Name: induction of accelerated atherosclerosis in mice: the "wire-injury" model
Uploaded: 2020-08-25T13:00:00
Duration: 5 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Induction of Accelerated Atherosclerosis in Mice: The "Wire-Injury" Model at JoVE.com

Эта работа была поддержана Междисциплинарным центром клинических исследований «ИКФ Ахен» (младшая исследовательская группа E.A.L.) на медицинском факультете Университета RWTH Aachen. Мы также благодарим г-жу Рою Солтан за помощь в окрашивания иммуногистохимии.

Эксперименты, представленные в настоящем документе, проводятся в соответствии с немецким законодательством и европейскими руководящими принципами по уходу за животными. Эти животные разводят в животном учреждении Института лабораторных наук о животных, Университетская больница Ахен, Германия, под наблюдением профессора Р. Толбы и д-ра А. Теубнера (сотрудник по защите животных).
1. Уход за животными
<ol><li>Держите мышей в специализированном отделении помощи, обеспечивая надлежащий доступ к пище и специализированному ветеринарному контролю и лечению. Если животные были перемещены или приобретены у третьих лиц, пожалуйста, убедитесь, что один недельный период проживания, прежде чем пройти процедуру.</li>
</ol>2. Гиперлипидемия Побуждение
<ol><li>Кормите 6 - 8 недель, 18 - 20 г, самку (по желанию) ApoE-/- мышей с атерогенной диетой (21% жира, 0,15% холестерина, 19,5% казеина, WT/WT) за неделю до хирургической процедуры и продолжайте диету до тех пор, пока не будет проведен анализ атеросплотетических бляшек.</li>
</ol>3. Хирургическая подготовка
<ol><li>Анестезировать мышей с помощью интраперитонеальной инъекции 100 мг/кг кетамина по весу тела и 10 мг/кг ксилазина по весу тела. Подтвердите правильное обезболивания перед операцией из-за отсутствия рефлексов и движения усов. Поместите небольшое количество стерильной мази глаза в глаз, чтобы свести к минимуму сушку.</li>
	<li>Обеспечить поддержание стерильных условий, чтобы избежать инфекций во время операции с помощью стерильных материалов и инструментов.</li>
	<li>Бритье мышей в области брюшной шеи. Дезинфицировать кожу бетадином перед разрезом. Сделайте 1 см разрез кожи в средней области области шеи, на вершине трахеи.</li>
	<li>Разделите два жировых тела, чтобы обеспечить надлежащий вид на область трахеи. Используйте втягивающие для удержания мышечного слоя и подвергать сонной артерии. При наличии, выполните тупое вскрытие тонкого мышечного слоя, покрывающего сонную артерию.</li>
	<li>Используйте острые изогнутые щипцы, чтобы отделить сонную артерию от блуждающего нерва и яремной вены. Таким образом, должна быть видна область бифуркации с внутренней и внешней сонной артерией. Используйте 0,9% NaCl, чтобы избежать сухости тканей во время хирургической процедуры.</li>
</ol>4. Травма провода
<ol><li>Поместите 7 см длиной 0/5 шелкового шва под сонной артерии, проксимальной к аортальной арке. Сделайте открытый цикл, готовый к закрытию в любое время.</li>
	<li>Поместите два шелковых шва 0/7 (каждый длиной 1,5 см) вокруг внешней сонной артерии: одна петля близка к точке бифуркации и одна петля как можно дистальной. Подготовьте их как открытый цикл, готовый к закрытию в любое время.</li>
	<li>Поместите один шелковый шов длиной 0/7 (1,5 см) под внутреннюю сонную артерию. Подготовьте его как открытый цикл, готовый к закрытию в любое время.</li>
	<li>Расположите стол мыши с головой мыши к оператору, чтобы обеспечить правильное позиционирование для вставки направляющей проволоки во время денаделяции(рисунок 1A).</li>
	<li>Под микроскопическим взглядом, остановить кровоток через общую сонную артерию, удерживая и потянув концы 0/5 шелкового шва с гемостат щипцами.</li>
	<li>Сразу же после общей сонной артерии лигатуры, закрыть шовные петли, размещенные на внутренней сонной артерии и дистальной шов на внешней сонной артерии плотно (Рисунок 1B).</li>
