Name: induction of accelerated atherosclerosis in mice: the "wire-injury" model
Uploaded: 2020-08-25T13:00:00
Duration: 5 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Induction of Accelerated Atherosclerosis in Mice: The "Wire-Injury" Model at JoVE.com

Detta arbete stöddes av Interdisciplinary Centre for Clinical Research IZKF Aachen (junior forskargrupp till E.A.L.) inom den medicinska fakulteten vid RWTH Aachen University. Vi tackar även mrs Roya Soltan för hjälp med immunhistokemifärgningen.

Experiment som presenteras i denna uppsats utförs enligt den tyska lagen och till de europeiska riktlinjerna för djurvård. Djuren föds upp i djuranläggningen vid Institutet för laboratoriedjursvetenskap, Universitetssjukhuset Aachen, Tyskland, under överinseende av Prof. Dr. R. Tolba och Dr. A. Teubner (djurskyddsansvarig).
1. Djurvård
<ol><li>Håll mössen i en specialiserad vårdenhet, vilket garanterar korrekt tillgång till mat och specialiserad veterinärkontroll och behandling. Om djuren flyttas eller köps från tredje part, vänligen säkerställa en en vecka boendeperiod innan de genomgår förfarandet.</li>
</ol>2. Hyperlipidemi Inducering
<ol><li>Foder 6 - 8 vecka gammal, 18 - 20 g, hona (valfritt) ApoE-/- möss med en aterogen diet (21% fett, 0,15% kolesterol, 19,5% casein, wt/wt) en vecka före det kirurgiska ingreppet och fortsätta dieten tills den aterosklerotiska plackanalysen ska utföras.</li>
</ol>3. Kirurgisk förberedelse
<ol><li>Bedöva mössen med hjälp av en intraperitoneal injektion på 100 mg/kg ketamin genom kroppsvikt och 10 mg/kg xylazin genom kroppsvikt. Bekräfta korrekt anesthetization före kirurgi av bristen på reflexer och morrhår rörelse. Placera en liten mängd steril ögonsalva i ögat för att minimera torkning.</li>
	<li>Säkerställa upprätthållandet av sterila tillstånd för att undvika infektioner under operation genom att använda sterila material och instrument.</li>
	<li>Raka mössen i regionen ventral hals. Desinficera huden med betadin före snitt. Gör en 1 cm hud snitt i medianregionen i nackområdet, ovanpå luftstrupen.</li>
	<li>Separera de två feta kropparna för att säkerställa en korrekt bild över trakealregionen. Använd upprullningsdon för att hålla muskelskiktet och exponera halspulsådern. Om närvarande, utför den trubbiga-dissektion av det tunna muskelskiktet som täcker halspulsådern.</li>
	<li>Använd skarpa böjda tärnor för att separera halspulsådern från vagusnerven och halsvenen. Således bör bifurkationsområdet med den inre och yttre halspulsådern vara synlig. Använd 0,9% NaCl för att undvika vävnad torrhet under det kirurgiska ingreppet.</li>
</ol>4. Tråd-skada
<ol><li>Placera en 7 cm lång 0/5 siden sutur under halspulsådern, proximala till aortavalvet. Gör en öppen slinga, redo att stängas när som helst.</li>
	<li>Placera två 0/7 sidensuturer (vardera 1,5 cm långa) runt den yttre halspulsådern: en slinga nära bifurkationspunkten, och en slinga så distala som möjligt. Förbered dem som en öppen slinga, redo att stängas när som helst.</li>
	<li>Placera en 0/7 sidensutur (1,5 cm lång) under den inre halspulsådern. Förbered det som en öppen slinga, redo att stängas när som helst.</li>
	<li>Placera musbordet med mushuvudet mot operatören för att säkerställa korrekt positionering för ledarens infogning under denudationen (Bild 1A).</li>
	<li>Under den mikroskopiska vyn, stoppa blodflödet genom den gemensamma halspulsådern genom att hålla och dra ändarna av 0/5 silke sutur med hemostat tärna.</li>
	<li>Omedelbart efter den gemensamma halspulsådern ligatur, stäng suturöglorna som placeras på den inre halspulsådern och den distala suturen på den yttre halspulsådern tätt (Figur 1B).</li>
