Name: induction of accelerated atherosclerosis in mice: the "wire-injury" model
Uploaded: 2020-08-25T13:00:00
Duration: 5 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Induction of Accelerated Atherosclerosis in Mice: The "Wire-Injury" Model at JoVE.com

Dette arbeidet ble støttet av Tverrfaglig senter for klinisk forskning IZKF Aachen (junior forskningsgruppe til E.A.L.) ved det medisinske fakultet ved RWTH Aachen University. Vi takker også Mrs. Roya Soltan for hjelp med immunohistochemistry farging.

Eksperimenter som presenteres i denne artikkelen utføres i henhold til tysk lov og til de europeiske retningslinjene for dyrepleie. Dyrene er avlet i dyreanlegget ved Institute for Laboratory Animal Science, Universitetssykehuset Aachen, Tyskland, under tilsyn av prof. Dr. R. Tolba og Dr. A. Teubner (dyrevelferdsoffiser).
1. Dyrepleie
<ol><li>Hold musene i en spesialisert omsorgsenhet, noe som sikrer riktig tilgang til mat og spesialisert veterinærkontroll og behandling. Hvis dyrene flyttes eller kjøpes fra tredjeparter, må du sørge for en ukes overnattingsperiode før du gjennomgår prosedyren.</li>
</ol>2. Hyperlipidemi-indukement
<ol><li>Mate 6 - 8 uker gammel, 18 - 20 g, hunn (valgfritt) ApoE-/- mus med et aterogent kosthold (21% fett, 0,15% kolesterol, 19,5% e-/dl-/wt) en uke før kirurgisk prosedyre og fortsett dietten til den aterosklerotiske plakkanalysen skal utføres.</li>
</ol>3. Kirurgisk forberedelse
<ol><li>Bedøv musene ved hjelp av en intraperitoneal injeksjon på 100 mg/kg ketamin etter kroppsvekt og 10 mg/kg xylazin etter kroppsvekt. Bekreft riktig bedøvelse før operasjonen av mangel på reflekser og whisker bevegelse. Legg en liten mengde steril øyesalve i øyet for å minimere tørking.</li>
	<li>Sørg for vedlikehold av sterile forhold for å unngå infeksjoner under operasjonen ved hjelp av sterile materialer og instrumenter.</li>
	<li>Barber musene i ventral nakkeområdet. Desinfiser huden med betadin før snitt. Lag et 1 cm hud snitt i medianområdet av nakkeområdet, på toppen av luftrøret.</li>
	<li>Skill de to fettlegemene for å sikre riktig utsikt over trakealområdet. Bruk retractors å holde muskellaget og utsette halspulsåren. Hvis det finnes, utfør sløv disseksjon av det tynne muskellaget som dekker halspulsåren.</li>
	<li>Bruk skarpe buede tang for å skille halspulsåren fra vagusnerven og halsvenen. Dermed bør bifurcation området med den interne og eksterne halspulsåren være synlig. Bruk 0,9 % NaCl for å unngå tørrhet i vev under kirurgisk prosedyre.</li>
</ol>4. Trådskade
<ol><li>Plasser en 7 cm lang 0/5 silkesutur under halspulsåren, proksimal til aortabuen. Lag en åpen sløyfe, klar til å lukkes når som helst.</li>
	<li>Plasser to 0/7 silkesuturer (hver 1,5 cm lang) rundt den ytre halspulsåren: en løkke nær bifurcation punktet, og en løkke så distal som mulig. Forbered dem som en åpen sløyfe, klar til å lukkes når som helst.</li>
	<li>Plasser en 0/7 silkesutur (1,5 cm lang) under den indre halspulsåren. Forbered den som en åpen sløyfe, klar til å lukkes når som helst.</li>
	<li>Plasser musebordet med musehodet mot operatøren for å sikre riktig posisjonering for innsetting av ledevaier under denudasjonen (figur 1A).</li>
	<li>Under mikroskopisk visning, stopp blodstrømmen gjennom den vanlige halspulsåren ved å holde og trekke endene av 0/5 silkesutur med hemostat tang.</li>
	<li>Umiddelbart etter den vanlige halspulsåren ligatur, lukk suturløkkene plassert på den indre halspulsåren og den distale suturen på den ytre halspulsåren tett (figur 1B).</li>
