하십시오. 절단 하는 동안, 외부 경 동맥을 볼 수 없습니다. 따라서 실크 봉합사의 수준에서 분기를 고려하십시오. 실크 봉합사가 사라지면 섹션을 수집합니다. 외부 경동맥의 절개가 너무 크고 혈관이 파열되면 경동맥 과 내부 경동맥으로의 혈류가 효과적으로 중단되고 집게를 사용하여 혈관의 개구부를 찾으려고 노력한다. 가이드 와이어를 도입하고 비하를 수행 한 후, 분기 근처 선박을 바인딩합니다. 절단 하는 동안 봉합사에서 실크가 사라지기 시작할 때 수집하기 시작합니다. 가이드 와이어로 반증하는 동안 동맥 파열이 발생하는 경우 가이드 와이어가 제대로 연마되었는지 현미경으로 확인하십시오.
임상 상황에 와이어 상해 모형의 유사성에도 불구하고, 많은 단은 마우스에 있는 토착 동맥 경화증에 집중됩니다, 또는 작은 동물 수술을 능력을 발휘할 수 있는 훈련된 인력의 부족 때문에 쥐 또는 토끼에 있는 풍선 혈관 성형술과 같은 침략적인 동맥 경화증 유도를 선택합니다. 토끼 /쥐를 사용 하 여 혜택에도 불구 하 고, 예를 들어 소형화 된 장비에 대 한 필요, 쥐 모델 도 토끼 모델 다양 한 녹아웃 균주를 제공, 네오인 티마 성장 및 스텐트 혈전증에 관련 된 분자 메커니즘을 공부 의 관점에서.
마우스에서 스텐트 내 레스텐소를 연구하기 위한 기존 모델은 어렵고, 높은 수술 능력을 필요로 하며, 출혈이나 마비와 같은 합병증의 위험이 높습니다. 예를 들어, 대퇴동맥을 통한 흉부 대동맥내로의 기계적 상해 또는 스텐트 이식은 높은 사망률(35%)을 동반한다. 뒷다리 마비 또는 출혈13-15로인해. 우리는 또한 마우스(16)의경동맥에 스텐트 이식을 설명합니다. 절차는 비슷합니다. 그러나, 분석을 위한 조직 처리는 복잡하고 모든실험실(16)에는제공되지 않는다. 경동맥은 수술 절차뿐만 아니라 초음파 이미징과 같은 기존 이미징 방법에 대해서도 직접 접근 할 수 있습니다. 마우스내 경동맥의 다른 상해 유도는 전기장치(17)를사용하여 수행될 수 있다. 이 방법은 수행하기 쉽고 높은 재현성을 보장합니다. 그러나, 그것은 기계적 상해와 동일하지 않은 모든 선박 층에서 부상을 유도한다. 풍선 응용 프로그램은 임상 사례에 따라 혈관 직경조정과 같은 이점이 있으며 병리학적 결과에 강한 영향을 미칩니다. 마우스 풍선을 사용할 수 있지만, 그들은 매우 비싸므로 널리 사용되지 않습니다. 대신, 와이어 부상은 스텐트 협착증을 모방한 확립된 방법입니다.
기상경화성 배경이 있지만, 반증은 정상적인 동맥 벽에서 수행됩니다. 따라서, 네오인티마 형성은 임상 상황에 비해 중등도가 될 것이다. 전임상 모델의 높은 수는 어떤 모델도 인간에서 병리생리학으로 이어지는 세포 및 분자 메커니즘의 전체를 발견하는 데 필요한 모든 기준을 충족하지 않는다는 것을 보여줍니다(표 2참조).
와이어-상해 절차를 수행한 후, 다른 생물학적 및 분자 분석은 세포, 단백질, mRNA, microRNAs, 유전자 또는 기타 바이오마커를 식별하기 위해 수행될 수 있으며, 이는 죽상 경화증에 대한 새로운 치료 전략을 개발하기 위한 치료 적 표적으로 사용될 수 있으며, 특히 혈관 손상 후 신자극성 형성을 위한 것이다. 가능한 경우, 플라크 성장은 고주파 초음파 또는 기타 고해상도 이미징 기술을 사용하여 모니터링될 수 있습니다. 더욱이, 이 기술을 마스터하면 운영자가 칼라 배치, 부분 결찰 또는 스텐트 이식과 같은 다른 침습성 죽상 경화증 유도 모델에 프로토콜을 조정할 수있는 기회를 제공 할 것입니다.