	<li>Выполните небольшой разрез (артериотомия, половина диаметра сосуда) дистальной к внешней сонной артерии, между двумя петлями, используя небольшие ножницы(рисунок 1С). Если разрез слишком большой, пожалуйста, следуйте инструкциям по устранению неполадок (см. Обсуждение).</li>
	<li>Используйте коммерчески полированные провода руководства или используйте в доме специализированного персонала для полировки проводов направляющего. Дезинфицировать 14-дюймовый полированный гибкий направляющий провод с алкоголем и увлажнить его в капельке 0,9% NaCl для обеспечения надлежащего скольжения в сосуд.</li>
	<li>Вставьте направляющий провод в общую сонную артерию через поперечную артериотомию внешней сонной артерии(рисунок 1D). Получить эндотелиальной денаделяции путем прохождения направляющей проволоки вдоль судна при повороте. Повторите эту процедуру три раза. Поддерживайте ту же амплитуду вращательного движения в каждой мыши, чтобы увеличить воспроизводимость.</li>
	<li>Закройте проксимальную петлю на внешней сонной артерии плотно. Восстановление кровотока в сонной артерии путем разрезания шва вокруг общей артерии и шва вокруг внутренней сонной артерии.</li>
</ol>5. Шов и восстановление
<ol><li>Удалите втягивающие и верните мышечный слой и два жировых тела в физиологическое положение.</li>
	<li>Закройте кожу тремя разделенными швами 0/6, если необходимы эхокардиографические измерения. Если визуализация не требуется, используйте металлические зажимы, чтобы закрыть кожу.</li>
	<li>Положите мышь вниз на левую сторону под инфракрасным светом, пока она не проснется. Не оставляйте животное без присмотра и не оставляют в компании других животных до полного выздоровления.</li>
	<li>Для будущей идентификации отметьте мышь с помощью локальной системы. Спросите сотрудника по защите животных из местного учреждения.</li>
</ol>6. Анализ атеросклеротической бляшки
<ol><li>Анестезировать мышей в конце времени, используя интраперитонеальной инъекции 100 мг/кг кетамина по весу тела и 10 мг/кг ксилазина по весу тела. Подтвердите правильное обезболительство отсутствием рефлексов и движения усов.</li>
	<li>Выполните exsanguination ретро-орбитальной или сердечной прокола и собирать кровь для дальнейшего анализа2.</li>
	<li>Дезинфицировать кожу бетадином. Откройте грудную полость и удалите право ушной клетки. Perfuse фосфат буферизированный раствор через левый желудочек, чтобы удалить оставшуюся кровь из сосуда, а затем пронизыть 4% PFA, чтобы исправить ткани.</li>
	<li>Если фиксация не требуется, высаживать сонную артерию сразу после мытья2,4,11. Выполняйте стандартные протоколы с анализом интереса: встраивание парафина, криосекция, мРНК или анализ белка и т.д.</li>
	<li>Для морфометрических измерений, тщательно высаживать сонную артерию, включая бифуркацию, с минимальными манипуляциями, как проксимальной к аортальной арке с помощью изогнутых щипцов и маленьких ножниц.</li>
	<li>Встраивать сонную артерию в парафиновый блок с помощью стандартных протоколов встраивания. Для выполнения поперечного сечения, поместите сонную артерию вертикально на бифуркации. Вырезать 5 мкм толщиной серийных секций, начиная с бифуркации и собирать их все на покрытием гистологических слайдов (Рисунок 2A).</li>
	<li>Пятно каждый10-й раздел с помощью окрашивания Movat, чтобы подчеркнутьlaminas 2,4,11. После сбора микроскопических фотографий всех сосудов (с использованием цели 10X), измерьте просвет, а также внутреннюю и внешнюю ламину для каждого раздела, используя специально разработанное программное обеспечение2,4,11, как показано на рисунке 2B. Рассчитайте интимный рост и средства массовой информации судов.</li>
	<li>Анализ гладких мышечных клеток и макрофагов содержание, или эндотелиального восстановления в серийных разделах, используя обычные иммунохистологические окрашивания2 (Рисунок 2C).</li>
</ol>

