Name: the isolation, differentiation, and quantification of human antibody-secreting b cells from blood: elispot as a functional readout of humoral immunity
Uploaded: 2016-12-14T12:30:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about The Isolation, Differentiation, and Quantification of Human Antibody-secreting B Cells from Blood: ELISpot as a Functional Readout of Humoral Immunity at JoVE

This study was supported by a research grant from the Ministry of Science and Technology of the Executive Yuan of Taiwan (NSC99-2320-B-002-011). I would like to acknowledge the excellent service provided by the Flow Cytometric Analyzing and Sorting Core of the First Core Laboratory in College of Medicine of National Taiwan University.

Humant perifert blod må innhentes fra friske donorer i henhold til informert samtykke, og bruk av blodprøver må følge de vedtatte retningslinjer fastsatt av private institusjonelle gjennomgang boards. I denne studien til protokollen bruke menneskeblod i en demonstrasjon av resultatene av flowcytometri (figur 1) og ELISPOT-analyser (figur 3) ble godkjent av Internal Review Board of National Taiwan University Hospital (protokoll nummer 201307019RINB). 1. Isolering og rensing av ...

Isolering og rensing av humant perifert blod B-cellene Normalt kan RBC effektivt sprengt og klarert av lysis buffer (trinn 1.2). Det er viktig ikke å inkubere PBMC med RBC lysis buffer lenger enn 5 minutter, som celleviabilitet kan bli påvirket av ammoniumklorid. Alternativt kan RBC og blodplater samtidig bli fjernet av den følgende protokoll. Blande friskt fullblod med syre-citrat-dextrose (ACD) buffer (39 mM sitronsyre, 75 mM natriumcitrat, og 135 mM dekstrose,...

