Name: bacterial inner-membrane display for screening a library of antibody fragments
Uploaded: 2016-10-15T15:00:00
Duration: 12 min 28 s
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We thank Tomer Zohar for work on scFv screening and characterization assays. A portion of this work was supported by award number F32CA150622 from the National Cancer Institute (to AJK). The content is solely the responsibility of the authors and does not necessarily represent the official views of the National Cancer Institute or the National Institutes of Health.

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L., D&#252;bel, S., B&#246;ldicke, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Specific+in+vivo+knockdown+of+protein+function+by+intrabodies.">Specific in vivo knockdown of protein function by intrabodies.</a> MAbs. 7 (6), 1010-1035 (2015).</li></ol>

The authors declare that they have no competing financial interests.

Ingeniería de anticuerpos para la actividad citoplasmática es una tarea difícil debido al medio reductor del citoplasma, lo que impide la formación de enlaces disulfuro estabilizador 6,7. Esto hace que la mayoría de los anticuerpos para ser citoplásmicamente inactiva a no ser que se han diseñado para la estabilidad y la solubilidad en el citoplasma, además de estar diseñado para la afinidad de unión. Los métodos existentes de presentación de fagos, presentación de superficie bacteriana, y métodos de presentación en superficie de levadura todo el uso de la vía secretora 14-16 para la visualización de anticuerpos manipulados, pero estos métodos no tienen medios para diseñar plegado intracelular. Los anticuerpos manipulados utilizando la pantalla-membrana interna han mejorado la estabilidad y la solubilidad citoplásmica debido a que el control de calidad de plegado de la vía Tat evita la translocación de anticuerpos que están mal plegadas e inestables en el citoplasma. Este método simplifica el proceso iterativo de anticuerpos intracelulares de ingeniería para la afinidad de unand solubilidad, ya que las dos propiedades están diseñados en un solo paso. Aunque este método fue diseñado para la ingeniería de anticuerpos con una solubilidad en el entorno intracelular reductor, también se podría aplicar a los anticuerpos de ingeniería para funcionar en condiciones no reductoras, ya que las proteínas por ingeniería genética usando este método mantienen su plegado en el ambiente oxidante del periplasma. Aunque esta técnica simplifica el proceso de ingeniería de anticuerpos con alta afinidad y alta solubilidad citoplasmática, varias limitaciones son importantes a considerar cuando se utiliza este protocolo. Al analizar las señales de ELISA pantalla secundaria para identificar variantes de scFv prometedor, el umbral para discernir entre variantes potencialmente interesantes y los que no pueden exhibir adecuada de unión al antígeno no es probable que sea evidente hasta después de varios clones se han caracterizado más. Es importante buscar unión mejorada sobre el anticuerpo parental; sin embargo,una señal anormalmente alta podría ser indicativo de avidez 29 o los efectos de agregación 30, un reto que no es única para el enfoque de detección de visualización de la membrana interior. Una limitación clave a recordar cuando se utiliza este protocolo es la incapacidad para recuperar esferoplastos después del encuadre, ya que son inviables (datos no publicados). Esto requiere las etapas de amplificación de ADN y de transformación para recuperar los plásmidos que codifican el anticuerpo. Varios pasos críticos del protocolo permiten la ingeniería simultánea de plegado y unión de los anticuerpos. Para el cribado para tener éxito, la biblioteca de scFv se proyectará debe expresarse como una fusión con el péptido señal ssTorA. Sin esta secuencia, los anticuerpos no serán dirigidos a la vía Tat y por lo tanto no se translocan al periplasma 19. Además, es imperativo que una etiqueta de epítopo C-terminal se fusiona a los anticuerpos para permitir la detección de los anticuerpos que se muestran en el binding ensayos. Claramente, la E. coli cepa utilizada para expresar los scFv además, debe tener la maquinaria vía Tat es necesario, pero esto es cierto de la E. comúnmente utilizado cepas de E. coli. Las modificaciones de este protocolo son posibles para mejorar su potencial para aislar anticuerpos con las características deseadas. Un paso panorámica de sustracción puede ser completado antes de la toma panorámica contra el antígeno diana para agotar la biblioteca de scFv de constituyentes no deseados. Los esferoplastos de la biblioteca se pueden incubar con perlas magnéticas recubiertas con BCCP solo o revestido con una proteína no deseada, y de los esferoplastos que se unen a las perlas pueden ser descartadas antes de cribado de los esferoplastos no unidos restantes para la unión a la diana deseada. Como se mencionó en los resultados representativos, un método para mejorar la afinidad de un scFv aislado es incluir un competidor soluble en la reacción de panning para competir con los scFv que se muestran en los esferoplastos. Debido a que el borrador solublesetitor es una proteína purificada, sin ADN se amplificó a partir de ella, de modo que sólo las secuencias de los scFv que se muestran en los esferoplastos se recuperarán en la reacción de PCR. Además, este método podría extenderse a la ingeniería de otros tipos de anticuerpos o a proteínas de unión que no son anticuerpos. E. pantalla del centro de la membrana coli es una potente plataforma de ingeniería anticuerpos con alta afinidad y altos niveles de solubilidad intracelular. Este método es particularmente adecuado para la ingeniería eficiente de anticuerpos diseñados para funcionar en el medio ambiente intracelular. Estos anticuerpos intracelulares que ya se están estudiando como agentes terapéuticos potenciales en varios campos, incluyendo las enfermedades neurodegenerativas, cáncer y las infecciones virales 31. Esta técnica permitirá un uso más generalizado de anticuerpos intracelulares como herramientas para la investigación y la medicina en estos campos y cualquier otro campo en el que se desea estudiar es un objetivo proteína in situ.

