Name: rapid analysis of circadian phenotypes in arabidopsis protoplasts transfected with a luminescent clock reporter
Uploaded: 2016-09-17T15:00:00
Duration: 7 min 42 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Rapid Analysis of Circadian Phenotypes in Arabidopsis Protoplasts Transfected with a Luminescent Clock Reporter at JoVE.com

We would like to thank Prof. David Somers and Dr. Jeongsik Kim for the luciferase reporter plasmid and initial method development. Prof. Karen Halliday kindly provided all the circadian mutant lines used in this study. This research was supported by Royal Society research grants RS120372 and RS140275. GvO is a Royal Society University Research Fellow (UF110173).

BEMÆRK: I denne protokol, er reagenser og mængder, der er beskrevet udtrykt pr Arabidopsis linje, der er testet, og vil resultere i seks replikatbrønde for at genotype. Multiplicer materialerne med antallet af linjer, der skal analyseres, når der analyseres mere end én linje. I videoen, vil vildtype-Arabidopsis sammenlignes med døgnrytmen ur mutant linje ZTL (selvom repræsentative resultater fra flere rækker, vil blive leveret senere). <table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody><tr><td> enzymopløsning </td><td></td></tr><tr><td> Cellulase </td><td> 0,5% (vægt / volumen) </td></tr><tr><td> pectinase R10 </td><td> 0,25% (vægt / volumen) </td></tr><tr><td> D-mannitol </td><td> 400 mM </td></tr><tr><td> CaCl2 </td><td> 10 mM </td></tr><tr><td> KCI </td><td> 20 mM </td></tr><tr><td> Bovint serumalbumin </td><td> 0,1% (vægt / volumen) </td></tr><tr><td> MES, pH 5,7 </td><td> 20 mM </td></tr><tr><td></td><td></td></tr><tr><td> W5 løsning </td><td></td></tr><tr><td> NaCl </td><td> 150 mM </td></tr><tr><td> CaCl2 </td><td> 125 mM </td></tr><tr><td> KCI </td><td> 5 mM </td></tr><tr><td> MES, pH 5,7 </td><td> 2 mM </td></tr><tr><td> Glucose </td><td> 5 mM </td></tr><tr><td></td><td></td></tr><tr><td> MMG løsning </td><td></td></tr><tr><td> MES, pH 5,7 </td><td> 4 mM </td></tr><tr><td> D-mannitol </td><td> 400 mM </td></tr><tr><td> MgCl2 </td><td> 15 mM </td></tr><tr><td></td><td></td></tr><tr><td> PEG-opløsning </td><td></td></tr><tr><td> PEG4000 </td><td> 40% (vægt / volumen) </td></tr><tr><td> D-mannitol </td><td> 200 mM </td></tr><tr><td> CaCl2 </td&gt; <td> 100 mM </td></tr><tr><td></td><td></td></tr><tr><td> Imaging løsning </td><td></td></tr><tr><td> W5 løsning </td><td> til slutvolumen </td></tr><tr><td> Kalvefosterserum </td><td> 5% (v / v) </td></tr><tr><td> luciferin </td><td> 1.2 mM </td></tr><tr><td> Ampicillin </td><td> 50 mg / ml </td></tr></tbody></table> Tabel 1: Liste over løsninger. 1. Forberedelse af materialer og buffere <ol><li> plantematerialer <ol><li> Hold Arabidopsis Col -0 frø i vand i et 1,5 ml rør ved 4 ° C i mørke i fire dage. Pipettere frøene på jord i en gryde og overførsel til lange dag betingelser (16 timers lys 8 timers mørke) ved 21 ° C i 7 dage. Efterlad et låg på gryden for de første tre dage for at sikre høj luftfugtighed. Transplant seks kimplanter til en ny 8 cm x 13 cm x 5 cm potte og fortsætte med at vokse planterne under de samme betingelser for anothER 21 dage. Sørg for, at jorden er fugtig hele. </li></ol></li><li> reporterplasmid <ol><li> Oprense CCA1pro: LUC-reporterplasmid 19 fra bakteriekultur på forhånd ved hjælp af et DNA isolation kit ifølge producentens instruktioner. BEMÆRK: 20 ug reporterplasmid er påkrævet (10 pi ved 2 pg / pl i dH2O) for en transfektion. </li></ol></li><li> Løsninger BEMÆRK: For denne protokol er brug for fem løsninger: Enzym løsning, Wash 5 (W5) løsning, Mannitol-Magnesium (MMG) løsning, polyethylenglycol (PEG) løsning, og billedbehandling løsning (tabel 1). Forbered disse inden du fortsætter til protoplast isolation trin. <ol><li> Forbered 10 ml enzymopløsning som pr tabel 1, tilsætte enzymerne sidste, og filter sterilisere opløsningen gennem et 0,22 um sprøjtefilter. </li><li> Forbered de resterende løsninger i følgende mængder: 15 ml W5 løsning, 10 ml MMG solution, 1 ml PEG-opløsning og 1,5 ml imaging opløsning som pr tabel 1. BEMÆRK: Det er vigtigt, at PEG-opløsning fremstilles ikke mindre end en time før transfektion at sikre, at PEG fuldt er opløst. Filtersteriliser den billeddannende opløsning gennem et 0,22 um sprøjtefilter. </li></ol></li></ol><img alt="figur 1" src="/files/ftp_upload/54586/54586fig1.jpg" /> Figur 