	<li>Utför ett litet snitt (arteriotomy, hälften av kärlets diameter) distala till den yttre halspulsådern, mellan de två slingorna, med hjälp av små saxar (Figur 1C). Om snittet är för stort, följ instruktionerna för felsökning (se Diskussion).</li>
	<li>Använd kommersiellt polerade ledare eller använd in-house specialiserad personal för att polera guidetrådarna. Desinficera 14 tums polerad flexibel guide-tråd med alkohol och fukta den i en droppe på 0,9% NaCl för att säkerställa korrekt glidande in i kärlet.</li>
	<li>För in ledaren i den gemensamma halspulsådern via den tvärgående arteriotomi av den yttre halspulsådern (Figur 1D). Erhåll endotelförstärkring genom att föra ledaren längs kärlet medan den roterar. Upprepa den här proceduren tre gånger. Bibehålla samma amplitud av rotationsrörelse i varje mus för att öka reproducerbarheten.</li>
	<li>Stäng den proximala slingan på den yttre halspulsådern tätt. Återställ blodflödet i halspulsådern genom att klippa suturen runt vanliga artär och suturen runt den inre halspulsådern.</li>
</ol>5. Sutur och återhämtning
<ol><li>Ta bort upprullningsdonen och återför muskellagret och de två feta kropparna till fysiologiskt läge.</li>
	<li>Stäng huden med tre separerade suturer 0/6, om echocardiographic mätningar behövs. Om ingen avbildning behövs, använd metalliska klipp för att stänga huden.</li>
	<li>Lägg musen ner på sin vänstra sida under det infraröda ljuset tills det vaknar. Lämna inte ett djur utan uppsikt och inte heller i sällskap med andra djur förrän det är helt återställt.</li>
	<li>För framtida identifiering, markera musen med hjälp av det lokala systemet. Fråga djurskyddsombudet från den lokala institutionen.</li>
</ol>6. Analys av den aterosklerotiska plack
<ol><li>Bedöva mössen vid sluttidspunkten med hjälp av en intraperitoneal injektion på 100 mg/kg ketamin genom kroppsvikt och 10 mg/kg xylazin genom kroppsvikt. Bekräfta korrekt anesthetization av bristen på reflexer och morrhår rörelse.</li>
	<li>Utför exsanguination genom retro-orbital eller hjärtpunktion och samla in blodet för vidare analys2.</li>
	<li>Desinficera huden med betadin. Öppna brösthålan och ta bort hjärtats högra aurikulum. Genomsyra fosfatbuffrad lösning genom vänster kammare för att avlägsna det återstående blodet från kärlet och sedan genomsyra 4% PFA för att fixera vävnaden.</li>
	<li>Om ingen fixering krävs, explantera halspulsådern omedelbart eftertvättning 2,4,11. Utför standardprotokoll med analyser av intresse: paraffininbäddning, kryosektion, mRNA eller proteinanalys etc.</li>
	<li>För morfometriska mätningar, noggrant explant den halspulsådern inklusive bifurkation, med minimal manipulation, som proximala till aorta arch med hjälp av böjda tlys och små saxar.</li>
	<li>Bädda in halspulsådern i paraffinblocket med hjälp av standardinbäddningsprotokoll. För att utföra transversal snittning, placera halspulsådern upprätt på bifurkation. Skär 5 μm tjocka seriesektioner som börjar med bifurkationen och samla dem alla på belagda histologiska objektglas (Figur 2A).</li>
	<li>Stain varje 10:e avsnitt med Movat färgning för att markera laminas2,4,11. Efter att ha samlat mikroskopiska bilder på alla fartyg (med hjälp av en 10X-målsättning), mäta lumen, samt den interna och externa lamina för varje avsnitt, med hjälp av särskild utformadprogramvara 2,4,11, som visas i figur 2B. Beräkna fartygens skrämmande tillväxt och media.</li>
	<li>Analysera glatta muskelceller och makrofaginnehåll, eller endotelåtervinning i serieavsnitt, med vanliga immunohistologiska färgning2 (Figur 2C).</li>
</ol>