죽상 경화증은 심근 경색 또는 치기와 같은 심장 혈관 사건의 근본적인 주요 병리학입니다. 급성 심혈관 증후군을 유발하는 주요 메커니즘은 플라크 파열, 피상침식 및 혈전 형성입니다. 플라크 발달에 연결된 여러 임상 상황이 있습니다: 토착 죽상 경화성 플라크, 종말 이후의 restenosis, 및 스텐트 이식 없이 풍선 혈관 성형술 후 의 석면1. 동맥 손상 후, 염증 과정의억제(2,3) 및 내피구의 회수는 추가 합병증을 방지하기 위해 필수적이다1. 임상 연구는 윤리적 고려 사항, 비용 및 기본 메커니즘에 대한 지식부족으로 인해 조직 및 혈액 샘플로 제한됩니다. 이러한 이유로, 임상 상태를 재현할 수 있는 동물 모델4-6에서분자 메커니즘을 연구할 필요가 있다. 죽상 동맥 경화증의 맥락에서 가속 된 네오인티마 형성의 우리의 모델은 작은 동물7-11에서이러한 모델의 구현에 대한 수년간의 경험의 결과입니다. 마우스 모델은 취급의 용이성, 동물 구매 및 관리와 관련된 저렴한 비용으로 인해 큰 동물 그룹을 가질 수있는 능력, 다양한 형질 전환 및 녹아웃 균주의 가용성으로 인해 연구를위한 가장 매력적인 모델입니다.
마우스 모델의 주요 단점은 동맥 경화성 질환(경동맥, 대동맥 및 대퇴동맥)을 받는 주요 동맥의 작은 크기로, 혈관을 조작하고 침습적으로 동맥경화성 플라크를 유도하기 위해 자격을 갖춘 외과 적 전문 지식과 기술을 필요로 한다. 따라서, 이 논문에서 제안된 종말또는 스텐트 이식 후 의정작용의 맥락에서, 가속된 네오인티마 형성의 모델은 관심 있는 인력에 대한 도입을 용이하게 하기 위한 단계별 지침 및 제안으로 제시된다. 또 다른 단점은 비하가 정상적인 동맥 벽에 이루어지므로, 따라서, 신-인티마 형성은 임상 상황에 비해 온건할 것이라는 것이다. 높은 수준의 혈장 콜레스테롤은 아폴리포프로틴 E녹아웃(Apoe-/-)-/-높은 지방 식단으로 공급되는 마우스는 신친티마 형성에 필요한 적절한 염증성 환경을 조성한다.
수술은 스테레오 현미경으로 수행됩니다. 경동맥은 복부 자궁 경부 부위의 중앙 분리에 의해 노출됩니다. 경동맥 위에 해부학적 구조가 수술 후 염증을 줄이기 위해 최소한으로 조작됩니다. 경동맥 분면이 노출됩니다. 가속 된 neointima 형성을 유도하기 위해, 내부 및 외부 경동맥은 혈류 중단 및 후속 일반적인 경동맥 부인을 위해 준비됩니다. 결론적으로, 이 방법은 동물 수술 경험이 부족한 인력에 의해 배울 수 있습니다.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Stereomicroscope</td>
			<td>Olympus</td>
			<td>SZ/X9</td>
			<td>-</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Forceps</td>
			<td>FST, Germany</td>
			<td>91197-00</td>
			<td>standard tip curved 0,17 mm</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hemostat forceps</td>
			<td>FST, Germany</td>
			<td>13007-12</td>
			<td>curved</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Scissors</td>
			<td>FST, Germany</td>
			<td>91460-11</td>
			<td>Straight</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vannas scissor</td>
			<td>Aesculap, Germany</td>
			<td>OC 498 R</td>
			<td>-</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Retractors</td>
			<td>FST, Germany</td>
			<td>18200-10</td>
			<td>2.5mm wide</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Retractors</td>
			<td>FST, Germany</td>
			<td>18200-11</td>
			<td>5mm wide</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ketamine 10%</td>
			<td>CEVA, Germany</td>
			<td>-</td>
			<td>-</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Xylazine 2%</td>
			<td>Medistar, Germany</td>
			<td>-</td>
			<td>-</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bepanthene eye and nose cream</td>
			<td>Bayer, Germany</td>
			<td>-</td>
			<td>-</td>
		</tr>
		<tr>
			<td rowspan="3">Silicon tube</td>
			<td rowspan="3">IFK Isofluor, Germany</td>
			<td rowspan="3">custom-made&#160; product</td>
			<td>diameter 500&#181;m,</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>section thickness 100 &#181;m,</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>polytetrafluorethylene catheter</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PROLENE Suture 6/0&#160;</td>
			<td>ETHICON</td>
			<td>8707H&#160;</td>
			<td>polypropylene monofilament suture, unresorbable, needle CC-1, 13mm, 3/8 Circle&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>7/0 Silk</td>
			<td>Seraflex</td>
			<td>IC 1005171Z</td>
			<td>-</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Michel Suture Clips</td>
			<td>FST, Germany</td>
			<td>12040-01&#160;</td>
			<td>&#160;-&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Clip Applying Forcep</td>
			<td>FST, Germany</td>
			<td>12018-12&#160;</td>
			<td>&#160;-&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>14&#8221;Wire for Catheter</td>
			<td>Abbot</td>
			<td>1000462H</td>
			<td>Use 10 cm from stiff part and equalize the ends</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mice</td>
			<td>Charles River</td>
			<td>Apolipoprotein E -/- mice with C57/Bl6 background</td>
			<td>&#160;-&#160;</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