1:. Protoplastisolering Bladene af voksne Arabidopsis planter (A) er fastgjort på autoklave bånd med det nedre epidermal lag opad (B). (C) Magic tape forsigtigt presses på det nedre epidermislag med spidsen af en 15 ml konisk rør. (D) Det magiske bånd tages for at blotlægge mesofylceller (E). (F) Strimler af autoklave tape med orlovs bundet, flød på enzymopløsning indeholdende cellulase og pectinase, frigiver protoplaster i opløsningen. (G) Bladet skeletter forbliver på autoklave bånd efter enzymfordøjelse og bortkastes, hvorefter protoplasterne i enzymopløsning (H). (I) Endelige resulterende mesophyll protoplaster (Scale bar = 50 um). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/54586/54586fig1large.jpg" target="_blank">Klik her for at se en større version af dette tal.</a> 2. protoplastisolering <ol><li> Mærke et petriskål, og der tilsættes 10 ml filtersteriliseret Enzyme opløsning. </li><li> Fix fire strimler af autoklave tape med den klæbende side op på en ren lab overflade, og markere størrelsen af ​​petriskålen på strimlerne. </li><li> Skær blade af 4 uger gamle planter (figur 1a), og tryk den øverste epidermis på autoklaven tape (dvs. det nedre epidermal opad ( <strong&gt; Figur 1b)). </li><li> Tryk forsigtigt strimler af magi tape på den nedre epidermale overflade ved hjælp af en 15 ml konisk rør. Pas på ikke at knuse bladet væv (figur 1c). Træk forsigtigt magiske tape off at fratage de lavere epidermis (figur 1d) og udsætte mesofylceller (figur 1e). </li><li> Skær autoklaven tape til at passe petriskålen, betjene pincet til at flytte bånd i petriskål og flyde på enzymopløsningen (figur 1f), blade vender nedad. Rotere med 60 rpm på en platform-ryster i 60 minutter, hvorunder protoplasterne vil blive frigivet i opløsningen. </li><li> Brug en pincet til at fjerne og kassere de strimler af autoklave tape (figur 1 g), og pipette opløsningen indeholdende protoplasterne (Figur 1h) i en 50 ml konisk rør. Brug en stor indvendig diameter pipettespids (såsom en P5000 spids eller et P1000 spids med enden afskåret). </li><li> Centrifugeres protoplasterne ved 100 xg i 3 minutter ved 4 ° C og fjern supernatanten med en pipette. Pas, da pillen er meget løs. </li><li> Tilsæt 10 ml W5 løsning protoplasterne og resuspender ved forsigtigt at hvirvle glasset. </li><li> Rest protoplasterne på is i 30-60 min. Under dette trin vurdere udbyttet ved at tælle protoplaster i et hæmocytometer (Figur 1i). </li><li> Indsamle protoplasterne ved centrifugering ved 100 x g i 3 minutter ved 4 ° C og fjern supernatanten med en pipette. Pas, da pillen er meget løs. </li><li> Resuspender protoplasterne til en koncentration på 5 x 10 5 protoplaster / ml i MMG opløsning. </li></ol> 3. Protoplast Transfektion <ol><li> Tilsæt 10 pi reporterplasmid (2 pg / pl) til en 15 ml konisk rør. </li><li> Tilføj 400 ul protoplaster til røret. </li><li> Tilsæt en volumen (410 pi) PEG-opløsning og blandes ved at vende røret forsigtigt 12 gange til at transficere protoplasterne. </li><li> Efter 8-15 min incubation ved stuetemperatur, fortynd protoplast-DNA-PEG-blandingen med fire volumener (1640 pi) W5 opløsning og blandes ved at vende forsigtigt seks gange. </li><li> Indsamle de transficerede protoplaster ved centrifugering ved 100 xg i 2 min ved stuetemperatur og fjern supernatanten med en pipette. Igen, passe, da pelleten er meget løs. </li><li> Resuspender protoplasterne i 1.250 pi imaging løsning. </li><li> Alikvote 200 pi i seks replikere brønde i en plade med 96 brønde, udfylde eventuelle tomme brønde med W5-opløsning, og forsegle pladen med et klæbemiddel klart låg egnet til luminescerende billeddannelse. </li></ol> 4. Imaging <ol><li> Overfør pladen til enhver luminescerende imaging setup egnet til anlæg billeddannelse. Skift selvklæbende låg på pladerne 10-15 min efter overførsel for at undgå kondens og trykforskelle mellem brøndene, derefter starte billeddannelse. Aflæs pladen hver ~ 45 min (3 sek pr brønd) i fem dage ved stuetemperatur. BEMÆRK:hyppigheden af ​​pladen læser og læse tid per brønd kan variere afhængigt af imaging setup. </li></ol> 5. Data Analysis <ol><li> Analyser luminescens resultater ved hjælp af enhver analyse software (f.eks Biologisk rytmer Analysis Software System (BRASS) 22). Sammenlign mutant linje til kontrol vildtype at afsløre døgnrytmen defekter. </li></ol>