<ol>
	<li>Simsekyilmaz, S., Liehn, E. A., Militaru, C., Vogt, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Progress+in+interventional+cardiology:+challenges+for+the+future.">Progress in interventional cardiology: challenges for the future.</a> Thromb Haemost. 113 (3), 464-472 (2015).</li><li>Kubo, N., McCurdy, S., Boisvert, W. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Defective+Fas+Expression+on+Bone+Marrow+Derived+Cells+Alters+Atherosclerotic+Plaque+Morphology+in+Hyperlipidemic+Mice.">Defective Fas Expression on Bone Marrow Derived Cells Alters Atherosclerotic Plaque Morphology in Hyperlipidemic Mice.</a> Discoveries. 3 (1), e37 (2015).</li><li>Saffarzadeh, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterization+of+rapid+neutrophil+extracellular+trap+formation+and+its+cooperation+with+phagocytosis+in+human+neutrophils.">Characterization of rapid neutrophil extracellular trap formation and its cooperation with phagocytosis in human neutrophils.</a> Discoveries. 2 (2), e19 (2014).</li><li>Lindner, V., Fingerle, J., Reidy, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mouse+model+of+arterial+injury.">Mouse model of arterial injury.</a> Circ Res. 73 (5), 792-796 (1993).</li><li>Schwartz, R. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Preclinical+evaluation+of+drug-eluting+stents+for+peripheral+applications:+recommendations+from+an+expert+consensus+group.">Preclinical evaluation of drug-eluting stents for peripheral applications: recommendations from an expert consensus group.</a> Circulation. 110 (16), 2498-2505 (2004).</li><li>Schwartz, R. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Restenosis+and+the+proportional+neointimal+response+to+coronary+artery+injury:+results+in+a+porcine+model.">Restenosis and the proportional neointimal response to coronary artery injury: results in a porcine model.</a> J Am Coll Cardiol. 19 (2), 267-274 (1992).</li><li>Curaj, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Noninvasive+molecular+ultrasound+monitoring+of+vessel+healing+after+intravascular+surgical+procedures+in+a+preclinical+setup.">Noninvasive molecular ultrasound monitoring of vessel healing after intravascular surgical procedures in a preclinical setup.</a> Arterioscler Thromb Vasc Biol. 35 (6), 1366-1373 (2015).</li><li>Liehn, E. A., Schober, A., Weber, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Blockade+of+keratinocyte-derived+chemokine+inhibits+endothelial+recovery+and+enhances+plaque+formation+after+arterial+injury+in+ApoE-deficient+mice.">Blockade of keratinocyte-derived chemokine inhibits endothelial recovery and enhances plaque formation after arterial injury in ApoE-deficient mice.</a> Arterioscler Thromb Vasc Biol. 24 (10), 1891-1896 (2004).</li><li>Liehn, E. A., Zernecke, A., Postea, O., Weber, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chemokines:+inflammatory+mediators+of+atherosclerosis.">Chemokines: inflammatory mediators of atherosclerosis.</a> Arch Physiol Biochem. 112 (4-5), 229-238 (2006).</li><li>Simsekyilmaz, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Role+of+extracellular+RNA+in+atherosclerotic+plaque+formation+in+mice.">Role of extracellular RNA in atherosclerotic plaque formation in mice.</a> Circulation. 129 (5), 598-606 (2014).</li><li>Wu, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rhodamine-loaded+intercellular+adhesion+molecule-1-targeted+microbubbles+for+dual-modality+imaging+under+controlled+shear+stresses.">Rhodamine-loaded intercellular adhesion molecule-1-targeted microbubbles for dual-modality imaging under controlled shear stresses.</a> Circ Cardiovasc Imaging. 6 (6), 974-981 (2013).</li><li>Schober, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Crucial+role+of+the+CCL2/CCR2+axis+in+neointimal+hyperplasia+after+arterial+injury+in+hyperlipidemic+mice+involves+early+monocyte+recruitment+and+CCL2+presentation+on+platelets.">Crucial role of the CCL2/CCR2 axis in neointimal hyperplasia after arterial injury in hyperlipidemic mice involves early monocyte recruitment and CCL2 presentation on platelets.</a> Circ Res. 95 (11), 1125-1133 (2004).</li><li>Ali, Z. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Increased+in-stent+stenosis+in+ApoE+knockout+mice:+insights+from+a+novel+mouse+model+of+balloon+angioplasty+and+stenting.">Increased in-stent stenosis in ApoE knockout mice: insights from a novel mouse model of balloon angioplasty and stenting.</a> Arterioscler Thromb Vasc Biol. 27 (4), 833-840 (2007).</li><li>Chamberlain, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+novel+mouse+model+of+in+situ+stenting.">A novel mouse model of in situ stenting.</a> Cardiovasc Res. 85, 38-44 (2010).</li><li>Rodriguez-Menocal, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+novel+mouse+model+of+in-stent+restenosis.">A novel mouse model of in-stent restenosis.</a> Atherosclerosis. 209 (2), 359-366 (2010).</li><li>Simsekyilmaz, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+murine+model+of+stent+implantation+in+the+carotid+artery+for+the+study+of+restenosis.">A murine model of stent implantation in the carotid artery for the study of restenosis.</a> J Vis Exp. , e50233 (2013).</li><li>Schroder, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=NADPH+oxidase+Nox2+is+required+for+hypoxia-induced+mobilization+of+endothelial+progenitor+cells.">NADPH oxidase Nox2 is required for hypoxia-induced mobilization of endothelial progenitor cells.</a> Circ Res. 105 (6), 537-544 (2009).</li></ol>