induction of accelerated atherosclerosis in mice: the "wire-injury" model

죽상 동맥 경화증은 동맥 벽에서 발전하는 증식 섬유 염증 성 질환으로 혈류 가 부족하거나 혈류 부족을 유발합니다. 더욱이, 결함이 있는 혈관 벽의 파열에 의해, 동맥 경화증은 심근 경색 또는 치기의 주요 원인 및 죽음의 가장 빈번한 원인을 나타내는 폐색 혈전 형성을 유도합니다. 심혈관 분야의 진보에도 불구하고, 많은 질문이 답을 찾지 못하고 있으며, 죽상 동맥 경화증 과 그 효과 동안 분자 메커니즘에 대한 이해를 향상시키기 위해서는 추가적인 기본 연구가 필수적입니다. 제한된 임상 연구로 인해 스텐트 이식 후 신자극성 형성, 풍선 혈관 성형술 또는 종말발성술과 같은 죽상 경화 상태를 재현하는 대표적인 동물 모델에 대한 필요성이 있습니다. 마우스는 많은 장점을 제시하고 분자 프로세스를 공부하기 위한 가장 빈번한 모형이기 때문에, 현재 연구 결과는 또한 재변절차 후에 동맥에 있는 neointima 대형의 인간적인 상태를 대표하는 철부 상해 모형으로 알려져 있는 내피성 반출의 침략적인 절차를 제안합니다.

