Name: rapid analysis of circadian phenotypes in arabidopsis protoplasts transfected with a luminescent clock reporter
Uploaded: 2016-09-17T15:00:00
Duration: 7 min 42 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Rapid Analysis of Circadian Phenotypes in Arabidopsis Protoplasts Transfected with a Luminescent Clock Reporter at JoVE.com

We would like to thank Prof. David Somers and Dr. Jeongsik Kim for the luciferase reporter plasmid and initial method development. Prof. Karen Halliday kindly provided all the circadian mutant lines used in this study. This research was supported by Royal Society research grants RS120372 and RS140275. GvO is a Royal Society University Research Fellow (UF110173).

OBS: I detta protokoll är reagenser och volymer som beskrivs uttryckt per Arabidopsis linje som testas, och kommer att resultera i sex likadana brunnar för att genotyp. Multiplicera materialen med antalet linjer som skall analyseras när man analyserar mer än en rad. I videon, kommer vildtyp Arabidopsis jämföras med dygnsrytm klockan mutantlinjen ZTL (även representativa resultat från ytterligare rader kommer att ges senare). <table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody><tr><td> enzym~~POS=TRUNC lösning~~POS=HEADCOMP </td><td></td></tr><tr><td> cellulas </td><td> 0,5% (vikt / volym) </td></tr><tr><td> pektinas R10 </td><td> 0,25% (vikt / volym) </td></tr><tr><td> D-mannitol </td><td> 400 mM </td></tr><tr><td> CaCl2 </td><td> 10 mM </td></tr><tr><td> KCl </td><td> 20 mM </td></tr><tr><td> Bovint serumalbumin </td><td> 0,1% (vikt / volym) </td></tr><tr><td> MES, pH 5,7 </td><td> 20 mM </td></tr><tr><td></td><td></td></tr><tr><td> W5-lösning </td><td></td></tr><tr><td> NaCl </td><td> 150 mM </td></tr><tr><td> CaCl2 </td><td> 125 mM </td></tr><tr><td> KCl </td><td> 5 mM </td></tr><tr><td> MES, pH 5,7 </td><td> 2 mM </td></tr><tr><td> Glukos </td><td> 5 mM </td></tr><tr><td></td><td></td></tr><tr><td> MMG lösning </td><td></td></tr><tr><td> MES, pH 5,7 </td><td> 4 mM </td></tr><tr><td> D-mannitol </td><td> 400 mM </td></tr><tr><td> MgCl2 </td><td> 15 mM </td></tr><tr><td></td><td></td></tr><tr><td> PEG-lösning </td><td></td></tr><tr><td> PEG4000 </td><td> 40% (vikt / volym) </td></tr><tr><td> D-mannitol </td><td> 200 mM </td></tr><tr><td> CaCl2 </td&gt; <td> 100 mM </td></tr><tr><td></td><td></td></tr><tr><td> bildlösning </td><td></td></tr><tr><td> W5-lösning </td><td> till slutlig volym </td></tr><tr><td> Fetalt bovint serum </td><td> 5% (volym / volym) </td></tr><tr><td> luciferin </td><td> 1,2 mM </td></tr><tr><td> ampicillin </td><td> 50 mg / ml </td></tr></tbody></table> Tabell 1: Förteckning över lösningar. 1. Framställning av material och buffertar <ol><li> växtmaterial <ol><li> Håll Arabidopsis Col -0 frön i vatten i en 1,5 ml rör vid 4 ° C i mörker under fyra dagar. Pipett frön på jord i en kruka och överföra till långa dagens förhållanden (16 timmar ljus 8 h mörker) vid 21 ° C under 7 dagar. Lämna ett lock på grytan för de första tre dagarna för att säkerställa hög luftfuktighet. Transplant sex plantor till en ny 8 cm x 13 cm x 5 cm kruka och fortsätta växa plantorna på samma villkor för anothER 21 dagar. Se till att jorden är fuktig hela. </li></ol></li><li> reporterplasmid <ol><li> Rena den CCA1pro: LUC reporterplasmid 19 från bakteriekultur i förväg, med hjälp av en DNA-isoleringskit i enlighet med tillverkarens instruktioner. OBS: 20 mikrogram reporterplasmid krävs (10 pl vid 2 ug / ul i dH 2 O) för en transfektion. </li></ol></li><li> lösningar OBS: För detta protokoll fem lösningar behövs: Enzymlösning, Wash 5 (W5) lösning Mannitol-Magnesium (MMG) lösning, polyetylenglykol (PEG) -lösning, och bildbehandling lösning (tabell 1). Förbered dessa innan du fortsätter med protoplastisoleringssteget. <ol><li> Förbered 10 ml av enzymlösning enligt tabell 1, tillsätta enzymerna förra, och filtersterilisera lösningen genom ett 0,22 | j, m sprutfilter. </li><li> Förbered de återstående lösningarna i följande volymer: 15 ml W5-lösning, 10 ml MMG solution, 1 ml PEG-lösning och 1,5 ml bildlösning enligt tabell 1. OBS: Det är viktigt att PEG-lösningen framställs inte mindre än en hr före transfektion för att säkerställa att PEG fullständigt har lösts upp. Filter sterilisera det bildgivande lösningen genom ett 0,22 | j, m sprutfilter. </li></ol></li></ol><img alt="Figur 1" src="/files/ftp_upload/54586/54586fig1.jpg" /> Figur 1:. Protoplast isolering Bladen av vuxna Arabidopsis växter (A) är fixerade på autoklav band med lägre epidermal skiktet uppåt (B). (C) Magic Tape försiktigt pressas på den nedre epidermala skiktet med spetsen på en 15 ml koniskt rör. (D) Den magiska tejpen avlägsnas för att exponera mesofyllceller (E). (F) Remsor av autoklav tejp med ledighets bundna är flöt på enzymlösning innehållande cellulas och pektinas, släppa protoplaster i lösningen. (G) Bladskelett kvar på autoklav tejp efter enzymdigerering och kasseras, vilket lämnar protoplasterna i enzymlösning (H). (I) Slut följd mesophyll protoplaster (Skala bar = 50 pm). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/54586/54586fig1large.jpg" target="_blank">Klicka här för att se en större version av denna siffra.</a> 2. Protoplast Isolering <ol><li> Märka en petriskål och tillsätt 10 ml filtersteriliserad Enzymlösning. </li><li> Fäst fyra remsor av autoklav tejp med den klibbiga sidan uppåt på en ren labb yta och markera storleken av petriskålen på remsorna. </li><li> Klipp blad av fyra veckor gamla växter (Figur 1a), och tryck på övre epidermis på autoklav tejp (dvs lägre epidermisytan uppåt ( <strong&gt; Figur 1b)). </li><li> Tryck försiktigt remsor av magi tejp på den nedre epidermisytan med hjälp av en 15 ml koniska rör. Se till att inte krossa bladvävnad (Figur 1c). Dra försiktigt magiska tejpen att beröva de lägre epidermis (Figur 1d) och exponera mesofyllceller (Figur 1e). </li><li> Skär autoklav tejp för att passa petriskålen, använd pincett för att flytta bandet i petriskål och flyta på enzymlösningen (figur 1F), lämnar nedåt. Rotera vid 60 rpm på en plattform skakapparat under 60 min, under vilken protoplasterna kommer att släppas in i lösningen. </li><li> Använd pincett för att ta bort och kassera remsor av autoklav tejp (Figur 1 g) och pipett lösningen innehållande protoplasterna (Figur 1h) i en 50 ml koniska rör. Använd en bred-bore pipettspetsen (såsom en P5000 spets eller en P1000 spets med änden avskurna). </li><li> Centrifugera protoplasterna vid 100 xg under 3 min vid 4 ° C och avlägsna supernatanten med en pipett. Var försiktig, eftersom pelleten är mycket lös. </li><li> Tillsätt 10 ml W5 lösning protoplastema och återsuspendera genom att försiktigt snurra röret. </li><li> Vila protoplasterna på is under 30-60 min. Under detta steg bedöma avkastning genom att räkna protoplaster i en hemocytometer (Figur 1i). </li><li> Samla protoplasterna genom centrifugering vid 100 x g under 3 min vid 4 ° C och avlägsna supernatanten med en pipett. Var försiktig, eftersom pelleten är mycket lös. </li><li> Resuspendera protoplasterna till en koncentration av 5 x 10 5 protoplaster / ml i MMG lösning. </li></ol> 3. Protoplast Transfektion <ol><li> Tillsätt 10 | il reporterplasmid (2 ug / ul) till en 15 ml koniska rör. </li><li> Tillsätt 400 pl protoplaster till röret. </li><li> Lägga en volym (410 | il) PEG-lösning och blanda genom att vända röret försiktigt 12 gånger för att transfektera de protoplaster. </li><li> Efter 8-15 min incubation vid rumstemperatur späds protoplast-DNA-PEG-blandningen med fyra volymer (1640 | il) W5-lösning och blanda genom att vända försiktigt sex gånger. </li><li> Samla de transfekterade protoplasterna genom centrifugering vid 100 xg under 2 min vid rumstemperatur och avlägsna supernatanten med en pipett. Än en gång, ta hand, eftersom pelleten är mycket lös. </li><li> Resuspendera protoplasterna i 1250 il imaging lösning. </li><li> Alikvot 200 ^ till sex replikera brunnar i en 96-brunnars platta, fylla eventuella tomma brunnar med W5-lösning, och försegla plattan med ett lim klart lock lämpligt för luminiscerande avbildning. </li></ol> 4. Imaging <ol><li> Överför plattan till en självlysande imaging inställning lämpar sig för växt avbildning. Ändra självhäftande lock på plattorna 10-15 min efter överföring för att undvika kondens och tryckskillnader mellan brunnarna, sedan börja avbildning. Läs plattan varje ~ 45 min (3 sek per brunn) under fem dagar vid rumstemperatur. OBS!frekvens av plattan läser och lästiden per brunn kan variera beroende på bildinställningen. </li></ol> 5. Dataanalys <ol><li> Analysera luminiscens resultat med hjälp av något analysmjukvara (till exempel biologiska rytmer Analysis Software System (mässing) 22). Jämför mutantlinjen till vild-typ kontroller för att avslöja dygns defekter. </li></ol>

