Name: rapid analysis of circadian phenotypes in arabidopsis protoplasts transfected with a luminescent clock reporter
Uploaded: 2016-09-17T15:00:00
Duration: 7 min 42 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Rapid Analysis of Circadian Phenotypes in Arabidopsis Protoplasts Transfected with a Luminescent Clock Reporter at JoVE.com

We would like to thank Prof. David Somers and Dr. Jeongsik Kim for the luciferase reporter plasmid and initial method development. Prof. Karen Halliday kindly provided all the circadian mutant lines used in this study. This research was supported by Royal Society research grants RS120372 and RS140275. GvO is a Royal Society University Research Fellow (UF110173).

Merk: I denne protokollen blir reagenser og volumer som er beskrevet uttrykt pr Arabidopsis linje som testes, og vil resultere i seks replikate brønner for det genotype. Multipliser materialene med antall linjer som skal analyseres ved å analysere mer enn én linje. I videoen, vil villtype Arabidopsis sammenlignes med biologiske klokke mutant linje ZTL (selv om representative resultater fra andre linjer vil bli gitt senere). <table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody><tr><td> Enzyme løsning </td><td></td></tr><tr><td> cellulase </td><td> 0,5% (vekt / volum) </td></tr><tr><td> pektinasen R10 </td><td> 0,25% (w / v) </td></tr><tr><td> D-mannitol </td><td> 400 mm </td></tr><tr><td> CaCl2 </td><td> 10 mm </td></tr><tr><td> KCl </td><td> 20 mm </td></tr><tr><td> Bovine Serum Albumin </td><td> 0,1% (w / v) </td></tr><tr><td> MES, pH 5,7 </td><td> 20 mm </td></tr><tr><td></td><td></td></tr><tr><td> W5 løsning </td><td></td></tr><tr><td> NaCl </td><td> 150 mm </td></tr><tr><td> CaCl2 </td><td> 125 mm </td></tr><tr><td> KCl </td><td> 5 mm </td></tr><tr><td> MES, pH 5,7 </td><td> 2 mm </td></tr><tr><td> glukose </td><td> 5 mm </td></tr><tr><td></td><td></td></tr><tr><td> MMG løsning </td><td></td></tr><tr><td> MES, pH 5,7 </td><td> 4 mm </td></tr><tr><td> D-mannitol </td><td> 400 mm </td></tr><tr><td> MgCl2 </td><td> 15 mM </td></tr><tr><td></td><td></td></tr><tr><td> PEG-oppløsningen </td><td></td></tr><tr><td> PEG4000 </td><td> 40% (vekt / volum) </td></tr><tr><td> D-mannitol </td><td> 200 mm </td></tr><tr><td> CaCl2 </td&gt; <td> 100 mm </td></tr><tr><td></td><td></td></tr><tr><td> Imaging løsning </td><td></td></tr><tr><td> W5 løsning </td><td> til sluttvolum </td></tr><tr><td> Føtalt bovint serum </td><td> 5% (v / v) </td></tr><tr><td> luciferin </td><td> 1,2 mm </td></tr><tr><td> ampicillin </td><td> 50 mg / ml </td></tr></tbody></table> Tabell 1: Liste av løsninger. 1. Utarbeidelse av materialer og buffere <ol><li> plantematerialer <ol><li> Hold Arabidopsis Col -0 frø i vann i et 1,5 ml rør ved 4 ° C i mørke i fire dager. Pipetter frøene bort på jord i en pott og overføre til lange døgnet forhold (16 timer lys 8 timers mørke) ved 21 ° C i 7 dager. Legg igjen en lokk på potten for de tre første dagene for å sikre høy luftfuktighet. Transplant seks spirene til en ny 8 cm x 13 cm x 5 cm pot og fortsette å vokse planter under de samme betingelsene for another 21 dager. Pass på at jorden er fuktig hele. </li></ol></li><li> reporter Plasmid <ol><li> Rense CCA1pro: LUC reporter plasmid 19 fra bakteriekultur på forhånd, ved hjelp av en DNA kit i henhold til produsentens instruksjoner. MERK: 20 ug reporter plasmid er nødvendig (10 pl ved 2 ug / ul i dH 2 O) for en transfeksjon. </li></ol></li><li> Solutions MERK: For denne protokollen fem løsninger er nødvendig: Enzym løsning, Wash 5 (W5) løsning, Mannitol-Magnesium (MMG) løsning, polyetylenglykol (PEG) løsning, og tenkelig løsning (tabell 1). Forbered disse før du fortsetter til protoplasten isolasjon trinn. <ol><li> Fremstille 10 ml enzymoppløsning som angitt i tabell 1, å tilsette enzymene sist, og filter sterilisere løsningen gjennom et 0,22 um sprøytefilter. </li><li> Forbered de resterende løsninger innenfor følgende volumer: 15 ml W5 løsning, 10 ml MMG solution, 1 ml PEG-løsning og 1,5 ml tenkelig løsning som per tabell 1. Merk: Det er viktig at det PEG-oppløsning fremstilles som ikke er mindre enn en time før transfeksjon for å sikre at PEG er fullstendig oppløst. Filter sterilisere tenkelig løsning gjennom et 0,22 mikrometer sprøyte filter. </li></ol></li></ol><img alt="Figur 1" src="/files/ftp_upload/54586/54586fig1.jpg" /> Figur 