	<li>Utfør et lite snitt (arteriotomi, halvparten av fartøyets diameter) distal til den ytre halspulsåren, mellom de to løkkene, ved hjelp av liten saks (figur 1C). Hvis snittet er for stort, følger du feilsøkingsinstruksjonene (se diskusjonen).</li>
	<li>Bruk kommersielt polerte ledninger eller bruk internt spesialisert personell til å polere ledevaierene. Desinfiser den 14 tommers polerte fleksible ledevaieren med alkohol og fukt den i en dråpe på 0,9 % NaCl for å sikre at den glir inn i fartøyet.</li>
	<li>Sett ledevaieren inn i den vanlige halspulsåren via den tverrgående arterien i den ytre halspulsåren (figur 1D). Få endoteldeudasjon ved å sende ledevaieren langs fartøyet mens du roterer. Gjenta denne prosedyren tre ganger. Oppretthold samme amplitude rotasjonsbevegelse i hver mus for å øke reproduserbarheten.</li>
	<li>Lukk den proksimale løkken på den eksterne halspulsåren tett. Gjenopprett blodstrømmen i halspulsåren ved å kutte suturen rundt vanlig arterie og suturen rundt den indre halspulsåren.</li>
</ol>5. Sutur og gjenoppretting
<ol><li>Fjern retractors og returnere muskellaget og de to fettlegemene til fysiologisk stilling.</li>
	<li>Lukk huden med tre separerte suturer 0/6, hvis ekkokardigrafiske målinger er nødvendig. Hvis det ikke er behov for avbildning, bruk metalliske klips for å lukke huden.</li>
	<li>Legg musen ned på venstre side under infrarødt lys til den våkner. Ikke la et dyr være uten tilsyn eller i selskap med andre dyr før det er fullstendig restituert.</li>
	<li>For fremtidig identifikasjon merker du musen ved hjelp av det lokale systemet. Spør dyrevelferdsoffiseren fra den lokale institusjonen.</li>
</ol>6. Analyse av aterosklerotisk plakk
<ol><li>Bedøve musene på sluttpunktet ved hjelp av en intraperitoneal injeksjon på 100 mg/kg ketamin etter kroppsvekt og 10 mg/kg xylazin etter kroppsvekt. Bekreft riktig bedøvelse ved mangel på reflekser og whisker bevegelse.</li>
	<li>Utfør exsanguination ved retro-orbital eller hjerte punktering og samle blodet for videre analyse2.</li>
	<li>Desinfiser huden med betadin. Åpne thoraxhulen og fjern hjertets høyre auriculum. Perfuse fosfat bufret løsning gjennom venstre ventrikkel for å fjerne det gjenværende blodet fra fartøyet og deretter perfuse 4% PFA for å fikse vevet.</li>
	<li>Hvis det ikke er nødvendig med fiksering, må du bruke halspulsåren umiddelbart etter vask2,4,11. Utfør standardprotokoller med interesseanalyser: parafininnbygging, kryoseksjon, mRNA eller proteinanalyse, etc.</li>
	<li>For morfologiske målinger, forsiktig explant halspulsåren inkludert bifurcation, med minimal manipulasjon, som proksimal til aorta buen ved hjelp av buede tang og liten saks.</li>
	<li>Bygg inn halspulsåren i parafinblokken ved hjelp av standard innebyggingsprotokoller. For å utføre tverrgående snitting, plasser halspulsåren oppreist på bifurcation. Klipp 5 μm tykke serieseksjoner som starter med bifurcation og samle dem alle på belagt histologiske lysbilder (Figur 2A).</li>
	<li>Beis hvertiende del ved hjelp av Movat farging for å markere laminas2,4,11. Etter å ha samlet mikroskopiske bilder av alle fartøy (ved hjelp av et 10X-mål), måle lumen, samt den interne og eksterne lamina for hver seksjon, ved hjelp av spesialdesignetprogramvare 2,4,11, som vist i figur 2B. Beregn den intimale veksten og mediene til fartøyene.</li>
	<li>Analyser glatte muskelceller og makrofaginnhold, eller endotelgjenoppretting i serielle seksjoner, ved hjelp av vanlig immunohistologiskfarging 2 (figur 2C).</li>
</ol>