Anticuerpos capaces de doblar y funcionando en el entorno intracelular son herramientas prometedoras tanto para aplicaciones terapéuticas y de investigación. Tienen la capacidad de modular la actividad de la proteína mediante la unión a una proteína diana dentro de las células para evitar interacciones proteína-proteína, interrumpir las interacciones proteína-ácido nucleico, o impedir el acceso de sustrato a las enzimas 1-5. Aunque los anticuerpos tienen un gran potencial para aplicaciones intracelulares, ingeniería ellos para el plegamiento adecuado y la solubilidad en el medio ambiente intracelular, mientras que se mantiene la capacidad de unirse a un antígeno diana es un reto. El entorno citoplásmico reducir evita la formación de los enlaces disulfuro que normalmente se requieren para el plegado estable de anticuerpos de longitud completa y fragmentos de anticuerpos, incluyendo anticuerpo de cadena sencilla (scFv) anticuerpos 6,7. Una serie de enfoques de evolución dirigida se han empleado para diseñar anticuerpos con hafinidades IGH para encauzar antígenos 8-10. Estos enfoques utilizan comúnmente presentación de fagos, presentación de superficie de levadura, o presentación de superficie bacteriana para cribar grandes bibliotecas de anticuerpos 11-13. Estos métodos son de gran alcance y eficaz para la identificación de anticuerpos que se unen a objetivos, sin embargo, dependen de la vía secretora para el transporte de las proteínas que se mostrarán 14-16. La vía secretora transloca proteínas desplegadas desde el citoplasma reducción en el lumen del retículo endoplasmático en la levadura o en el periplasma en bacterias. Las proteínas se pliegan a continuación en condiciones oxidantes y se muestran en la superficie celular o empaquetados en partículas de fago para la detección de la afinidad de unión a 17,18. Como resultado, los anticuerpos aislados usando estas técnicas no necesariamente plegar bien en el citoplasma, y ​​la solubilidad intracelular a menudo deben ser diseñados por separado si se utilizan los anticuerpos en aplicaciones intracelulares. Mejorarla eficacia de los anticuerpos de ingeniería que están bien plegadas en el citoplasma, se informó anteriormente el éxito de MAD-TRAP (pantalla anclada a la membrana para el reconocimiento basado en Tat de proteínas que asocian), un método para el cribado de una biblioteca de anticuerpos scFv utilizando Escherichia coli inervación pantalla membrana 19. visualización del centro de la membrana bacteriana se basa en la vía de doble arginina translocación (Tat) para el transporte de los anticuerpos que se muestran, en contraste con otros métodos de visualización común que utilizan la vía secretora. La vía de Tat contiene un mecanismo de control de calidad que sólo permite, proteínas correctamente plegadas solubles para ser transportados de la E. citoplasma coli, a través de la membrana interna, y en el periplasma 20,21. Sustratos sobreexpresa Tat (es decir., Proteínas dirigidas a la vía de Tat con una fusión N-terminal con el péptido señal Tat ssTorA) que son bien doblado en el citoplasma forman una translocación de larga vida intermedio con el N-terminal in el citoplasma y el C-terminal en el periplasma 19. Esto permite la visualización de Tat sustratos correctamente plegadas, incluyendo fragmentos de anticuerpos, en la cara periplásmico de la E. membrana interna coli. Después de retirar la membrana externa mediante digestión enzimática para generar esferoplastos, los anticuerpos están expuestos al espacio extracelular (Figura 1). Esto permite Tat sustratos que se muestran en la membrana interna que se proyectarán por la unión a un objetivo específico. Es importante destacar que, el aprovechamiento de la vía de Tat para la visualización de la superficie celular asegura que sólo los anticuerpos de la biblioteca que son bien plegadas en el citoplasma serán interrogados por la unión, lo que permite la ingeniería simultánea de afinidad y plegado intracelular de unión. En este protocolo, se describe cómo mostrar una biblioteca de scFv en el E. membrana interna coli, Pan la biblioteca contra un antígeno diana, y llevar a cabo una pantalla secundaria para identificar los componentes más prometedores de la biblioteca. Mientras nos centramos<html> el protocolo de scFv, el método podría ser aplicado a la ingeniería de cualquier proteína cuya aplicación requiere de plegado y unión intracelular. <img alt="Figura 1" src="/files/ftp_upload/54583/54583fig1.jpg" /> Figura 1. Pantalla-Tat membrana interna. En E. coli, los anticuerpos scFv que se expresan como una fusión con la secuencia señal ssTorA y correctamente plegadas en el citoplasma son transportados a través de la membrana interna. Una translocación formas intermedias, donde los scFv están anclados en la membrana interna con el extremo N-terminal en el citoplasma y el C-terminal en el periplasma. El E. membrana externa coli se digiere enzimáticamente para formar esferoplastos, exponiendo de este modo los anticuerpos anclados al espacio extracelular y ponerlos a disposición para la detección mediante el uso de un anticuerpo que se une a la etiqueta epítopo fusionado C-terminal en el anticuerpo visualizada.carga / 54583 / 54583fig1large.jpg &quot;target =&quot; _ blank &quot;&gt; Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="1824">
	<tbody>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:627px;">scFv library</td>
			<td style="width:205px;">Varies</td>
			<td style="width:135px;">N/A</td>
			<td style="width:859px;">A suitable scFv library should be obtained from a commercial or academic source.</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">MC4100 E. coli cells</td>
			<td>Coli Genetic Stock Center</td>
			<td>6152</td>
			<td>Cells need to be chemically competent or electrocompetent, depending on the selected transformation method.</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Glycerol</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>BP229-4</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:627px;">Difco dehydrated culture media LB Broth, Miller (Luria-Bertani)</td>
			<td style="width:205px;">BD</td>
			<td style="width:135px;">244610</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:627px;">Chloramphenicol (Cm)</td>
			<td style="width:205px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:135px;">BP904-100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Sodium chloride (NaCl)</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>BP358-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Potassium chloride (KCl)</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>BP366-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="26">
			<td height="26" style="height:26px;">Sodium phosphate, dibasic (Na2HPO4)</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>BP332-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="26">
			<td height="26" style="height:26px;">Potassium phosphate, monobasic (KH2PO4)</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>BP362-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:627px;">Bovine serum albumin (BSA)</td>