B-celler spiller en sentral rolle i utviklingen av humoral immunitet. De i utgangspunktet utvikle seg i benmargen og inn i blodstrømmen som naive B-celler, som kan migrere inn i lymfevev, slik som milt, lymfeknuter, og mandlene, for videre utvikling. Ved Ag møte, noen naive B-celler vandrer inn lymfoide follikler, hvor Germinal senter B-celler kan differensiere til minne B-celler og plasmablasts (PBS) / plasmaceller (PC). Mens de fleste PBS / PC-utgang inn i blodstrømmen, noen til slutt ligge i benmargen til å gjennomgå terminal differensiering i langlivede PCer 1. B-celler i omløp er heterogene, og ved steady state, PBS / PC-er sjeldne i perifert blod 2. Som følge av tilgjengeligheten av avstamning-spesifikke overflatemarkører, strømningscytometri har blitt en populær metode for identifisering og karakterisering av B-celleundergrupper i perifert blod. En utvidet bruk av flyt cytometry er tilsetningen av et cellesorteringsfunksjon, som tillater separering og isolering av de enkelte delmengder av B-celler med høy renhet. På bakgrunn av ekspresjonen av spesifikke overflatereseptorer på forskjellige utviklingsstadier, humane sirkulerende B-celler er generelt klassifisert i tre hoved subpopulasjoner: naive B-celler (CD19 + CD27 - CD38 -), minne-B-celler (CD19 + CD27 + CD38 -) og PBS / PC (CD19 + CD27 + CD38 +) 3-4 (figur 1). Naive B-celler av natur har ikke møtt Ags. Imidlertid kan de bli differensiert i IgM + CD27 + minne-B-celler. Selv naive B-celler er homogene i å uttrykke B-celle antigen reseptor (BCR) -associated molekyler (f.eks CD19, CD20 og CD22) de er heterogene i sin immunoglobulin repertoar 5. Flertallet av CD27 + minne-B-celler kan differensieres til CD27+ / hi CD38 + PBS / PC-6. I tillegg minne B-celler og PBS / PCer er polyklonale og vise utviklings og funksjonell heterogenitet 4-7. PBS / PC-er i omløp er normalt kortvarig og uttrykker ikke CD138, men de som er laget for å slå seg ned i benmargen vil terminalt differensiere og bli langvarige. Terminalt differensiert PCer uttrykke CD138 og ned-regulere CD27 molekyler på overflaten 8. Siden både PBS og PC-er i stand til å skille ut Abs, i mange tilfeller de er kollektivt betegnet som ASCs. I kontrast, kan verken naive B-celler eller minne B-celler produsere betydelige mengder Abs 9-10. Likevel, når isolert, både naive og minne B-celler kan differensieres i ASCs i 3 - 10 dager når den plasseres i de riktige dyrkingsforhold 6, 11-15. Faktisk ASCs avledet fra in vitro differensiering dele lignende overflate uttrykk for CD27 og CD38 med dem direkte isolert from perifert blod 6. I tillegg ASCer differensierte in vitro uttrykker et lavt nivå av overflate CD20, lignende den av sirkulerende PBS / PC 6. Selv om dyrknings-avledede ASCer er alle kortvarig, kan de utskiller Abs, noe som indikerer at de er funksjonelt kompetente og i stand til å bidra til den humorale immunitet. Både ELISA og ELISPOT er langt de mest anvendt metoder som å skaffe funksjonell informasjon om humoral immunrespons. ELISA er en 96-brønners plate-baserte analysen, og det er ofte brukt for å måle titere av serum Ag-spesifikke Abs og andre analytter (f.eks cytokiner). Det er praktisk og skalerbar. ELISA er utformet for å bruke et fast-fase enzym-analyse for å påvise tilstedeværelse av ABS eller andre stoffer, slik som serum, i en væskeprøve 16. De avlesninger fra serum ELISA har blitt mye brukt for å representere den immunrespons i kroppen. Et verktøy er nødvendig for kjøp av readouts fra ELISA-analyser er en spektrofotometrisk mikroplateleser. Leseren kan bestemme den optiske tetthet (OD) av sluttproduktene vanligvis resulterer fra reaksjonen av pepperrot peroksidase (HRP) -konjugert deteksjon Abs og deres spesifikke substrater 17. Med hensyn til å rapportere den humorale immunrespons, serumnivåer Ab bestemt ved ELISA betegne kollektivt, men ikke individuell, utførelse av ASCer i kroppen. I tillegg klarer ELISA for å ta hensyn til deltakelse av minne-B-celler, som ikke skiller ut Abs. Som ELISA, er ELISPOT en mye brukt metode for påvisning og overvåking av immunrespons i perifere blodprøver 17-18. ELISPOT er en teknikk som er relatert til en sandwich ELISA. I det blir cellene plassert i polyvinylidendifluorid (PVDF) membran-sikkerhets brønner av 96-brønners mikroplater for en kortvarig kultur. ELISPOT-analysen er analog til å utføre Western-blotting på en mikroplate og utvikle ferdigg flekker på PVDF-membran i hver brønn. Et automatisert ELISPOT-lesersystem eller et stereomikroskop for manuell telling er nødvendig. Den største fordelen med ELISPOT i å oppdage en immunrespons er den suverene følsomhet i kvantifisering av ASCs og cytokin-sekresjon celler. Den rapporterer sine funksjonelle aktiviteter i humoral og cellulær immunitet, henholdsvis. I måling av humorale immunfunksjon, blir serumnivåer Ab bestemt ved hjelp av ELISA og antallet ASC oppregnet av ELISPOT ofte korrelert, men dataavlesninger fra disse to analyser har noen forskjeller i funksjonelle konsekvenser 19-20. Den største fordelen med ELISPOT er dens følsomhet for metoden. Nivået av serum-Ab titere som rapportert av ELISA er presentert semi-kvantitativt som OD-avlesninger, betegner den relative Ab nivå, eller mer kvantitativt, som konsentrasjonsavlesninger når en kjent mengde av de riktige isotyper av Abs er tatt med for referanse. I kontrast til resultatene av ELISPOT er presented som det absolutte antall av ASCer i en celle pool av interesse (for eksempel, ikke-fraksjonerte perifere mononukleære blodceller (PBMC) og rensede B-celler fra PBMC). ELISPOT kan oppdage en enkelt ASC, men ELISA krever Ab mengder fra ASCs å nå optimalisert analyseavhengig konsentrasjoner før måling. Derfor er ELISPOT åpenbart bedre enn ELISA i følsomhet for mengdebestemmelse. Videre er ELISPOT også egnet for å kvantifisere de in vitro differensierte ASCer fra aktiverte minne-B-celler. Memory B-celler ikke utskiller Abs men kan differensiere til ASCs ved aktivering; de har derfor ikke bidrar til serum Abs detektert ved ELISA. Således er ELISPOT-metoden for valg ved måling av immunresponsen av sirkulerende hukommelses-B-celler etter aktivering i kultur. Det gir mulighet for overvåking av opprettholdelse av langvarig humoral immunitet.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>BD Vacutainer K2E</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>367525</td>