<ol>
	<li>Simsekyilmaz, S., Liehn, E. A., Militaru, C., Vogt, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Progress+in+interventional+cardiology:+challenges+for+the+future.">Progress in interventional cardiology: challenges for the future.</a> Thromb Haemost. 113 (3), 464-472 (2015).</li><li>Kubo, N., McCurdy, S., Boisvert, W. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Defective+Fas+Expression+on+Bone+Marrow+Derived+Cells+Alters+Atherosclerotic+Plaque+Morphology+in+Hyperlipidemic+Mice.">Defective Fas Expression on Bone Marrow Derived Cells Alters Atherosclerotic Plaque Morphology in Hyperlipidemic Mice.</a> Discoveries. 3 (1), e37 (2015).</li><li>Saffarzadeh, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterization+of+rapid+neutrophil+extracellular+trap+formation+and+its+cooperation+with+phagocytosis+in+human+neutrophils.">Characterization of rapid neutrophil extracellular trap formation and its cooperation with phagocytosis in human neutrophils.</a> Discoveries. 2 (2), e19 (2014).</li><li>Lindner, V., Fingerle, J., Reidy, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mouse+model+of+arterial+injury.">Mouse model of arterial injury.</a> Circ Res. 73 (5), 792-796 (1993).</li><li>Schwartz, R. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Preclinical+evaluation+of+drug-eluting+stents+for+peripheral+applications:+recommendations+from+an+expert+consensus+group.">Preclinical evaluation of drug-eluting stents for peripheral applications: recommendations from an expert consensus group.</a> Circulation. 110 (16), 2498-2505 (2004).</li><li>Schwartz, R. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Restenosis+and+the+proportional+neointimal+response+to+coronary+artery+injury:+results+in+a+porcine+model.">Restenosis and the proportional neointimal response to coronary artery injury: results in a porcine model.</a> J Am Coll Cardiol. 19 (2), 267-274 (1992).</li><li>Curaj, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Noninvasive+molecular+ultrasound+monitoring+of+vessel+healing+after+intravascular+surgical+procedures+in+a+preclinical+setup.">Noninvasive molecular ultrasound monitoring of vessel healing after intravascular surgical procedures in a preclinical setup.</a> Arterioscler Thromb Vasc Biol. 35 (6), 1366-1373 (2015).</li><li>Liehn, E. A., Schober, A., Weber, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Blockade+of+keratinocyte-derived+chemokine+inhibits+endothelial+recovery+and+enhances+plaque+formation+after+arterial+injury+in+ApoE-deficient+mice.">Blockade of keratinocyte-derived chemokine inhibits endothelial recovery and enhances plaque formation after arterial injury in ApoE-deficient mice.</a> Arterioscler Thromb Vasc Biol. 24 (10), 1891-1896 (2004).</li><li>Liehn, E. A., Zernecke, A., Postea, O., Weber, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chemokines:+inflammatory+mediators+of+atherosclerosis.">Chemokines: inflammatory mediators of atherosclerosis.</a> Arch Physiol Biochem. 112 (4-5), 229-238 (2006).</li><li>Simsekyilmaz, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Role+of+extracellular+RNA+in+atherosclerotic+plaque+formation+in+mice.">Role of extracellular RNA in atherosclerotic plaque formation in mice.</a> Circulation. 129 (5), 598-606 (2014).</li><li>Wu, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rhodamine-loaded+intercellular+adhesion+molecule-1-targeted+microbubbles+for+dual-modality+imaging+under+controlled+shear+stresses.">Rhodamine-loaded intercellular adhesion molecule-1-targeted microbubbles for dual-modality imaging under controlled shear stresses.</a> Circ Cardiovasc Imaging. 6 (6), 974-981 (2013).</li><li>Schober, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Crucial+role+of+the+CCL2/CCR2+axis+in+neointimal+hyperplasia+after+arterial+injury+in+hyperlipidemic+mice+involves+early+monocyte+recruitment+and+CCL2+presentation+on+platelets.">Crucial role of the CCL2/CCR2 axis in neointimal hyperplasia after arterial injury in hyperlipidemic mice involves early monocyte recruitment and CCL2 presentation on platelets.</a> Circ Res. 95 (11), 1125-1133 (2004).</li><li>Ali, Z. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Increased+in-stent+stenosis+in+ApoE+knockout+mice:+insights+from+a+novel+mouse+model+of+balloon+angioplasty+and+stenting.">Increased in-stent stenosis in ApoE knockout mice: insights from a novel mouse model of balloon angioplasty and stenting.</a> Arterioscler Thromb Vasc Biol. 27 (4), 833-840 (2007).</li><li>Chamberlain, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+novel+mouse+model+of+in+situ+stenting.">A novel mouse model of in situ stenting.</a> Cardiovasc Res. 85, 38-44 (2010).</li><li>Rodriguez-Menocal, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+novel+mouse+model+of+in-stent+restenosis.">A novel mouse model of in-stent restenosis.</a> Atherosclerosis. 209 (2), 359-366 (2010).</li><li>Simsekyilmaz, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+murine+model+of+stent+implantation+in+the+carotid+artery+for+the+study+of+restenosis.">A murine model of stent implantation in the carotid artery for the study of restenosis.</a> J Vis Exp. , e50233 (2013).</li><li>Schroder, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=NADPH+oxidase+Nox2+is+required+for+hypoxia-induced+mobilization+of+endothelial+progenitor+cells.">NADPH oxidase Nox2 is required for hypoxia-induced mobilization of endothelial progenitor cells.</a> Circ Res. 105 (6), 537-544 (2009).</li></ol>

