Name: the isolation, differentiation, and quantification of human antibody-secreting b cells from blood: elispot as a functional readout of humoral immunity
Uploaded: 2016-12-14T12:30:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about The Isolation, Differentiation, and Quantification of Human Antibody-secreting B Cells from Blood: ELISpot as a Functional Readout of Humoral Immunity at JoVE

This study was supported by a research grant from the Ministry of Science and Technology of the Executive Yuan of Taiwan (NSC99-2320-B-002-011). I would like to acknowledge the excellent service provided by the Flow Cytometric Analyzing and Sorting Core of the First Core Laboratory in College of Medicine of National Taiwan University.

Humant perifert blod skal indhentes fra raske donorer under informeret samtykke, og brugen af ​​blodprøver skal være i overensstemmelse med de godkendte retningslinjer fastlagt af de enkelte institutionelle anmeldelse bestyrelser. I denne undersøgelse, at protokollen bruge menneskeblod i en demonstration af resultaterne af flowcytometri (figur 1) og ELISPOT-analyser (figur 3) blev godkendt af den interne Review Board of National Taiwan University Hospital (protokol nummer 201307019RINB). <p class...

Isolering og oprensning af humane perifere blod B-celler Normalt kan RBC&#39;er effektivt brydes og væk for lysepuffer (trin 1.2). Det er vigtigt ikke at inkubere PBMC&#39;er med RBC lysepuffer længere end 5 min, som cellelevedygtighed kan være påvirket af ammoniumchlorid. Alternativt kan RBC&#39;er og blodplader samtidigt fjernes ved den følgende protokol. Bland frisk fuldblod med syre-citrat-dextrose (ACD) puffer (39 mM citronsyre, 75 mM natriumcitrat og 135 ...