죽상 경화성 플라크 유도 절차는 15 -20 분 소요하고 주로 절차 도중 생기는 출혈 때문에 최소한의 사망률을 보여줍니다. 수술 후, 마우스는 20 - 25 분 이내에 마취에서 회복. 수술 후 마비나 수유 장애와 같은 신체적 장애는 관찰되지 않았습니다.
와이어-부상은 풍선 반출 또는 스텐트 이식 후 혈관 병변을 모방하여 내피화를 유도합니다. 부상 직후, 탈모된 혈관 벽은 혈전세포 층으로 덮여 있으며, 이는단핵구(12)의접착을 중재하고 선호한다. 미디어에서 활성화된 부드러운 근육 세포는 증식하고 친밀감 공간으로 이동하여 네오인티마를 형성합니다. 부드러운 근육 세포를 위한 그밖 선조는 혈액에서 이동합니다 (40%로 추정됩니다) 네오티마 성장에 기여합니다. 플라크 형성은 전신 재내피화 후, 일반적으로 와이어 부상 후 4 주 후에 끝납니다.
네오티마 형성은 모바트 염색을 사용하여 평가될 수 있다. 플라크 크기는 그림 2B에표시된 소프트웨어를 사용하여 각 슬라이드에 대해 계산됩니다. 총 플라크 크기(왼쪽 경동맥)는 70,000~100,000μm² 사이로 다를 수 있으며, 제어 용기 크기(오른쪽 경동맥)는 7,000~8,000μm² 사이로 다를 수 있습니다. 이러한 값은 외과 의사에 크게 의존합니다. 따라서 동일한 연구를 위해 실험 하는 동안 동일한 외과 의사를 사용하는 것이 좋습니다.
개발 된 플라크는 주로 확산 및 미디어에서 이동 부드러운 근육 세포로 구성된 스텐트 레스텐디스에서 유사합니다. 면역학적 염색 절차에 의해 결정된 세포 조성물은 매끄러운 근육 세포 함량이 약 30-40%임을 나타내며, 대식세포는 부상당한 선박의 네오인티마의 15~25%에서 발견된다. 재내피화는 내피 마커에 대한 염색 후 측정될 수 있으며, 루멘의 전체 둘레에 염색된 둘레의 백분율로 계산될 수 있다. 일반적으로 재내피화는 3주 후에 80-90%에 이르며, 4주 후에 거의 완료되어야한다(그림 2C). 개발 중 플라크 성장을 추적하기 위해, 연구된 관심사와 주제에 따라 와이어 부상 후 의 모든 시간 지점에서 동일한 분석을 반복할 수 있습니다(표 1참조).
<img alt="Figure 1" src="/files/ftp_upload/54571/54571fig1.jpg"> 그림 1. 수술 절차의 회로도 표현. (A) The positioning of the operation table toward the operator during the wire-injury procedure (B) Enlarged view of the common carotid artery and its branches, as it appears under the microscope at 10X magnification (C) The size of the incision in the external carotid artery under the microscope at 10X magnification (D) Schematic representation of wire-injury procedure using the 14 inch guide wire. <a href="http://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/54571/54571fig1large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a>
<img alt="Figure 2" src="/files/ftp_upload/54571/54571fig2.jpg"> 그림 2. 레스타시스 플라크 분석. (A) 일반적인 경동맥에서 플라크 분석의 회로도 표현, 4주 후 와이어-부상유도(B) 네오인티마 형성 4주 후 와이어-부상 및 분석에 사용되는 주요 파라미터의 회로도 표현. 인티마(녹색영역)는 루멘(레드)과 라미나 인터나(그린 라인)의 차이이다. 미디어(노란색 영역)는 라미나 엑스테르나(노란색 선)와 인터나(녹색선)의 차이이다. 스케일 바 100 μm(C) 네오티마 형성에 관여하는 주요 세포 유형의 염색의 대표적인 이미지. 부드러운 근육 세포 (부드러운 근육 액틴 -빨강, 스케일 바 100 μm), 대식세포 (Mac 2- 녹색, 스케일 바 100 μm) 및 내피 세포 (CD31- 빨간색, 화살표, 스케일 바 50 μm). <a href="http://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/54571/54571fig2large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a>
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody>
<tr>
<td>시간</td>
			<td>트롬버스</td>
			<td>플라크(μm²)</td>
			<td>
Macrophages (플라크에서%)
</td>
			<td>
부드러운 근육 세포 (플라크에서%)
</td>
			<td>
재내피화 (루멘 둘레%)
</td>
		</tr>
<tr>
<td>1일</td>
			<td>현재</td>
			<td>0</td>
			<td>0</td>
			<td>0</td>
			<td>0</td>
		</tr>
<tr>
<td>1주일</td>
			<td>-</td>
			<td>& 30 000</td>
			<td>> 10</td>
			<td>& 50</td>
			<td>& 50</td>
		</tr>
<tr>
<td>2주</td>
			<td>-</td>