<ol>
	<li>Goodspeed, D., Chehab, E. W., Min-Venditti, A., Braam, J., Covington, M. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Arabidopsis+synchronizes+jasmonate-mediated+defense+with+insect+circadian+behavior.">Arabidopsis synchronizes jasmonate-mediated defense with insect circadian behavior.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 109 (12), 4674-4677 (2012).</li><li>Zhang, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Crosstalk+between+the+circadian+clock+and+innate+immunity+in+Arabidopsis.">Crosstalk between the circadian clock and innate immunity in Arabidopsis.</a> PLoS Pathog. 9 (6), 1003370 (2013).</li><li>Hevia, M. A., Canessa, P., M&#252;ller-Esparza, H., Larrondo, L. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+circadian+oscillator+in+the+fungus+Botrytis+cinerea+regulates+virulence+when+infecting+Arabidopsis+thaliana.">A circadian oscillator in the fungus Botrytis cinerea regulates virulence when infecting Arabidopsis thaliana.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 112 (28), 8744-8749 (2015).</li><li>Bhardwaj, V., Meier, S., Petersen, L. N., Ingle, R. A., Roden, L. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Defence+responses+of+Arabidopsis+thaliana+to+infection+by+Pseudomonas+syringae+are+regulated+by+the+circadian+clock.">Defence responses of Arabidopsis thaliana to infection by Pseudomonas syringae are regulated by the circadian clock.</a> PLoS One. 6 (10), 26968 (2011).</li><li>Graf, A., Schlereth, A., Stitt, M., Smith, A. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Circadian+control+of+carbohydrate+availability+for+growth+in+Arabidopsis+plants+at+night.">Circadian control of carbohydrate availability for growth in Arabidopsis plants at night.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. 107 (20), 9458-9463 (2010).</li><li>Dodd, A. N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Plant+circadian+clocks+increase+photosynthesis,+growth,+survival,+and+competitive+advantage.">Plant circadian clocks increase photosynthesis, growth, survival, and competitive advantage.</a> Science. 309 (5734), 630-633 (2005).</li><li>Covington, M. F., Maloof, J. N., Straume, M., Kay, S. A., Harmer, S. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Global+transcriptome+analysis+reveals+circadian+regulation+of+key+pathways+in+plant+growth+and+development.">Global transcriptome analysis reveals circadian regulation of key pathways in plant growth and development.</a> Genome Biol. 9 (8), 130 (2008).</li><li>Choudhary, M. K., Nomura, Y., Wang, L., Nakagami, H., Somers, D. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantitative+Circadian+Phosphoproteomic+Analysis+of+Arabidopsis+Reveals+Extensive+Clock+Control+of+Key+Components+in+Physiological,+Metabolic,+and+Signaling+Pathways.">Quantitative Circadian Phosphoproteomic Analysis of Arabidopsis Reveals Extensive Clock Control of Key Components in Physiological, Metabolic, and Signaling Pathways.</a> Mol. Cell. Proteomics. 14 (8), 2243-2260 (2015).</li><li>Mizoguchi, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=LHY+and+CCA1+Are+Partially+Redundant+Genes+Required+to+Maintain+Circadian+Rhythms+in+Arabidopsis.">LHY and CCA1 Are Partially Redundant Genes Required to Maintain Circadian Rhythms in Arabidopsis.</a> Dev. Cell. 2 (5), 629-641 (2002).</li><li>Kikis, E. A., Khanna, R., Quail, P. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=ELF4+is+a+phytochrome-regulated+component+of+a+negative-feedback+loop+involving+the+central+oscillator+components+CCA1+and+LHY.">ELF4 is a phytochrome-regulated component of a negative-feedback loop involving the central oscillator components CCA1 and LHY.</a> Plant J. 44 (2), 300-313 (2005).</li><li>Lu, S. X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CCA1+and+ELF3+Interact+in+the+Control+of+Hypocotyl+Length+and+Flowering+Time+in+Arabidopsis.">CCA1 and ELF3 Interact in the Control of Hypocotyl Length and Flowering Time in Arabidopsis.</a> Plant Physiol. 158 (2), 1079-1088 (2012).</li><li>Nakamichi, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=PSEUDO-RESPONSE+REGULATORS+9,+7,+and+5+are+transcriptional+repressors+in+the+Arabidopsis+circadian+clock.">PSEUDO-RESPONSE REGULATORS 9, 7, and 5 are transcriptional repressors in the Arabidopsis circadian clock.</a> Plant Cell. 22 (3), 594-605 (2010).</li><li>Dixon, L. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Temporal+repression+of+core+circadian+genes+is+mediated+through+EARLY+FLOWERING+3+in+Arabidopsis.">Temporal repression of core circadian genes is mediated through EARLY FLOWERING 3 in Arabidopsis.</a> Curr. Biol. 21 (2), 120-125 (2011).</li><li>Gendron, J. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Arabidopsis+circadian+clock+protein,+TOC1,+is+a+DNA-binding+transcription+factor.">Arabidopsis circadian clock protein, TOC1, is a DNA-binding transcription factor.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 109 (8), 3167-3172 (2012).</li><li>Hsu, P. Y., Harmer, S. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Wheels+within+wheels:+the+plant+circadian+system.">Wheels within wheels: the plant circadian system.</a> Trends Plant Sci. 1, 1-10 (2013).</li><li>Daniel, X., Sugano, S., Tobin, E. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CK2+phosphorylation+of+CCA1+is+necessary+for+its+circadian+oscillator+function+in+Arabidopsis.">CK2 phosphorylation of CCA1 is necessary for its circadian oscillator function in Arabidopsis.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 101 (9), 3292-3297 (2004).</li><li>Portol&#233;s, S., M&#225;s, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+functional+interplay+between+protein+kinase+CK2+and+CCA1+transcriptional+activity+is+essential+for+clock+temperature+compensation+in+Arabidopsis.">The functional interplay between protein kinase CK2 and CCA1 transcriptional activity is essential for clock temperature compensation in Arabidopsis.</a> PLoS Genet. 6 (11), e1001201 (2010).</li><li>Fujiwara, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Post-translational+regulation+of+the+Arabidopsis+circadian+clock+through+selective+proteolysis+and+phosphorylation+of+pseudo-response+regulator+proteins.">Post-translational regulation of the Arabidopsis circadian clock through selective proteolysis and phosphorylation of pseudo-response regulator proteins.</a> J. Biol. Chem. 283 (34), 23073-23083 (2008).</li><li>Kim, J., Somers, D. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rapid+assessment+of+gene+function+in+the+circadian+clock+using+artificial+microRNA+in+Arabidopsis+mesophyll+protoplasts.">Rapid assessment of gene function in the circadian clock using artificial microRNA in Arabidopsis mesophyll protoplasts.</a> Plant Physiol. 154 (2), 611-621 (2010).</li><li>Wu, F. -. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tape-Arabidopsis+Sandwich+-+a+simpler+Arabidopsis+protoplast+isolation+method.">Tape-Arabidopsis Sandwich - a simpler Arabidopsis protoplast isolation method.</a> Plant Methods. 5, 16 (2009).</li><li>Baldwin, T. O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Firefly+luciferase:+the+structure+is+known,+but+the+mystery+remains.">Firefly luciferase: the structure is known, but the mystery remains.</a> Structure. 4 (3), 223-228 (1996).</li><li>Edwards, K. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantitative+analysis+of+regulatory+flexibility+under+changing+environmental+conditions.">Quantitative analysis of regulatory flexibility under changing environmental conditions.</a> Mol. Syst. Biol. 6 (424), 424 (2010).</li><li>Somers, D. E., Schultz, T. F., Milnamow, M., Kay, S. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=ZEITLUPE+Encodes+a+Novel+Clock-Associated+PAS+Protein+from+Arabidopsis.">ZEITLUPE Encodes a Novel Clock-Associated PAS Protein from Arabidopsis.</a> Cell. 101 (3), 319-329 (2000).</li><li>Wang, Z. -. Y., Tobin, E. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Constitutive+Expression+of+the+CIRCADIAN+CLOCK+ASSOCIATED+1+(CCA1)+Gene+Disrupts+Circadian+Rhythms+and+Suppresses+Its+Own+Expression.">Constitutive Expression of the CIRCADIAN CLOCK ASSOCIATED 1 (CCA1) Gene Disrupts Circadian Rhythms and Suppresses Its Own Expression.</a> Cell. 93 (7), 1207-1217 (1998).</li><li>Kim, W. -. Y., Geng, R., Somers, D. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Circadian+phase-specific+degradation+of+the+F-box+protein+ZTL+is+mediated+by+the+proteasome.">Circadian phase-specific degradation of the F-box protein ZTL is mediated by the proteasome.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 100 (8), 4933-4938 (2003).</li><li>Zhai, Z., Jung, H. -. I., Vatamaniuk, O. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+of+protoplasts+from+tissues+of+14-day-old+seedlings+of+Arabidopsis+thaliana.">Isolation of protoplasts from tissues of 14-day-old seedlings of Arabidopsis thaliana.</a> J. Vis. Exp. , e15-e17 (2009).</li><li>Yoo, S. -. D., Cho, Y. -. H., Sheen, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Arabidopsis+mesophyll+protoplasts:+a+versatile+cell+system+for+transient+gene+expression+analysis.">Arabidopsis mesophyll protoplasts: a versatile cell system for transient gene expression analysis.</a> Nat. Protoc. 2 (7), 1565-1572 (2007).</li><li>Damm, B., Schmidt, R., Willmitzer, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Efficient+transformation+of+Arabidopsis+thaliana+using+direct+gene+transfer+to+protoplasts.">Efficient transformation of Arabidopsis thaliana using direct gene transfer to protoplasts.</a> Mol. Gen. Genet. 217 (1), 6-12 (1989).</li><li>Zhang, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+highly+efficient+rice+green+tissue+protoplast+system+for+transient+gene+expression+and+studying+light/chloroplast-related+processes.">A highly efficient rice green tissue protoplast system for transient gene expression and studying light/chloroplast-related processes.</a> Plant Methods. 7 (1), 30 (2011).</li></ol>

