Name: the isolation, differentiation, and quantification of human antibody-secreting b cells from blood: elispot as a functional readout of humoral immunity
Uploaded: 2016-12-14T12:30:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about The Isolation, Differentiation, and Quantification of Human Antibody-secreting B Cells from Blood: ELISpot as a Functional Readout of Humoral Immunity at JoVE

This study was supported by a research grant from the Ministry of Science and Technology of the Executive Yuan of Taiwan (NSC99-2320-B-002-011). I would like to acknowledge the excellent service provided by the Flow Cytometric Analyzing and Sorting Core of the First Core Laboratory in College of Medicine of National Taiwan University.

Humant perifert blod måste erhållas från friska donatorer enligt informerat samtycke, och användningen av blodprov måste överensstämma med de godkända riktlinjer som fastställts av enskilda institutionella prövningsnämnder. I denna studie, att protokollet använder människoblod i en demonstration av resultaten av flödescytometri (figur 1) och ELISPOT-analyser (Figur 3) godkändes av den inre Review Board of National Taiwan University Hospital (protokollnummer 201307019RINB). <p class="jove_...

Isolering och rening av humant perifert blod-B-celler Normalt kan RBC effektivt brista och godkänts av lysbuffert (steg 1,2). Det är viktigt att inte inkubera PBMC med RBC lysisbuffert längre än fem minuter, som cellviabilitet kan påverkas av ammoniumklorid. Alternativt kan RBC och trombocyter samtidigt avlägsnas genom följande protokoll. Blanda färskt helblod med syra-citrat-dextros (ACD) buffert (39 mM citronsyra, 75 mM natriumcitrat och 135 mM dextros; pH...