<ol>
	<li>Simsekyilmaz, S., Liehn, E. A., Militaru, C., Vogt, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Progress+in+interventional+cardiology:+challenges+for+the+future.">Progress in interventional cardiology: challenges for the future.</a> Thromb Haemost. 113 (3), 464-472 (2015).</li><li>Kubo, N., McCurdy, S., Boisvert, W. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Defective+Fas+Expression+on+Bone+Marrow+Derived+Cells+Alters+Atherosclerotic+Plaque+Morphology+in+Hyperlipidemic+Mice.">Defective Fas Expression on Bone Marrow Derived Cells Alters Atherosclerotic Plaque Morphology in Hyperlipidemic Mice.</a> Discoveries. 3 (1), e37 (2015).</li><li>Saffarzadeh, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterization+of+rapid+neutrophil+extracellular+trap+formation+and+its+cooperation+with+phagocytosis+in+human+neutrophils.">Characterization of rapid neutrophil extracellular trap formation and its cooperation with phagocytosis in human neutrophils.</a> Discoveries. 2 (2), e19 (2014).</li><li>Lindner, V., Fingerle, J., Reidy, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mouse+model+of+arterial+injury.">Mouse model of arterial injury.</a> Circ Res. 73 (5), 792-796 (1993).</li><li>Schwartz, R. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Preclinical+evaluation+of+drug-eluting+stents+for+peripheral+applications:+recommendations+from+an+expert+consensus+group.">Preclinical evaluation of drug-eluting stents for peripheral applications: recommendations from an expert consensus group.</a> Circulation. 110 (16), 2498-2505 (2004).</li><li>Schwartz, R. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Restenosis+and+the+proportional+neointimal+response+to+coronary+artery+injury:+results+in+a+porcine+model.">Restenosis and the proportional neointimal response to coronary artery injury: results in a porcine model.</a> J Am Coll Cardiol. 19 (2), 267-274 (1992).</li><li>Curaj, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Noninvasive+molecular+ultrasound+monitoring+of+vessel+healing+after+intravascular+surgical+procedures+in+a+preclinical+setup.">Noninvasive molecular ultrasound monitoring of vessel healing after intravascular surgical procedures in a preclinical setup.</a> Arterioscler Thromb Vasc Biol. 35 (6), 1366-1373 (2015).</li><li>Liehn, E. A., Schober, A., Weber, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Blockade+of+keratinocyte-derived+chemokine+inhibits+endothelial+recovery+and+enhances+plaque+formation+after+arterial+injury+in+ApoE-deficient+mice.">Blockade of keratinocyte-derived chemokine inhibits endothelial recovery and enhances plaque formation after arterial injury in ApoE-deficient mice.</a> Arterioscler Thromb Vasc Biol. 24 (10), 1891-1896 (2004).</li><li>Liehn, E. A., Zernecke, A., Postea, O., Weber, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chemokines:+inflammatory+mediators+of+atherosclerosis.">Chemokines: inflammatory mediators of atherosclerosis.</a> Arch Physiol Biochem. 112 (4-5), 229-238 (2006).</li><li>Simsekyilmaz, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Role+of+extracellular+RNA+in+atherosclerotic+plaque+formation+in+mice.">Role of extracellular RNA in atherosclerotic plaque formation in mice.</a> Circulation. 129 (5), 598-606 (2014).</li><li>Wu, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rhodamine-loaded+intercellular+adhesion+molecule-1-targeted+microbubbles+for+dual-modality+imaging+under+controlled+shear+stresses.">Rhodamine-loaded intercellular adhesion molecule-1-targeted microbubbles for dual-modality imaging under controlled shear stresses.</a> Circ Cardiovasc Imaging. 6 (6), 974-981 (2013).</li><li>Schober, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Crucial+role+of+the+CCL2/CCR2+axis+in+neointimal+hyperplasia+after+arterial+injury+in+hyperlipidemic+mice+involves+early+monocyte+recruitment+and+CCL2+presentation+on+platelets.">Crucial role of the CCL2/CCR2 axis in neointimal hyperplasia after arterial injury in hyperlipidemic mice involves early monocyte recruitment and CCL2 presentation on platelets.</a> Circ Res. 95 (11), 1125-1133 (2004).</li><li>Ali, Z. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Increased+in-stent+stenosis+in+ApoE+knockout+mice:+insights+from+a+novel+mouse+model+of+balloon+angioplasty+and+stenting.">Increased in-stent stenosis in ApoE knockout mice: insights from a novel mouse model of balloon angioplasty and stenting.</a> Arterioscler Thromb Vasc Biol. 27 (4), 833-840 (2007).</li><li>Chamberlain, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+novel+mouse+model+of+in+situ+stenting.">A novel mouse model of in situ stenting.</a> Cardiovasc Res. 85, 38-44 (2010).</li><li>Rodriguez-Menocal, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+novel+mouse+model+of+in-stent+restenosis.">A novel mouse model of in-stent restenosis.</a> Atherosclerosis. 209 (2), 359-366 (2010).</li><li>Simsekyilmaz, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+murine+model+of+stent+implantation+in+the+carotid+artery+for+the+study+of+restenosis.">A murine model of stent implantation in the carotid artery for the study of restenosis.</a> J Vis Exp. , e50233 (2013).</li><li>Schroder, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=NADPH+oxidase+Nox2+is+required+for+hypoxia-induced+mobilization+of+endothelial+progenitor+cells.">NADPH oxidase Nox2 is required for hypoxia-induced mobilization of endothelial progenitor cells.</a> Circ Res. 105 (6), 537-544 (2009).</li></ol>