Det finns inga upplysningar av författarna.

I detta papper ger vi användbara tips för att utföra tråd-skada förfarandet även av personal med minimal erfarenhet av djuroperationer. Det finns två kritiska steg i att utföra denna procedur: snittet av den externa halspulsådern och införandet av tråden. Snittet i den yttre halspulsådern behöver utföras så långt som möjligt från bifurkationen, för att säkerställa tillräckligt med kvarvarande material (Figur 1C). Snittet bör inte vara för stort, på grund av risken att skära hela fartyget. Det andra kritiska steget är den höga risken för blödning under artäriotomi och införandet av ledaren om blodflödet inte effektivt upphör. Dessutom kan endotel denudation inte äga rum eller artärbrist är möjligt om ledaren inte är korrekt införd i lumenkärlet. För att undvika detta måste ledarens yta putsas försiktigt före operationen.
För att optimera protokollet, positionen för operationsbordet med mus-huvudet mot kirurgen säkerställer en bättre vy, tillgänglighet och kontroll för rätt guide tråd manipulation. Dessutom, för att öka reproducerbarheten, använd samma ledare i alla studier. Eftersom trådstorleken inte förändras är det viktigt att tänka på och eliminera alla möjliga skillnader mellan mössen genom att använda samma kön, ålder och vikt för alla möss som ingår i en studie. Därefter kommer Evans-Blue färgning hjälpa kirurgen bestämma effektiviteten i denudation. Att det finns lämplig utrustning är en förutsättning för att förfarandet skall lyckas. En 10X stereomicroscope är viktigt för att utföra denna procedur. Den korrekta beredningen av ledaren (till exempel polering det) är avgörande. Därför rekommenderar vi starkt att ledarens förberedelser utförs av specialiserad teknisk personal där det finns.
Det finns många felsökningssteg i det här protokollet. Om incising den yttre halspulsådern nära bifurkation, försiktigt binda den externa, nära bifurkation, så ingen blödning uppstår. Under skärning kan den externa halspulsådern inte ses. Därför anser bifurkation på nivån av silke sutur. Samla upp sektioner när sidensuturen försvinner. Om snittet i den yttre halspulsådern är för stort och kärlet är sprucket, se till att blodflödet in i halspulsådd communis och inre halspulsådern är effektivt avbryts och försöka hitta öppnandet av kärlet med hjälp av tärna. Efter införandet av ledaren och utför denudationen, bind kärlet nära bifurkationen. Under skärning, börja samla när silket från suturen börjar försvinna. Om artärruptur uppstår under denudationen med ledaren, kontrollera under mikroskopet om ledaren är ordentligt polerad.
Trots likheten mellan tråd-skada modellen kliniska situationer, många grupper är inriktade på infödda åderförkalkning hos möss, eller de väljer invasiva åderförkalkning induktioner, såsom ballong angioplastik hos råttor eller kaniner, på grund av bristen på utbildad personal som kan utföra små djur operationer. Trots fördelarna med att använda kaniner/råttor, t ex inget behov av miniatyriserad utrustning, erbjuder varken råttmodeller eller kaninmodeller en mängd olika knock-out-stammar, när det gäller att studera molekylära mekanismer som är involverade i neointimatillväxt och in-stent-trombos.
De befintliga modellerna för att studera i-stent restenosis i möss är svåra, kräver hög kirurgisk kompetens, och har hög risk för komplikationer såsom blödning eller förlamning. Till exempel åtföljs den mekaniska skadan eller stent-implantationen i bröstaorten via lårbensartären av en hög dödlighet (35%) grund av bakbensförlamning ellerblödning 13-15. Vi beskriver också stent implantation i halspulsådern av en mus16. Förfarandet är liknande; dock är vävnadsbehandlingen för analys komplicerad och är inte tillgänglig för alla laboratorier16. Halspulsådern är direkt tillgänglig, inte bara för operation förfaranden, men också för befintliga bildframställning metoder såsom ultraljudsavbildning. Andra skada induktioner i halspulsådern hos möss kan göras med hjälp av elektriska enheter17. Denna metod är enkel att utföra och säkerställer hög reproducerbarhet. Det inducerar dock skada i alla kärlskikt, som inte är identisk med mekanisk skada. Ballongtillämpningar har fördelar, t ex justeringen av kärldiametern i linje med den kliniska praxisen och har starkt inflytande på det patologiska utfallet. Även om mus ballonger finns, de är mycket dyra och därför inte används i stor utsträckning. Istället är tråd-skada den etablerade metoden, härma i-stent stenos.
Denudation utförs på den normala arteriell väggen, fast med en aterosklerotisk bakgrund. Därför kommer neointimabildningen att vara måttlig jämfört med den kliniska situationen. Det höga antalet prekliniska modeller visar att ingen av modellerna uppfyller alla de kriterier som krävs för att avslöja helheten av de cellulära och molekylära mekanismer som leder till patofysiologin hos människor (se tabell 2).
Efter att ha utfört tråd-skada förfarandet, kan andra biologiska och molekylära analys utföras för att identifiera celler, proteiner, mRNAs, microRNAs, gener eller andra biomarkörer, som kan användas som terapeutiska mål för att utveckla nya behandlingsstrategier för åderförkalkning, och i synnerhet för neointima bildas efter vaskulär skada. Om det finns tillgängligt kan plaketten tillväxt övervakas med högfrekvent ultraljud eller andra högupplösta avbildningstekniker. Dessutom skulle behärska denna teknik ge operatören möjlighet att anpassa protokollet till andra invasiva åderförkalkningsinducering modeller, såsom krage placering, partiell ligatur eller ens stent implantation.