B-celler spelar en central roll i utvecklingen av humoral immunitet. De initialt utvecklas i benmärgen och in i blodomloppet som naiva B-celler, som kan vandra in i lymfvävnader såsom mjälte, lymfkörtlar och tonsiller, för vidareutveckling. Vid Ag möter några naiva B-celler migrerar till lymfoida folliklar, där germinal center B-celler kan differentiera till minnes-B-celler och plasmablasts (PBS) / plasmaceller (PC). Medan de flesta PBS / PC utträde in i blodomloppet, några så småningom uppehålla sig i benmärgen att genomgå terminal differentiering till långlivade datorer 1. B-celler i omlopp är heterogena, och vid steady state, PBS / datorer är sällsynta i perifert blod 2. Som ett resultat av tillgängligheten av härstamningsspecifika ytmarkörer, har flödescytometri blivit en populär metod för identifiering och karakterisering av de B-cellundergrupper i perifert blod. En utvidgad tillämpning av flödes cytometry är tillägget av en cellsorterare funktion, som medger separation och isolering av enskilda delmängder av B-celler med hög renhet. Baserat på expressionen av specifika ytreceptorer i olika utvecklingsstadier, mänskliga cirkulerande B-celler är i allmänhet klassificeras i tre huvudunderpopulationer: naiva B-celler (CD19 + CD27 - CD38 -), minnes-B-celler (CD19 + CD27 + CD38 -), och PBS / PC (CD19 + CD27 + CD38 +) 3-4 (Figur 1). Naiva B-celler av naturen har inte stött på AGS. De kan emellertid differentieras till IgM + CD27 + minnes-B-celler. Även naiva B-celler är homogena uttrycka B-cellsantigenreceptor (BCR) -associated molekyler (t.ex. CD19, CD20 och CD22) de är heterogena i deras immunoglobulin repertoar 5. Majoriteten av CD27 + minnes-B-celler kan differentieras till CD27+ / hi CD38 + PBS / PC 6. Dessutom minnes-B-celler och PBS / PC är polyklonala och uppvisar utvecklande och funktionell heterogenitet 4-7. PBS / datorer i omlopp är normalt kortlivade och inte uttrycka CD138, men de gjorde att slå sig ner i benmärgen kommer terminalt differentiera och bli långlivade. Terminalt differentierade datorer uttrycker CD138 och nedreglera CD27-molekyler på sina ytor 8. Eftersom både PBS och datorer är kapabla att utsöndra Abs, i många tillfällen de kollektivt betecknas som DSK. I motsats härtill kan varken naiva B-celler eller minnes-B-celler producerar avsevärda mängder Abs 9-10. Icke desto mindre, när den isoleras, både naiva och minnes-B-celler kan differentieras till ASCs i 3 - 10 dagar när de placeras i de riktiga odlingsbetingelser 6, 11-15. I själva verket, DSK: er som härrör från in vitro differentiering dela liknande yta uttryck för CD27 och CD38 med de direkt isolerade frOm perifert blod sex. Dessutom DSK: er differentierade in vitro uttrycker en låg nivå av ytan CD20, liknande den i cirkulerande PBS / PC 6. Även om odlingshärledda DSKer är alla kortlivade, kan de utsöndra Abs, vilket indikerar att de är funktionellt behörigt och kan bidra till den humorala immuniteten. Både ELISA och ELISpot är överlägset de mest tillämpade metoder som man kan få funktionell information om det humorala immunsvaret. ELISA är en 96-brunnars platta-baserad analys, och det används ofta för att mäta de titrar av serum-Ag-specifik Abs och andra analyter (t.ex. cytokiner). Det är bekvämt och skalbar. ELISA används för att använda en fast fas enzymanalys för att detektera närvaron av Abs eller andra ämnen, såsom serum, i ett vätskeprov 16. De avläsning från serum ELISA har använts i stor utsträckning för att representera immunsvaret i kroppen. Ett verktyg som krävs för förvärv av readouts från ELISA-analyser är en spektrofotometrisk mikroplattläsare. Läsaren kan bestämma den optiska densiteten (OD) av slutprodukterna typiskt resulterar från reaktionen av pepparrotsperoxidas (HRP) -konjugerad detekterings Abs och deras specifika substrat 17. När det gäller att rapportera det humorala immunsvaret, serum Ab nivåer bestäms av ELISA beteckna det kollektiva, men inte individuella, prestanda DSK: er i kroppen. Dessutom ELISA låter att ta hänsyn till den deltagande av minnes-B-celler, vilka inte utsöndrar Abs. Liksom ELISA, är ELISpot en allmänt använd metod för att detektera och övervaka immunsvar i perifera blodprov 17-18. ELISpot är en teknik relaterad till en sandwich-ELISA. I den, är celler placeras i polyvinylidendifluorid (PVDF) membranstödda brunnar av 96-brunnars mikroplattor för en kortsiktig odling. ELISPOT-analysen är analogt med att utföra western blotting på en mikro och developing fläckarna på PVDF-membranet i varje brunn. krävs ett automatiserat ELISpot läsarsystem eller en stereo för manuell räkning. Den största fördelen med ELISpot vid detektering av ett immunsvar är dess utmärkt känslighet vid kvantifieringen av ASC: er och cytokin-utsöndrande celler. Det rapporterar deras funktionella aktiviteter i humoral och cellulär immunitet, respektive. Vid mätningen av humorala immunförsvar, är serum Ab halter som uppmätts med ELISA och antalet ASC: er räknas upp ELISpot ofta korrelerade, men data avläsning från dessa två analyser har vissa skillnader i funktionella konsekvenser 19-20. Den största fördelen med ELISpot är dess känslighet metod. Nivån av serum Ab-titrar som rapporterats av ELISA presenteras halv kvantitativt som OD avläsningar, som betecknar den relativa Ab nivå, eller mer kvantitativt, eftersom koncentrations avläsning när en känd mängd av rätt isotyperna av Abs ingår som referens. I kontrast, resultaten av ELISpot är presented som det absoluta antalet ASC: er i en cell pool av intresse (t.ex., ofraktionerade perifera mononukleära blodceller (PBMC) och renade B-celler från PBMC). ELISpot kan upptäcka en enda ASC, men ELISA kräver AB uppgår från DSK att nå optimerade analysberoende koncentrationer före mätningen. Därför är ELISpot naturligtvis överlägsen ELISA i känslighet för kvantifiering. Dessutom är ELISpot också lämplig för att kvantifiera de differentierade DSK in vitro från aktiverade minnes-B-celler. Minnes-B-celler inte utsöndrar Abs men kan differentiera till DSKer vid aktivering; De har därför inget bidrag till serum Abs detekteras med ELISA. Således är ELISpot den metod som i mätningen av immunsvaret av cirkulerande minnes B-celler efter aktivering i odling. Det möjliggör övervakning av underhåll på lång sikt humoral immunitet.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>BD Vacutainer K2E</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>367525</td>