Det er ingen avsløringer av forfatterne.

I dette papiret gir vi nyttige tips for å utføre ledningsskadeprosedyren selv av personell med minimal erfaring i dyreoperasjoner. Det er to kritiske skritt i å utføre denne prosedyren: snittet av den eksterne halspulsåren og innsetting av ledningen. Snittet i den ytre halspulsåren må utføres så langt som mulig fra bifurcation, for å sikre nok gjenværende materiale (Figur 1C). Snittet bør ikke være for stort, på grunn av risikoen for å kutte hele fartøyet. Det andre kritiske trinnet er den høye risikoen for blødning under arteriotomien og innsetting av ledevaieren hvis blodstrømmen ikke er effektivt seponert. Videre kan endoteldeudasjon ikke finne sted eller arteriell brudd er mulig hvis føringsledningen ikke er riktig introdusert i lumenbeholderen. For å unngå dette må overflaten på føringsledningen polerings forsiktig før operasjonen.
For å optimalisere protokollen sikrer plasseringen av operasjonsbordet med musehodet mot kirurgen en bedre visning, tilgjengelighet og kontroll for riktig ledevaiermanipulasjon. Videre, for å øke reproduserbarheten, bruk samme ledevaier i alle studiene. Siden trådstørrelsen ikke endres, er det viktig å vurdere og eliminere alle mulige forskjeller mellom musene ved å bruke samme kjønn, alder og vekt for alle mus som er inkludert i en studie. Deretter vil Evans-Blue farging hjelpe kirurgen med å bestemme effektiviteten av denudasjonen. Eksistensen av passende utstyr er en forutsetning for prosedyrens suksess. Et 10X stereomikroskop er avgjørende for å utføre denne prosedyren. Riktig fremstilling av ledevaieren (for eksempel polering av den) er avgjørende. Derfor anbefaler vi på det sterkeste at føringsledningspreparatet utføres av spesialisert teknisk personell der det er tilgjengelig.
Det er mange feilsøkingstrinn i denne protokollen. Hvis du incising den ytre halspulsåren nær bifurcation, forsiktig binde externa, nær bifurcation, slik at ingen blødning oppstår. Under skjæring kan ikke den eksterne halspulsåren ses. Derfor bør du vurdere bifurcation på nivået av silkesutur. Samle seksjoner når silkesuturen forsvinner. Hvis snittet i den ytre halspulsåren er for stor og fartøyet er sprukket, sørg for at blodstrømmen inn i halsmunningen og den indre halspulsåren effektivt avbrytes og prøver å finne åpningen av fartøyet ved hjelp av tang. Etter innføring av ledevaieren og utført denudasjonen, bind fartøyet nær bifurcation. Under skjæring begynner du å samle når silke fra suturen begynner å forsvinne. Hvis arteriell brudd oppstår under denudasjonen med ledevaieren, må du kontrollere under mikroskopet om ledevaieren er riktig polert.
Til tross for likheten mellom trådskademodellen til kliniske situasjoner, er mange grupper fokusert på innfødt aterosklerose hos mus, eller de velger invasive aterosklerose induksjoner, for eksempel ballongangoplastikk hos rotter eller kaniner, på grunn av mangel på trent personell som kan utføre små dyreoperasjoner. Til tross for fordelene ved å bruke kaniner/rotter, for eksempel ikke behov for miniatyrisert utstyr, tilbyr verken rottemodeller eller kaninmodeller en rekke forskjellige utslagsstammer, når det gjelder å studere molekylære mekanismer involvert i neointimavekst og trombose i stent.
De eksisterende modellene for å studere in-stentose hos mus er vanskelige, krever høye kirurgiske ferdigheter, og har høy risiko for komplikasjoner som blødning eller lammelse. For eksempel er den mekaniske skaden eller stentimplantasjonen i thorax aorta via lårarterien ledsaget av høy dødelighet (35%) på grunn av lammelse av bakbenet ellerblødning 13-15. Vi beskriver også stentimplantasjon i halspulsåren til en mus16. Prosedyren er lik; Vevsbehandlingen for analyse er imidlertid komplisert og er ikke tilgjengelig for alle laboratorier16. Halspulsåren er direkte tilgjengelig, ikke bare for operasjonsprosedyrer, men også for eksisterende bildemetoder som ultralydavbildning. Andre skadeinduksjoner i halspulsårene hos mus kan gjøres ved hjelp av elektriske apparater17. Denne metoden er enkel å utføre og sikrer høy reproduserbarhet. Det induserer imidlertid skade i alle karlag, som ikke er identisk med mekanisk skade. Ballongapplikasjoner har fordeler, for eksempel justeringen av fartøyets diameter i tråd med klinisk praksis og har sterk innflytelse på det patologiske utfallet. Selv om museballonger er tilgjengelige, er de svært dyre og derfor ikke mye brukt. I stedet er wire-skaden den etablerte metoden, etterligner in-stent stenose.
Denudasjonen utføres på den normale arterielle veggen, men med en aterosklerotisk bakgrunn. Derfor vil neointimaformasjonen være moderat sammenlignet med den kliniske situasjonen. Det høye antallet prekliniske modeller viser at ingen av modellene oppfyller alle kriteriene som er nødvendige for å avdekke helheten av cellulære og molekylære mekanismer som fører til patofysiologi hos mennesker (se tabell 2).
Etter å ha utført ledningsskadeprosedyren, kan andre biologiske og molekylære analyser utføres for å identifisere celler, proteiner, mRNAer, microRNAer, gener eller andre biomarkører, som kan brukes som terapeutiske mål for å utvikle nye behandlingsstrategier for aterosklerose, og spesielt for neointimadannelse etter vaskulær skade. Hvis tilgjengelig, kan plakkveksten overvåkes ved hjelp av høyfrekvent ultralyd eller andre høyoppløselige bildeteknikker. Videre ville mestring av denne teknikken gi operatøren muligheten til å tilpasse protokollen til andre invasive ateroskleroseinduksjonsmodeller, for eksempel krageplassering, delvis ligation eller til og med stentimplantasjon.