B-celler spiller en central rolle i udviklingen af ​​humoral immunitet. De oprindeligt udvikle sig i knoglemarven og ind i blodet som naive B-celler, som kan migrere ind i lymfevæv, såsom milt, lymfeknuder og mandler, til videreudvikling. Upon Ag møde, nogle naive B-celler migrerer ind lymfoide follikler, hvor kimcenter B-celler kan differentiere til memory-B-celler og plasmablasts (PBS) / plasmaceller (PC&#39;ere). Mens de fleste PBS / pc&#39;er egress i blodstrømmen, et par vinder opholde sig i knoglemarven til at undergå terminal differentiering til langlivede pc&#39;er 1. B-celler i omløb er heterogene, og ved steady state, PBS / pc&#39;er er sjældne i perifert blod 2. Som følge af tilgængeligheden af ​​slægt-specifikke overflademarkører, flowcytometri er blevet en populær metode til identificering og karakterisering af de B-celle-undergrupper i perifert blod. En udvidet anvendelse af flow cytometry er tilføjelsen af ​​en cellesorteringsapparat funktion, der tillader separation og isolering af individuelle undergrupper af B-celler med høj renhed. Baseret på ekspressionen af specifikke overfladereceptorer på forskellige udviklingsstadier, humane cirkulerende B-celler er generelt inddeles i tre hovedkategorier subpopulationer: naive B-celler (CD19 + CD27 - CD38 -), memory-B-celler (CD19 + CD27 + CD38 -), og PBS / pc&#39;er (CD19 + CD27 + CD38 +) 3-4 (figur 1). Naive B-celler af natur har ikke stødt Ags. De kan imidlertid opdeles i IgM + CD27 + B-hukommelsesceller. Selv naive B-celler er homogene i at udtrykke B-celle antigen receptor (BCR) associeret molekyler (f.eks CD19, CD20 og CD22) de er heterogene i deres immunglobulin repertoire 5. Størstedelen af CD27 + B-hukommelsesceller kan differentieres til CD27+ / hi CD38 + PBS / pc&#39;er 6. Desuden memory-B-celler og PBS / pc&#39;er er polyklonale og udviser udviklingsmæssig og funktionel heterogenitet 4-7. PBS / pc&#39;er i omløb normalt kortvarig og ikke udtrykker CD138, men dem, der foretages for at slå sig ned i knoglemarven vil terminalt differentiere og blive langlivede. Terminalt differentierede pc&#39;er udtrykker CD138 og nedregulere CD27-molekyler på deres overflader 8. Da både PBS og pc&#39;er er i stand til at udskille Abs, i mange lejligheder de er kollektivt betegnet som ASC-kontrakter. I modsætning hertil kan hverken naive B-celler eller memory B celler producerer betydelige mængder af Abs 9-10. Men når isoleret, både naive og memory-B-celler kan differentieres til ASC&#39;er i 3 - 10 dage, når de anbringes i de rette dyrkningsbetingelser 6, 11-15. Faktisk ASC&#39;er stammer fra in vitro-differentiering deler lignende overflade udtryk for CD27 og CD38 med de direkte isoleret frabout perifert blod 6. Derudover ASC&#39;er differentierede in vitro udtrykker et lavt niveau af overfladen CD20, ligner den for cirkulerende PBS / pc&#39;er 6. Selvom kultur-afledte ASC&#39;er er alle kortvarig, kan de udskiller Abs, hvilket indikerer, at de er funktionelt kompetente og i stand til at bidrage til den humorale immunitet. Både ELISA og ELISpot er langt de mest almindeligt anvendte metoder med at opnå funktionel information om det humorale immunrespons. ELISA er en 96-brønds plade-baseret assay, og det er ofte anvendt til at måle titre af serum Ag-Ab&#39;er og andre analytter (f.eks cytokiner). Det er praktisk og skalerbar. ELISA kan bruge en fastfase-enzymanalyse at detektere tilstedeværelsen af Abs eller andre stoffer, såsom serum, i en væskeprøve 16. De udlæsninger fra serum ELISA&#39;er er ofte blevet brugt til at repræsentere immunresponset af kroppen. Et værktøj nødvendigt for erhvervelse af readouts fra ELISA-assays Spektrofotometrisk mikropladelæser. Læseren kan bestemme den optiske densitet (OD) af slutprodukterne typisk dannes ved reaktionen af peberrodsperoxidase (HRP) -konjugeret påvisning Abs og deres specifikke substrater 17. Med hensyn til at rapportere det humorale immunrespons, serum Ab-niveauer bestemt ved ELISA betegne den kollektive, men ikke individuelt, udførelse af ASC&#39;er i kroppen. Desuden ELISA ikke tager hensyn til deltagelse memory-B-celler, som ikke udskiller Abs. Ligesom ELISA, ELISpot er en meget anvendt metode til påvisning og overvågning af immunrespons i blodprøver perifere 17-18. ELISpot er en teknik relateret til en sandwich-ELISA. Heri anbringes celler i polyvinylidendifluorid (PVDF) membran-backed brønde af 96-brønds mikroplader for en kortsigtet kultur. ELISPOT-assayet er analog med udførelse western blotting på en mikroplade og developing pletter på PVDF-membran i hver brønd. Et automatiseret ELISpot reader system eller et stereomikroskop for manuel tælling er påkrævet. Den største fordel ved ELISpot i detektion af en immunreaktion er dens fremragende følsomhed i kvantificeringen af ​​ASC&#39;er og cytokin-secernerende celler. Det rapporterer deres funktionelle aktiviteter i humorale og cellulære immunitet, hhv. Ved målingen af humorale immunforsvar, er serum Ab-niveauer bestemt ved ELISA, og antallet af ASC&#39;er opregner ELISpot ofte korreleret, men data udlæsninger fra disse to assays har nogle forskelle i funktionelle implikationer 19-20. Den største fordel ved ELISpot er dens følsomhed metode. Niveauet af serum Ab-titre som rapporteret af ELISA præsenteres semi-kvantitativt som OD udlæsninger, der angiver det relative Ab-niveau, eller mere kvantitativt, da koncentration aflæsning, når en kendt mængde af de rigtige isotyper af Abs er medtaget som reference. I modsætning hertil resultaterne af ELISpot er presented som den absolutte antal ASC&#39;er i en celle pulje af interesse (f.eks ufraktionerede mononukleære celler fra perifert blod (PBMC&#39;er) og renset B-celler fra PBMC&#39;er). ELISpot kan detektere en enkelt ASC, men ELISA kræver Ab mængder fra ASC&#39;er at nå optimerede assay-afhængige koncentrationer før målingen. Derfor ELISpot er naturligvis bedre end ELISA i følsomhed kvantificering. Desuden ELISpot er også egnet til kvantificering af in vitro differentierede ASC&#39;er fra aktiverede B-hukommelsesceller. B-hukommelsesceller udskiller ikke Abs men kan differentiere til ASC&#39;er ved aktivering; de derfor ikke har bidraget til serum Abs detekteret ved ELISA. , ELISpot er således den foretrukne metode til måling af immunresponset af cirkulerende memory-B-celler efter aktivering i kultur. Det giver mulighed for overvågning af opretholdelsen af ​​langsigtet humoral immunitet.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>BD Vacutainer K2E</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>367525</td>
