Name: the isolation, differentiation, and quantification of human antibody-secreting b cells from blood: elispot as a functional readout of humoral immunity
Uploaded: 2016-12-14T12:30:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about The Isolation, Differentiation, and Quantification of Human Antibody-secreting B Cells from Blood: ELISpot as a Functional Readout of Humoral Immunity at JoVE

This study was supported by a research grant from the Ministry of Science and Technology of the Executive Yuan of Taiwan (NSC99-2320-B-002-011). I would like to acknowledge the excellent service provided by the Flow Cytometric Analyzing and Sorting Core of the First Core Laboratory in College of Medicine of National Taiwan University.

sangue periferico umano deve essere ottenuto da donatori sani sotto il consenso informato, e l&#39;uso di campioni di sangue deve essere conforme alle linee guida approvate stabiliti dalle singole schede di revisione istituzionale. In questo studio, il protocollo da utilizzare sangue umano in una dimostrazione dei risultati di citometria a flusso (Figura 1) e saggi ELISPOT (Figura 3) è stato approvato dal Consiglio riesame interno della National Taiwan University Hospital (numero di protocollo 201307019RIN...

Isolamento e la purificazione delle cellule del sangue umano periferico B Normalmente, globuli rossi possono essere efficacemente rotti e liquidati con tampone di lisi (passo 1,2). È importante non incubare PBMC con il tampone di lisi RBC più di 5 minuti, come vitalità cellulare può essere influenzata dal cloruro di ammonio. In alternativa, globuli rossi e piastrine possono essere contemporaneamente rimossi dalla seguente protocollo. Mescolare sangue intero fres...