Aterosklerose er den viktigste patologien underliggende kardiovaskulære hendelser som hjerteinfarkt eller hjerneslag. De viktigste mekanismene som utløser akutte kardiovaskulære syndromer er plakkbrudd, overfladisk erosjon og trombedannelse. Det er flere kliniske situasjoner knyttet til plakkutviklingen: innfødt aterosklerotisk plakk, restenose etter endarterektomi og restenose etter ballong angioplastikk med / uten stentimplantasjon1. Etter arteriell skade er undertrykkelse av de inflammatoriske prosessene2,3 og gjenopprettingen av endeotelrommet avgjørende for å forhindre ytterligere komplikasjoner1. Klinisk forskning er begrenset til vev og blodprøver på grunn av etiske hensyn, kostnader, og mangel på kunnskap i grunnleggende mekanismer. Av disse grunnene er det behov for å studere molekylære mekanismer i dyremodeller4-6, som kan gjenskape de kliniske forholdene. Vår modell av akselerert neointima dannelse i sammenheng med aterosklerose er et resultat av mange års erfaring i gjennomføringen av disse modellene i små dyr7-11. Musemodellen er den mest attraktive modellen for forskning, på grunn av sin enkle håndtering, evnen til å ha store dyregrupper på grunn av lave kostnader knyttet til dyrekjøp og omsorg, og tilgjengeligheten av ulike transgene og knockout stammer.
Den største ulempen med musemodellen er den lille størrelsen på hovedarteriene utsatt for aterosklerotisk sykdom (halspulsåren, aorta og lårarterien), som krever kvalifisert kirurgisk ekspertise og ferdigheter for å manipulere karene og å invasivt indusere en aterosklerotisk plakk. Derfor presenteres modellen av akselerert neointimadannelse, i sammenheng med restenose etter endarterektomi eller stentimplantasjon, foreslått i dette papiret med en trinnvis retningslinje og forslag for å lette innføringen for interessert personell. En annen ulempe er at denudasjonen er gjort på den normale arterielle veggen, og derfor vil neo-intimaformasjonen være moderat sammenlignet med den kliniske situasjonen. Det høye nivået av plasmakolesterol nådd i apolipoprotein E knockout (Apoe-/-) mus matet med høyt fett-diett skaper et riktig pro-inflammatorisk miljø som trengs for neo-intima formasjon.
Operasjonen utføres under et stereomikroskop. Halspulsåren er utsatt for et median snitt i ventralhalsområdet. Anatomiske strukturer på toppen av og rundt halspulsåren er minimalt manipulert for å redusere postkirurgisk betennelse. Halspulsåren bifurcation er utsatt. For å indusere akselerert neointimadannelse, er interne og eksterne halspulsårarterier forberedt for blodstrømsslutt og påfølgende vanlig halspulsårendeudasjon. Til slutt kan metoden læres av personell med minimal erfaring i dyreoperasjoner.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Stereomicroscope</td>
			<td>Olympus</td>
			<td>SZ/X9</td>
			<td>-</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Forceps</td>
			<td>FST, Germany</td>
			<td>91197-00</td>
			<td>standard tip curved 0,17 mm</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hemostat forceps</td>
			<td>FST, Germany</td>
			<td>13007-12</td>
			<td>curved</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Scissors</td>
			<td>FST, Germany</td>
			<td>91460-11</td>
			<td>Straight</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vannas scissor</td>
			<td>Aesculap, Germany</td>
			<td>OC 498 R</td>
			<td>-</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Retractors</td>
			<td>FST, Germany</td>
			<td>18200-10</td>
			<td>2.5mm wide</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Retractors</td>
			<td>FST, Germany</td>
			<td>18200-11</td>
			<td>5mm wide</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ketamine 10%</td>
			<td>CEVA, Germany</td>
			<td>-</td>
			<td>-</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Xylazine 2%</td>
			<td>Medistar, Germany</td>
			<td>-</td>
			<td>-</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bepanthene eye and nose cream</td>
			<td>Bayer, Germany</td>
			<td>-</td>
			<td>-</td>
		</tr>
		<tr>
			<td rowspan="3">Silicon tube</td>
			<td rowspan="3">IFK Isofluor, Germany</td>
			<td rowspan="3">custom-made&#160; product</td>
			<td>diameter 500&#181;m,</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>section thickness 100 &#181;m,</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>polytetrafluorethylene catheter</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PROLENE Suture 6/0&#160;</td>
			<td>ETHICON</td>
			<td>8707H&#160;</td>
			<td>polypropylene monofilament suture, unresorbable, needle CC-1, 13mm, 3/8 Circle&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>7/0 Silk</td>
			<td>Seraflex</td>
			<td>IC 1005171Z</td>
			<td>-</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Michel Suture Clips</td>
			<td>FST, Germany</td>
			<td>12040-01&#160;</td>
			<td>&#160;-&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Clip Applying Forcep</td>
			<td>FST, Germany</td>
			<td>12018-12&#160;</td>
			<td>&#160;-&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>14&#8221;Wire for Catheter</td>
			<td>Abbot</td>
			<td>1000462H</td>
			<td>Use 10 cm from stiff part and equalize the ends</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mice</td>
			<td>Charles River</td>
			<td>Apolipoprotein E -/- mice with C57/Bl6 background</td>
			<td>&#160;-&#160;</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

induction of accelerated atherosclerosis in mice: the "wire-injury" model

Aterosklerose er en proliferativ fibro-inflammatorisk sykdom som utvikler seg i arteriell vegg, induserer en mangelfull blodstrøm eller mangel på blodstrøm. Videre, ved brudd på den defekte vaskulære veggen, induserer aterosklerose okklusiv trombedannelse, som representerer hovedårsaken til hjerteinfarkt eller hjerneslag og den hyppigste dødsårsaken. Til tross for fremskrittene i kardiovaskulærfeltet, forblir mange spørsmål ubesvart, og ytterligere grunnleggende forskning er avgjørende for å forbedre vår forståelse av molekylære mekanismer under aterosklerose og dens effekter. På grunn av begrensede kliniske studier er det behov for representative dyremodeller som gjenskaper aterosklerotiske tilstander som neointimadannelse etter stentimplantasjon, ballongangoplastikk eller endarterektomi. Siden musen presenterer mange fordeler og er den mest brukte modellen for å studere molekylære prosesser, foreslår den nåværende studien en invasiv prosedyre for endoteldeudasjon, også kjent som wire-skademodellen, som er representativ for den menneskelige tilstanden til neointimadannelse i arterier etter revaskulariseringsprosedyrer.