Åderförkalkning är den huvudsakliga patologin bakom kardiovaskulära händelser som hjärtinfarkt eller stroke. De viktigaste mekanismerna som utlöser akuta hjärt-syndrom är plack bristning, ytlig erosion och trombbildning. Det finns flera kliniska situationer som är kopplade till plack utveckling: infödda aterosklerotiska plack, restenosis efter endarterectomy, och restenosis efter ballong angioplastik med/utan stent implantation1. Efter arteriell skada, undertryckande av de inflammatoriska processer2,3 och återvinning av endotelavdelningen är väsentliga för att förhindra ytterligare komplikationer1. Klinisk forskning är begränsad till vävnad och blodprov på grund av etiska överväganden, kostnader, och en brist på kunskap i grundläggande mekanismer. Av dessa skäl finns det ett behov av att studera molekylära mekanismer i djurmodeller4-6, som kan återskapa de kliniska tillstånden. Vår modell av accelererad neointima bildning i samband med åderförkalkning är resultatet av många års erfarenhet av genomförandet av dessa modeller i små djur7-11. Musmodellen är den mest attraktiva modellen för forskning, på grund av dess enkel hantering, förmågan att ha stora djurgrupper på grund av låga kostnader relaterade till djurinköp och vård, och tillgången på olika transgena och knockout-stammar.
Den stora nackdelen med musmodellen är den lilla storleken på de viktigaste artärerna utsätts för aterosklerotisk sjukdom (halspulsådern, aorta, och lårbensartären), som kräver kvalificerad kirurgisk expertis och färdigheter för att manipulera kärlen och att invasivt framkalla en aterosklerotisk plack. Därför är modellen av accelererade neointima bildandet, i samband med restenosis efter endarterectomy eller stent implantation, som föreslås i detta dokument med en steg-för-steg riktlinje och förslag för att underlätta införandet för intresserade personal. En annan nackdel är att denudation görs på den normala arteriella väggen, och därför kommer neo-intima formationen måttlig jämfört med den kliniska situationen. Den höga nivån av plasmakolesterol som nåtts i apolipoprotein E knockout (Apoe-/-) möss som matas med en hög fett-diet skapar en ordentlig pro-inflammatorisk miljö som behövs för neo-intima formation.
Operationen utförs under ett stereomikroskop. Halspulsådern exponeras av ett mediananser i ventrala livmoderhalscancer området. Anatomiska strukturer ovanpå och kring halspulsådern är minimalt manipulerade för att minska postkirurgisk inflammation. Halspulsådern bifurkation är utsatt. För att inducera accelererad neointima bildning, inre och yttre halspulsådern är förberedda för blodflödet upphörande och efterföljande gemensamma halspulsådernsvärning. Sammanfattningsvis kan metoden läras av personal med minimal erfarenhet av djuroperationer.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Stereomicroscope</td>
			<td>Olympus</td>
			<td>SZ/X9</td>
			<td>-</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Forceps</td>
			<td>FST, Germany</td>
			<td>91197-00</td>
			<td>standard tip curved 0,17 mm</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hemostat forceps</td>
			<td>FST, Germany</td>
			<td>13007-12</td>
			<td>curved</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Scissors</td>
			<td>FST, Germany</td>
			<td>91460-11</td>
			<td>Straight</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vannas scissor</td>
			<td>Aesculap, Germany</td>
			<td>OC 498 R</td>
			<td>-</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Retractors</td>
			<td>FST, Germany</td>
			<td>18200-10</td>
			<td>2.5mm wide</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Retractors</td>
			<td>FST, Germany</td>
			<td>18200-11</td>
			<td>5mm wide</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ketamine 10%</td>
			<td>CEVA, Germany</td>
			<td>-</td>
			<td>-</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Xylazine 2%</td>
			<td>Medistar, Germany</td>
			<td>-</td>
			<td>-</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bepanthene eye and nose cream</td>
			<td>Bayer, Germany</td>
			<td>-</td>
			<td>-</td>
		</tr>
		<tr>
			<td rowspan="3">Silicon tube</td>
			<td rowspan="3">IFK Isofluor, Germany</td>
			<td rowspan="3">custom-made&#160; product</td>
			<td>diameter 500&#181;m,</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>section thickness 100 &#181;m,</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>polytetrafluorethylene catheter</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PROLENE Suture 6/0&#160;</td>
			<td>ETHICON</td>
			<td>8707H&#160;</td>
			<td>polypropylene monofilament suture, unresorbable, needle CC-1, 13mm, 3/8 Circle&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>7/0 Silk</td>
			<td>Seraflex</td>
			<td>IC 1005171Z</td>
			<td>-</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Michel Suture Clips</td>
			<td>FST, Germany</td>
			<td>12040-01&#160;</td>
			<td>&#160;-&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Clip Applying Forcep</td>
			<td>FST, Germany</td>
			<td>12018-12&#160;</td>
			<td>&#160;-&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>14&#8221;Wire for Catheter</td>
			<td>Abbot</td>
			<td>1000462H</td>
			<td>Use 10 cm from stiff part and equalize the ends</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mice</td>
			<td>Charles River</td>
			<td>Apolipoprotein E -/- mice with C57/Bl6 background</td>
			<td>&#160;-&#160;</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

induction of accelerated atherosclerosis in mice: the "wire-injury" model

Åderförkalkning är en proliferativ fibro-inflammatorisk sjukdom utvecklas i den arteriella väggen, förmå en bristfällig blodflödet eller en brist på blodflödet. Genom bristning av den defekta kärlväggen inducerar atheroskleros dessutom ocklusionsbildning, som representerar den främsta orsaken till hjärtinfarkt eller stroke och den vanligaste dödsorsaken. Trots framstegen inom det kardiovaskulära området förblir många frågor obesvarade, och ytterligare grundforskning är avgörande för att förbättra vår förståelse av de molekylära mekanismerna under åderförkalkning och dess effekter. På grund av begränsade kliniska studier, det finns ett behov av representativa djurmodeller återskapa aterosklerotiska förhållanden såsom neointima bildas efter stent implantation, ballong angioplastik, eller endarterectomy. Eftersom musen presenterar många fördelar och är den mest använda modellen för att studera molekylära processer, föreslår den aktuella studien ett invasivt förfarande av endotel denudation, även känd som tråd-skada modell, som är representativ för det mänskliga tillståndet för neointima bildning i artärer efter revascularization förfaranden.