			<td style="width:205px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:135px;">BP9706-100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Sucrose</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>BP220-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Tris base</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>BP1521</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA), 0.5 M</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>BP2482-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="26">
			<td height="26" style="height:26px;">Magnesium chloride (MgCl2)</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>BP214-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:627px;">Lysozyme</td>
			<td style="width:205px;">Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:135px;">L3790-10X1ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Vortex mixer</td>
			<td>VWR</td>
			<td>97043-564</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Bicine</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>BP2646100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:627px;">D-Biotin</td>
			<td style="width:205px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:135px;">BP232-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Isopropyl &#946;-D-1-thiogalactopyranoside</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>BP1755-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">BugBuster Master Mix (cell lysis detergent)</td>
			<td>EMD Millipore</td>
			<td>71456</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Vivaspin 2 MWCO, 3000 daltons</td>
			<td style="width:205px;">GE Healthcare Sciences</td>
			<td>28932240</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Target antigen</td>
			<td>Varies</td>
			<td>N/A</td>
			<td>Purified target antigen may be purchased or produced/purified.</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:627px;">Dynabeads MyOne Streptavidin T1</td>
			<td style="width:205px;">Invitrogen</td>
			<td style="width:135px;">65601</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:627px;">Dynamag-2 magnet</td>
			<td style="width:205px;">Invitrogen</td>
			<td style="width:135px;">12321D</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Tube rotator</td>
			<td>VWR</td>
			<td>13916-822</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:627px;">PCR primers</td>
			<td style="width:205px;">IDT</td>
			<td style="width:135px;">N/A</td>
			<td>Primer sequences are as described in the protocol.</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:627px;">10X T4 DNA ligase reaction buffer</td>
			<td style="width:205px;">New England BioLabs</td>
			<td style="width:135px;">B0202S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:627px;">T4 Polynucelotide kinase (PNK)</td>
			<td style="width:205px;">New England BioLabs</td>
			<td style="width:135px;">M0201S</td>
			<td>Make sure the T4 ligase buffer used in the primer phosphorylation reaction contains 1 mM ATP.&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:627px;">5X Phusion HF buffer pack</td>
			<td style="width:205px;">New England BioLabs</td>
			<td style="width:135px;">B0518S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:627px;">Deoxynucleotide (dNTP) solution mix, 10 mM each dNTP</td>
			<td style="width:205px;">New England BioLabs</td>
			<td style="width:135px;">N0447L</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:627px;">Phusion DNA polymerase</td>
			<td style="width:205px;">New England BioLabs</td>
			<td style="width:135px;">M0530S</td>
			<td>Other high-fidelity polymerases may be used as an alternative, but the annealing temperature in Table 3 must be adjusted.</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">C1000 Touch thermal cycler with dual 48/48 fast reaction module</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>185-1148</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Agarose</td>
			<td>Promega</td>
			<td>V3121</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:627px;">SYBR Safe DNA gel stain</td>
			<td style="width:205px;">Invitrogen</td>
			<td style="width:135px;">S33102</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Wizard SV gel and PCR clean-up system</td>
			<td>Promega</td>
			<td>A9281</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:627px;">T4 DNA ligase</td>
			<td style="width:205px;">New England BioLabs</td>
			<td style="width:135px;">M0202S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:627px;">Microdialysis membrane filter</td>
			<td style="width:205px;">EMD Millipore</td>
			<td style="width:135px;">VSWP04700</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Agar</td>
			<td>BD</td>
			<td>214030</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:627px;">96-well polystyrene round-bottom cell culture plates</td>
			<td style="width:205px;">VWR</td>
			<td style="width:135px;">10062-902</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:627px;">Costar general polystyrene assay plate lids</td>
			<td style="width:205px;">Corning</td>
			<td style="width:135px;">3931</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Microtitre plate shaker</td>
			<td style="width:205px;">VWR</td>
			<td>12620-926</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Costar 96 well EIA/RIA Easy Wash clear flat bottom polystyrene high bind microplate</td>
			<td style="width:205px;">Corning</td>
			<td style="width:135px;">3369</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:627px;">Bel-blotter polycarbonate 96-well replicating tool</td>
			<td style="width:205px;">Bel-Art Products</td>
			<td>378760002</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Instant nonfat dry milk</td>
			<td>Quality Biological</td>
			<td>A614-1000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Tween 20 (polysorbate 20)</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>BP337-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:627px;">PopCulture reagent (concentrated cell lysis detergent)</td>
			<td style="width:205px;">EMD Millipore</td>
			<td>71092-3</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:627px;">Monoclonal ANTI-FLAG M2-Peroxidase(HRP) antibody produced in mouse</td>
			<td style="width:205px;">Sigma Aldrich</td>
			<td>A8592</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:627px;">SigmaFast OPD</td>
			<td style="width:205px;">Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:135px;">P9187-50SET</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="26">
			<td height="26" style="height:26px;">Sulfuric acid (H2SO4), 10N solution</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>SA200-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Reynolds Wrap aluminum foil</td>
			<td>VWR</td>
			<td>89079-075</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">BioTek Epoch microplate spectrophotometer</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>11120570</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