The authors have nothing to disclose.

Her præsenteres en hurtig analyse til screening cirkadiske periode defekter i Arabidopsis linjer, herunder protoplastisolering, transfektion, og luminecent billeddannelse. Den døgnrytmen periode i vildtype Arabidopsis og uret mutanter cca1 / LHY, ZTL, og CCA1 -OX blev beregnet ud fra målinger af luminescens fra en CCA1pro: LUC reporter og fundet at være i overensstemmelse med publicerede data fra hele planter ved hjælp af mere tids- forbrugende transgene metoder (tabel 2). Anvendelse af dette assay til at screene Arabidopsis-mutanter undgår det oprindelige krav om at generere transgene luminescerende linier, hvilket er tidskrævende og kan kun afsløre, at en bestemt mutant udviser vildtype rytmer. En klar fordel ved denne protokol er, at enhver Arabidopsis linje kan screenes på kort tid for ændrede døgnrytmen transkriptionelle rytmer, som vil hjælpe identifikationen af flere gener, der påvirker tidtagning i planter. <p class= &quot;Jove_content&quot;&gt; Isolering af protoplaster kan være besværlig, især hvis den mutante linie viser en væksthæmmede fænotype. Tidligere rapporterede metoder til at generere protoplaster involverer skæring blade og kimplanter i tynde strimler og vakuum infiltrerende strimlerne med enzymopløsning at tillade enzymerne at nå cellevæggene 26,27. Den efterfølgende spaltning kræver mindst 3 timers inkubation i mørke for at frigive protoplasterne i enzymopløsningen. Når vakuum infiltration ikke anvendes, er inkubationstiden op til 18 timer anbefales. I den protokol, der præsenteres her, vakuum infiltration er unødvendig, fordi det epidermale cellelag uigennemtrængelig for enzymerne fjernes ved tape. Ved generering protoplaster ved at skære plantemateriale er det nødvendigt at adskille protoplaster fra cellevæggen debris efter fordøjelse; Dette gøres typisk ved filtrering af opløsningen eller oprensning deraf på en sukker gradient 27,26. Her vil enhver ufordøjet væv forbliver på autoklaven båndet efterfordøjelse, så filtrering og sukker gradient oprensning af protoplasterne kan udelades. Der er en chance for, at stress som følge af langvarig protoplasting procedurer påvirker cellernes levedygtighed og døgnrytmen ur. Den tape-baseret protoplasting metode 20 visualiseret her giver et stort antal protoplaster; og i betragtning af levedygtigheden af celler over en døgnrytmen tidsserier og de ​​matchende periode længder af protoplaster og hele planter (tabel 2), er den metode, der er beskrevet her foretrækkes frem alternative metoder til at generere protoplaster. Det transfektion trin i protokollen er et afgørende skridt, at virkninger på levedygtighed protoplaster. PEG-opløsningen muliggør DNA&#39;et, der skal leveres ind i cellen, og begge inkubationstiden i denne opløsning (trin 3.4) og procentdelen af ​​PEG bør bestemmes empirisk. Den normale koncentration er 20%, med lavere koncentrationer reducerer transformeringen effektivitet og højerekoncentrationer reducerer levedygtighed 28. Inkubationstid så kort som fem minutter kunne give effektiv transfektion af protoplasterne 27. Protoplasterne kan afbildes på enhver luminescerende imaging platform. I denne video har vi anvendt en luminescens-pladelæser udstyret med udvendige lys (rød og blå lysdioder, 630 og 470 nm, ved en kombineret intensitet på ~ 20 uE), som giver mulighed for high-throughput screening og hyppige målinger. Andre imaging udstyr, der registrerer luminescens, såsom alternative plade læsere eller opsætninger baseret omkring en charge-coupled device (CCD) kamera, kunne anvendes lige så godt, så længe belysning er til rådighed for fotosyntese. Fordelen ved at anvende et CCD-kamera monteret på en kontrollerbar kabinet er, at lys og temperatur kan programmeres. En ulempe er den længere capture tid, indføre lange perioder med mørke, som kan forårsage stress til protoplasterne foruden forstyrreing endogene tidtagning. Uanset hvilken eksperimentel platform er valgt, justering af indstillinger sandsynligvis være nødvendig i forhold til indstillingerne for kimplanter eller modne planter. Det er vores erfaring, kan øge koncentrationen af ​​reporter plasmid under transfektion og / eller luciferin i imaging buffer løse eventuelle uregelmæssig eller hurtigt dæmpende rytmer, der måtte opstå i indledende forsøg. I fremtidige eksperimenter, kan den her beskrevne metode anvendes til at studere circadian fænotype af enhver mutant Arabidopsis linje. Med mindre modifikationer, kan effekten af fx forskellige lægemidler på tidtagning studeres i denne opsætning. Endvidere kan transfektion modificeres til at inkludere kunstige microRNA til gen-silencing 19, yderligere udvidelse alsidigheden af denne protokol. Protokoller til at generere ris protoplaster er veletableret 29 og den billeddannende protokol præsenteres her kunne også anvendes til at fremme vores understanding af uret i økonomisk vigtige enkimbladede afgrøder.