			<td>10 ml tube</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ficoll-Paque Plus</td>
			<td>GE Healthcare</td>
			<td>17-1440-02</td>
			<td>endotoxin-free</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypan blue 0.5% solution</td>
			<td>Biological Industries</td>
			<td>03-102-1B</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>IMag Human B lymphocyte enrichment set</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>558007</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Biotinylated CD27 mAb</td>
			<td>Biolegend</td>
			<td>302804</td>
			<td>clone O323</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Streptavidin magnetic microbeads</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>9000810</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>15 ml Falcon tubes</td>
			<td>BD Falcon</td>
			<td>352196</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Blue nylon mesh cell strainer, 40 &#956;m</td>
			<td>BD Falcon</td>
			<td>352340</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-human CD19-APC</td>
			<td>Biolegend</td>
			<td>302212</td>
			<td>clone HIB19</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-human CD27-eFluor 450</td>
			<td>eBioscience</td>
			<td>48-0279-42</td>
			<td>clone O323</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-human CD38-PE-Cy7</td>
			<td>Biolegend</td>
			<td>303516</td>
			<td>clone HIT2&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-human CD38-PE-Cy7</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>560677</td>
			<td>clone HIT2&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-human CD45-FITC</td>
			<td>Biolegend</td>
			<td>304006</td>
			<td>clone HI30</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-human CD45-FITC</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>555482</td>
			<td>clone HI30</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-mouse/rat/human CD27-PerCP Cy5.5</td>
			<td>Biolegend</td>
			<td>124213</td>
			<td>clone LG.3A10</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-human CD27-PerCP Cy5.5</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>65429</td>
			<td>clone L128</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-human CD19-FITC</td>
			<td>Miltenyi Biotec</td>
			<td>130-098-064</td>
			<td>clone LT19</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-human CD19-FITC</td>
			<td>GeneTex</td>
			<td>GTX75599</td>
			<td>clone LT19</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-human CD20-FITC</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>555622</td>
			<td>clone 2H7</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>biotinylated anti-human CD27</td>
			<td>Biolegend</td>
			<td>302804</td>
			<td>clone O323</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>biotinylated anti-human CD27</td>
			<td>eBioscience</td>
			<td>13-0279-80</td>
			<td>clone O323</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>7-aminoactinomycin D (7-AAD)</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>559925</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CpG (ODN 2006)&#160;</td>
			<td>InvivoGen</td>
			<td>tlrl-2006</td>
			<td>type B CpG</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Recombinant human IL-2</td>
			<td>PeproTech</td>
			<td>200-02</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Recombinant human IL-10</td>
			<td>PeproTech</td>
			<td>200-10</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Recombinant human IL-21</td>
			<td>PeproTech</td>
			<td>200-21</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Recombinant human sCD40L</td>
			<td>PeproTech</td>
			<td>310-02</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Protein A of S. aureus Cowan (SAC)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>82526</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pokeweed mitogen (PWM)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>L9379</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MultiScreen filter plates, 0.45 &#181;m pore size</td>
			<td>Merck Millipore</td>
			<td>MSIPS4510</td>
			<td>sterile, clear 96-well filter plate with hydrophobic PVDF membrane</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BCIP/NBT solution</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>B6404</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BCIP/NBT single reagent, alkaline phosphatase substrate</td>
			<td>Merck Millipore</td>
			<td>ES006</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Human IgG</td>
			<td>Jackson ImmunoResearch</td>
			<td>009-000-003</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Human IgG, Fc fragment</td>
			<td>Jackson ImmunoResearch</td>
			<td>009-000-008</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>F(ab&#39;)2 fragment of goat anti-human Ig (IgG+IgM+IgA)</td>
			<td>Jackson ImmunoResearch</td>
			<td>109-006-127</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Goat anti-human IgG-alkaline phosphatase, Fc&#947; fragment specific</td>
			<td>Jackson ImmunoResearch</td>
			<td>109-055-008</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Goat anti-human IgM-alkaline phosphatase, Fc&#181; fragment specific</td>
			<td>Jackson ImmunoResearch</td>
			<td>109-055-095</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Goat anti-human IgG-peroxidase, Fc&#947; fragment specific</td>
			<td>Jackson ImmunoResearch</td>
			<td>109-035-008</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Goat anti-human IgM-peroxidase, Fc&#181; fragment specific</td>
			<td>Jackson ImmunoResearch</td>
			<td>109-035-095</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BD ELISPOT AEC substrate kit</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>551951</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>C.T.L. ImmunoSpot analyzer</td>
			<td>C.T.L.</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