bacterial inner-membrane display for screening a library of antibody fragments

Antibodies engineered for intracellular function must not only have affinity for their target antigen, but must also be soluble and correctly folded in the cytoplasm. Commonly used methods for the display and screening of recombinant antibody libraries do not incorporate intracellular protein folding quality control, and, thus, the antigen-binding capability and cytoplasmic folding and solubility of antibodies engineered using these methods often must be engineered separately. Here, we describe a protocol to screen a recombinant library of single-chain variable fragment (scFv) antibodies for antigen-binding and proper cytoplasmic folding simultaneously. The method harnesses the intrinsic intracellular folding quality control mechanism of the Escherichia coli twin-arginine translocation (Tat) pathway to display an scFv library on the E. coli inner membrane. The Tat pathway ensures that only soluble, well-folded proteins are transported out of the cytoplasm and displayed on the inner membrane, thereby eliminating poorly folded scFvs prior to interrogation for antigen-binding. Following removal of the outer membrane, the scFvs displayed on the inner membrane are panned against a target antigen immobilized on magnetic beads to isolate scFvs that bind to the target antigen. An enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA)-based secondary screen is used to identify the most promising scFvs for additional characterization. Antigen-binding and cytoplasmic solubility can be improved with subsequent rounds of mutagenesis and screening to engineer antibodies with high affinity and high cytoplasmic solubility for intracellular applications.

El plegamiento de la proteína mecanismo de control de calidad intracelular de la vía de Tat en E. coli limita el transporte a través de la membrana interna de la célula a las proteínas que son bien plegadas en el ambiente citoplasmático de reducción. Por la sobreexpresión de una fusión de un scFv a la secuencia señal ssTorA (la secuencia señal de la proteína de TORA, que es, naturalmente, transportado por la vía de Tat 20), la translocación está estancado, lo que resulta en la pantalla de los scFv en la membrana interna 19. Después de la interrupción enzimática de la membrana externa, los anticuerpos que se muestran se hacen disponibles para el cribado para la actividad de unión al antígeno. La capacidad de tomar ventaja de la vía de Tat para la visualización de scFv se demostró por Karlsson et al. 19 (Figura 6). Los anticuerpos scFv y scFv13 scFv13.R4 se fusionaron a ya sea la secuencia de ssTorA nativo o un ssTorA modificada que carece de la par de residuos de arginina-arginina reconocido porla vía de Tat. scFv13.R4 fue diseñado por Martineau et al. de scFv13 a través de cuatro rondas de evolución dirigida y es conocido para plegar bien en el citoplasma 9. Este scFv se muestra en la membrana interna, pero sólo cuando se expresa como una fusión con la secuencia señal nativa ssTorA (Figura 6). Por el contrario, scFv13 no está bien doblada citoplásmicamente 9, por lo que no se muestra bien en la membrana interna, independientemente de la secuencia señal a la que se fusiona. Además, si los scFv se expresaron en células que carecían de la proteína tatC, un componente vital de la maquinaria Tat 20,28, no se observó la pantalla, mostrando la importancia del vínculo entre la pantalla del centro de la membrana y la vía Tat. Estos resultados demuestran que sólo las proteínas que contienen el péptido señal Tat y que se pliegan correctamente en el citoplasma se muestran en la membrana interna, que permite el transporte a través de la vía de Tat para funcionar como una pantalla para fol intracelulartimbre. <img alt="Figura 6" src="/files/ftp_upload/54583/54583fig6.jpg" /> Figura 6. Detección de scFv que se muestran en la membrana interna. La citometría de flujo se realizó un análisis para detectar la pantalla de mal plegada scFv13 y bien plegada scFv13.R4 en la