<ol>
	<li>Goodspeed, D., Chehab, E. W., Min-Venditti, A., Braam, J., Covington, M. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Arabidopsis+synchronizes+jasmonate-mediated+defense+with+insect+circadian+behavior.">Arabidopsis synchronizes jasmonate-mediated defense with insect circadian behavior.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 109 (12), 4674-4677 (2012).</li><li>Zhang, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Crosstalk+between+the+circadian+clock+and+innate+immunity+in+Arabidopsis.">Crosstalk between the circadian clock and innate immunity in Arabidopsis.</a> PLoS Pathog. 9 (6), 1003370 (2013).</li><li>Hevia, M. A., Canessa, P., M&#252;ller-Esparza, H., Larrondo, L. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+circadian+oscillator+in+the+fungus+Botrytis+cinerea+regulates+virulence+when+infecting+Arabidopsis+thaliana.">A circadian oscillator in the fungus Botrytis cinerea regulates virulence when infecting Arabidopsis thaliana.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 112 (28), 8744-8749 (2015).</li><li>Bhardwaj, V., Meier, S., Petersen, L. N., Ingle, R. A., Roden, L. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Defence+responses+of+Arabidopsis+thaliana+to+infection+by+Pseudomonas+syringae+are+regulated+by+the+circadian+clock.">Defence responses of Arabidopsis thaliana to infection by Pseudomonas syringae are regulated by the circadian clock.</a> PLoS One. 6 (10), 26968 (2011).</li><li>Graf, A., Schlereth, A., Stitt, M., Smith, A. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Circadian+control+of+carbohydrate+availability+for+growth+in+Arabidopsis+plants+at+night.">Circadian control of carbohydrate availability for growth in Arabidopsis plants at night.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. 107 (20), 9458-9463 (2010).</li><li>Dodd, A. N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Plant+circadian+clocks+increase+photosynthesis,+growth,+survival,+and+competitive+advantage.">Plant circadian clocks increase photosynthesis, growth, survival, and competitive advantage.</a> Science. 309 (5734), 630-633 (2005).</li><li>Covington, M. F., Maloof, J. N., Straume, M., Kay, S. A., Harmer, S. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Global+transcriptome+analysis+reveals+circadian+regulation+of+key+pathways+in+plant+growth+and+development.">Global transcriptome analysis reveals circadian regulation of key pathways in plant growth and development.</a> Genome Biol. 9 (8), 130 (2008).</li><li>Choudhary, M. K., Nomura, Y., Wang, L., Nakagami, H., Somers, D. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantitative+Circadian+Phosphoproteomic+Analysis+of+Arabidopsis+Reveals+Extensive+Clock+Control+of+Key+Components+in+Physiological,+Metabolic,+and+Signaling+Pathways.">Quantitative Circadian Phosphoproteomic Analysis of Arabidopsis Reveals Extensive Clock Control of Key Components in Physiological, Metabolic, and Signaling Pathways.</a> Mol. Cell. Proteomics. 14 (8), 2243-2260 (2015).</li><li>Mizoguchi, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=LHY+and+CCA1+Are+Partially+Redundant+Genes+Required+to+Maintain+Circadian+Rhythms+in+Arabidopsis.">LHY and CCA1 Are Partially Redundant Genes Required to Maintain Circadian Rhythms in Arabidopsis.</a> Dev. Cell. 2 (5), 629-641 (2002).</li><li>Kikis, E. A., Khanna, R., Quail, P. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=ELF4+is+a+phytochrome-regulated+component+of+a+negative-feedback+loop+involving+the+central+oscillator+components+CCA1+and+LHY.">ELF4 is a phytochrome-regulated component of a negative-feedback loop involving the central oscillator components CCA1 and LHY.</a> Plant J. 44 (2), 300-313 (2005).</li><li>Lu, S. X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CCA1+and+ELF3+Interact+in+the+Control+of+Hypocotyl+Length+and+Flowering+Time+in+Arabidopsis.">CCA1 and ELF3 Interact in the Control of Hypocotyl Length and Flowering Time in Arabidopsis.</a> Plant Physiol. 158 (2), 1079-1088 (2012).</li><li>Nakamichi, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=PSEUDO-RESPONSE+REGULATORS+9,+7,+and+5+are+transcriptional+repressors+in+the+Arabidopsis+circadian+clock.">PSEUDO-RESPONSE REGULATORS 9, 7, and 5 are transcriptional repressors in the Arabidopsis circadian clock.</a> Plant Cell. 22 (3), 594-605 (2010).</li><li>Dixon, L. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Temporal+repression+of+core+circadian+genes+is+mediated+through+EARLY+FLOWERING+3+in+Arabidopsis.">Temporal repression of core circadian genes is mediated through EARLY FLOWERING 3 in Arabidopsis.</a> Curr. Biol. 21 (2), 120-125 (2011).</li><li>Gendron, J. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Arabidopsis+circadian+clock+protein,+TOC1,+is+a+DNA-binding+transcription+factor.">Arabidopsis circadian clock protein, TOC1, is a DNA-binding transcription factor.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 109 (8), 3167-3172 (2012).</li><li>Hsu, P. Y., Harmer, S. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Wheels+within+wheels:+the+plant+circadian+system.">Wheels within wheels: the plant circadian system.</a> Trends Plant Sci. 1, 1-10 (2013).</li><li>Daniel, X., Sugano, S., Tobin, E. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CK2+phosphorylation+of+CCA1+is+necessary+for+its+circadian+oscillator+function+in+Arabidopsis.">CK2 phosphorylation of CCA1 is necessary for its circadian oscillator function in Arabidopsis.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 101 (9), 3292-3297 (2004).</li><li>Portol&#233;s, S., M&#225;s, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+functional+interplay+between+protein+kinase+CK2+and+CCA1+transcriptional+activity+is+essential+for+clock+temperature+compensation+in+Arabidopsis.">The functional interplay between protein kinase CK2 and CCA1 transcriptional activity is essential for clock temperature compensation in Arabidopsis.</a> PLoS Genet. 6 (11), e1001201 (2010).</li><li>Fujiwara, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Post-translational+regulation+of+the+Arabidopsis+circadian+clock+through+selective+proteolysis+and+phosphorylation+of+pseudo-response+regulator+proteins.">Post-translational regulation of the Arabidopsis circadian clock through selective proteolysis and phosphorylation of pseudo-response regulator proteins.</a> J. Biol. Chem. 283 (34), 23073-23083 (2008).</li><li>Kim, J., Somers, D. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rapid+assessment+of+gene+function+in+the+circadian+clock+using+artificial+microRNA+in+Arabidopsis+mesophyll+protoplasts.">Rapid assessment of gene function in the circadian clock using artificial microRNA in Arabidopsis mesophyll protoplasts.</a> Plant Physiol. 154 (2), 611-621 (2010).</li><li>Wu, F. -. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tape-Arabidopsis+Sandwich+-+a+simpler+Arabidopsis+protoplast+isolation+method.">Tape-Arabidopsis Sandwich - a simpler Arabidopsis protoplast isolation method.</a> Plant Methods. 5, 16 (2009).</li><li>Baldwin, T. O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Firefly+luciferase:+the+structure+is+known,+but+the+mystery+remains.">Firefly luciferase: the structure is known, but the mystery remains.</a> Structure. 4 (3), 223-228 (1996).</li><li>Edwards, K. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantitative+analysis+of+regulatory+flexibility+under+changing+environmental+conditions.">Quantitative analysis of regulatory flexibility under changing environmental conditions.</a> Mol. Syst. Biol. 6 (424), 424 (2010).</li><li>Somers, D. E., Schultz, T. F., Milnamow, M., Kay, S. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=ZEITLUPE+Encodes+a+Novel+Clock-Associated+PAS+Protein+from+Arabidopsis.">ZEITLUPE Encodes a Novel Clock-Associated PAS Protein from Arabidopsis.</a> Cell. 101 (3), 319-329 (2000).</li><li>Wang, Z. -. Y., Tobin, E. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Constitutive+Expression+of+the+CIRCADIAN+CLOCK+ASSOCIATED+1+(CCA1)+Gene+Disrupts+Circadian+Rhythms+and+Suppresses+Its+Own+Expression.">Constitutive Expression of the CIRCADIAN CLOCK ASSOCIATED 1 (CCA1) Gene Disrupts Circadian Rhythms and Suppresses Its Own Expression.</a> Cell. 93 (7), 1207-1217 (1998).</li><li>Kim, W. -. Y., Geng, R., Somers, D. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Circadian+phase-specific+degradation+of+the+F-box+protein+ZTL+is+mediated+by+the+proteasome.">Circadian phase-specific degradation of the F-box protein ZTL is mediated by the proteasome.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 100 (8), 4933-4938 (2003).</li><li>Zhai, Z., Jung, H. -. I., Vatamaniuk, O. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+of+protoplasts+from+tissues+of+14-day-old+seedlings+of+Arabidopsis+thaliana.">Isolation of protoplasts from tissues of 14-day-old seedlings of Arabidopsis thaliana.</a> J. Vis. Exp. , e15-e17 (2009).</li><li>Yoo, S. -. D., Cho, Y. -. H., Sheen, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Arabidopsis+mesophyll+protoplasts:+a+versatile+cell+system+for+transient+gene+expression+analysis.">Arabidopsis mesophyll protoplasts: a versatile cell system for transient gene expression analysis.</a> Nat. Protoc. 2 (7), 1565-1572 (2007).</li><li>Damm, B., Schmidt, R., Willmitzer, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Efficient+transformation+of+Arabidopsis+thaliana+using+direct+gene+transfer+to+protoplasts.">Efficient transformation of Arabidopsis thaliana using direct gene transfer to protoplasts.</a> Mol. Gen. Genet. 217 (1), 6-12 (1989).</li><li>Zhang, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+highly+efficient+rice+green+tissue+protoplast+system+for+transient+gene+expression+and+studying+light/chloroplast-related+processes.">A highly efficient rice green tissue protoplast system for transient gene expression and studying light/chloroplast-related processes.</a> Plant Methods. 7 (1), 30 (2011).</li></ol>