Авторы не могут разглашать информацию.

В этом документе мы предоставляем полезные советы для выполнения процедуры травмы провода даже персоналом с минимальным опытом в операциях на животных. Есть два критических шага в выполнении этой процедуры: разрез внешней сонной артерии и вставки провода. Разрез во внешней сонной артерии должен быть выполнен как можно дальше от бифуркации, для того, чтобы обеспечить достаточно оставшегося материала(Рисунок 1C). Разрез не должен быть слишком большим, из-за риска разрезания всего сосуда. Вторым важным шагом является высокий риск кровотечения во время артериотомии и вставки направляющей проволоки, если кровоток не эффективно прекращено. Кроме того, эндотелиальное денудирование может не иметь место или разрыв артерий возможен, если направляющий провод не будет должным образом введен в сосуде просвета. Чтобы избежать этого, поверхность направляющей проволоки должна быть тщательно отполирована перед операцией.
Для оптимизации протокола положение операционного стола с мышью-головой к хирургу обеспечивает лучшее представление, доступность и контроль для правильной манипуляции проводом. Кроме того, чтобы увеличить воспроизводимость, используйте тот же провод руководства во всех исследованиях. В виду того что размер провода не изменяет, важно рассматривать и исключить все возможные разницы между мышами путем использование такого же пола, времени и веса для всех мышей включенных в изучение. После этого, Эванс-Голубое окрашивание поможет хирургу определить эффективность денуды. Наличие соответствующего оборудования является необходимым условием успеха процедуры. 10X стереомикроскоп имеет важное значение для выполнения этой процедуры. Надлежащая подготовка направляющего провода (например, его полировка) имеет решающее значение. Поэтому мы настоятельно рекомендуем, чтобы подготовка проводов направляющей была выполнена специализированным техническим персоналом там, где это возможно.
В этом протоколе есть много шагов по устранению неполадок. При резвлении внешней сонной артерии вблизи бифуркации, тщательно привязать externa, вблизи бифуркации, так что никаких кровотечений не происходит. Во время резки внешняя соная артерия не видна. Поэтому рассмотрим бифуркацию на уровне шелкового шва. Собирайте секции, когда шелковый шов исчезает. Если разрез во внешней сонной артерии слишком велик и сосуд разрывается, убедитесь, что приток крови в сонную коммуну и внутреннюю сонную артерию эффективно прерывается и попытаться найти отверстие сосуда с помощью щипцов. После введения направляющей проволоки и выполнения денадерации, свяжите сосуд вблизи бифуркации. Во время резки, начинают собирать, когда шелк из шва начинает исчезать. Если артериальный разрыв происходит во время денадерации с помощью направляющей проволоки, проверьте под микроскопом, правильно ли отполирована направляющей проволоки.
Несмотря на сходство модели проволоки травмы клинических ситуаций, многие группы сосредоточены на родной атеросклероз у мышей, или они выбирают инвазивные индукции атеросклероза, такие как воздушный шар ангиопластики у крыс или кроликов, из-за отсутствия квалифицированного персонала, который может выполнять небольшие операции животных. Несмотря на преимущества использования кроликов/крыс, например нет необходимости в миниатюрном оборудовании, ни модели крыс, ни модели кроликов не предлагают различных штаммов нокаута, с точки зрения изучения молекулярных механизмов, участвующих в росте неоинтимы и в стентом тромбозе.
Существующие модели для изучения стентного рестеноза у мышей трудны, требуют высоких хирургических навыков, и имеют высокий риск осложнений, таких как кровотечение или паралич. Например, механическая травма или стент-имплантация в грудную аорту через бедренную артерию сопровождается высоким уровнем смертности (35%) из-за паралича задней ноги или кровотечения13-15. Мы также описываем имплантацию стента в сонную артерию мыши16. Процедура аналогична; однако, обработка тканей для анализа является сложной и не доступна для всех лабораторий16. Сонной артерии непосредственно доступны, не только для операционных процедур, но и для существующих методов визуализации, таких как ультразвуковое изображение. Другие индукции травмы в сонных артериях у мышей может быть сделано с помощью электрических устройств17. Этот метод прост в выполнении и обеспечивает высокую воспроизводимость. Тем не менее, он вызывает травмы во всех слоях судна, который не идентичен механической травмы. Применение воздушных шаров имеет преимущества, например, корректировка диаметра сосуда в соответствии с клинической практикой и оказывает сильное влияние на патологический исход. Несмотря на то, что мыши шары доступны, они очень дорогие и, следовательно, не широко используется. Вместо этого, проволока-травма является установленным методом, имитирующим стент стеноза.
Денудация выполняется на обычной артериальной стенке, хотя и с атеросклеротическим фоном. Таким образом, образование неоинтимы будет умеренным по сравнению с клинической ситуацией. Большое количество доклинических моделей свидетельствует о том, что ни одна из моделей не соответствует всем критериям, необходимым для раскрытия всей клеточной и молекулярной механизмов, ведущих к патофизиологии у людей (см. таблицу 2).
После выполнения процедуры травмы провода, другой биологический и молекулярный анализ может быть выполнен для выявления клеток, белков, мРНК, микроРНК, генов или других биомаркеров, которые могут быть использованы в качестве терапевтических целей для разработки новых стратегий лечения атеросклероза, и, в частности, для формирования неонитимы после сосудистой травмы. При наличии, рост бляшки можно контролировать с помощью высокочастотного ультразвука или других методов визуализации высокого разрешения. Кроме того, освоение этого метода даст оператору возможность адаптировать протокол к другим инвазивным моделям атероссклероза, таким как размещение воротников, частичная перевязка или даже имплантация стента.