1:. Protoplast isolasjon Bladene på voksne planter Arabidopsis (A) er festet på autoklav tape med den nedre epidermale lag vendt opp (B). (C) magiske båndet blir forsiktig trykket på den nedre epidermal laget med spissen av en 15 ml konisk rør. (D) The magic tape er fjernet for å eksponere de mesophyll celler (E). (F) Strimler av autoklav tape med permisjons festet floteres på enzymløsning inneholdende cellulase og pektinase, slippe protoplaster i løsningen. (G) Et blad skjeletter forblir på båndet etter autoklav enzymoppslutning og kastes og etterlater protoplastene i enzymløsning (H). (I) Endelig resultat mesophyll protoplaster (Scale bar = 50 mikrometer). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/54586/54586fig1large.jpg" target="_blank">Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.</a> 2. Protoplast Isolation <ol><li> Merk en petriskål og tilsett 10 ml filter-sterilisert Enzyme løsning. </li><li> Fix fire strimler av autoklav tape med den klebrige siden opp på en ren overflate lab, og markere størrelsen på petriskålen på strimlene. </li><li> Klipp bladene av 4-ukers gamle planter (Figur 1a), og trykk den øvre epidermis på autoklaven tape (dvs. den nedre epidermal siden opp ( <strong&gt; Figur 1b)). </li><li> Trykk forsiktig strimler av magi tape på nedre epidermal overflaten ved hjelp av en 15 ml konisk tube. Pass på å ikke knuse blad vev (Figur 1c). Trekk forsiktig magi tape av å strippe de lavere epidermis (figur 1d), og utsett mesophyll celler (figur 1e). </li><li> Skjær autoklaven båndet for å tilpasse petriskål, bruk pinsett for å bevege båndet inn i petriskålen og flyte på enzymløsning (figur 1f), blader vendt nedover. Roterer med 60 rpm på en plattform rister i 60 min, hvorunder protoplastene blir frigjort i oppløsningen. </li><li> Bruk pinsett til å fjerne og forkaste strimler av autoklav tape (figur 1 g) og pipetter løsningen inneholder protoplaster (figur 1 t) i en 50 ml konisk tube. Bruk en vid boring pipettespiss (for eksempel en P5000 spiss eller en P1000 spiss med enden avskåret). </li><li> Sentrifuger protoplaster på 100 xg i 3 minutter ved 4 ° C og fjern supernatanten med en pipette. Ta vare, som pellets er veldig løs. </li><li> Tilsett 10 ml W5 oppløsning til protoplastene og resuspender ved forsiktig virvlende røret. </li><li> Hvil protoplastene på is i 30-60 min. Under dette trinnet, vurdere utbyttet ved å telle protoplaster i en hemocytometer (figur 1i). </li><li> Samle protoplastene etter sentrifugering ved 100 x g i 3 minutter ved 4 ° C og fjern supernatanten med en pipette. Ta vare, som pellets er veldig løs. </li><li> Resuspender protoplastene til en konsentrasjon på 5 x 10 5 protoplaster / ml i MMG oppløsning. </li></ol> 3. Protoplast Transfeksjon <ol><li> Tilsett 10 ul reporter plasmid (2 ug / ul) i et 15 ml konisk rør. </li><li> Tilsett 400 ul protoplaster til røret. </li><li> Tilsett en volum (410 ul) PEG-løsning og bland ved å snu røret forsiktig 12 ganger for å transfektere de protoplaster. </li><li> Etter 8-15 min incubation ved værelsestemperatur, fortynnes den protoplast-DNA-PEG-blanding med fire volumer (1640 ul) W5 løsning og bland forsiktig ved å snu seks ganger. </li><li> Samle de transfekterte protoplastene etter sentrifugering ved 100 x g i 2 min ved romtemperatur og fjern supernatanten med en pipette. Igjen, ta vare, som pellets er veldig løs. </li><li> Resuspender protoplaster i 1250 mL tenkelig løsning. </li><li> Delmengde 200 ul til seks replikere brønner i en 96-brønns plate, fylle eventuelle tomme brønner med W5-oppløsning, og forsegle platen med et klebemiddel klar lokk egner seg for selvlysende avbildning. </li></ol> 4. Imaging <ol><li> Overføre platen til en hvilken som helst selvlysende avbildning oppsett egnet for plante avbildning. Endre limet lokkene på platene 10-15 min etter overføring for å unngå kondens og trykkforskjeller mellom brønnene, og deretter begynne bildebehandling. Avles platen hvert ~ 45 min (3-sek per brønn) i fem dager ved romtemperatur. MERK:Hyppigheten av plate leser og lese tid per brønn kan variere avhengig av bildeoppsettet. </li></ol> 5. Data Analysis <ol><li> Analyser luminescens resultatene ved hjelp av noen analyse programvare (for eksempel biologiske rytmer Analysis Software System (BRASS) 22). Sammenlign mutant linje til villtype kontroller for å avdekke biologiske defekter. </li></ol>