Den aterosklerotiske plakkinduksjonsprosedyren tar 15 - 20 min og viser en minimal dødelighet, hovedsakelig på grunn av blødningen som oppstår under prosedyren. Etter operasjonen gjenoppretter musene fra anestesi innen 20 - 25 min. Ingen fysisk svekkelse, som lammelse eller fôringsforstyrrelser ble observert etter operasjonen.
Ledningsskaden induserer en de-endotelialisering, etterligner vaskulære lesjoner etter ballongdeudasjon eller stentimplantasjon. Umiddelbart etter skade vil den denuded vaskulære veggen bli dekket med et lag trombocytter, som formidler og favoriserer vedheft av monocytter12. Aktiverte glatte muskelceller fra media vil spre seg og migrere inn i intimalrommene, og danner neointimaen. Andre stamfarer for glatte muskelceller vil migrere fra blodet (anslått til å være 40%) og bidra til neointima vekst. Plakkdannelsen avsluttes etter fullstendig re-endotelialisering, vanligvis 4 uker etter trådskaden.
Neointimaformasjonen kan vurderes ved hjelp av Movat-farging. Plakkstørrelsen beregnes for hvert lysbilde ved hjelp av programvare som vist i figur 2B. Den totale plakkstørrelsen (venstre halspulsåren) kan variere mellom 70.000 - 100.000 μm², mens kontrollkarstørrelsen (høyre halspulsåren) kan variere mellom 7000 - 8000 μm². Disse verdiene avhenger i stor grad av kirurgen. Derfor anbefaler vi på det sterkeste å bruke samme kirurg under forsøkene for samme studie.
Den utviklede plakk ligner i stent restenose, som hovedsakelig består av spredte og migrerte glatte muskelceller fra media. Den cellulære sammensetningen bestemmes av immunologiske fargingsprosedyrer viser at det glatte muskelcelleinnholdet er ca. 30 - 40%, mens makrofager finnes i 15 - 25% av neointimaen til det skadede fartøyet. Re-endotelialisering kan måles etter farging for en endotelmarkør, og beregnes som prosentandelen av omkrets farget over hele omkretsen av lumen. Vanligvis når re-endotelialisering 80 - 90% etter 3 uker, og bør nesten være fullført etter 4 uker (Figur 2C). For å spore plakkveksten under utviklingen, kan den samme analysen gjentas for hvert gangpunkt etter ledningsskaden, avhengig av interessen og faget som studeres (se tabell 1).
<img alt="Figure 1" src="/files/ftp_upload/54571/54571fig1.jpg"> Figur 1. Skjematisk representasjon av operativ prosedyre. (A) Plasseringen av operasjonstabellen mot operatøren under ledningsskadeprosedyren (B) Forstørret visning av den vanlige halspulsåren og dens grener, slik det ser ut under mikroskopet ved 10X forstørrelse (C) Størrelsen på snittet i den ytre halspulsåren under mikroskopet ved 10X forstørrelse (D) Skjematisk representasjon av trådskadeprosedyre ved hjelp av 14-ledeledningen. <a href="http://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/54571/54571fig1large.jpg" target="_blank">Vennligst klikk her for å se en større versjon av denne figuren.</a>
<img alt="Figure 2" src="/files/ftp_upload/54571/54571fig2.jpg"> Figur 2. Analyse av Restenosis Plaque. (A) Skjematisk representasjon av plakkanalyse i den vanlige halspulsåren, 4 uker etter induksjon av wire-skade (B) Neointima formasjon 4 uker etter wire-skade og skjematisk representasjon av hovedparametere som brukes til analyse. Intima (grønt område) er forskjellen mellom lumen (rød) og lamina interna (grønn linje). Media (gult område) er forskjellen mellom lamina externa (gul linje) og interna (grønn linje). Vektlinje 100 μm(C) Representative bilder av fargingen av de viktigste celletypene som er involvert i neointimadannelse. Glatte muskelceller (glatt muskel actin -rød, skala bar 100 μm), makrofager (Mac 2- grønn, skala bar 100 μm) og endotelceller (CD31- rød, piler, skala bar 50 μm). <a href="http://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/54571/54571fig2large.jpg" target="_blank">Vennligst klikk her for å se en større versjon av denne figuren.</a>
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody>
<tr>
<td>Tid</td>
			<td>Trombus</td>
			<td>Plakk (μm²)</td>
			<td>
Makrofager (% fra plakk)
</td>
			<td>
Glatte muskelceller (% fra plakk)
</td>
			<td>
Ny endotelialisering (% lumen omkrets)
</td>
		</tr>
<tr>
<td>1 dag</td>
			<td>Presentere</td>
			<td>0</td>
			<td>0</td>
			<td>0</td>