cellule B svolgono un ruolo centrale nello sviluppo di immunità umorale. Inizialmente si sviluppano nel midollo osseo ed entrano nel flusso sanguigno come cellule naive B, che possono migrare nei tessuti linfoidi, come la milza, i linfonodi, tonsille e, per un ulteriore sviluppo. Su Ag incontro, alcune cellule B naïve migrano in follicoli linfoidi, dove il centro germinale cellule B possono differenziarsi in cellule di memoria B e plasmablasts (PBS) / plasmacellule (PC). Mentre la maggior parte dei PC PBS / uscita nel flusso sanguigno, alcuni infine risiedono nel midollo osseo di sottoporsi a differenziazione terminale nei PC di lunga durata 1. Cellule B in circolazione sono eterogenei, e allo stato stazionario, PBS / PC sono rari nel sangue periferico 2. Come risultato della disponibilità di marcatori di superficie specifici lineage, citometria a flusso è diventato un metodo popolare per l&#39;identificazione e la caratterizzazione dei sottoinsiemi B-cellule nel sangue periferico. Un&#39;applicazione estesa di cytometr flussoy è l&#39;aggiunta di una funzione cell sorter, che permette la separazione e l&#39;isolamento di singoli sottogruppi di cellule B con elevata purezza. Sulla base della espressione dei recettori di superficie specifici a diversi stadi di sviluppo, che circolano cellule B umane sono generalmente classificati in tre sottopopolazioni principali: le cellule B naive (CD19 + CD27 - CD38 -), le cellule B di memoria (CD19 + CD27 + CD38 -), e PBS / PC (CD19 + CD27 + CD38 +) 3-4 (Figura 1). le cellule B naïve per natura non hanno incontrato Ags. Tuttavia, possono essere differenziate in cellule IgM + CD27 + B di memoria. Anche se le cellule B naïve sono omogenei nell&#39;esprimere recettore per l&#39;antigene delle cellule B (BCR) molecole -associated (ad esempio, CD19, CD20 e CD22) siano eterogenei nella loro immunoglobuline repertorio 5. La maggior parte delle cellule CD27 + B di memoria può essere differenziato in CD27+ / hi CD38 + PBS / PC 6. Inoltre, le cellule B di memoria e PBS / PC sono policlonali ed esibiscono evolutiva e funzionale l&#39;eterogeneità 4-7. PBS / PC in circolazione sono normalmente di breve durata e non esprimono CD138, ma quelli fatti di stabilirsi nel midollo osseo saranno terminali differenziare e diventare di lunga durata. Terminalmente differenziate PC esprimono CD138 e giù-regolano le molecole CD27 sulla loro superficie 8. Dal momento che sia PB e PC sono in grado di secernere Abs, in molte occasioni sono collettivamente indicati come ASC. Al contrario, né le cellule B naïve né cellule B di memoria in grado di produrre quantità apprezzabili di Abs 9-10. Tuttavia, quando isolato, entrambe le cellule B naive e memoria possono essere differenziati in ASC in 3 - 10 giorni, quando sono immessi nelle condizioni di coltura appropriate 6, 11-15. Infatti, ASC derivati da in vitro la differenziazione delle azioni simili espressioni superficiali di CD27 e CD38 con i diretti isolato frsangue periferico om 6. Inoltre, le ASC differenziate in vitro esprimono un basso livello di CD20 superficie, simile quella di PBS / PC 6 in circolazione. Anche se le ASC cultura di derivazione sono tutti di breve durata, possono secernono Abs, che indica che essi sono funzionalmente competenti e in grado di contribuire alla immunità umorale. Sia ELISA e ELISpot sono di gran lunga i metodi più comunemente applicato con cui ottenere informazioni funzionali sulla risposta immunitaria umorale. ELISA è un test piastra base 96 pozzetti, ed è utilizzato frequentemente per misurare i titoli di siero Abs Ag-specifica ed altri analiti (ad esempio, citochine). E &#39;conveniente e scalabile. ELISA è progettato per utilizzare un saggio enzimatico in fase solida per rilevare la presenza di Abs o altre sostanze, quali siero, in un campione liquido 16. Le letture da ELISA siero sono stati ampiamente utilizzati per rappresentare la risposta immunitaria del corpo. Uno strumento necessario per l&#39;acquisizione di riadouts da ELISA test è un lettore spettrofotometrico. Il lettore può determinare la densità ottica (OD) dei prodotti finali tipicamente risultanti dalla reazione di perossidasi di rafano (HRP) coniugata Abs rilevamento e loro substrati specifici 17. Per quanto riguarda la segnalazione della risposta immunitaria umorale, livelli sierici Ab determinati mediante ELISA denotano collettivo, ma non individuale, prestazioni di ASC nel corpo. Inoltre, ELISA non tiene conto della partecipazione dalle cellule B di memoria, che non secernono Abs. Come ELISA, ELISpot è un metodo ampiamente utilizzato per la rilevazione e il monitoraggio della risposta immunitaria nei campioni di sangue periferico 17-18. ELISpot è una tecnica relativa a un sandwich ELISA. In esso, le cellule vengono inseriti nella difluoruro di polivinilidene (PVDF) pozzi membrana-backed di 96 pozzetti per una cultura a breve termine. Il saggio ELISPOT è analogo all&#39;esecuzione di western blotting su una micropiastra e developing le macchie sulla membrana PVDF in ogni pozzetto. è richiesto un sistema di lettore ELISpot automatico o uno stereomicroscopio per il conteggio manuale. Il vantaggio principale di ELISpot nel rilevare una risposta immunitaria è la sua eccezionale sensibilità nella quantificazione di ASC e cellule secernenti citochine. Riporta le loro attività funzionali in immunità umorale e cellulare, rispettivamente. Nella misurazione della funzione immunitaria umorale, livelli sierici Ab determinati mediante ELISA e il numero di ASC enumerate da ELISpot sono spesso correlati, ma le letture dati da questi due saggi hanno alcune differenze nelle implicazioni funzionali 19-20. Il vantaggio principale di ELISpot è la sua sensibilità del metodo. Il livello di siero titoli Ab come riportato da ELISA è presentato semi-quantitativamente come letture OD, che indica il livello Ab relativa, o più quantitativamente, come letture di concentrazione quando una quantità nota dei propri isotipi di Abs è incluso per riferimento. Al contrario, i risultati di ELISpot sono Presented come il numero assoluto di ASC in un pool di cellule di interesse (ad esempio, le cellule mononucleate del sangue periferico non frazionate (PBMC) e le cellule B purificate da PBMC). ELISpot può rilevare una singola ASC, ma ELISA richiede quantità Ab da ASC raggiungere concentrazioni dosaggio-dipendente ottimizzate prima della misura. Quindi, ELISpot è ovviamente superiore a ELISA nella sensibilità di quantificazione. Inoltre, ELISpot è adatto anche per quantificare le ASC differenziate in vitro da cellule B di memoria attivate. le cellule B di memoria non secernono Abs ma possono differenziarsi in ASC al momento di attivazione; non hanno quindi alcun contributo di Abs siero rilevati da ELISA. Così, ELISpot è il metodo di scelta nella misurazione della risposta immunitaria delle cellule B della memoria circolanti dopo l&#39;attivazione in coltura. Esso consente il monitoraggio del mantenimento dell&#39;immunità umorale a lungo termine.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>BD Vacutainer K2E</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>367525</td>