Den aterosklerotiska plack induktionsproceduren tar 15 - 20 min och visar en minimal dödlighet, främst på grund av den blödning som inträffar under förfarandet. Efter operationen återhämtar sig mössen från anestesi inom 20 - 25 min. Ingen fysisk funktionsnedsättning, såsom förlamning, eller utfodring störning observerades efter operationen.
Tråd-skada inducerar en de-endothelialization, härma Vaskulär skador efter ballong denudation eller stent-implantation. Omedelbart efter skada kommer den denuded kärlväggen att täckas med ett lager av trombocyter, som förmedlar och gynnar vidhäftningen av monocyterna12. Aktiverade glatta muskelceller från media kommer att föröka sig och migrera in i de skrämmande utrymmena och bilda neointima. Andra progenitorer för glatta muskelceller kommer att migrera från blodet (beräknas vara 40%) och bidra till neointimatillväxten. Plackbildningen kommer att upphöra efter den fullständiga åter endothelialization, vanligen 4 veckor efter tråd-skada.
Neointimaformationen kan bedömas med hjälp av Movat-färgning. Plakettens storlek beräknas för varje objektglas med hjälp av programvara enligt figur 2B. Den totala plackstorleken (vänster halspulsåder) kan variera mellan 70 000 - 100 000 μm², medan kontrollkärlsstorleken (höger halspulsåder) kan variera mellan 7 000 - 8 000 μm². Dessa värden beror till stor del på kirurgen. Därför rekommenderar vi starkt att använda samma kirurg under experimenten för samma studie.
Den utvecklade plack liknar i stent restenosis, som huvudsakligen består av prolifererade och migrerade glatta muskelceller från media. Den cellulära kompositionen som bestäms av immunologiska färgningsförfaranden visar att den glatta muskelcellhalten är ungefär 30 - 40%, medan makrofager finns i 15 - 25% av det skadade kärlets neointima. Den re-endothelialization kan mätas efter färgning för en endotel markör, och beräknas som andelen omkrets färgas över hela omkretsen av lumen. Vanligtvis åter endotelialisering når 80 - 90% efter 3 veckor, och bör nästan vara komplett efter 4 veckor (Figur 2C). För att spåra plakettens tillväxt under dess utveckling kan samma analys upprepas för varje tid-punkt efter trådskadan, beroende på intresse och det ämne som studerats (se tabell 1).
<img alt="Figure 1" src="/files/ftp_upload/54571/54571fig1.jpg"> Bild 1. Schematisk representation av operativt förfarande. (A) Positionsanställning av operationstabellen mot operatören under tråd-skada förfarandet (B) Förstorad vy av den gemensamma halspulsådern och dess grenar, som det visas under mikroskopet vid 10X förstoring (C) Snittets storlek i den yttre halspulsådern under mikroskopet vid 10X förstoring (D) Schematisk representation av tråd-skada förfarande med hjälp av 14 tums guide tråd. <a href="http://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/54571/54571fig1large.jpg" target="_blank">Vänligen klicka här för att visa en större version av denna figur.</a>
<img alt="Figure 2" src="/files/ftp_upload/54571/54571fig2.jpg"> Bild 2. Analys av Restenosis Plakett. (A) Schematisk representation av plackanalys i den gemensamma halspulsådern, 4 veckor efter tråd-skada induktion (B) Neointima bildandet 4 veckor efter tråd-skada och schematisk representation av huvudparametrar som används för analys. Intima (grönområde) är skillnaden mellan lumen (röd) och lamina interna (grön linje). Media (gult område) är skillnaden mellan lamina-externa (gul linje) och interna (grön linje). Skala bar 100 μm (C) Representativa bilder av färgningen av de viktigaste celltyper som är involverade i neointimabildning. Glatta muskelceller (glatt muskulatur aktin -röd, skala bar 100 μm), makrofager (Mac 2- grön, skala bar 100 μm) och endotelceller (CD31- röd, pilar, skala bar 50 μm). <a href="http://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/54571/54571fig2large.jpg" target="_blank">Vänligen klicka här för att visa en större version av denna figur.</a>
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody>
<tr>
<td>Tid</td>
			<td>Trombus</td>
			<td>Plack (μm²)</td>
			<td>
Makrofager (% från Plaque)
</td>
			<td>
Glatta muskelceller (% från Plaque)
</td>
			<td>
Åter-endotelialisering (% lumen omkrets)
</td>
		</tr>
<tr>
<td>1 dag</td>