The authors have nothing to disclose.

Här presenterar vi en snabb analys för att screena dygnsrytm period defekter i Arabidopsis linjer, inklusive protoplastisolering, transfektion, och luminecent avbildning. Dygnsrytm period vildtyp Arabidopsis och klockan mutanter cca1 / LHY, ZTL och CCA1 -OX beräknades från mätningar av luminiscens från en CCA1pro: LUC reporter och befunnits vara i överensstämmelse med publicerade data som genereras från hela anläggningar som använder mer tids- konsumerar transgena metoder (tabell 2). Med användning av denna analys för att screena Arabidopsis-mutanter undviker första krav för att generera transgena luminiscenta linjer, vilket är tidsödande och kan endast avslöja att en viss mutant uppvisar vildtyp rytmer. En klar fördel med detta protokoll är att alla Arabidopsis linje kan screenas på kort tid för förändrade dygnstranskriptions rytmer, som kommer att hjälpa att identifiera fler gener som påverkar tidtagning i växter. <p class= &quot;Jove_content&quot;&gt; Isolering av protoplaster kan vara arbetskrävande, särskilt om den mutanta linjen visar en överskuggas fenotyp. Tidigare rapporterade metoder för att generera protoplaster innebär att skära blad eller plantor i tunna strimlor och vakuum infiltrerar remsorna med enzymlösning för att göra det möjligt för enzymer för att nå cellväggarna 26,27. Den efterföljande digerering kräver minst tre timmars inkubation i mörker för att frigöra protoplasterna i enzymlösningen. När vakuum infiltration inte tillämpas, är inkubationstiden upp till 18 timmar rekommenderas. I protokollet presenteras här, är vakuuminfiltration onödiga eftersom epidermal cellskiktet ogenomträngligt för enzymerna avlägsnas med tejp. När du skapar protoplaster genom att skära växtmaterial är det nödvändigt att separera protoplaster från cellväggen skräp efter matsmältningen, Detta görs vanligtvis genom filtrering av lösningen eller rena den på en socker gradient 27,26. Här kommer några osmält vävnad kvar på autoklav bandet efterdigestion, så filtrering och socker gradient rening av protoplasterna kan utelämnas. Det finns en chans att den stress som följer av långvarig protoplasting förfaranden påverkar cellernas livskraft och dygnsrytm klocka. Den bandbaserade protoplasting metod 20 visualiseras här ger ett stort antal protoplaster; och med tanke på livskraften hos cellerna under en dygnstidsserie och den matchande periodlängder av protoplaster och hela plantor (tabell 2) är den metod som beskrivs här att föredra framför alternativa metoder för att generera protoplaster. Transfektion steget i protokollet är ett kritiskt steg som påverkar lönsamheten av protoplasterna. PEG-lösningen gör det möjligt för DNA som skall avges in i cellen, och båda inkubationstid i denna lösning (steg 3,4) och procentandelen av PEG bör bestämmas empiriskt. Standardkoncentrationen är 20%, med lägre koncentrationer minskar transformationseffektiviteten och högrekoncentrationer minskar lönsamheten 28. Inkubationstid så kort som fem minuter skulle kunna ge en effektiv transfektion av protoplasterna 27. Protoplasterna kan avbildas på någon självlysande avbildning plattform. I den här filmen har vi använt en luminiscens plattläsare utrustad med externa lampor (röd och blå lysdioder, 630 och 470 nm, respektive, vid en kombinerad intensitet ~ 20 uE), som gör det möjligt för high-throughput screening och täta mätningar. Andra bildutrustning som detekterar luminiscens, såsom alternativa plattläsare eller inställningar uppbyggd kring en charge-coupled device (CCD) kamera, kan tillämpas lika bra så länge belysningen är tillgänglig för fotosyntes. Fördelen med att använda en CCD-kamera monterad på ett styrbart skåp är att ljus och temperatur kan programmeras. En nackdel är längre fånga tid, införa långa perioder av mörker som kan orsaka stress protoplastema förutom att störaing endogen tidtagning. Oavsett vilken experimentell plattform som väljs, kommer sannolikt att krävas jämfört med inställningar för plantor eller mogna växter justering av inställningar. I vår erfarenhet, kan öka koncentrationen av reporterplasmid under transfektion och / eller luciferin i bildbufferten lösa eventuella oregelbundna eller snabbt dämpande rytmer som kan uppstå i inledande experiment. I framtida experiment, kan de metoder som beskrivs här tillämpas för att studera dygnsrytm fenotypen av någon mutant Arabidopsis linje. Med mindre modifieringar, kan effekten av t.ex. olika droger på tidtagning studeras i denna inställning. Dessutom kan transfektion modifieras till att innefatta artificiell microRNA för gen tysta 19, ytterligare utöka mångsidigheten av detta protokoll. Protokoll för att generera risprotoplaster är väletablerade 29 och bild Protokollet presenteras här kan även tillämpas för att främja vår understanding av klockan i ekonomiskt viktiga monokotyledona grödor.