membrana interna. scFv se fusionaron a ssTorA nativo o ssTorA (KK), donde el par Arg-Arg en la secuencia ssTorA se modificó para Lys-Lys. Las etiquetas de epítopo FLAG C-terminal de los scFv se detectaron con un isotiocianato de fluoresceína (FITC) conjugado con anticuerpo anti-FLAG. Las células sin la proteína tatC (ΔtatC) y ssTorA-scFv13 sin la etiqueta FLAG se probaron como controles. M indica el valor mediana de la fluorescencia. Reproducido de la referencia 19 con permiso. <a href="http://www.jove.com/files/ftp_upload/54583/54583fig6large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a> <p class="jove_content" fo: keep-together.within-page = &quot;1&quot;&gt; pantalla interna de la membrana puede aislar con éxito anticuerpos scFv con altos niveles de afinidad para una proteína diana y los altos niveles de solubilidad citoplasmática. Además, las siguientes rondas de evolución dirigida utilizando visualización membrana interna mejoran las características de anticuerpos 19. Para demostrar esto, una biblioteca de PCR propensa a error sobre la base de scFv13, que tiene un bajo nivel de afinidad de unión para β-galactosidasa, se panorámica contra el antígeno diana β-galactosidasa utilizando la pantalla y paneo método descrito en el protocolo. scFv 1-4 fue aislado después de una ronda de mutagénesis y la panorámica, y exhibió mayor afinidad de unión a beta-galactosidasa de scFv13 (Figura 7A) y un mayor nivel de solubilidad citoplásmica (Figura 7B). Una nueva biblioteca, basado en scFv 1-4, se hizo usando PCR propensa a error, y la panorámica de esta biblioteca de segunda generación contraβ-galactosidasa se realizó utilizando una modificación del protocolo descrito. El paneo contra la β-galactosidasa para la segunda ronda de la evolución se llevó a cabo en presencia de purificado, scFv soluble 14 como un competidor para mejorar la probabilidad de aislar clones con mayor afinidad que scFv 1-4. Después de esta segunda ronda de mutagénesis y la panorámica, scFv y scFv 2-1 2-3 se aislaron utilizando la selección secundaria basados ​​en ELISA. Estos scFv no sólo exhiben mayor afinidad de unión para la β-galactosidasa de scFv13, pero también mostraron una mejor unión de la primera ronda del clon de scFv 1-4. scFv 2-1 exhibió β-galactosidasa de unión comparable a la de scFv13.R4 (Figura 7A). scFv 2-3 también muestra un aumento adicional de la solubilidad citoplásmica en comparación con scFv 14, destacando la ingeniería simultánea de solubilidad y de unión al antígeno. Desde afinidad y la expresión soluble de los scFv son examinados para detectar simultáneamente, es posible que un scFv seleccionado ha modsolubilidad eRate pero de alta versa vinculante o vicio. Por ejemplo, scFv 2-1 tiene soluble expresión más baja que scFv 2-3, pero exhibe una mayor afinidad de unión a la ß-galactosidasa. <img alt="Figura 7" src="/files/ftp_upload/54583/54583fig7.jpg" /> Figura 7. Objetivo de unión y la expresión citoplasmática de scFv variantes aislado utilizando la pantalla del centro de la membrana. ScFv (A) se expresaron en el citoplasma de E. células de E. coli (por ejemplo., sin la secuencia señal ssTorA) con una hexahistidina tag (6 x His) y se purificó usando ácido spin-columnas de níquel-nitrilotriacético. La unión de los scFv purificados a ß-galactosidasa se midió con un ELISA. scFv purificados se cargaron en placas de ELISA de β-galactosidasa-revestido, y se detectaron los scFv unidos con un anticuerpo anti-6 x His. Los datos son un promedio de seis réplicas, y la barra de error muestra el error estándar de la media.(B) Las fracciones soluble e insoluble de los lisados celulares de células que expresan los scFv citoplásmicamente fueron analizados por una transferencia Western sondada con un anticuerpo anti-6 x His. La concentración total de proteína se utilizó para normalizar la carga de las muestras. Reproducido (A) y adaptado (B) de la referencia 19 con permiso. <a href="http://www.jove.com/files/ftp_upload/54583/54583fig7large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>