			<td>0</td>
		</tr>
<tr>
<td>1 uke</td>
			<td>-</td>
			<td>< 30 000</td>
			<td>> 10</td>
			<td>< 50</td>
			<td>< 50</td>
		</tr>
<tr>
<td>2 uker</td>
			<td>-</td>
			<td>< 50 000</td>
			<td>> 10</td>
			<td>< 50</td>
			<td>> 50</td>
		</tr>
<tr>
<td>3 uker</td>
			<td>-</td>
			<td>< 70 000</td>
			<td>15-25</td>
			<td>30-40</td>
			<td>80-90</td>
		</tr>
<tr>
<td>4 uker</td>
			<td>-</td>
			<td>70 000 – 100 000</td>
			<td>15-25</td>
			<td>30-40</td>
			<td>Fullstendig</td>
		</tr>
</tbody></table>Tabell 1. Tidsavhengig plaketts utvikling.
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody>
<tr>
<td>Modell</td>
			<td>Dyr</td>
			<td>Fordeler</td>
			<td>Disanvantages</td>
		</tr>
<tr>
<td rowspan="2">Kostholdsindusert innfødt aterosklerose</td>
			<td>Liten</td>
			<td>
			<ul>
<li>etterligner aterosklerosepatologien</li>
				<li>enkel håndtering</li>
				<li>ingen kirurgi</li>
				<li>ingen stress for dyrene</li>
				<li>lave kostnader knyttet til dyrekjøp og omsorg</li>
				<li>tilgjengeligheten av ulike transgene og knockout stammer</li>
			</ul>
</td>
			<td>
			<ul>
<li>lav reproduserbarhet</li>
				<li>høy varians</li>
				<li>økte dyrets antall som kreves</li>
				<li>økt ventetid</li>
			</ul>
</td>
		</tr>
<tr>
<td>Store</td>
			<td>
			<ul>
<li>etterligner aterosklerosepatologien</li>
				<li>enkel håndtering</li>
				<li>ingen kirurgi</li>
				<li>ingen stress for dyrene</li>
			</ul>
</td>
			<td>
			<ul>
<li>lav reproduserbarhet</li>
				<li>høy varians</li>
				<li>økte dyrets antall som kreves</li>
			</ul>
</td>
		</tr>
<tr>
<td rowspan="2">Ballong dilatasjon</td>
			<td>Liten</td>
			<td>
			<ul>
<li>etterligner restenosis etter ballong angioplastikk</li>
				<li>lave kostnader knyttet til dyrekjøp og omsorg</li>
				<li>tilgjengeligheten av ulike transgene og knockout stammer</li>
			</ul>
</td>
			<td>
			<ul>
<li>liten størrelse på de viktigste arteriene</li>
				<li>krever kvalifisert kirurgisk ekspertise</li>
				<li>ballonger svært dyrt</li>
				<li>denudasjon er gjort på den normale arterielle veggen</li>
				<li>eksistensen av egnet utstyr</li>
				<li>risiko for komplikasjoner som blødning eller lammelse</li>
			</ul>
</td>
		</tr>
<tr>
<td>Store</td>
			<td>
			<ul>
<li>etterligner restenosis etter ballong angioplastikk</li>
				<li>enkel håndtering</li>
				<li>bruk av enheter for mennesker</li>
			</ul>
</td>
			<td>
			<ul>
<li>denudasjon er gjort på den normale arterielle veggen</li>
			</ul>
</td>
		</tr>
<tr>
<td>Wire skade</td>
			<td>Liten</td>
			<td>
			<ul>
<li>etterligner restenosis etter ballong angioplastikk</li>
				<li>enkel håndtering</li>
				<li>minimal dødelighet</li>
				<li>lave kostnader knyttet til dyrekjøp og omsorg</li>
				<li>tilgjengeligheten av ulike transgene og knockout stammer</li>
				<li>ingen fysisk svekkelse</li>
			</ul>
</td>
			<td>
			<ul>
<li>liten størrelse på de viktigste arteriene</li>
				<li>krever mindre kvalifisert kirurgisk ekspertise</li>
				<li>denudasjon er gjort på den normale arterielle veggen</li>
				<li>eksistensen av egnet utstyr</li>
			</ul>
</td>
		</tr>
<tr>
<td rowspan="2">Stent implantasjon</td>
			<td>Liten</td>
			<td>
			<ul>
<li>etterligner restenose og trombose etter stentimplantasjon</li>
				<li>lave kostnader knyttet til dyrekjøp og omsorg</li>
				<li>tilgjengeligheten av ulike transgene og knockout stammer</li>
			</ul>
</td>
			<td>
			<ul>
<li>liten størrelse på de viktigste arteriene</li>
				<li>krever kvalifisert kirurgisk ekspertise</li>
				<li>små stenter ikke tilgjengelig</li>
				<li>denudasjon er gjort på den normale arterielle veggen</li>
				<li>økt dødelighet</li>
				<li>eksistensen av egnet utstyr</li>
				<li>risiko for komplikasjoner som blødning eller lammelse</li>
			</ul>
</td>
		</tr>
<tr>
<td>Store</td>
			<td>
			<ul>
<li>etterligner restenosis og trombose etter stentimplantasjon</li>
				<li>enkel håndtering</li>
				<li>bruk av enheter for mennesker</li>
			</ul>
</td>
			<td>
			<ul>
<li>denudasjon er gjort på den normale arterielle veggen</li>
			</ul>
</td>
		</tr>
</tbody></table>Tabell 2. Fordeler og ulemper ved eksisterende modeller av arteriell skade.