			<td>10 ml tube</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ficoll-Paque Plus</td>
			<td>GE Healthcare</td>
			<td>17-1440-02</td>
			<td>endotoxin-free</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypan blue 0.5% solution</td>
			<td>Biological Industries</td>
			<td>03-102-1B</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>IMag Human B lymphocyte enrichment set</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>558007</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Biotinylated CD27 mAb</td>
			<td>Biolegend</td>
			<td>302804</td>
			<td>clone O323</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Streptavidin magnetic microbeads</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>9000810</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>15 ml Falcon tubes</td>
			<td>BD Falcon</td>
			<td>352196</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Blue nylon mesh cell strainer, 40 &#956;m</td>
			<td>BD Falcon</td>
			<td>352340</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-human CD19-APC</td>
			<td>Biolegend</td>
			<td>302212</td>
			<td>clone HIB19</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-human CD27-eFluor 450</td>
			<td>eBioscience</td>
			<td>48-0279-42</td>
			<td>clone O323</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-human CD38-PE-Cy7</td>
			<td>Biolegend</td>
			<td>303516</td>
			<td>clone HIT2&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-human CD38-PE-Cy7</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>560677</td>
			<td>clone HIT2&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-human CD45-FITC</td>
			<td>Biolegend</td>
			<td>304006</td>
			<td>clone HI30</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-human CD45-FITC</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>555482</td>
			<td>clone HI30</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-mouse/rat/human CD27-PerCP Cy5.5</td>
			<td>Biolegend</td>
			<td>124213</td>
			<td>clone LG.3A10</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-human CD27-PerCP Cy5.5</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>65429</td>
			<td>clone L128</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-human CD19-FITC</td>
			<td>Miltenyi Biotec</td>
			<td>130-098-064</td>
			<td>clone LT19</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-human CD19-FITC</td>
			<td>GeneTex</td>
			<td>GTX75599</td>
			<td>clone LT19</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-human CD20-FITC</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>555622</td>
			<td>clone 2H7</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>biotinylated anti-human CD27</td>
			<td>Biolegend</td>
			<td>302804</td>
			<td>clone O323</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>biotinylated anti-human CD27</td>
			<td>eBioscience</td>
			<td>13-0279-80</td>
			<td>clone O323</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>7-aminoactinomycin D (7-AAD)</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>559925</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CpG (ODN 2006)&#160;</td>
			<td>InvivoGen</td>
			<td>tlrl-2006</td>
			<td>type B CpG</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Recombinant human IL-2</td>
			<td>PeproTech</td>
			<td>200-02</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Recombinant human IL-10</td>
			<td>PeproTech</td>
			<td>200-10</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Recombinant human IL-21</td>
			<td>PeproTech</td>
			<td>200-21</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Recombinant human sCD40L</td>
			<td>PeproTech</td>
			<td>310-02</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Protein A of S. aureus Cowan (SAC)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>82526</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pokeweed mitogen (PWM)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>L9379</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MultiScreen filter plates, 0.45 &#181;m pore size</td>
			<td>Merck Millipore</td>
			<td>MSIPS4510</td>
			<td>sterile, clear 96-well filter plate with hydrophobic PVDF membrane</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BCIP/NBT solution</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>B6404</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BCIP/NBT single reagent, alkaline phosphatase substrate</td>
			<td>Merck Millipore</td>
			<td>ES006</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Human IgG</td>
			<td>Jackson ImmunoResearch</td>
			<td>009-000-003</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Human IgG, Fc fragment</td>
			<td>Jackson ImmunoResearch</td>
			<td>009-000-008</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>F(ab&#39;)2 fragment of goat anti-human Ig (IgG+IgM+IgA)</td>
			<td>Jackson ImmunoResearch</td>
			<td>109-006-127</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Goat anti-human IgG-alkaline phosphatase, Fc&#947; fragment specific</td>
			<td>Jackson ImmunoResearch</td>
			<td>109-055-008</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Goat anti-human IgM-alkaline phosphatase, Fc&#181; fragment specific</td>
			<td>Jackson ImmunoResearch</td>
			<td>109-055-095</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Goat anti-human IgG-peroxidase, Fc&#947; fragment specific</td>
			<td>Jackson ImmunoResearch</td>
			<td>109-035-008</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Goat anti-human IgM-peroxidase, Fc&#181; fragment specific</td>
			<td>Jackson ImmunoResearch</td>
			<td>109-035-095</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BD ELISPOT AEC substrate kit</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>551951</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>C.T.L. ImmunoSpot analyzer</td>
			<td>C.T.L.</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