De flesta levande organismer har en endogen tidtagare för att underlätta en effektiv förhandling av dagliga förändringar i miljön. Detta tidtagare, dygnsrytm klocka reglerar många aspekter av metabolismen och fysiologi hos en organism att förutse förutsägbara förändringar i den yttre miljön. I anläggningar för exempelvis väntan på tidsmässigt förutsägbara patogener eller växtätare attacker minskar kraftigt övergripande känslighet 1-4. Stärkelse metabolism är hårt reglerad av dygnsrytm klocka för att säkerställa att stärkelsereserver sist fram till gryningen om odlas på långa eller korta dagens förhållanden 5. I själva verket, växter med dygns klockor som matchar de 24 hr miljö visar ökad tillväxttakt, kol fixerings priser och överlevnad jämfört med växter som kör en klocka inkompatibla perioden 6. Den omfattande påverkan av dygnsrytmen i alla dessa processer uppstår i stor utsträckning från den rytmiska regleringen av upp till en tredjedelav den totala transkriptom i Arabidopsis 7. Dessa rytmiska genprodukter är involverade i ett brett spektrum av cellulära processer, inklusive metaboliska vägar, hormonsignaleringen och stressreaktioner 7. Ovanpå detta är direkt dygnsrytm reglering av proteiners funktion som fastställts av dygnsrytm reglering av fosforylering 8 och förmodligen andra posttranslationella modifieringar (PTMs). Vid mitten av dygnsrytm klocka som driver denna dagliga transkriptions omprogrammering ligger ett nätverk av transkriptions / translationella återkopplingar (TTFLs), inklusive morgonen uttryckt gener dygnsrytm klocka SAMBAND en (CCA1) och sen avlånga hypokotyl (LHY) som undertrycka uttrycket av kvällens gener TIMING aV CAB en (TOC1), gigantea (GI) och medlemmarna i kvällskomplexet (EG), LUX ARRHYTHMO (LUX), tidig blomning 3 (ELF3), och ELF4 9-11. tillsammans with pseudo RESPONSE REGULATOR -genes (PRR3, 5, 7, och 9), undertrycker TOC1 CCA1 / LHY expression medan EG verkar som en positiv regulator 12-14. Ytterligare återkopplingsmekanismer, post-transkriptionell och post-translationell reglering av TTFL nätverkskomponenter spelar en viktig roll i tuning dygnsrytm. Hittills är den vanligast förekommande PTM identifieras på dygnsrytm klocka proteiner fosforylering 15. Fosforylering av CCA1 av Kaseinkinas 2 (CK2) påverkar dess bindning till mål initiativtagare 16 och är viktigt för temperaturkompensering av dygnsrytm klockan 17. PRR proteiner fosforyleras differentiellt över dygnscykeln, och fosforylering av TOC1 påverkar interaktion med sin negativ regulator, kvällen faser klocka komponent ZEITLUPE (ZTL) 18. Dessa exempel illustrerar hur PTMs och protein-proteininteraktioner tune den TTFL nätverket i en 24-hrtranskriptionell oscillator. För en mer detaljerad introduktion till transkriptionsklocknätet och dess reglering, utmärkta senaste omdömena finns tillgängliga (t.ex. referens 15). Men det återstår mindre klart är i vilken utsträckning rytmiskt reglerade processer och andra aspekter av cellulär metabolism mata tillbaka in i tidtagningen själva mekanismen. Omfattande screening av Arabidopsis mutanter för fel klock kan få ytterligare kunskap om vilka mekanismer eller signalvägar kan vara inblandade i genereringen av 24 h rytmer från en TTFL nätverk. För detta ändamål, Kim och Somers tidigare publicerade ett genombrott metod för effektiv och snabb analys av klockfunktionen i någon Arabidopsis linje 19. Baserat på användningen av övergående uttryck i protoplaster, denna metod överträffar behovet av stabila transgena linjerna eller korsar till självlysande klocka markör linjer. Här, vi visualisera en högavkastande protoplast isolation metod 20 i kombination med en optimerad protokoll för att screena dygnsrytm defekter genom självlysande avbildning av transient uttryckta markörerna klock i en 96-brunnsplattläsare. Vi kommer att jämföra vildtyp Collaboration 0 Arabidopsis mutanter välkaraktäriserade klock att bekräfta den metod som beskrivs här framgångsrikt upptäcker förändrade dygnsrytm. Protoplaster från dessa linjer transfekteras med en reporterkonstruktion som uttrycker eldflugeluciferas från dygns CCA1 promotorn; CCA1pro: LUC 19. Luciferas katalyserar flerstegs reaktion, i vilken luciferin omvandlas till elektroniskt exciterat oxyluciferin som sänder ut ljus 21, som avbildas över tiden för att utvärdera den tid, amplitud och fas av transkriptionella rytmer i dessa protoplaster. Protokollet består av tre huvuddelar; isolera protoplasts, transfektion protoplasterna med reportern plasmiden, och självlysande imåldrande. Dessa tre delar bör alltid utföras på en enda dag, med användning av nyberedda buffertar och reagens. Växternas tillväxt och rening av tillräckliga mängder av reporterplasmid bör utföras i förväg och är inte visualiseras i detta protokoll.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>CELLULYSIN Cellulase, Trichoderma viride&#160;</td>
			<td>Merck Millipore</td>
			<td>219466</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pectinase R10</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>P2401</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>D-mannitol</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>M4125&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CaCl2</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>C4901</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>KCl</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>P3911</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bovine Serum Albumin</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>A4503</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MES</td>
			<td>Acros Organics</td>
			<td>327765000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaCl</td>
			<td>Acros Organics</td>
			<td>327300010</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glucose</td>
			<td>Fischer Scientific</td>
			<td>G/0500/60</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MgCl2</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>M2670</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Polyethylene glycol (PEG) 4000</td>
			<td>Acros Organics</td>
			<td>434630010</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal Bovine Serum&#160;</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>F4135</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>D-Luciferin, Firefly</td>
			<td>Biosynth AG</td>
			<td>L-8200</td>
			<td>Dissolve luciferin powder in 0.1M trisphosphate buffer pH 8.0 to a concentration of 50mM</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ampicillin</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>A9618</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Comply Steam Indicator Tape</td>
			<td>3M</td>
			<td>1222</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Magic Tape</td>
			<td>3M</td>
			<td>819-1460</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Petri Dishes</td>
			<td>Scientific Laboratory Supplies</td>
			<td>SLS2002</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microplate, 96 well, flat bottom, white</td>
			<td>Greiner Bio-One</td>
			<td>655075</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TopSeal-A, adhesive lids for 96-well plates</td>
			<td>Perkin Elmer</td>
			<td>6050195</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Syringe, 10 ml, w/o needle</td>
			<td>BD Plastipak</td>
			<td>302188</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Syringe filter 0.22 &#181;m</td>
			<td>Merck Millipore</td>
			<td>SLGP033RS</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Biological Rhythms Analysis Software System (BRASS)</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Free download at amillar.org</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>QIAfilter Maxiprep Kit</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>12262</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Modified Fuch-Rosenthal counting chamber, double cell</td>
			<td>Hawksley</td>
			<td>AC6000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bright field microscope</td>
			<td>Optika Microscopes</td>
			<td>B-150POL-B</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LB942 TriStar2 multimode reader, with luminescence module</td>
			<td>Berthold Technologies Ltd</td>
			<td>57947/57948</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