<ol>
	<li>Goodspeed, D., Chehab, E. W., Min-Venditti, A., Braam, J., Covington, M. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Arabidopsis+synchronizes+jasmonate-mediated+defense+with+insect+circadian+behavior.">Arabidopsis synchronizes jasmonate-mediated defense with insect circadian behavior.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 109 (12), 4674-4677 (2012).</li><li>Zhang, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Crosstalk+between+the+circadian+clock+and+innate+immunity+in+Arabidopsis.">Crosstalk between the circadian clock and innate immunity in Arabidopsis.</a> PLoS Pathog. 9 (6), 1003370 (2013).</li><li>Hevia, M. A., Canessa, P., M&#252;ller-Esparza, H., Larrondo, L. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+circadian+oscillator+in+the+fungus+Botrytis+cinerea+regulates+virulence+when+infecting+Arabidopsis+thaliana.">A circadian oscillator in the fungus Botrytis cinerea regulates virulence when infecting Arabidopsis thaliana.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 112 (28), 8744-8749 (2015).</li><li>Bhardwaj, V., Meier, S., Petersen, L. N., Ingle, R. A., Roden, L. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Defence+responses+of+Arabidopsis+thaliana+to+infection+by+Pseudomonas+syringae+are+regulated+by+the+circadian+clock.">Defence responses of Arabidopsis thaliana to infection by Pseudomonas syringae are regulated by the circadian clock.</a> PLoS One. 6 (10), 26968 (2011).</li><li>Graf, A., Schlereth, A., Stitt, M., Smith, A. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Circadian+control+of+carbohydrate+availability+for+growth+in+Arabidopsis+plants+at+night.">Circadian control of carbohydrate availability for growth in Arabidopsis plants at night.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. 107 (20), 9458-9463 (2010).</li><li>Dodd, A. N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Plant+circadian+clocks+increase+photosynthesis,+growth,+survival,+and+competitive+advantage.">Plant circadian clocks increase photosynthesis, growth, survival, and competitive advantage.</a> Science. 309 (5734), 630-633 (2005).</li><li>Covington, M. F., Maloof, J. N., Straume, M., Kay, S. A., Harmer, S. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Global+transcriptome+analysis+reveals+circadian+regulation+of+key+pathways+in+plant+growth+and+development.">Global transcriptome analysis reveals circadian regulation of key pathways in plant growth and development.</a> Genome Biol. 9 (8), 130 (2008).</li><li>Choudhary, M. K., Nomura, Y., Wang, L., Nakagami, H., Somers, D. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantitative+Circadian+Phosphoproteomic+Analysis+of+Arabidopsis+Reveals+Extensive+Clock+Control+of+Key+Components+in+Physiological,+Metabolic,+and+Signaling+Pathways.">Quantitative Circadian Phosphoproteomic Analysis of Arabidopsis Reveals Extensive Clock Control of Key Components in Physiological, Metabolic, and Signaling Pathways.</a> Mol. Cell. Proteomics. 14 (8), 2243-2260 (2015).</li><li>Mizoguchi, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=LHY+and+CCA1+Are+Partially+Redundant+Genes+Required+to+Maintain+Circadian+Rhythms+in+Arabidopsis.">LHY and CCA1 Are Partially Redundant Genes Required to Maintain Circadian Rhythms in Arabidopsis.</a> Dev. Cell. 2 (5), 629-641 (2002).</li><li>Kikis, E. A., Khanna, R., Quail, P. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=ELF4+is+a+phytochrome-regulated+component+of+a+negative-feedback+loop+involving+the+central+oscillator+components+CCA1+and+LHY.">ELF4 is a phytochrome-regulated component of a negative-feedback loop involving the central oscillator components CCA1 and LHY.</a> Plant J. 44 (2), 300-313 (2005).</li><li>Lu, S. X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CCA1+and+ELF3+Interact+in+the+Control+of+Hypocotyl+Length+and+Flowering+Time+in+Arabidopsis.">CCA1 and ELF3 Interact in the Control of Hypocotyl Length and Flowering Time in Arabidopsis.</a> Plant Physiol. 158 (2), 1079-1088 (2012).</li><li>Nakamichi, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=PSEUDO-RESPONSE+REGULATORS+9,+7,+and+5+are+transcriptional+repressors+in+the+Arabidopsis+circadian+clock.">PSEUDO-RESPONSE REGULATORS 9, 7, and 5 are transcriptional repressors in the Arabidopsis circadian clock.</a> Plant Cell. 22 (3), 594-605 (2010).</li><li>Dixon, L. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Temporal+repression+of+core+circadian+genes+is+mediated+through+EARLY+FLOWERING+3+in+Arabidopsis.">Temporal repression of core circadian genes is mediated through EARLY FLOWERING 3 in Arabidopsis.</a> Curr. Biol. 21 (2), 120-125 (2011).</li><li>Gendron, J. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Arabidopsis+circadian+clock+protein,+TOC1,+is+a+DNA-binding+transcription+factor.">Arabidopsis circadian clock protein, TOC1, is a DNA-binding transcription factor.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 109 (8), 3167-3172 (2012).</li><li>Hsu, P. Y., Harmer, S. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Wheels+within+wheels:+the+plant+circadian+system.">Wheels within wheels: the plant circadian system.</a> Trends Plant Sci. 1, 1-10 (2013).</li><li>Daniel, X., Sugano, S., Tobin, E. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CK2+phosphorylation+of+CCA1+is+necessary+for+its+circadian+oscillator+function+in+Arabidopsis.">CK2 phosphorylation of CCA1 is necessary for its circadian oscillator function in Arabidopsis.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 101 (9), 3292-3297 (2004).</li><li>Portol&#233;s, S., M&#225;s, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+functional+interplay+between+protein+kinase+CK2+and+CCA1+transcriptional+activity+is+essential+for+clock+temperature+compensation+in+Arabidopsis.">The functional interplay between protein kinase CK2 and CCA1 transcriptional activity is essential for clock temperature compensation in Arabidopsis.</a> PLoS Genet. 6 (11), e1001201 (2010).</li><li>Fujiwara, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Post-translational+regulation+of+the+Arabidopsis+circadian+clock+through+selective+proteolysis+and+phosphorylation+of+pseudo-response+regulator+proteins.">Post-translational regulation of the Arabidopsis circadian clock through selective proteolysis and phosphorylation of pseudo-response regulator proteins.</a> J. Biol. Chem. 283 (34), 23073-23083 (2008).</li><li>Kim, J., Somers, D. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rapid+assessment+of+gene+function+in+the+circadian+clock+using+artificial+microRNA+in+Arabidopsis+mesophyll+protoplasts.">Rapid assessment of gene function in the circadian clock using artificial microRNA in Arabidopsis mesophyll protoplasts.</a> Plant Physiol. 154 (2), 611-621 (2010).</li><li>Wu, F. -. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tape-Arabidopsis+Sandwich+-+a+simpler+Arabidopsis+protoplast+isolation+method.">Tape-Arabidopsis Sandwich - a simpler Arabidopsis protoplast isolation method.</a> Plant Methods. 5, 16 (2009).</li><li>Baldwin, T. O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Firefly+luciferase:+the+structure+is+known,+but+the+mystery+remains.">Firefly luciferase: the structure is known, but the mystery remains.</a> Structure. 4 (3), 223-228 (1996).</li><li>Edwards, K. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantitative+analysis+of+regulatory+flexibility+under+changing+environmental+conditions.">Quantitative analysis of regulatory flexibility under changing environmental conditions.</a> Mol. Syst. Biol. 6 (424), 424 (2010).</li><li>Somers, D. E., Schultz, T. F., Milnamow, M., Kay, S. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=ZEITLUPE+Encodes+a+Novel+Clock-Associated+PAS+Protein+from+Arabidopsis.">ZEITLUPE Encodes a Novel Clock-Associated PAS Protein from Arabidopsis.</a> Cell. 101 (3), 319-329 (2000).</li><li>Wang, Z. -. Y., Tobin, E. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Constitutive+Expression+of+the+CIRCADIAN+CLOCK+ASSOCIATED+1+(CCA1)+Gene+Disrupts+Circadian+Rhythms+and+Suppresses+Its+Own+Expression.">Constitutive Expression of the CIRCADIAN CLOCK ASSOCIATED 1 (CCA1) Gene Disrupts Circadian Rhythms and Suppresses Its Own Expression.</a> Cell. 93 (7), 1207-1217 (1998).</li><li>Kim, W. -. Y., Geng, R., Somers, D. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Circadian+phase-specific+degradation+of+the+F-box+protein+ZTL+is+mediated+by+the+proteasome.">Circadian phase-specific degradation of the F-box protein ZTL is mediated by the proteasome.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 100 (8), 4933-4938 (2003).</li><li>Zhai, Z., Jung, H. -. I., Vatamaniuk, O. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+of+protoplasts+from+tissues+of+14-day-old+seedlings+of+Arabidopsis+thaliana.">Isolation of protoplasts from tissues of 14-day-old seedlings of Arabidopsis thaliana.</a> J. Vis. Exp. , e15-e17 (2009).</li><li>Yoo, S. -. D., Cho, Y. -. H., Sheen, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Arabidopsis+mesophyll+protoplasts:+a+versatile+cell+system+for+transient+gene+expression+analysis.">Arabidopsis mesophyll protoplasts: a versatile cell system for transient gene expression analysis.</a> Nat. Protoc. 2 (7), 1565-1572 (2007).</li><li>Damm, B., Schmidt, R., Willmitzer, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Efficient+transformation+of+Arabidopsis+thaliana+using+direct+gene+transfer+to+protoplasts.">Efficient transformation of Arabidopsis thaliana using direct gene transfer to protoplasts.</a> Mol. Gen. Genet. 217 (1), 6-12 (1989).</li><li>Zhang, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+highly+efficient+rice+green+tissue+protoplast+system+for+transient+gene+expression+and+studying+light/chloroplast-related+processes.">A highly efficient rice green tissue protoplast system for transient gene expression and studying light/chloroplast-related processes.</a> Plant Methods. 7 (1), 30 (2011).</li></ol>