			<td>Närvarande</td>
			<td>0</td>
			<td>0</td>
			<td>0</td>
			<td>0</td>
		</tr>
<tr>
<td>1 vecka</td>
			<td>-</td>
			<td>< 30 000</td>
			<td>> 10</td>
			<td>< 50</td>
			<td>< 50</td>
		</tr>
<tr>
<td>2 veckor</td>
			<td>-</td>
			<td>< 50 000</td>
			<td>> 10</td>
			<td>< 50</td>
			<td>> 50</td>
		</tr>
<tr>
<td>3 veckor</td>
			<td>-</td>
			<td>< 70 000</td>
			<td>15-25</td>
			<td>30-40</td>
			<td>80-90</td>
		</tr>
<tr>
<td>4 veckor</td>
			<td>-</td>
			<td>70 000 – 100 000</td>
			<td>15-25</td>
			<td>30-40</td>
			<td>Komplett</td>
		</tr>
</tbody></table>Tabell 1. Tidsberoende Plaques utveckling.
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody>
<tr>
<td>Modell</td>
			<td>Djur</td>
			<td>Fördelar</td>
			<td>Disanvantages</td>
		</tr>
<tr>
<td rowspan="2">Kost-inducerad infödda åderförkalkning</td>
			<td>Liten</td>
			<td>
			<ul>
<li>härmar åderförkalkningspatologin</li>
				<li>enkel hantering</li>
				<li>ingen operation</li>
				<li>ingen stress för djuren</li>
				<li>låga kostnader i samband med djurinköp och vård</li>
				<li>tillgänglighet av olika transgena och knockout-stammar</li>
			</ul>
</td>
			<td>
			<ul>
<li>låg återproduktivhet</li>
				<li>hög varians</li>
				<li>ökat djurets antal krävs</li>
				<li>ökad väntetid</li>
			</ul>
</td>
		</tr>
<tr>
<td>Stora</td>
			<td>
			<ul>
<li>härmar åderförkalkningspatologin</li>
				<li>enkel hantering</li>
				<li>ingen operation</li>
				<li>ingen stress för djuren</li>
			</ul>
</td>
			<td>
			<ul>
<li>låg återproduktivhet</li>
				<li>hög varians</li>
				<li>ökat djurets antal krävs</li>
			</ul>
</td>
		</tr>
<tr>
<td rowspan="2">Ballong dilatation</td>
			<td>Liten</td>
			<td>
			<ul>
<li>härmar restenosis efter ballong angioplastik</li>
				<li>låga kostnader i samband med djurinköp och vård</li>
				<li>tillgänglighet av olika transgena och knockout-stammar</li>
			</ul>
</td>
			<td>
			<ul>
<li>liten storlek på de viktigaste artärerna</li>
				<li>kräver kvalificerad kirurgisk expertis</li>
				<li>ballonger mycket dyrt</li>
				<li>denudation görs på den normala arteriella väggen</li>
				<li>förekomsten av lämplig utrustning</li>
				<li>risker för komplikationer som blödning eller förlamning</li>
			</ul>
</td>
		</tr>
<tr>
<td>Stora</td>
			<td>
			<ul>
<li>härmar restenosis efter ballong angioplastik</li>
				<li>enkel hantering</li>
				<li>användning av anordningar för människor</li>
			</ul>
</td>
			<td>
			<ul>
<li>denudation görs på den normala arteriella väggen</li>
			</ul>
</td>
		</tr>
<tr>
<td>Tråd skada</td>
			<td>Liten</td>
			<td>
			<ul>
<li>härmar restenosis efter ballong angioplastik</li>
				<li>enkel hantering</li>
				<li>minimal dödlighet</li>
				<li>låga kostnader i samband med djurinköp och vård</li>
				<li>tillgänglighet av olika transgena och knockout-stammar</li>
				<li>ingen fysisk nedskrivning</li>
			</ul>
</td>
			<td>
			<ul>
<li>liten storlek på de viktigaste artärerna</li>
				<li>kräver mindre kvalificerad kirurgisk expertis</li>
				<li>denudation görs på den normala arteriella väggen</li>
				<li>förekomsten av lämplig utrustning</li>
			</ul>
</td>
		</tr>
<tr>
<td rowspan="2">Stent implantation</td>
			<td>Liten</td>
			<td>
			<ul>
<li>härmar restenosis och trombos efter stentimplantation</li>
				<li>låga kostnader i samband med djurinköp och vård</li>
				<li>tillgänglighet av olika transgena och knockout-stammar</li>
			</ul>
</td>
			<td>
			<ul>
<li>liten storlek på de viktigaste artärerna</li>
				<li>kräver kvalificerad kirurgisk expertis</li>
				<li>små stent finns inte</li>
				<li>denudation görs på den normala arteriella väggen</li>
				<li>ökad dödlighet</li>
				<li>förekomsten av lämplig utrustning</li>
				<li>risker för komplikationer som blödning eller förlamning</li>
			</ul>
</td>
		</tr>
<tr>
<td>Stora</td>
			<td>
			<ul>
<li>härmar restenosis och trombos efter stentimplantation</li>
				<li>enkel hantering</li>
				<li>användning av anordningar för människor</li>
			</ul>
</td>
			<td>
			<ul>
<li>denudation görs på den normala arteriella väggen</li>
			</ul>
</td>
		</tr>
</tbody></table>Tabell 2. Fördelar och nackdelar med Existent Modeller av arteriell skada.