rapid analysis of circadian phenotypes in arabidopsis protoplasts transfected with a luminescent clock reporter

The plant circadian clock allows the anticipation of daily changes to the environment. This anticipation aids the responses to temporally predictable biotic and abiotic stress. Conversely, disruption of circadian timekeeping severely compromises plant health and reduces agricultural crop yields. It is therefore imperative that we understand the intricate regulation of circadian rhythms in plants, including the factors that affect motion of the transcriptional clockwork itself.
Testing circadian defects in the model plant Arabidopsis thaliana (Arabidopsis) traditionally involves crossing specific mutant lines to a line rhythmically expressing firefly luciferase from a circadian clock gene promoter. This approach is laborious, time-consuming, and could be fruitless if a mutant has no circadian phenotype. The methodology presented here allows a rapid initial assessment of circadian phenotypes. Protoplasts derived from mutant and wild-type Arabidopsis are isolated, transfected with a rhythmically expressed luminescent reporter, and imaged under constant light conditions for 5 days. Luminescent traces will directly reveal whether the free-running period of mutant plants is different from wild-type plants. The advantage of the method is that any Arabidopsis line can efficiently be screened, without the need for generating a stably transgenic luminescent clock marker line in that mutant background.

Protoplaster av vildtyp Arabidopsis jämfördes med de kända mutanter klock cca1 / LHY (kort period mutant 2), ZTL (lång period mutant 23), och överuttryck linjen CCA1 -OX (arytmiska 24). Alla transfekterades transient med CCA1pro: LUC reporter och avbildas i konstant ljus på en plattläsare under 5 dagar. Här visar vi att i cca1 / LHY mutanten är fri-rinnande period av dygnsstyrda genuttryck förkortas (Figur 2a), i linje med den publicerade analyserade perioden av stabil transgen uttryckning av självlysande klocka markörer 2,9. Perioden av dygns oscillationer i protoplaster av ZTL mutanten är längre än i vild typ (fig 2b), i enlighet med tidigare publicerade resultat från plantor, cellsuspension Cultures och protoplaster 19,23,25. Överuttryck av CCA1 låser klockan i morgon fas och global transkription blir arytmier 24. Genomgående, observerade vi inga svängningar i CCA1pro: LUC expression i CCA1 -OX protoplaster (Figur 2c). <img alt="figur 2" src="/files/ftp_upload/54586/54586fig2.jpg" /> Figur 2: protoplast dygnsrytm Protoplaster av Collaboration 0, cca1 / LHY, ZTL och CCA1 -OX transient transformerade med CCA1pro: LUC konstruera och dygnsrytm i luminiscens avbildades under 5 dagar (A - C). (D) Circadian uppskattningar period baserat på luminiscens spår i Col -0, cca1 / LHY och ZTL (A - B). Migen ± SEM, n = 3-5, t-test p-värde som anges. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/54586/54586fig2large.jpg" target="_blank">Klicka här för att se en större version av denna siffra.</a> <table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody><tr><td> Genotyp </td><td> Period (protoplaster) </td><td> Period (transgena) </td><td> Rapporterad av: </td><td> referenser </td></tr><tr><td> sam- 0 </td><td> 23,0 ± 0,21 </td><td> 24,4 ± 0,09 </td><td> pCCA1: LUC i Col -0 </td><td> (2) </td></tr><tr><td> cca1 / LHY </td><td> 20,6 ± 0,13 </td><td> 19,9 ± 0,11 </td><td> pCCA1: LUC i Col -0 </td><td> (2) </td></tr><tr><td></td><td></td><td> ~ 18 </td><td> RNA i L er bakgrund </td><td> (9) </td></tr><tr><td&gt; ZTL </td><td> 25,1 ± 0,12 </td><td> 27,4 ± 0,5 </td><td> CAB2: LUC i C24 ekotyp </td><td> (22) </td></tr><tr><td> CCA1 -OX </td><td> arytmisk </td><td> arytmisk </td><td> pCCA1: LUC (LD data) </td><td> (2) </td></tr><tr><td></td><td></td><td> arytmisk </td><td> RNA och protein i Col -0 bakgrund </td><td> (23) </td></tr></tbody></table> Tabell 2: dygnsrytm i Protoplaster Jämfört med transgena plantor Den dygnsrytm period pCCA1. LUC expression i protoplaster jämfört med periodlängder först rapporterades för mutationen och, om möjligt, med pCCA1: LUC expression i Col -0.