The authors have nothing to disclose.

Her presenterer vi en rask analyse for å screene circadian periode defekter i Arabidopsis linjer, inkludert protoplast isolasjon, transfeksjon, og luminecent bildebehandling. Circadian periode i villtype Arabidopsis og klokken mutanter cca1 / lhy, ZTL, og CCA1 -OX ble beregnet ut fra målinger av luminescens fra en CCA1pro: LUC reporter og funnet å være i samsvar med publiserte data generert fra hele planter som bruker mer tid- forbruker transgene tilnærminger (tabell 2). Ved hjelp av denne analysen for å screene Arabidopsis mutanter unngår den innledende krav for å generere transgene selvlysende linjer, noe som er tidkrevende og kan bare viser at en spesiell mutant viser villtype-rytmer. En klar fordel med denne protokollen er at enhver Arabidopsis linje kan bli vist i løpet av kort tid etter endrede circadian transkripsjons rytmer, som vil hjelpe identifisering av flere gener som påvirker tidtaking i planter. <p class= &quot;Jove_content&quot;&gt; Isolering av protoplaster kan være arbeidskrevende, spesielt hvis mutant Linjen viser et overskygget fenotype. Tidligere rapporterte fremgangsmåter for generering av protoplaster innebære skjæreblader eller stiklinger i tynne strimler og vakuum-infiltrering av strimler med enzymløsning for å tillate enzymer for å oppnå celleveggene 26,27. Den påfølgende spaltning krever minst 3 timers inkubering i mørket for å frigjøre protoplastene til enzym-oppløsningen. Når vakuum infiltrasjon ikke er brukt, er inkubasjonstiden opp til 18 timer anbefales. I den protokoll som presenteres her, er vakuum-infiltrering unødvendig fordi det epidermal cellelaget ugjennomtrengelig for enzymene blir fjernet ved tape. Ved generering av protoplaster ved å skjære plantemateriale er det nødvendig å skille protoplaster fra celleveggavfall etter fordøyelse; Dette blir vanligvis gjort ved å filtrere oppløsningen eller rense det på en sukker gradient 27,26. Her vil en hvilken som helst ufordøyd vev forblir på autoklaven båndet etterfordøyelse, så filtrering og sukker gradient rensing av protoplastene kan utelates. Det er en sjanse for at stress som følge av langvarig protoplasting prosedyrer påvirker celle levedyktighet og den biologiske klokke. Båndet baserte protoplasting metode 20 visualisert her gir et høyt antall protoplaster; og gitt levedyktigheten av celler i løpet av en cirkadisk tidsserie og de ​​samsvarende perioden lengdene av protoplaster og hele planter (tabell 2), er metodikken som beskrevet her å foretrekke fremfor alternative metoder for å generere protoplaster. Transfeksjon trinn i protokollen er et kritisk punkt som virkninger på levedyktighet av protoplaster. Den PEG-oppløsning gjør det mulig for DNA som skal leveres inn i cellen, og både inkubasjonstid i denne oppløsning (trinn 3.4) og prosentandelen av PEG bør bestemmes empirisk. Den standard-konsentrasjonen er 20%, med lavere konsentrasjoner som reduserer transformasjonseffektivitet og høyerekonsentrasjoner reduserer levedyktighet 28. Inkubasjonstid så korte som fem minutter kan gi effektiv transfeksjon av protoplastene 27. Protoplastene kan avbildes på en hvilken som helst selvlysende avbildning plattform. I denne videoen, har vi brukt en luminescens plateleser utstyrt med utvendige lys (rød og blå lysdioder, 630 og 470 nm, henholdsvis på en kombinert intensitet av ~ 20 μE), som gjør det mulig for high-throughput screening og hyppige målinger. Andre bildeutstyr som detekterer luminescens, for eksempel alternative plate lesere eller oppsett basert rundt en CCD (CCD) kamera, kan brukes like godt så lenge belysning er tilgjengelig for fotosyntese. Fordelen med å bruke et CCD-kamera montert på et styrbart kabinett er at lys og temperatur kan programmeres. En ulempe er den lengre opptakstid, innføring av lengre perioder med mørke som kan føre til stress til protoplastene i tillegg til å foruroligeing endogen tidtaking. Uansett hvilken eksperimentell plattform er valgt, vil trolig være nødvendig i forhold til innstillinger for planter eller modne planter justering av innstillinger. I vår erfaring, kan øke konsentrasjonen av reporter plasmid under transfeksjon og / eller luciferin i bildebufferen løse eventuelle feilaktige eller raskt demper rytmer som kan oppstå i innledende forsøk. I senere eksperimenter, kan metoden beskrevet her bli anvendt for å studere circadian fenotypen til en hvilken som helst mutant Arabidopsis linje. Med mindre endringer, kan effekten av for eksempel ulike legemidler på tidtaking bli studert i dette oppsettet. Videre kan transfeksjon bli endret til å omfatte kunstig mikroRNA for genet stanse 19, ytterligere utvide allsidigheten til denne protokollen. Protokoller for å generere ris protoplaster er godt etablert 29 og bilde protokoll som presenteres her kan like gjerne brukes til å videreutvikle vår understanding av klokken i økonomisk viktige monocot kulturplanter.