De fleste levende organismer besidder en endogen tidtager at hjælpe effektiv forhandling af daglige ændringer i miljøet. Denne tidtager, den døgnrytmen ur, regulerer mange aspekter af stofskiftet og fysiologi en organisme til at foregribe forudsigelige ændringer i det eksterne miljø. I planter f.eks foregribelse af tidsmæssigt forudsigelige patogen eller planteædende angreb reducerer stærkt samlet modtagelighed 1 - 4. Stivelse stofskifte er stramt reguleret af døgnrytmen ur at sikre, at reserverne stivelse sidste indtil daggry, om dyrket på lange eller korte dag betingelser 5. Faktisk, planter med døgnrytmen ure matcher de 24 timers miljø show øget vækstrater, kulstof fiksering satser og overlevelse satser i forhold til planter, der kører et ur af uoverensstemmende perioden 6.. Den omfattende indflydelse døgnrytmen i alle disse processer opstår i vid udstrækning fra den rytmiske regulering af op til en tredjedelaf den samlede transkriptom i Arabidopsis 7. Disse rytmiske genprodukter er involveret i en bred vifte af cellulære processer, herunder metaboliske veje, hormon-signalering, og stressreaktioner 7. Oven i det, er direkte døgnrytmen regulering af protein hjemlet ved døgnrytmen regulering af fosforylering 8 og sandsynligvis andre post-translationelle modifikationer (PTMS). I centrum af den døgnrytmen ur, der driver denne daglige transkriptionel omprogrammering ligger et netværk af transkriptionel / translationel feedback-sløjfer (TTFLs), herunder morgen-udtrykte gener døgnrytmen ur ASSOCIATED 1 (CCA1) og sent langstrakt hypokotyle (LHY), der undertrykker udtrykket af aftenens gener TIMING aF CAB 1 (TOC1), gigantea (GI) og medlemmerne af aftenen kompleks (EF) LUX ARRHYTHMO (LUX), tidligt blomstrende 3 (ELF3), og ELF4 9-11. sammen with pseudo responsregulatorprotein -genes (PRR3, 5, 7 og 9), TOC1 undertrykker CCA1 / LHY udtryk mens EF fungerer som en positiv regulator 12-14. Yderligere på feedback-mekanismer, post-transkriptionel og posttranslationel regulering af TTFL netværkskomponenter spiller en vigtig rolle i tuning døgnrytmen. Til dato den mest rigelige PTM identificeret på døgnrytmen ur proteiner er phosphorylering 15. Phosphorylering af CCA1 af Caseinkinase 2 (CK2) påvirker dets binding til at målrette initiativtagere 16 og er vigtig for temperaturkompensation af døgnrytmen ur 17. PRR proteiner fosforyleres forskelligt over døgnrytmen cyklus, og fosforylering af TOC1 påvirker interaktion med sin negative regulator, aftenen-faset ur komponent ZEITLUPE (ZTL) 18. Disse eksempler illustrerer, hvordan PTMS og protein-protein interaktioner tune TTFL netværket i en 24-timerstranskriptionel oscillator. For en mere detaljeret introduktion til transkriptionelle ur-netværket og dets regulering, fremragende seneste anmeldelser er tilgængelige (f.eks henvisning 15). Men hvad der er tilbage mindre klart er, i hvilket omfang rytmisk regulerede processer og andre aspekter af cellulær metabolisme foder tilbage til tidtagning mekanisme selv. Omfattende screening af Arabidopsis mutanter for ur defekter kunne vinde yderligere forståelse af hvilke mekanismer eller signalveje kan inddrages i dannelsen af ​​24 timers rytmer fra et TTFL netværk. Til dette formål, Kim og Somers tidligere offentliggjorte et gennembrud metode til effektiv og hurtig analyse af ur funktion i enhver Arabidopsis linje 19. Baseret på anvendelsen af ​​forbigående ekspression i protoplaster, denne metode overgår behovet for stabile transgene linjer eller sender til luminescerende ur markør linjer. Her vil vi visualisere en højtydende protoplast isolation metode 20 kombineret med en optimeret protokol til at screene cirkadiske defekter ved luminescerende billeddannelse af forbigående udtrykt ur markører i en 96-brønds plade-læser. Vi vil sammenligne vildtype samar- 0 Arabidopsis til velkarakteriserede ur mutanter for at bekræfte den metode, der er beskrevet her, held registrerer ændrede døgnrytme. Protoplaster afledt af disse linjer er transficeret med et reporter konstruktion, der udtrykker ildflueluciferase fra døgnrytmen CCA1 promotor, CCA1pro: LUC 19. Luciferase katalyserer flertrinsreaktion hvori luciferin omdannes til elektronisk exciteret oxyluciferin der udsender lys 21, som afbildes over tid at vurdere den periode, amplitude og fase af transkriptionelle rytmer i disse protoplaster. Protokollen består af tre hoveddele; isolering protoplasterne, transfektion protoplasterne med reporterplasmidet, og luminescerende imaldrende. Disse tre dele bør altid udføres på en enkelt dag, anvendes frisklavet buffere og reagenser. Plantevækst og oprensning af tilstrækkelige mængder af reporterplasmid bør udføres i forvejen og er ikke visualiseret i denne protokol.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>CELLULYSIN Cellulase, Trichoderma viride&#160;</td>
			<td>Merck Millipore</td>
			<td>219466</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pectinase R10</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>P2401</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>D-mannitol</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>M4125&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CaCl2</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>C4901</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>KCl</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>P3911</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bovine Serum Albumin</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>A4503</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MES</td>
			<td>Acros Organics</td>
			<td>327765000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaCl</td>
			<td>Acros Organics</td>
			<td>327300010</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glucose</td>
			<td>Fischer Scientific</td>
			<td>G/0500/60</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MgCl2</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>M2670</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Polyethylene glycol (PEG) 4000</td>
			<td>Acros Organics</td>
			<td>434630010</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal Bovine Serum&#160;</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>F4135</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>D-Luciferin, Firefly</td>
			<td>Biosynth AG</td>
			<td>L-8200</td>
			<td>Dissolve luciferin powder in 0.1M trisphosphate buffer pH 8.0 to a concentration of 50mM</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ampicillin</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>A9618</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Comply Steam Indicator Tape</td>
			<td>3M</td>
			<td>1222</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Magic Tape</td>
			<td>3M</td>
			<td>819-1460</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Petri Dishes</td>
			<td>Scientific Laboratory Supplies</td>
			<td>SLS2002</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microplate, 96 well, flat bottom, white</td>
			<td>Greiner Bio-One</td>
			<td>655075</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TopSeal-A, adhesive lids for 96-well plates</td>
			<td>Perkin Elmer</td>
			<td>6050195</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Syringe, 10 ml, w/o needle</td>
			<td>BD Plastipak</td>
			<td>302188</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Syringe filter 0.22 &#181;m</td>
			<td>Merck Millipore</td>
			<td>SLGP033RS</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Biological Rhythms Analysis Software System (BRASS)</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Free download at amillar.org</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>QIAfilter Maxiprep Kit</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>12262</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Modified Fuch-Rosenthal counting chamber, double cell</td>
			<td>Hawksley</td>
			<td>AC6000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bright field microscope</td>
			<td>Optika Microscopes</td>
			<td>B-150POL-B</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LB942 TriStar2 multimode reader, with luminescence module</td>
			<td>Berthold Technologies Ltd</td>
			<td>57947/57948</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