the isolation, differentiation, and quantification of human antibody-secreting b cells from blood: elispot as a functional readout of humoral immunity

Det kännetecknande för humoral immunitet är att generera funktionella DSKer som syntetiserar och utsöndrar Abs specifik för ett antigen (Ag), såsom en patogen, och som används för värdförsvar. För kvantitativ bestämning av den funktionella statusen av det humorala immunsvaret hos en individ, både serum Abs och cirkulerande DSKer vanligen mätt som funktionella avläsningar. Hos människa är perifert blod den mest praktiska och lättillgänglig prov som kan användas för bestämning av det humorala immunsvaret som framkallas av värd B-celler. Distinkta B-cellundergrupper, inklusive DSKer, kan isoleras direkt från perifert blod via selektion med härstamningsspecifika Ab-konjugerade mikropärlor eller via cellsortering med flödescytometri. Dessutom kan renade naiva och minnes-B-celler aktiveras och differentieras till DSK: er i odling. De funktionella aktiviteter DSK att bidra till Ab sekre kan kvantifieras genom ELISpot, vilket är en analys som konvergerar enzym-kopplad immunoabsorbance analys (ELISA) och Western blotting-teknik för att möjliggöra räkning av enskilda ASC: er vid enkelcellnivån. I praktiken har det ELISpot-analysen blivit allt vanligare att utvärdera vaccinets effektivitet på grund av den lätthet vid hantering av ett stort antal blodprov. Metoderna för att isolera humana B-celler från perifert blod, kommer differentieringen av B-celler i DSK: er in vitro och anställning av ELISpot för kvantifiering av totala IgM- och IgG-DSKer beskrivas här.

PBMC tömdes av RBC och vidhäftande celler (steg från 1,2 till 1,7). En alikvot (2 x 10 6) av cellerna utsattes för en flödescytometrisk analys för att illustrera de populationer av naiva B-celler, minnes-B-celler och PBS / datorer i perifert blod (figur 1). I detta givarens PBMC, var cirka 10% av lymfocyterna CD19 + B-celler. I B-cellavdelningen, den procentuella andelen CD19 + CD27 - naiva B-celler var cirka 50%. Å andr...