Watch this Scientific Journal Video about Rapid Analysis of Circadian Phenotypes in Arabidopsis Protoplasts Transfected with a Luminescent Clock Reporter at JoVE.com

Rapid Analysis of Circadian Phenotypes in Arabidopsis Protoplasts Transfected with a Luminescent Clock Reporter

Dygnsrytm klocka reglerar ungefär en tredjedel av Arabidopsis transkriptom, men andelen av gener som beaktas vid tidtagning fortfarande okänd. Här visualisera vi en metod för att snabbt bedöma dygnsrytm fenotyper i någon mutantlinjen av Arabidopsis med hjälp av självlysande avbildning av en dygns reporter transient uttryckt i protoplaster.

Snabb analys av dygns Fenotyper i Arabidopsis protoplaster transfekterade med en lysande klocka Reporter

The plant circadian clock allows the anticipation of daily changes to the environment. This anticipation aids the responses to temporally predictable ...

Research

JoVE Journal

Biology

Isolation of Protoplasts from Tissues of 14-day-old Seedlings of Arabidopsis thaliana

Isolation of Protoplasts from Tissues of 14-day-old Seedlings of Arabidopsis thaliana

Isolering av Protoplasts från vävnaderna på 14 dagar gamla plantor av Arabidopsis thaliana</em

Protoplasts are plant cells that have had their cell walls enzymatically removed. Isolation of protoplasts  from different plant tissues was first ...

Floral-dip Transformation of Arabidopsis thaliana to Examine pTSO2::&beta;-glucuronidase Reporter Gene Expression

Floral-dip Transformation of Arabidopsis thaliana to Examine pTSO2::ÃƒÅ½Ã‚Â²-glucuronidase Reporter Gene Expression

Blom-dip Omvandling av Arabidopsis thaliana För att undersöka PTSO2:: β-glukuronidasaktivitet Reporter Gene Expression

The ability to introduce foreign genes into an organism is the foundation for modern biology and biotechnology. In the model flowering plant Arabidopsis ...

RNAi Screening to Identify Postembryonic Phenotypes in C. elegans

RNAi Screening to Identify Postembryonic Phenotypes in C. elegans

RNAi screening identifiera Postembryonic fenotyper i C. elegans</em

C. elegans has proven to be a valuable model system for the discovery and functional characterization of many genes and gene pathways1. More sophisticated ...

Monitoring Cell-autonomous Circadian Clock Rhythms of Gene Expression Using Luciferase Bioluminescence Reporters

Övervakning Cell-autonoma dygnsrytm klocka rytmer av genuttryck Använda Luciferas bioluminiscens Reportrar

In mammals, many aspects of behavior and physiology such as sleep-wake cycles and liver metabolism are regulated by endogenous circadian clocks ...

Rapid Genetic Analysis of Epithelial-Mesenchymal Signaling During Hair Regeneration

Snabb genetisk analys av Epithelial-mesenkymala Signaling Under Hair Regeneration

Hair follicle morphogenesis, a complex process requiring interaction between epithelia-derived keratinocytes and the underlying mesenchyme, is an ...

Design and Analysis of Temperature Preference Behavior and its Circadian Rhythm in Drosophila

Design and Analysis of Temperature Preference Behavior and its Circadian Rhythm in Drosophila

Design och analys av temperaturpreferensbeteende och dess dygnsrytm i Drosophila

The circadian clock regulates many aspects of life, including sleep, locomotor activity, and body temperature (BTR) rhythms1,2. We recently identified a ...

Rapid and Efficient Zebrafish Genotyping Using PCR with High-resolution Melt Analysis

Snabb och effektiv Zebrafish Genotyping Använda PCR med hög upplösning Smält Analysis

Zebrafish is a powerful vertebrate model system for studying development, modeling disease, and performing drug screening. Recently a variety of genetic ...

Quantification of Orofacial Phenotypes in Xenopus

Quantification of Orofacial Phenotypes in Xenopus

Kvantifiering av Orofacial fenotyper in<em&gt; Xenopus</em

Xenopus has become an important tool for dissecting the mechanisms governing craniofacial development and defects. A method to quantify orofacial ...

Transfecting RAW264.7 Cells with a Luciferase Reporter Gene

Transfektera RAW264.7 Celler med en luciferasrapportörgen

Transfection of desired genetic materials into cells is an inevitable procedure in biomedical research studies. While numerous methods have been ...

Clock Scan Protocol for Image Analysis: ImageJ Plugins

Klocksökningsprotokoll för bildanalys: ImageJ-plugins

The clock scan protocol for image analysis is an efficient tool to quantify the average pixel intensity within, at the border, and outside (background) a ...