De fleste levende organismer har en endogen tidtaker for å hjelpe effektiv forhandling av daglige endringer i miljøet. Dette timekeeper, biologiske klokke, regulerer mange aspekter av metabolismen og fysiologi av en organisme å forutse forutsigbare endringer i det ytre miljø. I planter for eksempel påvente av timelig forutsigbare patogen eller herbivore angrep sterkt reduserer generelle mottakelighet 1-4. Stivelse metabolisme er tett regulert av biologiske klokke for å sikre at stivelse reserver siste før daggry enten vokst på lange eller korte dag forhold 5. Faktisk, planter med biologiske klokka som samsvarer med 24-timers miljø viser økt vekstrater, karbonfikseringsrater og overlevelse sammenlignet med planter som kjører en klokke som ikke samsvarer perioden 6. Den omfattende innvirkning av cirkadianske rytmer i alle disse fremgangsmåter oppstår i stor utstrekning fra den rytmisk regulering av opptil en tredjedelav den totale transkriptomet i Arabidopsis 7. Disse rytmiske genprodukter involvert i et bredt spekter av cellulære prosesser, inkludert metabolske veier, hormon-signalering, og stressresponser 7. På toppen av det, er direkte biologiske regulering av protein funksjon etablert av circadian regulering av fosforylering 8 og mest sannsynligvis andre posttranslasjonelle modifikasjoner (PTMs). I sentrum av den biologiske klokke som driver dette daglig transkripsjonen omprogrammering ligger et nettverk av transkripsjonen / translasjonell feedbacksløyfer (TTFLs), inkludert morgen-uttrykte gener biologiske klokke ASSOCIATED 1 (CCA1) og sen langstrakte hypocotyl (LHY) som undertrykke uttrykket av kvelden gener Tidspunkt for CAB 1 (TOC1), gigantea (GI) og medlemmer av kvelden kompleks (EF), LUX ARRHYTHMO (LUX), tidlig blomstring 3 (ELF3), og ELF4 9-11. sammen viddh pseudo RESPONSE regulator -genes (PRR3, 5, 7 og 9), undertrykker TOC1 CCA1 / LHY uttrykk mens EU fungerer som en positiv regulator 12-14. Tilleggs å tilbakekoblingsmekanismer, post-transcriptional og post-translasjonell regulering av TTFL nettverkskomponenter spiller en viktig rolle i tuning døgnrytme. Til dags dato den mest tallrike PTM identifisert på biologiske klokke proteiner er fosforylering 15. Fosforylering av CCA1 av kasein kinase 2 (CK2) påvirker dens binding til målet arrangører 16 og er viktig for temperaturkompensering av biologiske klokke 17. PRR proteiner fosforyleres forskjellig over døgnsyklus, og fosforylering av TOC1 påvirker samspillet med sin negative regulator, om kvelden-faset klokke komponent ZEITLUPE (ZTL) 18. Disse eksemplene illustrerer hvordan PTMs og protein-protein interaksjoner tune den TTFL nettverk inn i en 24-timerstranskripsjonen oscillator. For en mer detaljert innføring i transkripsjonen klokken nettverket og dets regulering, gode siste vurderingene er tilgjengelig (f.eks referanse 15). Men det som er igjen mindre klart er i hvilken grad rytmisk regulerte prosesser og andre aspekter av cellenes stoffskifte mate tilbake til tidtaking mekanisme selv. Omfattende screening av Arabidopsis mutanter for klokkefeil kan få ytterligere forståelse av hvilke mekanismer eller signalveier kan være involvert i produksjon av 24-timers rytmer fra et TTFL nettverk. For dette formål, Kim og Somers tidligere publiserte et gjennombrudd fremgangsmåte for effektiv og rask analyse av klokkefunksjon i en hvilken som helst Arabidopsis linje 19. Basert på bruk av forbigående uttrykk i protoplaster, overgår denne metodikken behovet for stabile transgene linjer eller krysser til selvlysende klokke merkelinjer. Her visualiserer vi en høytytende protoplast isolation metode 20 kombinert med en optimalisert protokoll for å screene biologiske defekter ved selvlysende avbildning av transient uttrykt klokke markører i et 96-brønners plateleser. Vi vil sammenligne villtype kolleger 0 Arabidopsis til godt karakterisert klokke mutanter å bekrefte metoden beskrevet her hell oppdager endrede døgnrytme. Protoplaster avledet fra disse linjene er tilført med en reporter konstruksjon som uttrykker ildflue luciferase fra circadian CCA1 arrangøren; CCA1pro: LUC 19. Luciferase katalyserer flertrinns reaksjon hvor luciferin omdannes til elektronisk spent oxyluciferin som avgir lys 21, som blir fotografert over tid for å vurdere periode, amplitude og fase av transkripsjonelle rytmer i disse protoplaster. Protokollen består av tre hoveddeler; isolere protoplaster, trans de protoplaster med reporter plasmid, og selvlysende imaldring. Disse tre delene skal alltid utføres på en enkelt dag, ved hjelp av nylagde buffere og reagenser. Plantevekst og rensing av tilstrekkelige mengder av reporter plasmid bør utføres på forhånd, og er ikke anskueliggjort i denne protokollen.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>CELLULYSIN Cellulase, Trichoderma viride&#160;</td>
			<td>Merck Millipore</td>
			<td>219466</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pectinase R10</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>P2401</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>D-mannitol</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>M4125&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CaCl2</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>C4901</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>KCl</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>P3911</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bovine Serum Albumin</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>A4503</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MES</td>
			<td>Acros Organics</td>
			<td>327765000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaCl</td>
			<td>Acros Organics</td>
			<td>327300010</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glucose</td>
			<td>Fischer Scientific</td>
			<td>G/0500/60</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MgCl2</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>M2670</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Polyethylene glycol (PEG) 4000</td>
			<td>Acros Organics</td>
			<td>434630010</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal Bovine Serum&#160;</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>F4135</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>D-Luciferin, Firefly</td>
			<td>Biosynth AG</td>
			<td>L-8200</td>
			<td>Dissolve luciferin powder in 0.1M trisphosphate buffer pH 8.0 to a concentration of 50mM</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ampicillin</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>A9618</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Comply Steam Indicator Tape</td>
			<td>3M</td>
			<td>1222</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Magic Tape</td>
			<td>3M</td>
			<td>819-1460</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Petri Dishes</td>
			<td>Scientific Laboratory Supplies</td>
			<td>SLS2002</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microplate, 96 well, flat bottom, white</td>
			<td>Greiner Bio-One</td>
			<td>655075</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TopSeal-A, adhesive lids for 96-well plates</td>
			<td>Perkin Elmer</td>
			<td>6050195</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Syringe, 10 ml, w/o needle</td>
			<td>BD Plastipak</td>
			<td>302188</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Syringe filter 0.22 &#181;m</td>
			<td>Merck Millipore</td>
			<td>SLGP033RS</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Biological Rhythms Analysis Software System (BRASS)</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Free download at amillar.org</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>QIAfilter Maxiprep Kit</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>12262</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Modified Fuch-Rosenthal counting chamber, double cell</td>
			<td>Hawksley</td>
			<td>AC6000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bright field microscope</td>
			<td>Optika Microscopes</td>
			<td>B-150POL-B</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LB942 TriStar2 multimode reader, with luminescence module</td>
			<td>Berthold Technologies Ltd</td>
			<td>57947/57948</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