Watch this Scientific Journal Video about Bacterial Inner-membrane Display for Screening a Library of Antibody Fragments at JoVE.com

Bacterial Inner-membrane Display for Screening a Library of Antibody Fragments

We provide a method to simultaneously screen a library of antibody fragments for binding affinity and cytoplasmic solubility by using the Escherichia coli twin-arginine translocation pathway, which has an inherent quality control mechanism for intracellular protein folding, to display the antibody fragments on the inner membrane.

Visualización interior de la membrana bacteriana para la selección de una biblioteca de fragmentos de anticuerpos

Antibodies engineered for intracellular function must not only have affinity for their target antigen, but must also be soluble and correctly folded in ...

Research

JoVE Journal

Biochemistry

Laboratory Scale Production and Purification of a Therapeutic Antibody

Laboratorio de producción a gran escala y purificación de un anticuerpo terapéutico

Ensuring the successful production of a therapeutic antibody begins early on in the development process. The first stage is vector expression of the ...

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Bioquímica

Analysis of Histone Antibody Specificity with Peptide Microarrays

Análisis de especificidad de anticuerpos histona con microarrays peptídicos

Post-translational modifications (PTMs) on histone proteins are widely studied for their roles in regulating chromatin structure and gene expression. The ...

Semi-automated Biopanning of Bacterial Display Libraries for Peptide Affinity Reagent Discovery and Analysis of Resulting Isolates

Biopanning semi-automatizado de bibliotecas de exhibición bacteriana péptido afinidad reactivo descubrimiento y análisis de los aislamientos que

Biopanning bacterial display libraries is a proven technique for peptide affinity reagent discovery for recognition of both biotic and abiotic targets. ...

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