			<td>& 50 000</td>
			<td>> 10</td>
			<td>& 50</td>
			<td>> 50</td>
		</tr>
<tr>
<td>3주</td>
			<td>-</td>
			<td>& 70 000</td>
			<td>15-25</td>
			<td>30-40</td>
			<td>80-90</td>
		</tr>
<tr>
<td>4주</td>
			<td>-</td>
			<td>70 000 – 100 000</td>
			<td>15-25</td>
			<td>30-40</td>
			<td>완료</td>
		</tr>
</tbody></table>표 1. 시간에 따라 달라 진 플라크개발.
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody>
<tr>
<td>모델</td>
			<td>동물</td>
			<td>장점</td>
			<td>경멸의 반적</td>
		</tr>
<tr>
<td rowspan="2">식이 유발 된 토착 동맥 경화증</td>
			<td>작은</td>
			<td>
			<ul>
<li>죽상 동맥 경화증 병리를 모방</li>
				<li>취급의 용이성</li>
				<li>수술 없음</li>
				<li>동물에 대한 스트레스 없음</li>
				<li>동물 구매 및 관리와 관련된 저렴한 비용</li>
				<li>다양한 형질 전환 및 녹아웃 균주의 가용성</li>
			</ul>
</td>
			<td>
			<ul>
<li>낮은 재생산성</li>
				<li>높은 분산</li>
				<li>동물의 수 증가</li>
				<li>대기 시간 증가</li>
			</ul>
</td>
		</tr>
<tr>
<td>큰</td>
			<td>
			<ul>
<li>죽상 동맥 경화증 병리를 모방</li>
				<li>취급의 용이성</li>
				<li>수술 없음</li>
				<li>동물에 대한 스트레스 없음</li>
			</ul>
</td>
			<td>
			<ul>
<li>낮은 재생산성</li>
				<li>높은 분산</li>
				<li>동물의 수 증가</li>
			</ul>
</td>
		</tr>
<tr>
<td rowspan="2">풍선 팽창</td>
			<td>작은</td>
			<td>
			<ul>
<li>풍선 혈관 성형술 후 restenosis를 모방</li>
				<li>동물 구매 및 관리와 관련된 저렴한 비용</li>
				<li>다양한 형질 전환 및 녹아웃 균주의 가용성</li>
			</ul>
</td>
			<td>
			<ul>
<li>주요 동맥의 작은 크기</li>
				<li>자격을 갖춘 외과 전문 지식이 필요합니다.</li>
				<li>풍선은 매우 비싸다</li>
				<li>일반적인 동맥 벽에 반출</li>
				<li>적절한 장비의 존재</li>
				<li>출혈 이나 마비로 합병증의 위험</li>
			</ul>
</td>
		</tr>
<tr>
<td>큰</td>
			<td>
			<ul>
<li>풍선 혈관 성형술 후 restenosis를 모방</li>
				<li>취급의 용이성</li>
				<li>인간을 위한 장치 사용</li>
			</ul>
</td>
			<td>
			<ul>
<li>일반적인 동맥 벽에 반출</li>
			</ul>
</td>
		</tr>
<tr>
<td>와이어 부상</td>
			<td>작은</td>
			<td>
			<ul>
<li>풍선 혈관 성형술 후 restenosis를 모방</li>
				<li>취급의 용이성</li>
				<li>최소 사망률</li>
				<li>동물 구매 및 관리와 관련된 저렴한 비용</li>
				<li>다양한 형질 전환 및 녹아웃 균주의 가용성</li>
				<li>신체적 장애 없음</li>
			</ul>
</td>
			<td>
			<ul>
<li>주요 동맥의 작은 크기</li>
				<li>자격을 갖춘 수술 전문 지식이 덜 필요합니다.</li>
				<li>일반적인 동맥 벽에 반출</li>
				<li>적절한 장비의 존재</li>
			</ul>
</td>
		</tr>
<tr>
<td rowspan="2">스텐트 이식</td>
			<td>작은</td>
			<td>
			<ul>
<li>스텐트 이식 후 레세노증과 혈전증을 모방</li>
				<li>동물 구매 및 관리와 관련된 저렴한 비용</li>
				<li>다양한 형질 전환 및 녹아웃 균주의 가용성</li>
			</ul>
</td>
			<td>
			<ul>
<li>주요 동맥의 작은 크기</li>
				<li>자격을 갖춘 외과 전문 지식이 필요합니다.</li>
				<li>작은 스텐트를 사용할 수 없습니다.</li>
				<li>일반적인 동맥 벽에 반출</li>
				<li>사망률 증가</li>
				<li>적절한 장비의 존재</li>
				<li>출혈 이나 마비로 합병증의 위험</li>
			</ul>
</td>
		</tr>
<tr>
<td>큰</td>
			<td>
			<ul>
<li>레스타디스를 모방 스텐트 이식 후 혈전증</li>
				<li>취급의 용이성</li>
				<li>인간을 위한 장치 사용</li>
			</ul>
</td>
			<td>
			<ul>
<li>일반적인 동맥 벽에 반출</li>
			</ul>
</td>
		</tr>
</tbody></table>표 2. 동맥 상해의 실존모델의 장점과 단점.