rapid analysis of circadian phenotypes in arabidopsis protoplasts transfected with a luminescent clock reporter

The plant circadian clock allows the anticipation of daily changes to the environment. This anticipation aids the responses to temporally predictable biotic and abiotic stress. Conversely, disruption of circadian timekeeping severely compromises plant health and reduces agricultural crop yields. It is therefore imperative that we understand the intricate regulation of circadian rhythms in plants, including the factors that affect motion of the transcriptional clockwork itself.
Testing circadian defects in the model plant Arabidopsis thaliana (Arabidopsis) traditionally involves crossing specific mutant lines to a line rhythmically expressing firefly luciferase from a circadian clock gene promoter. This approach is laborious, time-consuming, and could be fruitless if a mutant has no circadian phenotype. The methodology presented here allows a rapid initial assessment of circadian phenotypes. Protoplasts derived from mutant and wild-type Arabidopsis are isolated, transfected with a rhythmically expressed luminescent reporter, and imaged under constant light conditions for 5 days. Luminescent traces will directly reveal whether the free-running period of mutant plants is different from wild-type plants. The advantage of the method is that any Arabidopsis line can efficiently be screened, without the need for generating a stably transgenic luminescent clock marker line in that mutant background.

Protoplaster af vildtype Arabidopsis blev sammenlignet med de kendte ur mutanter cca1 / LHY (kort periode mutant 2), ZTL (lang periode mutant 23), og overekspression linje CCA1 -OX (arytmisk 24). Alle blev transient transficeret med CCA1pro: LUC reporter og afbildes i konstant lys på en pladelæser over 5 dage. Her viser vi, at i cca1 / LHY mutant, er den fritløbende periode med døgnrytmen-kontrollerede genekspression forkortet (figur 2a), i overensstemmelse med den offentliggjorte analyserede periode af stabil transgen ekspression af selvlysende ur markører 2,9. Perioden med cirkadiske oscillationer i protoplaster af ZTL mutanten er længere end i vildtype (Figur 2b), i overensstemmelse med tidligere offentliggjorte resultater fra kimplanter, cellesuspension cultures og protoplaster 19,23,25. Overekspression af CCA1 låser uret i morgen-fase og global transskription bliver arytmiske 24. Konsekvent, observerede vi ingen svingninger i CCA1pro: LUC udtryk i CCA1 -OX protoplaster (Figur 2c). <img alt="Figur 2" src="/files/ftp_upload/54586/54586fig2.jpg" /> Figur 2: protoplast døgnrytmen Protoplaster af kol- 0, cca1 / LHY, ZTL, og CCA1 -OX blev forbigående transformeret med CCA1pro: LUC konstruere og døgnrytmer i luminescens blev afbildet over 5 dage (A - C). (D) døgnrytmen periode skøn baseret på luminescens spor i Col -0, cca1 / LHY og ZTL (A - B). Migen ± SEM, n = 3-5, t-test p-værdi som angivet. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/54586/54586fig2large.jpg" target="_blank">Klik her for at se en større version af dette tal.</a> <table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody><tr><td> Genotype </td><td> Periode (protoplaster) </td><td> Periode (transgene) </td><td> Rapporteret af: </td><td> Referencer </td></tr><tr><td> kol- 0 </td><td> 23,0 ± 0,21 </td><td> 24,4 ± 0,09 </td><td> pCCA1: LUC i Col -0 </td><td> (2) </td></tr><tr><td> cca1 / LHY </td><td> 20,6 ± 0,13 </td><td> 19,9 ± 0,11 </td><td> pCCA1: LUC i Col -0 </td><td> (2) </td></tr><tr><td></td><td></td><td> ~ 18 </td><td> RNA i L is baggrund </td><td> (9) </td></tr><tr><td&gt; ZTL </td><td> 25,1 ± 0,12 </td><td> 27,4 ± 0,5 </td><td> CAB2: LUC i C24 økotype </td><td> (22) </td></tr><tr><td> CCA1 -OX </td><td> arytmisk </td><td> arytmisk </td><td> pCCA1: LUC (LD kun data) </td><td> (2) </td></tr><tr><td></td><td></td><td> arytmisk </td><td> RNA og protein i Col -0 baggrund </td><td> (23) </td></tr></tbody></table> Tabel 2: døgnrytmen i Protoplaster Sammenlignet med transgene stiklinger Den døgnrytmen periode pCCA1:. LUC udtryk i protoplaster sammenlignet med perioden længder først rapporteret for mutationen og, hvis tilgængelig, med pCCA1: LUC udtryk i Col -0.