Атеросклероз является основной патологией, лежащей в основе сердечно-сосудистых событий, таких как инфаркт миокарда или инсульт. Основными механизмами, запускающих острые сердечно-сосудистые синдромы, являются разрыв бляшек, поверхностная эрозия и образование тромбов. Есть несколько клинических ситуаций, связанных с развитием бляшки: родной атеросклеротический налет, рестеноз после эндартерэктомии, и рестеноз после ангиопластики воздушного шара с / без стентовной имплантации1. После артериальной травмы, подавление воспалительных процессов2,3 и восстановление эндотелиального отсека необходимы для предотвращения дальнейших осложнений1. Клинические исследования ограничиваются образцами тканей и крови из-за этических соображений, затрат и отсутствия знаний в базовых механизмах. По этим причинам необходимо изучить молекулярные механизмы в животных моделях4-6,которые могут воссоздать клинические условия. Наша модель ускоренного образования неоинтимы в контексте атеросклероза является результатом многолетнего опыта в реализации этих моделей у мелких животных7-11. Модель мыши является наиболее привлекательной моделью для исследований, из-за его простоты обработки, способность иметь большие группы животных из-за низких затрат, связанных с покупкой и уходом за животными, а также наличие различных трансгенных и нокаут штаммов.
Основным недостатком мыши модели является небольшой размер основных артерий, подверженных атеросклеротической болезни (сонный артерии, аорты, и бедренной артерии), которая требует квалифицированных хирургических знаний и навыков для управления сосудами и инвазивно вызвать атеросклеротические бляшки. Поэтому модель ускоренного формирования неоинтимы, в контексте рестеноза после эндартерэктомии или имплантации стента, предложенная в настоящем документе, представлена пошаговым руководством и предложениями по облегчению введения для заинтересованного персонала. Другим недостатком является то, что денудация производится на нормальной артериальной стенке, и, следовательно, образование нео-интимы будет умеренным по сравнению с клинической ситуацией. Высокий уровень холестерина плазмы, достигнутый в аполипопротеине E нокаутом(Apoe-/-) мышей, питаемых с высоким содержанием жира-диета создает надлежащее провоспалительные среды, необходимые для формирования нео-интима.
Операция проводится под стереомикроскопом. Сонной артерии подвергается средний разрез в брюшной цервикальной области. Анатомические структуры поверх и окружающих сонной артерии минимально манипулируются, чтобы уменьшить послеоперационное воспаление. Обнажается бифуркация сонной артерии. Чтобы вызвать ускоренное образование неоинтимы, внутренние и внешние сонные артерии готовятся к прекращению кровотока и последующей общей денуляции сонной артерии. В заключение, метод может быть изучен персоналом с минимальным опытом в операциях на животных.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Stereomicroscope</td>
			<td>Olympus</td>
			<td>SZ/X9</td>
			<td>-</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Forceps</td>
			<td>FST, Germany</td>
			<td>91197-00</td>
			<td>standard tip curved 0,17 mm</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hemostat forceps</td>
			<td>FST, Germany</td>
			<td>13007-12</td>
			<td>curved</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Scissors</td>
			<td>FST, Germany</td>
			<td>91460-11</td>
			<td>Straight</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vannas scissor</td>
			<td>Aesculap, Germany</td>
			<td>OC 498 R</td>
			<td>-</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Retractors</td>
			<td>FST, Germany</td>
			<td>18200-10</td>
			<td>2.5mm wide</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Retractors</td>
			<td>FST, Germany</td>
			<td>18200-11</td>
			<td>5mm wide</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ketamine 10%</td>
			<td>CEVA, Germany</td>
			<td>-</td>
			<td>-</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Xylazine 2%</td>
			<td>Medistar, Germany</td>
			<td>-</td>
			<td>-</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bepanthene eye and nose cream</td>
			<td>Bayer, Germany</td>
			<td>-</td>
			<td>-</td>
		</tr>
		<tr>
			<td rowspan="3">Silicon tube</td>
			<td rowspan="3">IFK Isofluor, Germany</td>
			<td rowspan="3">custom-made&#160; product</td>
			<td>diameter 500&#181;m,</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>section thickness 100 &#181;m,</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>polytetrafluorethylene catheter</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PROLENE Suture 6/0&#160;</td>
			<td>ETHICON</td>
			<td>8707H&#160;</td>
			<td>polypropylene monofilament suture, unresorbable, needle CC-1, 13mm, 3/8 Circle&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>7/0 Silk</td>
			<td>Seraflex</td>
			<td>IC 1005171Z</td>
			<td>-</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Michel Suture Clips</td>
			<td>FST, Germany</td>
			<td>12040-01&#160;</td>
			<td>&#160;-&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Clip Applying Forcep</td>
			<td>FST, Germany</td>
			<td>12018-12&#160;</td>
			<td>&#160;-&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>14&#8221;Wire for Catheter</td>
			<td>Abbot</td>
			<td>1000462H</td>
			<td>Use 10 cm from stiff part and equalize the ends</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mice</td>
			<td>Charles River</td>
			<td>Apolipoprotein E -/- mice with C57/Bl6 background</td>
			<td>&#160;-&#160;</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

induction of accelerated atherosclerosis in mice: the "wire-injury" model

Атеросклероз является пролиферативным фибро-воспалительным заболеванием, развивающимся в артериальной стенке, вызывая дефицит кровотока или недостаток кровотока. Кроме того, при разрыве дефектной сосудистой стенки атеросклероз вызывает окклюзионное образование тромба, которое является основной причиной инфаркта миокарда или инсульта и наиболее частой причиной смерти. Несмотря на достижения в области сердечно-сосудистой системы, многие вопросы остаются без ответа, и дополнительные фундаментальные исследования необходимы для улучшения нашего понимания молекулярных механизмов во время атеросклероза и его последствий. Из-за ограниченных клинических исследований, существует необходимость в репрезентативных животных моделей воссоздания атеросклеротических условий, таких как образование неоинтимы после имплантации стента, воздушный шар ангиопластики, или эндартерэктомии. Так как мышь представляет много преимуществ и является наиболее часто используемой моделью для изучения молекулярных процессов, текущее исследование предлагает инвазивную процедуру эндотелиальной денуляции, также известную как модель травмы проволоки, которая является репрезентативной человеческого состояния формирования неоинтимы в артериях после процедур реваскуляризации.