			<td>10 ml tube</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ficoll-Paque Plus</td>
			<td>GE Healthcare</td>
			<td>17-1440-02</td>
			<td>endotoxin-free</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypan blue 0.5% solution</td>
			<td>Biological Industries</td>
			<td>03-102-1B</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>IMag Human B lymphocyte enrichment set</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>558007</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Biotinylated CD27 mAb</td>
			<td>Biolegend</td>
			<td>302804</td>
			<td>clone O323</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Streptavidin magnetic microbeads</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>9000810</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>15 ml Falcon tubes</td>
			<td>BD Falcon</td>
			<td>352196</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Blue nylon mesh cell strainer, 40 &#956;m</td>
			<td>BD Falcon</td>
			<td>352340</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-human CD19-APC</td>
			<td>Biolegend</td>
			<td>302212</td>
			<td>clone HIB19</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-human CD27-eFluor 450</td>
			<td>eBioscience</td>
			<td>48-0279-42</td>
			<td>clone O323</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-human CD38-PE-Cy7</td>
			<td>Biolegend</td>
			<td>303516</td>
			<td>clone HIT2&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-human CD38-PE-Cy7</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>560677</td>
			<td>clone HIT2&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-human CD45-FITC</td>
			<td>Biolegend</td>
			<td>304006</td>
			<td>clone HI30</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-human CD45-FITC</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>555482</td>
			<td>clone HI30</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-mouse/rat/human CD27-PerCP Cy5.5</td>
			<td>Biolegend</td>
			<td>124213</td>
			<td>clone LG.3A10</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-human CD27-PerCP Cy5.5</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>65429</td>
			<td>clone L128</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-human CD19-FITC</td>
			<td>Miltenyi Biotec</td>
			<td>130-098-064</td>
			<td>clone LT19</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-human CD19-FITC</td>
			<td>GeneTex</td>
			<td>GTX75599</td>
			<td>clone LT19</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-human CD20-FITC</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>555622</td>
			<td>clone 2H7</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>biotinylated anti-human CD27</td>
			<td>Biolegend</td>
			<td>302804</td>
			<td>clone O323</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>biotinylated anti-human CD27</td>
			<td>eBioscience</td>
			<td>13-0279-80</td>
			<td>clone O323</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>7-aminoactinomycin D (7-AAD)</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>559925</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CpG (ODN 2006)&#160;</td>
			<td>InvivoGen</td>
			<td>tlrl-2006</td>
			<td>type B CpG</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Recombinant human IL-2</td>
			<td>PeproTech</td>
			<td>200-02</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Recombinant human IL-10</td>
			<td>PeproTech</td>
			<td>200-10</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Recombinant human IL-21</td>
			<td>PeproTech</td>
			<td>200-21</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Recombinant human sCD40L</td>
			<td>PeproTech</td>
			<td>310-02</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Protein A of S. aureus Cowan (SAC)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>82526</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pokeweed mitogen (PWM)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>L9379</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MultiScreen filter plates, 0.45 &#181;m pore size</td>
			<td>Merck Millipore</td>
			<td>MSIPS4510</td>
			<td>sterile, clear 96-well filter plate with hydrophobic PVDF membrane</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BCIP/NBT solution</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>B6404</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BCIP/NBT single reagent, alkaline phosphatase substrate</td>
			<td>Merck Millipore</td>
			<td>ES006</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Human IgG</td>
			<td>Jackson ImmunoResearch</td>
			<td>009-000-003</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Human IgG, Fc fragment</td>
			<td>Jackson ImmunoResearch</td>
			<td>009-000-008</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>F(ab&#39;)2 fragment of goat anti-human Ig (IgG+IgM+IgA)</td>
			<td>Jackson ImmunoResearch</td>
			<td>109-006-127</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Goat anti-human IgG-alkaline phosphatase, Fc&#947; fragment specific</td>
			<td>Jackson ImmunoResearch</td>
			<td>109-055-008</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Goat anti-human IgM-alkaline phosphatase, Fc&#181; fragment specific</td>
			<td>Jackson ImmunoResearch</td>
			<td>109-055-095</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Goat anti-human IgG-peroxidase, Fc&#947; fragment specific</td>
			<td>Jackson ImmunoResearch</td>
			<td>109-035-008</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Goat anti-human IgM-peroxidase, Fc&#181; fragment specific</td>
			<td>Jackson ImmunoResearch</td>
			<td>109-035-095</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BD ELISPOT AEC substrate kit</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>551951</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>C.T.L. ImmunoSpot analyzer</td>
			<td>C.T.L.</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