Watch this Scientific Journal Video about Induction of Accelerated Atherosclerosis in Mice: The "Wire-Injury" Model at JoVE.com

Induction of Accelerated Atherosclerosis in Mice: The "Wire-Injury" Model

Denna studie beskriver ett invasivt förfarande för induktion av accelererad åderförkalkning hos möss. I jämförelse med andra metoder med hjälp av elektrisk- eller kryo-inducerad skada, mekanisk-inducerad skada härmar människans villkor för restenosis efter revascularization terapier och är idealisk för studier av de molekylära mekanismer som är inblandade.

Induktion av accelererad åderförkalkning hos möss: "Wire-skada" Modell

Atherosclerosis is a proliferative fibro-inflammatory disease developing in the arterial wall, inducing a deficient blood flow or a lack of blood flow. ...

Det övergripande målet med detta förfarande är att efterlikna det mänskliga tillståndet av restenosis efter revascularization terapi i möss att studera de molekylära mekanismer som är involverade i skadan svaret. De största fördelarna med dessa tekniker är att det är mycket reproducerbara och lätt utföras, gör forskare med även minimal erfarenhet att tillämpa metoden i små djurmodeller. Demonstrera förfarandet kommer att Adelina Curaj, en postdoc för mitt laboratorium.För att inducera hyperlipidemi, foder sex till åtta veckor gamla 18 till 20 gram Apoe knockout möss en aterogen kost en vecka före det kirurgiska ingreppet och tills aterosklerotisk plack analys. På dagen för operationen, efter att ha bekräftat en brist på svar på tå nypa, raka den sövda musen i regionen ventrala hals och desinficera den exponerade huden med Betadine. Gör en en centimeter hud snitt i median regionen i nacken över luftstrupen och separera de två fettkroppar för att få en fullständig bild av trakeal regionen.Med hjälp av ett upprullningsdon för att hålla muskelskiktet öppet, exponera halspulsådern och använda skarpa böjda tärnor för att separera artären från vagusnerven och halsvenen tills bifurkationsområdet i den inre och yttre halspulsådern är synlig. Löst, placera en sju centimeter lång 0-5 silke sutur under halspulsådern proximala till aorta arch, följt av en löst placerad 1,5 centimeter lång 0-7 silke sutur runt den yttre halspulsådern nära bifurkation punkt, och en löst placerad 1,5 lång centimeter 0-7 siden suture loop som disfurtal från bifurkation som möjligt. Placera en annan öppen 1,5 centimeter lång 0-7 silke sutur under den inre halspulsådern.Placera sedan djuret med huvudet vid klockan sex. Omedelbart, tätt stänga suturen slingor på den inre halspulsådern och den distala sutur på den externa halspulsådern. Använd hemostat-forceps för att dra i ändarna av 0-5 suturen för att stoppa blodflödet genom den gemensamma halspulsådern.Med hjälp av små saxar, gör en liten arteriotomy av hälften av kärlet diameter distala till den yttre halspulsådern mellan de två slingor och sätt in en 14 tums alkohol polerad flexibel ledare fuktad med en droppe 0,9%natriumklorid i den gemensamma halspulsådern via snittet. För att undvika arteriellt utbrott under Y-incision, använd en noggrant polerad ledare. Få endotelsering genom att övervälta tråden längs kärlet medan du roterar tre gånger, stäng sedan tätt den proximala slingan på den yttre halspulsådern och skär suturerna runt de vanliga och inre halspulsådern för att återställa blodflödet.Därefter tar du bort upprullningsdonen och returnerar muskellagret och de två fettkropparna till den fysiologiska positionen. Stäng huden med metalliska klipp, låt sedan musen återhämta sig på sin vänstra sida under ett infrarött ljus med övervakning tills den är helt återkrävs. Neointimaformationen kan bedömas med hjälp av Movat-färgning.Den totala plackstorlek, som kan variera mellan 70, 000 och 100, 000 micron i kvadrat, beroende på skicklighet kirurgen, kan sedan beräknas för varje prov med hjälp av lämplig programvara. Den utvecklade plack liknar omedelbar restenosis, som huvudsakligen består av prolifererade och migrerade glatta muskelceller från mediet. Den glatta muskelcellhalten utgör ungefär 30 till 40%av plack medan de makrofager som finns inom neointima av det skadade kärlet utgör 15 till 25%av det totala cellnumret.Den re-endothelialization normalt når 80 till 90%efter tre veckor och bör vara nästan komplett efter fyra veckor. För att spåra placken tillväxt under dess utveckling, kan analysen upprepas vid flera tidpunkter efter trådskada beroende på experimentell fråga. När behärskar, denna teknik kan slutföras i 15 minuter om den utförs på rätt sätt.Samtidigt som man försöker detta förfarande, är det viktigt att komma ihåg att det kirurgiska området bör ständigt hydreras för att förhindra torkning och för att göra tråden manipulation lättare.

Research

JoVE Journal

Medicine

Implantation of a Carotid Cuff for Triggering Shear-stress Induced Atherosclerosis in Mice

Implantation av en Carotid Manschett för att utlösa Sear-stress åderförkalkning hos möss

It is widely accepted that alterations in vascular shear stress trigger the expression of inflammatory genes in endothelial cells and thereby induce ...

Pharmacologic Induction of Epidermal Melanin and Protection Against Sunburn in a Humanized Mouse Model

Farmakologisk Induktion av epidermal melanin och skydd mot solbränna i en humaniserad musmodell

Fairness of skin, UV sensitivity and skin cancer  risk all correlate with the physiologic function of the melanocortin 1  receptor, a Gs-coupled signaling ...

Induction of Invasive Transitional Cell Bladder Carcinoma in Immune Intact Human MUC1 Transgenic Mice:  A Model for Immunotherapy Development

Induktion av invasiva Transitional Cell blåskarcinom i immuna intakt human MUC1 transgena möss: En modell för immunterapi utveckling

A preclinical model of invasive bladder cancer was developed in human mucin 1 (MUC1) transgenic (MUC1.Tg) mice for the purpose of evaluating immunotherapy ...

Quantitative Analysis and Characterization of Atherosclerotic Lesions in the Murine Aortic Sinus

Kvantitativ Analys och karakterisering av aterosklerotiska lesioner i murina Aorta Sinus

Atherosclerosis is a disease of the large arteries and a major underlying cause of myocardial infarction and stroke. Several different mouse models have ...

Inducing Myointimal Hyperplasia Versus Atherosclerosis in Mice: An Introduction of Two Valid Models

Induktion myointimal Hyperplasi Versus åderförkalkning hos möss: En introduktion av två giltiga modeller

Various in vivo laboratory rodent models for the induction of artery stenosis have been established to mimic diseases that include arterial plaque ...

Murine Model of Femoral Artery Wire Injury with Implantation of a Perivascular Drug Delivery Patch

Murina Modell av lårbensartären Wire Skada med Implantation av en perivaskulär Drug Delivery Patch

Percutaneous interventions including balloon angioplasty and stenting have been used to restore blood flow in vessels with occlusive vascular disease. ...

A Murine Model of Arterial Restenosis: Technical Aspects of Femoral Wire Injury

En mus modell av arteriell restenos: tekniska aspekter av femoral Wire Skada

Cardiovascular disease caused by atherosclerosis is the leading cause of death in the developed world. Narrowing of the vessel lumen, due to ...

The Rabbit Model of Accelerated Atherosclerosis: A Methodological Perspective of the Iliac Artery Balloon Injury

Kanin modellen av accelererad ateroskleros: ett metodologiskt perspektiv bäckenartären ballong skada

Acute coronary syndrome resulting from coronary occlusion following atherosclerotic plaque development and rupture is the leading cause of death in the ...

Isometric Contractility Measurement of the Mouse Mesenteric Artery Using Wire Myography

Isometrisk kontraktilitet mätning av mus mesenterica artär med Wire Myography

The wire myograph technique is used to assess the contractility of vascular smooth muscles in response to depolarization, GPCR agonists/inhibitors and ...