Watch this Scientific Journal Video about Rapid Analysis of Circadian Phenotypes in Arabidopsis Protoplasts Transfected with a Luminescent Clock Reporter at JoVE.com

Rapid Analysis of Circadian Phenotypes in Arabidopsis Protoplasts Transfected with a Luminescent Clock Reporter

Circadian ur regulerer omkring en tredjedel af Arabidopsis transkriptomet, men andelen af ​​gener, der føres tilbage til tidtagning fortsat ukendt. Her visualisere vi en metode til hurtigt at vurdere cirkadiske fænotyper i nogen mutant linje af Arabidopsis hjælp luminescerende billeddannelse af en circadian reporter transient udtrykt i protoplaster.

Hurtig Analyse af døgnrytmen fænotyper i Arabidopsis Protoplaster transficeret med et Selvlysende Clock Reporter

The plant circadian clock allows the anticipation of daily changes to the environment. This anticipation aids the responses to temporally predictable ...

Research

JoVE Journal

Biology

Isolation of Protoplasts from Tissues of 14-day-old Seedlings of Arabidopsis thaliana

Isolation of Protoplasts from Tissues of 14-day-old Seedlings of Arabidopsis thaliana

Protoplasts are plant cells that have had their cell walls enzymatically removed. Isolation of protoplasts  from different plant tissues was first ...

Floral-dip Transformation of Arabidopsis thaliana to Examine pTSO2::&beta;-glucuronidase Reporter Gene Expression

Floral-dip Transformation of Arabidopsis thaliana to Examine pTSO2::ÃƒÅ½Ã‚Â²-glucuronidase Reporter Gene Expression

The ability to introduce foreign genes into an organism is the foundation for modern biology and biotechnology. In the model flowering plant Arabidopsis ...

RNAi Screening to Identify Postembryonic Phenotypes in C. elegans

RNAi Screening to Identify Postembryonic Phenotypes in C. elegans

RNAi screening for at identificere Postembryonic fænotyper i C. elegans</em

C. elegans has proven to be a valuable model system for the discovery and functional characterization of many genes and gene pathways1. More sophisticated ...

Monitoring Cell-autonomous Circadian Clock Rhythms of Gene Expression Using Luciferase Bioluminescence Reporters

Overvågning Cell-selvstændige døgnrytmen ur Rhythms of Gene Expression Brug Luciferase bioluminescens Reporters

In mammals, many aspects of behavior and physiology such as sleep-wake cycles and liver metabolism are regulated by endogenous circadian clocks ...

Rapid Genetic Analysis of Epithelial-Mesenchymal Signaling During Hair Regeneration

Hurtig genetisk analyse af Epithelial-mesenkyme Signaling Under Hair Regeneration

Hair follicle morphogenesis, a complex process requiring interaction between epithelia-derived keratinocytes and the underlying mesenchyme, is an ...

Design and Analysis of Temperature Preference Behavior and its Circadian Rhythm in Drosophila

Design and Analysis of Temperature Preference Behavior and its Circadian Rhythm in Drosophila

Design og analyse af temperaturpræferenceadfærd og dens døgnrytme i Drosophila

The circadian clock regulates many aspects of life, including sleep, locomotor activity, and body temperature (BTR) rhythms1,2. We recently identified a ...

Rapid and Efficient Zebrafish Genotyping Using PCR with High-resolution Melt Analysis

Hurtig og effektiv zebrafisk Genotypebestemmelse Brug PCR med høj opløsning Melt Analyse

Zebrafish is a powerful vertebrate model system for studying development, modeling disease, and performing drug screening. Recently a variety of genetic ...

Quantification of Orofacial Phenotypes in Xenopus

Quantification of Orofacial Phenotypes in Xenopus

Kvantificering af Orofacial fænotyper i<em&gt; Xenopus</em

Xenopus has become an important tool for dissecting the mechanisms governing craniofacial development and defects. A method to quantify orofacial ...

Transfecting RAW264.7 Cells with a Luciferase Reporter Gene

Transfektion RAW264.7 Celler med en luciferasereportergen

Transfection of desired genetic materials into cells is an inevitable procedure in biomedical research studies. While numerous methods have been ...

Clock Scan Protocol for Image Analysis: ImageJ Plugins

Clock Scan Protocol for Image Analysis: ImageJ plugins

The clock scan protocol for image analysis is an efficient tool to quantify the average pixel intensity within, at the border, and outside (background) a ...