			<td>10 ml tube</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ficoll-Paque Plus</td>
			<td>GE Healthcare</td>
			<td>17-1440-02</td>
			<td>endotoxin-free</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypan blue 0.5% solution</td>
			<td>Biological Industries</td>
			<td>03-102-1B</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>IMag Human B lymphocyte enrichment set</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>558007</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Biotinylated CD27 mAb</td>
			<td>Biolegend</td>
			<td>302804</td>
			<td>clone O323</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Streptavidin magnetic microbeads</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>9000810</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>15 ml Falcon tubes</td>
			<td>BD Falcon</td>
			<td>352196</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Blue nylon mesh cell strainer, 40 &#956;m</td>
			<td>BD Falcon</td>
			<td>352340</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-human CD19-APC</td>
			<td>Biolegend</td>
			<td>302212</td>
			<td>clone HIB19</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-human CD27-eFluor 450</td>
			<td>eBioscience</td>
			<td>48-0279-42</td>
			<td>clone O323</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-human CD38-PE-Cy7</td>
			<td>Biolegend</td>
			<td>303516</td>
			<td>clone HIT2&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-human CD38-PE-Cy7</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>560677</td>
			<td>clone HIT2&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-human CD45-FITC</td>
			<td>Biolegend</td>
			<td>304006</td>
			<td>clone HI30</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-human CD45-FITC</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>555482</td>
			<td>clone HI30</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-mouse/rat/human CD27-PerCP Cy5.5</td>
			<td>Biolegend</td>
			<td>124213</td>
			<td>clone LG.3A10</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-human CD27-PerCP Cy5.5</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>65429</td>
			<td>clone L128</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-human CD19-FITC</td>
			<td>Miltenyi Biotec</td>
			<td>130-098-064</td>
			<td>clone LT19</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-human CD19-FITC</td>
			<td>GeneTex</td>
			<td>GTX75599</td>
			<td>clone LT19</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-human CD20-FITC</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>555622</td>
			<td>clone 2H7</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>biotinylated anti-human CD27</td>
			<td>Biolegend</td>
			<td>302804</td>
			<td>clone O323</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>biotinylated anti-human CD27</td>
			<td>eBioscience</td>
			<td>13-0279-80</td>
			<td>clone O323</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>7-aminoactinomycin D (7-AAD)</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>559925</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CpG (ODN 2006)&#160;</td>
			<td>InvivoGen</td>
			<td>tlrl-2006</td>
			<td>type B CpG</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Recombinant human IL-2</td>
			<td>PeproTech</td>
			<td>200-02</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Recombinant human IL-10</td>
			<td>PeproTech</td>
			<td>200-10</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Recombinant human IL-21</td>
			<td>PeproTech</td>
			<td>200-21</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Recombinant human sCD40L</td>
			<td>PeproTech</td>
			<td>310-02</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Protein A of S. aureus Cowan (SAC)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>82526</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pokeweed mitogen (PWM)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>L9379</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MultiScreen filter plates, 0.45 &#181;m pore size</td>
			<td>Merck Millipore</td>
			<td>MSIPS4510</td>
			<td>sterile, clear 96-well filter plate with hydrophobic PVDF membrane</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BCIP/NBT solution</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>B6404</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BCIP/NBT single reagent, alkaline phosphatase substrate</td>
			<td>Merck Millipore</td>
			<td>ES006</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Human IgG</td>
			<td>Jackson ImmunoResearch</td>
			<td>009-000-003</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Human IgG, Fc fragment</td>
			<td>Jackson ImmunoResearch</td>
			<td>009-000-008</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>F(ab&#39;)2 fragment of goat anti-human Ig (IgG+IgM+IgA)</td>
			<td>Jackson ImmunoResearch</td>
			<td>109-006-127</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Goat anti-human IgG-alkaline phosphatase, Fc&#947; fragment specific</td>
			<td>Jackson ImmunoResearch</td>
			<td>109-055-008</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Goat anti-human IgM-alkaline phosphatase, Fc&#181; fragment specific</td>
			<td>Jackson ImmunoResearch</td>
			<td>109-055-095</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Goat anti-human IgG-peroxidase, Fc&#947; fragment specific</td>
			<td>Jackson ImmunoResearch</td>
			<td>109-035-008</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Goat anti-human IgM-peroxidase, Fc&#181; fragment specific</td>
			<td>Jackson ImmunoResearch</td>
			<td>109-035-095</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BD ELISPOT AEC substrate kit</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>551951</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>C.T.L. ImmunoSpot analyzer</td>
			<td>C.T.L.</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