Процедура индукции атеросклеротических бляшек занимает 15 - 20 мин и показывает минимальный уровень смертности, в основном из-за кровотечения, возникающего во время процедуры. После операции мыши восстанавливаются после анестезии в течение 20 - 25 мин. Никаких физических нарушений, таких как паралич, или нарушение кормления не наблюдалось после операции.
Травма провода вызывает де-эндотелиализацию, имитируя сосудистые поражения после денуляции воздушного шара или стент-имплантации. Сразу после травмы оголенная сосудистая стенка будет покрыта слоем тромбоцитов, что является посредником и способствует спайке моноцитов12. Активированные гладкие мышечные клетки из средств массовой информации будут размножаться и мигрировать в интимные пространства, образуя неоинтиму. Другие прародители для гладких мышечных клеток будут мигрировать из крови (по оценкам, 40%) и способствовать росту неоинтимы. Формирование бляшек закончится после полной повторной эндотелиализации, как правило, через 4 недели после проволоки травмы.
Образование неоинтимы можно оценить с помощью окрашивания Моват. Размер налета рассчитывается для каждого слайда с помощью программного обеспечения, как показано на рисунке 2B. Общий размер зубного налета (левая соная артерия) может варьироваться от 70 000 до 100 000 мкм2, в то время как размер сосуда управления (правая сорото-артерия) может варьироваться от 7000 до 8000 мк2. Эти значения во многом зависят от хирурга. Поэтому мы настоятельно рекомендуем использовать одного и того же хирурга во время экспериментов для того же исследования.
Разработанная бляшка напоминает стентный рестенноз, который преимущественно состоит из размножающихся и мигрирующих гладких мышечных клеток из средств массовой информации. Клеточный состав, определяемый иммунологическими процедурами окрашивания, показывает, что содержание гладких мышечных клеток составляет примерно 30 - 40%, в то время как макрофаги встречаются в 15 - 25% от неоинтимы поврежденного сосуда. Повторное эндотелиализация может быть измерена после окрашивания эндотелиального маркера и рассчитывается как процент окружности, окрашенных по всей окружности просвета. Обычно повторное эндотелиализация достигает 80 - 90% после 3 недель, и должно быть почти завершено после 4 недель(рисунок 2C). Чтобы отслеживать рост бляшек во время его разработки, тот же анализ может быть повторен для каждого времени после проволоки травмы, в зависимости от интереса и предмета изучены (см. таблицу 1).
<img alt="Figure 1" src="/files/ftp_upload/54571/54571fig1.jpg"> Рисунок 1. Схематическое представление оперативной процедуры. (A) Позиционирование таблицы операций по отношению к оператору во время процедуры проволоки травмы(B) Расширенный вид общей сонной артерии и ее ветвей, как это появляется под микроскопом на 10X увеличение(C) Размер разреза во внешней сонной артерии под микроскопом на 10X увеличение(D) Измаическое представление проволоки травмы процедуры с использованием 14-дюймовый проводной направляющей. <a href="http://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/54571/54571fig1large.jpg" target="_blank">Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой фигуры.</a>
<img alt="Figure 2" src="/files/ftp_upload/54571/54571fig2.jpg"> Рисунок 2. Анализ реденоза. (A) Схематическое представление анализа бляшек в общей сонной артерии, через 4 недели после индукции проволоки(B) Неоинтима формирования 4 недели после проволоки травмы и схематическое представление основных параметров, используемых для анализа. Intima (зеленая зона) является разница между просвет (красный) и ламина интерна (зеленая линия). Медиа (желтая область) — это разница между ламиной эктерной (желтая линия) и интерной (зеленая линия). Масштабная планка 100 мкм(C) Репрезентативные изображения окрашивания основных типов клеток, участвующих в формировании неоинтимы. Гладкие мышечные клетки (гладкий мышечный актин -красный, шкала бар 100 мкм), макрофаги (Mac 2- зеленый, шкала бар 100 мкм) и эндотелиальные клетки (CD31- красный, стрелки, шкала бар 50 мкм). <a href="http://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/54571/54571fig2large.jpg" target="_blank">Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой фигуры.</a>
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody>
<tr>
<td>Время</td>
			<td>Тромбус</td>
			<td>Табличка (м2)</td>
			<td>
Макрофагов (% от таблички)
</td>
			<td>
Гладкие мышечные клетки (% от таблички)
</td>
			<td>
Ре-эндотелиализация (% окружность просвета)
</td>
		</tr>
<tr>
<td>1 день</td>