Watch this Scientific Journal Video about The Isolation, Differentiation, and Quantification of Human Antibody-secreting B Cells from Blood: ELISpot as a Functional Readout of Humoral Immunity at JoVE

The Isolation, Differentiation, and Quantification of Human Antibody-secreting B Cells from Blood: ELISpot as a Functional Readout of Humoral Immunity

Human peripheral blood is commonly used for the assessment of the humoral immune response. Here, the methods for isolating human B cells from peripheral blood, differentiating human B cells into antibody (Ab)-secreting B cells (ASCs) in culture, and enumerating the total IgM- and IgG-ASCs via an ELISpot assay are described.

Isoleringen, differentiering och kvantifiering av human antikropp-utsöndrande B-celler från blod: ELISpot som en funktionell Avläsning av humoral immunitet

The hallmark of humoral immunity is to generate functional ASCs, which synthesize and secrete Abs specific to an antigen (Ag), such as a pathogen, and are ...

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Isolation of Mouse Peritoneal Cavity Cells

Isolering av Mouse bukhålan celler

The peritoneal cavity is a membrane-bound and fluid-filled abdominal cavity of mammals, which contains the liver, spleen, most of the gastro-intestinal ...

Expansion, Purification, and Functional Assessment of Human Peripheral Blood NK Cells

Expansion, rening och Functional Assesment of Human Peripheral Blood NK-celler

Natural killer (NK) cells play an important role in immune surveillance against a variety of infectious microorganisms and tumors. Limited availability of ...

Introducing Shear Stress in the Study of Bacterial Adhesion

Introduktion Shear stress i studien av bakteriell vidhäftning

During bacterial infections a sequence of interactions occur between the pathogen and its host. Bacterial adhesion to the host cell surface is often the ...

Antigens Protected Functional Red Blood Cells By The Membrane Grafting Of Compact Hyperbranched Polyglycerols

Antigener skyddade funktionella röda blodkroppar av membranet Ympning av kompakt Hyperförgrenade Polyglyceroler

Red blood cell (RBC) transfusion is vital for the treatment of a number of acute and chronic medical problems such as thalassemia major and sickle cell ...

Isolation of Precursor B-cell Subsets from Umbilical Cord Blood

Isolering av prekursor B-cell-underuppsättningar från navelsträngsblod

Umbilical cord blood is highly enriched for hematopoietic progenitor cells at different lineage commitment stages. We have developed a protocol for ...

Analyzing the Effects of Stromal Cells on the Recruitment of Leukocytes from Flow

Analysera effekterna av stromaceller celler på rekrytering av leukocyter från Flow

Stromal cells regulate the recruitment of circulating leukocytes during inflammation through cross-talk with neighboring endothelial cells. Here we ...

Isolation, Characterization and Functional Examination of the Gingival Immune Cell Network

Isolering, karakterisering och funktionella Undersökning av tandkötts Immune Cell Network

Immune cell networks in tissues play a vital role in mediating local immunity and maintaining tissue homeostasis, yet little is known of the resident ...

Dextran Enhances the Lentiviral Transduction Efficiency of Murine and Human Primary NK Cells

Dextran effektiviserar Lentiviral transduktion murina och mänskliga primära NK-celler

The efficient transduction of specific genes into natural killer (NK) cells has been a major challenge. Successful transductions are critical to defining ...

Megakaryocyte Differentiation and Platelet Formation from Human Cord Blood-derived CD34+ Cells

Megakaryocyte Differentiation and Platelet Formation from Human Cord Blood-derived CD34+ Cells

Megakaryocyt differentiering och trombocytantal Formation från mänskliga sladd blod-derived CD34+ celler

Platelet production occurs principally in the bone marrow in a process known as thrombopoiesis. During thrombopoiesis, hematopoietic progenitor cells ...

Generation of Discriminative Human Monoclonal Antibodies from Rare Antigen-specific B Cells Circulating in Blood

Generation av diskriminerande humana monoklonala antikroppar från sällsynta Antigen-specifika B-celler som cirkulerar i blodet

Monoclonal antibodies (mAbs) are powerful tools useful for both fundamental research and in biomedicine. Their high specificity is indispensable when the ...