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Induction of Accelerated Atherosclerosis in Mice: The "Wire-Injury" Model

이 연구는 마우스에 있는 가속된 죽상 경화증의 유도를 위한 침략적인 절차를 기술합니다. 전기 또는 극저온 유도 된 상해를 사용하는 다른 방법에 비해, 기계적 으로 인한 상해는 재변 치료 후 restenosis의 인간의 상태를 모방하고 관련된 분자 메커니즘의 연구에 이상적입니다.

마우스에서 가속 죽상 경화증의 유도: "와이어 부상" 모델

Atherosclerosis is a proliferative fibro-inflammatory disease developing in the arterial wall, inducing a deficient blood flow or a lack of blood flow. ...

이 절차의 전반적인 목표는 상해 반응에 관련되되은 분자 기계장치를 공부하기 위하여 마우스에 있는 재회전 치료 후에 restenosis의 인간적인 상태를 모방하는 것입니다. 이러한 기술의 주요 장점은 매우 재현 가능하고 쉽게 수행할 수 있으므로 최소한의 경험을 가진 연구원이 작은 동물 모델에 방법을 적용할 수 있다는 것입니다. 절차를 시연하는 것은 내 실험실의 포스트 독인 아델리나 쿠라즈(Adelina Curaj)가 될 것입니다.고지혈증을 유도하기 위해, 수술 1주일 전과 죽상 경화성 플라크 분석전까지 6~8주 된 18~20그램 아포 녹아웃 마우스에게 아포겐성 식단을 먹인다. 수술 당일, 발가락 핀치에 대한 반응의 부족을 확인한 후, 복부 목 부위에 마취 된 마우스를 면도하고 베타딘으로 노출 된 피부를 소독하십시오. 기관지 위에 목의 중앙 분리부위에 있는 1센티미터 피부 절개를 만들고 기관 부위의 완전한 시야를 얻기 위하여 2개의 지방 바디를 분리합니다.하나의 리트랙터를 사용하여 근육층을 열어 놓고, 경동맥을 노출시키고, 날카로운 곡면집삼을 사용하여 내부 및 외부 경동맥의 양면 영역이 보일 때까지 미주 신경 및 경정맥에서 동맥을 분리한다. 느슨하게, 대동맥 대동맥 근위아래 7센티미터 길이의 0-5 실크 봉합사를 놓고, 그 다음에 는 1.5센티미터 길이의 0-7 실크 봉합사를 외부 경동맥 주변에 느슨하게 배치하고, 1.5센티미터 길이의 0-7 실크 봉합루프를 이중으로 배치하였다. 내부 경동맥 아래에 1.5센티미터 길이의 0-7 실크 봉합사를 더 엽니다.그런 다음 6시 위치에 머리를 가진 동물을 배치합니다. 즉시 내부 경동맥의 봉합봉 루프와 외부 경동맥의 단부 봉합사를 단단히 닫습니다. hemostat 집게를 사용하여 0-5 봉합사의 끝을 당겨 일반적인 경동맥을 통해 혈류를 중지하십시오.작은 가위를 사용하여, 두 루프 사이의 외부 경동맥에 혈관 직경의 절반의 작은 동맥 절제술을 하고 절개를 통해 일반적인 경동맥에 0.9 %의 염화 나트륨을 떨어 뜨리는 14 인치 알코올 연마 유연한 가이드 와이어를 삽입합니다. Y 절개 시 동맥 분화를 피하려면 신중하게 연마된 가이드와이어를 사용하십시오. 혈관을 따라 와이어를 3번 회전하는 동안 와이어를 통과한 다음 외부 경동맥의 근접 루프를 단단히 닫고 일반 및 내부 경동맥 주위의 봉합사를 잘라 혈액 흐름을 복원하여 내피 성모를 얻습니다.다음으로, 리트랙터를 제거하고 근육 층과 두 개의 지방 몸을 생리학적 위치로 되돌려 놓습니다. 금속 클립으로 피부를 닫은 다음 마우스가 적외선 아래에서 왼쪽에서 완전히 구부러지기 때까지 모니터링할 수 있도록 합니다. 네오티마 형성은 모바트 염색을 사용하여 평가될 수 있다.70, 000 및 100, 000 미크론 제곱 사이를 다를 수 있는 총 플라크 크기는 외과 의사의 기술에 따라 적절한 소프트웨어를 사용하여 각 샘플에 대해 계산할 수 있습니다. 개발 된 플라크는 주로 배지에서 증식 및 이동 된 부드러운 근육 세포로 구성된 즉각적인 restenosis와 유사합니다. 매끄러운 근육 세포 함량은 플라크의 약 30~40%를 나타내며, 부상당한 혈관의 네오인티마 내에서 발견되는 대식세포는 전체 세포 수의 15~25%를 차지합니다.재내피화는 일반적으로 3주 후에 80~90%에 이르며 4주 후에 거의 완료되어야 합니다. 개발 중 플라크 성장을 추적하기 위해 실험적 질문에 따라 와이어 부상 후 여러 시간 지점에서 분석을 반복할 수 있습니다. 마스터되면 제대로 수행되면 이 기술을 15분 만에 완료할 수 있습니다.이 절차를 시도하는 동안, 수술 영역은 건조를 방지하고 와이어 조작을 쉽게하기 위해 지속적으로 수화해야한다는 것을 기억하는 것이 중요합니다.