Watch this Scientific Journal Video about Induction of Accelerated Atherosclerosis in Mice: The "Wire-Injury" Model at JoVE.com

Induction of Accelerated Atherosclerosis in Mice: The "Wire-Injury" Model

Denne studien beskriver en invasiv prosedyre for induksjon av akselerert aterosklerose hos mus. Sammenlignet med andre metoder ved hjelp av elektrisk- eller kryo-indusert skade, etterligner mekanisk-indusert skade den menneskelige tilstanden til restenose etter revaskulariseringsbehandling og er ideell for studiet av de molekylære mekanismene som er involvert.

Induksjon av akselerert aterosklerose hos mus: "Wire-Injury" Modell

Atherosclerosis is a proliferative fibro-inflammatory disease developing in the arterial wall, inducing a deficient blood flow or a lack of blood flow. ...

Det overordnede målet med denne prosedyren er å etterligne den menneskelige tilstanden til restenose etter revaskulariseringsbehandling hos mus for å studere molekylære mekanismer som er involvert i skaderesponsen. De viktigste fordelene med disse teknikkene er at den er svært reproduserbar og lett utført, slik at forsker med selv minimal erfaring å bruke metoden i små dyremodeller. Å demonstrere prosedyren vil være Adelina Curaj, en postdoktor for laboratoriet mitt.For å indusere hyperlipidemi, mate seks til åtte uker gamle 18 til 20 gram Apoe knockout mus en aterogen diett en uke før kirurgisk prosedyre og til aterosklerotisk plakk analyse. På operasjonsdagen, etter å ha bekreftet mangel på respons på tåklemmen, barber den bedøvede musen i ventral nakkeområdet og desinfisere den eksponerte huden med Betadine. Lag en centimeter hud snitt i medianområdet av nakken over luftrøret og skille de to fettlegemene for å få en fullstendig visning av trakealområdet.Bruk en retractor til å holde muskellaget åpent, eksponere halspulsåren og bruk skarpe buede tang for å skille arterien fra vagusnerven og halsvenen til bifurcation-området i den indre og eksterne halspulsåren er synlig. Legg løst en syv centimeter lang 0-5 silkesutur under halspulsåren proksimalt til aortabuen, etterfulgt av en løst plassert 1,5 centimeter lang 0-7 silkesutur rundt den ytre halspulsåren nær bifurcation punktet, og en løst plassert 1,5 centimeter lang 0-7 silkesutursløyfe som distal fra bifurcation som mulig. Plasser en annen åpen 1,5 centimeter lang 0-7 silkesutur under den indre halspulsåren.Plasser deretter dyret med hodet i seks-posisjon. Lukk umiddelbart suturløkkene på den indre halspulsåren og den distale suturen på den ytre halspulsåren. Bruk hemostat tang til å trekke på endene av 0-5 sutur for å stoppe blodstrømmen gjennom den vanlige halspulsåren.Ved hjelp av liten saks, gjør en liten arteriotomi av halvparten av fartøyetdiameter distal til den ytre halspulsåren mellom de to løkkene og sett inn en 14 tommers alkoholpolert fleksibel ledevaier fuktet med en dråpe 0,9% natriumklorid i den vanlige halspulsåren via snittet. For å unngå arteriell utbrudd under Y-snitt, bruk en nøye polert ledetråd. Få endoteldeudasjon ved å passere ledningen langs fartøyet mens du roterer tre ganger, og lukk deretter den proksimale sløyfen på den ytre halspulsåren og kutt suturene rundt de vanlige og interne halspulsårene for å gjenopprette blodstrømmen.Deretter fjerner du retractorene og returnerer muskellaget og de to fettlegemene til fysiologisk stilling. Lukk huden med metalliske klips, og la musen deretter gjenopprette på venstre side under et infrarødt lys med overvåking til den er helt liggende. Neointimaformasjonen kan vurderes ved hjelp av Movat-farging.Den totale plakkstørrelsen, som kan variere mellom 70, 000 og 100, 000 mikron kvadrert, avhengig av kirurgens dyktighet, kan deretter beregnes for hver prøve ved hjelp av riktig programvare. Den utviklede plakk ligner øyeblikkelig restenose, som hovedsakelig består av spredte og migrerte glatte muskelceller fra mediet. Det glatte muskelcelleinnholdet representerer omtrent 30 til 40% av plakket, mens makrofagene som finnes i neointimaen til det skadede fartøyet utgjør 15 til 25% av det totale cellenummeret.Re-endotelialisering vanligvis når 80 til 90% etter tre uker og bør være nesten ferdig etter fire uker. For å spore plakkveksten under utviklingen, kan analysen gjentas på flere tidspunkter etter ledningsskaden avhengig av det eksperimentelle spørsmålet. Når mestret, kan denne teknikken fullføres i 15 minutter hvis den utføres riktig.Mens du forsøker denne prosedyren, er det viktig å huske at operasjonsområdet bør konstant hydreres for å forhindre tørking og for å gjøre ledningsmanipulasjonen enklere.

Research

JoVE Journal

Medicine

Implantation of a Carotid Cuff for Triggering Shear-stress Induced Atherosclerosis in Mice

Implantasjon av en Carotid Cuff for Utløsende Shear-stress Induced Åreforkalkning i Mus

It is widely accepted that alterations in vascular shear stress trigger the expression of inflammatory genes in endothelial cells and thereby induce ...

Pharmacologic Induction of Epidermal Melanin and Protection Against Sunburn in a Humanized Mouse Model

Farmakologisk Induksjon av epidermal Melanin og beskyttelse mot solbrenthet i en humanisert Mouse Model

Fairness of skin, UV sensitivity and skin cancer  risk all correlate with the physiologic function of the melanocortin 1  receptor, a Gs-coupled signaling ...

Induction of Invasive Transitional Cell Bladder Carcinoma in Immune Intact Human MUC1 Transgenic Mice:  A Model for Immunotherapy Development

Induksjon av Invasive Transitional Cell blære carcinoma in Immune Intakt Menneskelige MUC1 transgene mus: En modell for Immunterapi Development

A preclinical model of invasive bladder cancer was developed in human mucin 1 (MUC1) transgenic (MUC1.Tg) mice for the purpose of evaluating immunotherapy ...

Quantitative Analysis and Characterization of Atherosclerotic Lesions in the Murine Aortic Sinus

Atherosclerosis is a disease of the large arteries and a major underlying cause of myocardial infarction and stroke. Several different mouse models have ...

Inducing Myointimal Hyperplasia Versus Atherosclerosis in Mice: An Introduction of Two Valid Models

Inducing Myointimal Hyperplasi Versus Åreforkalkning i Mus: En introduksjon av to gyldige modeller

Various in vivo laboratory rodent models for the induction of artery stenosis have been established to mimic diseases that include arterial plaque ...

Murine Model of Femoral Artery Wire Injury with Implantation of a Perivascular Drug Delivery Patch

Murine Modell av lårarteriens Wire Injury med Implantasjon av en perivaskulære Drug Delivery Patch

Percutaneous interventions including balloon angioplasty and stenting have been used to restore blood flow in vessels with occlusive vascular disease. ...

A Murine Model of Arterial Restenosis: Technical Aspects of Femoral Wire Injury

En Muse Modell av arteriell restenose: tekniske aspekter ved Femoral Wire Injury

Cardiovascular disease caused by atherosclerosis is the leading cause of death in the developed world. Narrowing of the vessel lumen, due to ...

The Rabbit Model of Accelerated Atherosclerosis: A Methodological Perspective of the Iliac Artery Balloon Injury

Kanin modell av akselerert aterosklerose: et metodisk perspektiv iliaca arterien ballong skaden

Acute coronary syndrome resulting from coronary occlusion following atherosclerotic plaque development and rupture is the leading cause of death in the ...

Isometric Contractility Measurement of the Mouse Mesenteric Artery Using Wire Myography

Isometrisk Contractility måling av musen hvem arterien bruker Wire Myography

The wire myograph technique is used to assess the contractility of vascular smooth muscles in response to depolarization, GPCR agonists/inhibitors and ...