rapid analysis of circadian phenotypes in arabidopsis protoplasts transfected with a luminescent clock reporter

The plant circadian clock allows the anticipation of daily changes to the environment. This anticipation aids the responses to temporally predictable biotic and abiotic stress. Conversely, disruption of circadian timekeeping severely compromises plant health and reduces agricultural crop yields. It is therefore imperative that we understand the intricate regulation of circadian rhythms in plants, including the factors that affect motion of the transcriptional clockwork itself.
Testing circadian defects in the model plant Arabidopsis thaliana (Arabidopsis) traditionally involves crossing specific mutant lines to a line rhythmically expressing firefly luciferase from a circadian clock gene promoter. This approach is laborious, time-consuming, and could be fruitless if a mutant has no circadian phenotype. The methodology presented here allows a rapid initial assessment of circadian phenotypes. Protoplasts derived from mutant and wild-type Arabidopsis are isolated, transfected with a rhythmically expressed luminescent reporter, and imaged under constant light conditions for 5 days. Luminescent traces will directly reveal whether the free-running period of mutant plants is different from wild-type plants. The advantage of the method is that any Arabidopsis line can efficiently be screened, without the need for generating a stably transgenic luminescent clock marker line in that mutant background.

Protoplaster av vill-type Arabidopsis ble sammenlignet med de kjente klokke mutantene cca1 / lhy (kort periode mutant 2), ZTL (lang periode mutant 23), og overekspresjon linje CCA1 -OX (arytmisk 24). Alt ble transient transfektert med CCA1pro: LUC reporter og avbildes i konstant lys på en plate leser over 5 dager. Her viser vi at i cca1 / lhy mutant, er friløp periode circadian-kontrollerte genuttrykk forkortet (figur 2a), i tråd med den publiserte analyseperioden med stabile transgen uttrykk for selvlysende klokke markører 2,9. Perioden av cirkadianske svingninger i protoplaster av ZTL mutant er lengre enn i villtype (figur 2b), i henhold til tidligere publiserte resultater fra stiklinger, cellesuspensjon Cultures og protoplaster 19,23,25. Overekspresjon av CCA1 låser klokken i morgen-fase og global transkripsjon blir arytmisk 24. Konsekvent, observerte vi ingen svingninger i CCA1pro: LUC uttrykk i CCA1 -OX protoplaster (figur 2c). <img alt="Figur 2" src="/files/ftp_upload/54586/54586fig2.jpg" /> Figur 2: protoplast døgnrytme Protoplaster av kolleger 0, cca1 / lhy, ZTL, og CCA1 -OX ble transient transformert med CCA1pro: LUC konstruere og døgnrytme i luminescens ble fotografert over 5 dager (A - C). (D) i døgn perioden estimatene basert på luminescens spor i Col -0, cca1 / lhy og ZTL (A - B). Megen ± SEM, n = 3-5, t-test p-verdi som er angitt. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/54586/54586fig2large.jpg" target="_blank">Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.</a> <table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody><tr><td> genotype </td><td> Periode (protoplaster) </td><td> Periode (transgene) </td><td> Rapportert av: </td><td> Referanser </td></tr><tr><td> kol- 0 </td><td> 23,0 ± 0,21 </td><td> 24,4 ± 0,09 </td><td> pCCA1: LUC i Col -0 </td><td> (2) </td></tr><tr><td> cca1 / lhy </td><td> 20,6 ± 0,13 </td><td> 19.9 ± 0.11 </td><td> pCCA1: LUC i Col -0 </td><td> (2) </td></tr><tr><td></td><td></td><td> ~ 18 </td><td> RNA i L er bakgrunnen </td><td> (9) </td></tr><tr><td&gt; ZTL </td><td> 25.1 ± 0.12 </td><td> 27,4 ± 0,5 </td><td> CAB2: LUC i C24 ecotype </td><td> (22) </td></tr><tr><td> CCA1 -OX </td><td> arytmisk </td><td> arytmisk </td><td> pCCA1: LUC (LD data) </td><td> (2) </td></tr><tr><td></td><td></td><td> arytmisk </td><td> RNA og protein i Col -0 bakgrunn </td><td> (23) </td></tr></tbody></table> Tabell 2: døgnrytme i Protoplaster Sammenlignet med Transgene Stiklinger circadian periode pCCA1. LUC uttrykk i protoplaster sammenlignet med perioden lengder først rapportert for mutasjonen og, hvis tilgjengelig, med pCCA1: LUC uttrykk i Col -0.