Research

JoVE Journal

Medicine

Implantation of a Carotid Cuff for Triggering Shear-stress Induced Atherosclerosis in Mice

마우스의 전단 응력 유발 죽상 경화증을 실행을위한 경동맥 혈압계의 주입

It is widely accepted that alterations in vascular shear stress trigger the expression of inflammatory genes in endothelial cells and thereby induce ...

연구

의학

Pharmacologic Induction of Epidermal Melanin and Protection Against Sunburn in a Humanized Mouse Model

인간 답게 된 마우스 모델에서 표피 멜라닌 및 보호에 대하여 햇볕의 약물 유도

Fairness of skin, UV sensitivity and skin cancer  risk all correlate with the physiologic function of the melanocortin 1  receptor, a Gs-coupled signaling ...

Induction of Invasive Transitional Cell Bladder Carcinoma in Immune Intact Human MUC1 Transgenic Mice:  A Model for Immunotherapy Development

면역 본래대로 사람 MUC1 유전자 변형 마우스의 침략 과도 셀 방광 암의 유도 : 면역 요법 개발을위한 모델

A preclinical model of invasive bladder cancer was developed in human mucin 1 (MUC1) transgenic (MUC1.Tg) mice for the purpose of evaluating immunotherapy ...

Quantitative Analysis and Characterization of Atherosclerotic Lesions in the Murine Aortic Sinus

쥐의 대동맥 부비동의 동맥 경화 병변의 정량 분석​​ 및 특성

Atherosclerosis is a disease of the large arteries and a major underlying cause of myocardial infarction and stroke. Several different mouse models have ...

Inducing Myointimal Hyperplasia Versus Atherosclerosis in Mice: An Introduction of Two Valid Models

쥐에서 동맥 경화 수스 Myointimal 증식을 유도 : 두 개의 유효한 모델의 소개

Various in vivo laboratory rodent models for the induction of artery stenosis have been established to mimic diseases that include arterial plaque ...

Murine Model of Femoral Artery Wire Injury with Implantation of a Perivascular Drug Delivery Patch

혈관 주위 약물 전달 패치의 주입과 대퇴 동맥 와이어 부상의 쥐 모델

Percutaneous interventions including balloon angioplasty and stenting have been used to restore blood flow in vessels with occlusive vascular disease. ...

A Murine Model of Arterial Restenosis: Technical Aspects of Femoral Wire Injury

동맥 재 협착의 쥐 모델 : 대퇴 와이어 부상의 기술적 측면

Cardiovascular disease caused by atherosclerosis is the leading cause of death in the developed world. Narrowing of the vessel lumen, due to ...

The Rabbit Model of Accelerated Atherosclerosis: A Methodological Perspective of the Iliac Artery Balloon Injury

가속된 동맥 경화의 토끼 모델: 장 골 동맥 풍선 상해의 방법 론 적 관점

Acute coronary syndrome resulting from coronary occlusion following atherosclerotic plaque development and rupture is the leading cause of death in the ...

Isometric Contractility Measurement of the Mouse Mesenteric Artery Using Wire Myography

Myography 와이어를 사용 하 여 마우스 Mesenteric 동맥의 isometric 수축 측정

The wire myograph technique is used to assess the contractility of vascular smooth muscles in response to depolarization, GPCR agonists/inhibitors and ...