the isolation, differentiation, and quantification of human antibody-secreting b cells from blood: elispot as a functional readout of humoral immunity

Kendetegnet for humoral immunitet er at generere funktionelle ASC&#39;er, der syntetiserer og secernerer Abs specifikke for et antigen (Ag), såsom en patogen, og som anvendes til værtsforsvar. Til kvantitativ bestemmelse af den funktionelle status af det humorale immunrespons af en individuel, både serum Ab&#39;er og cirkulerende ASC&#39;er almindeligvis måles som funktionelle udlæsninger. Hos mennesker, perifert blod er den mest bekvemme og let tilgængelig prøve, der kan anvendes til bestemmelse af den humorale immunrespons, som fremkaldes af vært B-celler. Distinct B-celle-delmængder, herunder ASC&#39;er, kan isoleres direkte fra perifert blod via selektion med slægt-specifikke Ab-konjugerede mikroperler eller via cellesortering med flowcytometri. Desuden kan oprensede naive og memory-B-celler aktiveres og differentieret til ASC&#39;er i kultur. De funktionelle aktiviteter af ASC at bidrage til Ab sekretion kan kvantificeres ved ELISpot, som er et forsøg, der konvergerer enzym-bundet immunoabsorbance assay (ELISA) og Western blotting teknologier til at muliggøre tælling af individuelle ASC&#39;er på single-celle niveau. I praksis har ELISpot-assayet i stigende grad blevet anvendt til at evaluere vaccineeffektivitet på grund af den lette håndtering af et stort antal blodprøver. Fremgangsmåderne til isolering af humane B-celler fra perifert blod, vil differentieringen af B-celler i ASC&#39;er in vitro, og anvendelse af ELISpot til kvantificering af totale IgM- og IgG-ASC&#39;er blive beskrevet her.

PBMC&#39;er blev depleteret for RBC&#39;er og adhærente celler (trin 1.2 til 1.7). En portion (2 x 10 6) af celler blev underkastet en flowcytometrisk analyse til at illustrere de populationer af naive B-celler, memory-B-celler og PBS / pc&#39;er i perifert blod (figur 1). I denne donors PBMC&#39;er, omkring 10% af lymfocytterne var CD19 + B-celler. I B-celle-rum, procentdelen af CD19 + CD27 - naive B-celler var omkring 50%. P...