the isolation, differentiation, and quantification of human antibody-secreting b cells from blood: elispot as a functional readout of humoral immunity

Kjennetegnet av humoral immunitet er å generere funksjonelle ASCer, som syntetiserer og utskiller Abs spesifikk for et antigen (Ag), slik som en patogen, og blir brukt til vertens forsvar. For kvantitativ bestemmelse av den funksjonelle status av den humorale immunresponsen til et individ, både serum Abs og sirkulerende ASCer blir ofte målt som funksjonelle avlesninger. Hos mennesker er perifert blod den mest praktiske og lett tilgjengelige prøve som kan brukes for bestemmelse av den humorale immunrespons fremkalt ved verten B-celler. Forskjellige B-celleundergrupper, inkludert ASCer, kan bli isolert direkte fra perifert blod via utvalg med avstamning-spesifikk Ab-konjugerte mikroperler eller via cellesortering med flowcytometri. Videre kan rensede naive og minne B-celler aktiveres og differensiert i ASCs i kultur. De funksjonelle aktivitetene av ASCer for å bidra til Ab sekresjon kan kvantifiseres ved ELISPOT, som er en metode som konvergerer enzym-koblet immunoabsorbance assay (ELISA) og Western blotting teknologi for å muliggjøre bestemmelse av de enkelte ASC ved enkeltcellenivå. I praksis har ELISPOT-analysen blitt stadig mer brukt for å evaluere vaksineeffektivitet på grunn av den enkle håndtering av et stort antall blodprøver. Fremgangsmåtene for isolering av humane B-celler fra perifert blod, vil differensiering av B-celler til ASCer in vitro, og anvendelse av ELISPOT for kvantifisering av total IgM- og IgG-ASCer bli beskrevet her.

PBMC ble tappet for RBC og adherente celler (trinn 1,2 til 1,7). En alikvot (2 x 10 6) av cellene ble utsatt for en strømningscytometrisk analyse for å illustrere de populasjoner av naive B-celler, minne-B-celler, og PBS / PC i perifert blod (figur 1). I denne donors PBMC, omtrent 10% av lymfocyttene var CD19 + B-celler. I B-celle rommet, hvor mange prosent av CD19 + CD27 - naive B-celler var rundt 50%. På den annen side, om...