Watch this Scientific Journal Video about Rapid Analysis of Circadian Phenotypes in Arabidopsis Protoplasts Transfected with a Luminescent Clock Reporter at JoVE.com

Rapid Analysis of Circadian Phenotypes in Arabidopsis Protoplasts Transfected with a Luminescent Clock Reporter

Den biologiske klokke regulerer omtrent en tredjedel av Arabidopsis transkriptomet, men prosentandelen av gener som mates tilbake inn tidtakings er ukjent. Her visualisere en metode for raskt å vurdere circadian fenotyper i en hvilken som helst mutant linje av Arabidopsis ved hjelp av luminescerende avbildning av en cirkadisk reporter transient uttrykt i protoplaster.

Rask analyse av i døgn fenotyper i Arabidopsis Protoplaster tilført med en selvlysende klokke Reporter

The plant circadian clock allows the anticipation of daily changes to the environment. This anticipation aids the responses to temporally predictable ...

Research

JoVE Journal

Biology

Isolation of Protoplasts from Tissues of 14-day-old Seedlings of Arabidopsis thaliana

Isolation of Protoplasts from Tissues of 14-day-old Seedlings of Arabidopsis thaliana

Protoplasts are plant cells that have had their cell walls enzymatically removed. Isolation of protoplasts  from different plant tissues was first ...

Floral-dip Transformation of Arabidopsis thaliana to Examine pTSO2::&beta;-glucuronidase Reporter Gene Expression

Floral-dip Transformation of Arabidopsis thaliana to Examine pTSO2::ÃƒÅ½Ã‚Â²-glucuronidase Reporter Gene Expression

The ability to introduce foreign genes into an organism is the foundation for modern biology and biotechnology. In the model flowering plant Arabidopsis ...

RNAi Screening to Identify Postembryonic Phenotypes in C. elegans

RNAi Screening to Identify Postembryonic Phenotypes in C. elegans

RNAi Screening for å identifisere Postembryonic fenotyper i C. elegans</em

C. elegans has proven to be a valuable model system for the discovery and functional characterization of many genes and gene pathways1. More sophisticated ...

Monitoring Cell-autonomous Circadian Clock Rhythms of Gene Expression Using Luciferase Bioluminescence Reporters

Overvåking Cell-autonome biologiske klokke Rhythms of Gene Expression Bruke luciferase Bioluminescens Reporters

In mammals, many aspects of behavior and physiology such as sleep-wake cycles and liver metabolism are regulated by endogenous circadian clocks ...

Rapid Genetic Analysis of Epithelial-Mesenchymal Signaling During Hair Regeneration

Rapid Genetic Analysis of epitelial-mesenchymale signaleringsprotokoll Under Hair Regeneration

Hair follicle morphogenesis, a complex process requiring interaction between epithelia-derived keratinocytes and the underlying mesenchyme, is an ...

Design and Analysis of Temperature Preference Behavior and its Circadian Rhythm in Drosophila

Design and Analysis of Temperature Preference Behavior and its Circadian Rhythm in Drosophila

Design og analyse av temperaturpreferanseatferd og dens døgnrytme i Drosophila

The circadian clock regulates many aspects of life, including sleep, locomotor activity, and body temperature (BTR) rhythms1,2. We recently identified a ...

Rapid and Efficient Zebrafish Genotyping Using PCR with High-resolution Melt Analysis

Rask og effektiv Sebrafisk Genotyping Bruke PCR med høy oppløsning Melt Analysis

Zebrafish is a powerful vertebrate model system for studying development, modeling disease, and performing drug screening. Recently a variety of genetic ...

Quantification of Orofacial Phenotypes in Xenopus

Quantification of Orofacial Phenotypes in Xenopus

Kvantifisering av Orofacial fenotyper i<em&gt; Xenopus</em

Xenopus has become an important tool for dissecting the mechanisms governing craniofacial development and defects. A method to quantify orofacial ...

Transfecting RAW264.7 Cells with a Luciferase Reporter Gene

RAW264.7 transfektere celler med en luciferasereportergenet

Transfection of desired genetic materials into cells is an inevitable procedure in biomedical research studies. While numerous methods have been ...

Clock Scan Protocol for Image Analysis: ImageJ Plugins

Klokke Scan protokoll for bildeanalyse: ImageJ Plugins

The clock scan protocol for image analysis is an efficient tool to quantify the average pixel intensity within, at the border, and outside (background) a ...