			<td>Настоящее время</td>
			<td>0</td>
			<td>0</td>
			<td>0</td>
			<td>0</td>
		</tr>
<tr>
<td>1 неделя</td>
			<td>-</td>
			<td>Зтт; 30 000</td>
			<td>No 10</td>
			<td>Зтт; 50</td>
			<td>Зтт; 50</td>
		</tr>
<tr>
<td>2 недели</td>
			<td>-</td>
			<td>Зтт; 50 000</td>
			<td>No 10</td>
			<td>Зтт; 50</td>
			<td>50;</td>
		</tr>
<tr>
<td>3 недели</td>
			<td>-</td>
			<td>Зттт; 70 000</td>
			<td>15-25</td>
			<td>30-40</td>
			<td>80-90</td>
		</tr>
<tr>
<td>4 недели</td>
			<td>-</td>
			<td>70 000 – 100 000</td>
			<td>15-25</td>
			<td>30-40</td>
			<td>Полный</td>
		</tr>
</tbody></table>Таблица 1. Развитие таблички, зависящее от времени.
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody>
<tr>
<td>Модели</td>
			<td>Животных</td>
			<td>Преимущества</td>
			<td>Неуправляемые</td>
		</tr>
<tr>
<td rowspan="2">Вызванный диетой родной атеросклероз</td>
			<td>Маленький</td>
			<td>
			<ul>
<li>имитирует патологию атеросклероза</li>
				<li>простота обработки</li>
				<li>без хирургического вмешательства</li>
				<li>нет стресса для животных</li>
				<li>низкие затраты, связанные с покупкой и уходом за животными</li>
				<li>наличие различных трансгенных и нокаутирующих штаммов</li>
			</ul>
</td>
			<td>
			<ul>
<li>низкая репродукция</li>
				<li>высокая дисперсия</li>
				<li>увеличение числа животных требуется</li>
				<li>увеличенное время ожидания</li>
			</ul>
</td>
		</tr>
<tr>
<td>Большой</td>
			<td>
			<ul>
<li>имитирует патологию атеросклероза</li>
				<li>простота обработки</li>
				<li>без хирургического вмешательства</li>
				<li>нет стресса для животных</li>
			</ul>
</td>
			<td>
			<ul>
<li>низкая репродукция</li>
				<li>высокая дисперсия</li>
				<li>увеличение числа животных требуется</li>
			</ul>
</td>
		</tr>
<tr>
<td rowspan="2">Расширение воздушного шара</td>
			<td>Маленький</td>
			<td>
			<ul>
<li>имитирует ретеноз после ангиопластики воздушного шара</li>
				<li>низкие затраты, связанные с покупкой и уходом за животными</li>
				<li>наличие различных трансгенных и нокаутирующих штаммов</li>
			</ul>
</td>
			<td>
			<ul>
<li>небольшой размер основных артерий</li>
				<li>требует квалифицированных хирургических знаний</li>
				<li>воздушные шары очень дорогие</li>
				<li>денаделяция производится на нормальной артериальной стене</li>
				<li>наличие соответствующего оборудования</li>
				<li>риски осложнений, как кровотечение или паралич</li>
			</ul>
</td>
		</tr>
<tr>
<td>Большой</td>
			<td>
			<ul>
<li>имитирует ретеноз после ангиопластики воздушного шара</li>
				<li>простота обработки</li>
				<li>использование устройств для людей</li>
			</ul>
</td>
			<td>
			<ul>
<li>денаделяция производится на нормальной артериальной стене</li>
			</ul>
</td>
		</tr>
<tr>
<td>Травма провода</td>
			<td>Маленький</td>
			<td>
			<ul>
<li>имитирует ретеноз после ангиопластики воздушного шара</li>
				<li>простота обработки</li>
				<li>минимальный уровень смертности</li>
				<li>низкие затраты, связанные с покупкой и уходом за животными</li>
				<li>наличие различных трансгенных и нокаутирующих штаммов</li>
				<li>без физических нарушений</li>
			</ul>
</td>
			<td>
			<ul>
<li>небольшой размер основных артерий</li>
				<li>требует менее квалифицированных хирургических знаний</li>
				<li>денаделяция производится на нормальной артериальной стене</li>
				<li>наличие соответствующего оборудования</li>
			</ul>
</td>
		</tr>
<tr>
<td rowspan="2">Имплантация стента</td>
			<td>Маленький</td>
			<td>
			<ul>
<li>имитирует рестеноз и тромбоз после имплантации стента</li>
				<li>низкие затраты, связанные с покупкой и уходом за животными</li>
				<li>наличие различных трансгенных и нокаутирующих штаммов</li>
			</ul>
</td>
			<td>
			<ul>
<li>небольшой размер основных артерий</li>
				<li>требует квалифицированных хирургических знаний</li>
				<li>небольшие стенты не доступны</li>
				<li>денаделяция производится на нормальной артериальной стене</li>
				<li>повышенной смертности</li>
				<li>наличие соответствующего оборудования</li>
				<li>риски осложнений, как кровотечение или паралич</li>
			</ul>
</td>
		</tr>
<tr>
<td>Большой</td>
			<td>
			<ul>
<li>имитирует ретеноз и тромбоз после имплантации стента</li>
				<li>простота обработки</li>
				<li>использование устройств для людей</li>
			</ul>
</td>
			<td>
			<ul>
<li>денаделяция производится на нормальной артериальной стене</li>
			</ul>
</td>
		</tr>
</tbody></table>Таблица 2. Преимущества и недостатки существующих моделей артериальной травмы.