the isolation, differentiation, and quantification of human antibody-secreting b cells from blood: elispot as a functional readout of humoral immunity

Il segno distintivo dell&#39;immunità umorale è generare ASC funzionali, che sintetizzano e secernono Abs specifici per un antigene (Ag), come un agente patogeno, e sono utilizzati per difesa dell&#39;ospite. Per la determinazione quantitativa dello stato funzionale della risposta immunitaria umorale di un individuo, sia Abs siero e ASC circolanti sono comunemente misurati come letture funzionali. Negli esseri umani, sangue periferico è il campione più conveniente e facilmente accessibile che può essere utilizzato per la determinazione della risposta immunitaria umorale indotta da cellule ospiti B. sottoinsiemi delle cellule B distinte, tra cui ASC, possono essere isolate direttamente dal sangue periferico mediante selezione con microsfere Ab-coniugati specifici lineage o tramite cella di smistamento con citometria a flusso. Inoltre, purificato le cellule B naive e memoria possono essere attivati ​​e differenziate in ASC nella cultura. Le attività funzionali di ASC per contribuire alla Ab secrezione può essere quantificata ELISpot, che è un metodo che converge enzimasaggio linked immunoabsorbance (ELISA) e le tecnologie di Western blotting per consentire l&#39;enumerazione dei singoli ASC a livello di singola cellula. In pratica, il saggio ELISPOT è stato usato sempre per valutare l&#39;efficacia del vaccino a causa della facilità di trattamento di un gran numero di campioni di sangue. I metodi di isolare cellule B umane da sangue periferico, la differenziazione delle cellule B in ASC in vitro, e l&#39;impiego di ELISpot per la quantificazione del totale IgM e IgG-ASC verranno descritte qui.

PBMC sono state esaurite di globuli rossi e cellule aderenti (passi 1,2-1,7). Una aliquota (2 x 10 6) di cellule sono stati sottoposti ad analisi citofluorimetrica per illustrare le popolazioni di cellule naive B, cellule B di memoria, e PBS / PC nel sangue periferico (Figura 1). In PBMC di questo donatore, circa il 10% dei linfociti erano cellule CD19 + B. Nel vano B-cell, la percentuale di CD19 + CD27 - cellule B naive era di...

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The Isolation, Differentiation, and Quantification of Human Antibody-secreting B Cells from Blood: ELISpot as a Functional Readout of Humoral Immunity

Human peripheral blood is commonly used for the assessment of the humoral immune response. Here, the methods for isolating human B cells from peripheral blood, differentiating human B cells into antibody (Ab)-secreting B cells (ASCs) in culture, and enumerating the total IgM- and IgG-ASCs via an ELISpot assay are described.

L&#39;isolamento, la differenziazione e quantificazione di Human anticorpo-secernenti cellule B da sanguigno: ELISpot come una lettura funzionale del umorale immunità

The hallmark of humoral immunity is to generate functional ASCs, which synthesize and secrete Abs specific to an antigen (Ag), such as a pathogen, and are ...

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