Watch this Scientific Journal Video about The Isolation, Differentiation, and Quantification of Human Antibody-secreting B Cells from Blood: ELISpot as a Functional Readout of Humoral Immunity at JoVE

The Isolation, Differentiation, and Quantification of Human Antibody-secreting B Cells from Blood: ELISpot as a Functional Readout of Humoral Immunity

Human peripheral blood is commonly used for the assessment of the humoral immune response. Here, the methods for isolating human B cells from peripheral blood, differentiating human B cells into antibody (Ab)-secreting B cells (ASCs) in culture, and enumerating the total IgM- and IgG-ASCs via an ELISpot assay are described.

Den Isolering, differentiering, og Kvantificering af humant antistof-secernerende B-celler fra Blood: ELISpot som Funktionel Udlæsning af humoral immunitet

The hallmark of humoral immunity is to generate functional ASCs, which synthesize and secrete Abs specific to an antigen (Ag), such as a pathogen, and are ...

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Isolation of Mouse Peritoneal Cavity Cells

The peritoneal cavity is a membrane-bound and fluid-filled abdominal cavity of mammals, which contains the liver, spleen, most of the gastro-intestinal ...

Expansion, Purification, and Functional Assessment of Human Peripheral Blood NK Cells

Natural killer (NK) cells play an important role in immune surveillance against a variety of infectious microorganisms and tumors. Limited availability of ...

Introducing Shear Stress in the Study of Bacterial Adhesion

During bacterial infections a sequence of interactions occur between the pathogen and its host. Bacterial adhesion to the host cell surface is often the ...

Antigens Protected Functional Red Blood Cells By The Membrane Grafting Of Compact Hyperbranched Polyglycerols

Antigener Beskyttet Funktionelle røde blodlegemer ved The Membrane podning af Compact hyperforgrenet Polyglyceroler

Red blood cell (RBC) transfusion is vital for the treatment of a number of acute and chronic medical problems such as thalassemia major and sickle cell ...

Isolation of Precursor B-cell Subsets from Umbilical Cord Blood

Isolering af precursor B-celle-undergrupper fra navlestrengsblod

Umbilical cord blood is highly enriched for hematopoietic progenitor cells at different lineage commitment stages. We have developed a protocol for ...

Analyzing the Effects of Stromal Cells on the Recruitment of Leukocytes from Flow

At analysere virkningen af ​​stromacellers om ansættelse af Leukocytter fra Flow

Stromal cells regulate the recruitment of circulating leukocytes during inflammation through cross-talk with neighboring endothelial cells. Here we ...

Isolation, Characterization and Functional Examination of the Gingival Immune Cell Network

Isolation, karakterisering og funktionelle Undersøgelse af Gingival Immune Cell Network

Immune cell networks in tissues play a vital role in mediating local immunity and maintaining tissue homeostasis, yet little is known of the resident ...

Dextran Enhances the Lentiviral Transduction Efficiency of Murine and Human Primary NK Cells

Dextran effektiviserer Lentiviral transduktion af Murine og menneskelige primære NK-celler

The efficient transduction of specific genes into natural killer (NK) cells has been a major challenge. Successful transductions are critical to defining ...

Megakaryocyte Differentiation and Platelet Formation from Human Cord Blood-derived CD34+ Cells

Megakaryocyte Differentiation and Platelet Formation from Human Cord Blood-derived CD34+ Cells

Megakaryocyte differentiering og trombocyttal dannelse fra menneskelige ledning blod-afledte CD34+ celler

Platelet production occurs principally in the bone marrow in a process known as thrombopoiesis. During thrombopoiesis, hematopoietic progenitor cells ...

Generation of Discriminative Human Monoclonal Antibodies from Rare Antigen-specific B Cells Circulating in Blood

Generation af diskriminerende menneskelige monoklonale antistoffer fra sjældne Antigen-specifikke B celler cirkulerer i blodet

Monoclonal antibodies (mAbs) are powerful tools useful for both fundamental research and in biomedicine. Their high specificity is indispensable when the ...