Watch this Scientific Journal Video about The Isolation, Differentiation, and Quantification of Human Antibody-secreting B Cells from Blood: ELISpot as a Functional Readout of Humoral Immunity at JoVE

The Isolation, Differentiation, and Quantification of Human Antibody-secreting B Cells from Blood: ELISpot as a Functional Readout of Humoral Immunity

Human peripheral blood is commonly used for the assessment of the humoral immune response. Here, the methods for isolating human B cells from peripheral blood, differentiating human B cells into antibody (Ab)-secreting B cells (ASCs) in culture, and enumerating the total IgM- and IgG-ASCs via an ELISpot assay are described.

Den Isolation, Differensiering, og Kvantifisering av humane antistoff-sekresjon B-celler fra blod: ELISPOT som en funksjonell Avlesning av humoral immunitet

The hallmark of humoral immunity is to generate functional ASCs, which synthesize and secrete Abs specific to an antigen (Ag), such as a pathogen, and are ...

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Isolation of Mouse Peritoneal Cavity Cells

The peritoneal cavity is a membrane-bound and fluid-filled abdominal cavity of mammals, which contains the liver, spleen, most of the gastro-intestinal ...

Expansion, Purification, and Functional Assessment of Human Peripheral Blood NK Cells

Natural killer (NK) cells play an important role in immune surveillance against a variety of infectious microorganisms and tumors. Limited availability of ...

Introducing Shear Stress in the Study of Bacterial Adhesion

During bacterial infections a sequence of interactions occur between the pathogen and its host. Bacterial adhesion to the host cell surface is often the ...

Antigens Protected Functional Red Blood Cells By The Membrane Grafting Of Compact Hyperbranched Polyglycerols

Antigener Beskyttet Funksjonell røde blodceller av membranen Pode av kompakt hyperforgrenede Polyglycerols

Red blood cell (RBC) transfusion is vital for the treatment of a number of acute and chronic medical problems such as thalassemia major and sickle cell ...

Isolation of Precursor B-cell Subsets from Umbilical Cord Blood

Isolering av forløper B-celle undergrupper fra navlestrengsblod

Umbilical cord blood is highly enriched for hematopoietic progenitor cells at different lineage commitment stages. We have developed a protocol for ...

Analyzing the Effects of Stromal Cells on the Recruitment of Leukocytes from Flow

Analysere effekten av stromalceller på rekruttering av leukocytter fra Flow

Stromal cells regulate the recruitment of circulating leukocytes during inflammation through cross-talk with neighboring endothelial cells. Here we ...

Isolation, Characterization and Functional Examination of the Gingival Immune Cell Network

Isolasjon, karakterisering og Funksjonell Undersøkelse av Gingival immun Cell Network

Immune cell networks in tissues play a vital role in mediating local immunity and maintaining tissue homeostasis, yet little is known of the resident ...

Dextran Enhances the Lentiviral Transduction Efficiency of Murine and Human Primary NK Cells

Dekstran forbedrer Lentiviral signaltransduksjon effektiviteten av Murine og menneskelig primære NK celler

The efficient transduction of specific genes into natural killer (NK) cells has been a major challenge. Successful transductions are critical to defining ...

Megakaryocyte Differentiation and Platelet Formation from Human Cord Blood-derived CD34+ Cells

Megakaryocyte Differentiation and Platelet Formation from Human Cord Blood-derived CD34+ Cells

Megakaryocyte differensiering og blodplater formasjon fra menneske ledningen blod-avledet CD34+ celler

Platelet production occurs principally in the bone marrow in a process known as thrombopoiesis. During thrombopoiesis, hematopoietic progenitor cells ...

Generation of Discriminative Human Monoclonal Antibodies from Rare Antigen-specific B Cells Circulating in Blood

Generasjon av Discriminative menneskelige monoklonale antistoffer fra sjeldne Antigen-spesifikke B celler i blodet

Monoclonal antibodies (mAbs) are powerful tools useful for both fundamental research and in biomedicine. Their high specificity is indispensable when the ...