Watch this Scientific Journal Video about Induction of Accelerated Atherosclerosis in Mice: The "Wire-Injury" Model at JoVE.com

Induction of Accelerated Atherosclerosis in Mice: The "Wire-Injury" Model

Это исследование описывает инвазивную процедуру для индукции ускоренного атеросклероза у мышей. По сравнению с другими методами, использующими электрические или крио-индуцированные травмы, механически-индуцированной травмы имитирует состояние человека restenosis после реваскуляризации терапии и идеально подходит для изучения молекулярных механизмов участие.

Индукция ускоренного атеросклероза у мышей: модель "Wire-Injury"

Atherosclerosis is a proliferative fibro-inflammatory disease developing in the arterial wall, inducing a deficient blood flow or a lack of blood flow. ...

Общая цель этой процедуры состоит в том, чтобы имитировать состояние человека ререноза после реваскуляризации терапии у мышей для изучения молекулярных механизмов, участвующих в ответ травмы. Основными преимуществами этих методов является то, что он очень воспроизводится и легко выполняется, что позволяет исследователю с даже минимальным опытом применять метод в малых животных моделей. Демонстрация процедуры будет Аделина Curaj, postdoc для моей лаборатории.Чтобы вызвать гиперлипидемию, кормить от шести до восьми недель от 18 до 20 граммов Apoe нокаут мышей атерогенной диеты за неделю до хирургической процедуры и до атеросклеротической бляшки анализа. В день операции, подтвердив отсутствие реакции на щепотку ноша, побрить анестезированной мыши в области брюшной шеи и дезинфицировать обезвленную кожу бетадином. Сделайте один сантиметровый разрез кожи в средней области шеи над трахеей и разделте два жировых тела, чтобы получить полное представление о области трахеи.Используя один ретрактор, чтобы держать мышечный слой открытым, подвергать сонной артерии и использовать острые изогнутые миппы, чтобы отделить артерию от блуждающего нерва и яремной вены до бифуркации области внутренней и внешней сонной артерии видна. Свободно, поместите семь сантиметров длиной 0-5 шелковый шов под сонной артерии проксимальной аортальной арки, а затем один свободно размещены 1,5 сантиметра длиной 0-7 шелковый шов вокруг внешней сонной артерии близко к точке бифуркации, и один свободно размещены 1,5 сантиметра длиной 0-7 шелковый шов, как дистальной от бифуркации возможно. Поместите еще один открытый 1,5 сантиметр длиной 0-7 шелковый шов под внутренней сонной артерией.Затем распоить животное с головой в положении «шесть часов». Немедленно плотно закройте швовые петли на внутренней сонной артерии и дистальный шов на внешней сонной артерии. Используйте гемостатические типсы, чтобы тянуть на концах 0-5 шва, чтобы остановить кровоток через общую сонную артерию.Используя небольшие ножницы, сделать небольшую артериотомию половины диаметра сосуда дистальной внешней сонной артерии между двумя петлями и вставить 14-дюймовый алкоголь полированной гибкой направляющий смоченной с каплей 0,9% хлорида натрия в общую соонную артерию через разрез. Чтобы избежать артериального извержения во время Y-разреза, используйте тщательно отполированный направляющий провод. Получить эндотелиальной денудации, проходя провода вдоль судна во время вращения три раза, а затем плотно закрыть проксимальную петлю на внешней сонной артерии и сократить швы вокруг общих и внутренних сонных артерий для восстановления кровотока.Затем удалите ретракторы и верните мышечный слой и два жировых тела в физиологическое положение. Закройте кожу металлическими зажимами, а затем позвольте мыши восстановиться на левой стороне под инфракрасным светом с мониторингом, пока она полностью не откинется. Формирование неоинтимы можно оценить с помощью окрашивания Movat.Общий размер бляшки, который может варьироваться от 70 000 до 100 000 микрон в квадрате, в зависимости от мастерства хирурга, может быть рассчитан для каждого образца с помощью соответствующего программного обеспечения. Разработанный налет напоминает мгновенный ререноз, который в основном состоит из размножавшихся и мигрировавших гладких мышечных клеток из среды. Гладкое содержание мышечных клеток составляет примерно от 30 до 40% от налета, в то время как макрофаги, найденные в неоинтиме травмированного сосуда, составляют от 15 до 25% от общего числа клеток.Повторное эндотелиализация обычно достигает 80-90% через три недели и должна быть почти завершена через четыре недели. Чтобы отслеживать рост бляшки во время ее развития, анализ может быть повторен в нескольких точках времени после повреждения провода в зависимости от экспериментального вопроса. После освоения, этот метод может быть завершен в течение 15 минут, если он выполняется должным образом.При попытке этой процедуры, важно помнить, что хирургическая область должна быть постоянно гидратированных для предотвращения высыхания и сделать проволоки манипуляции легче.

Research

JoVE Journal

Medicine

Implantation of a Carotid Cuff for Triggering Shear-stress Induced Atherosclerosis in Mice

Имплантация сонной манжеты для запуска Shear-стресс, вызванный атеросклероза у мышей

It is widely accepted that alterations in vascular shear stress trigger the expression of inflammatory genes in endothelial cells and thereby induce ...

Pharmacologic Induction of Epidermal Melanin and Protection Against Sunburn in a Humanized Mouse Model

Фармакологического Индукционная эпидермального меланина и защиту кожи от ожогов в модели Humanized Mouse

Fairness of skin, UV sensitivity and skin cancer  risk all correlate with the physiologic function of the melanocortin 1  receptor, a Gs-coupled signaling ...

Induction of Invasive Transitional Cell Bladder Carcinoma in Immune Intact Human MUC1 Transgenic Mice:  A Model for Immunotherapy Development

Индукция инвазивная карцинома Переходные мочевого пузыря в иммунных интактными человеческими MUC1 трансгенных мышах: модель для иммунотерапии развития

A preclinical model of invasive bladder cancer was developed in human mucin 1 (MUC1) transgenic (MUC1.Tg) mice for the purpose of evaluating immunotherapy ...

Quantitative Analysis and Characterization of Atherosclerotic Lesions in the Murine Aortic Sinus

Количественный анализ и характеристика атеросклеротических поражений в синусе аорты мышиной

Atherosclerosis is a disease of the large arteries and a major underlying cause of myocardial infarction and stroke. Several different mouse models have ...

Inducing Myointimal Hyperplasia Versus Atherosclerosis in Mice: An Introduction of Two Valid Models

Склонение Myointimal гиперплазия против атеросклероза у мышей: Введение двух допустимых моделей

Various in vivo laboratory rodent models for the induction of artery stenosis have been established to mimic diseases that include arterial plaque ...

Murine Model of Femoral Artery Wire Injury with Implantation of a Perivascular Drug Delivery Patch

Мышиной модели бедренной артерии Wire травмы с имплантацией Периваскулярный Drug Delivery Patch

Percutaneous interventions including balloon angioplasty and stenting have been used to restore blood flow in vessels with occlusive vascular disease. ...

A Murine Model of Arterial Restenosis: Technical Aspects of Femoral Wire Injury

Мышиной модели артериальный рестеноз: Технические аспекты бедренной Wire травмы

Cardiovascular disease caused by atherosclerosis is the leading cause of death in the developed world. Narrowing of the vessel lumen, due to ...

The Rabbit Model of Accelerated Atherosclerosis: A Methodological Perspective of the Iliac Artery Balloon Injury

Кролик модель ускоренной атеросклероза: методологические перспективы травмы шар подвздошных артерии

Acute coronary syndrome resulting from coronary occlusion following atherosclerotic plaque development and rupture is the leading cause of death in the ...

Isometric Contractility Measurement of the Mouse Mesenteric Artery Using Wire Myography

Изометрические сократимости измерение верхней брыжеечной артерии мыши, с помощью проволоки миография

The wire myograph technique is used to assess the contractility of vascular smooth muscles in response to depolarization, GPCR agonists/inhibitors and ...