Name: an in vitro model of the blood-brain barrier using impedance spectroscopy: a focus on t cell-endothelial cell interaction
Uploaded: 2016-12-08T12:30:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about An In Vitro Model of the Blood-brain Barrier Using Impedance Spectroscopy: A Focus on T Cell-endothelial Cell Interaction at JoVE.com

私たちは、TEERの測定に関する有用な議論のためのアニカEngbers及びそれらの優れた技術サポートのためのフランク・クルトと博士はマーカス・シェーファー（nanoAnalytics GmbH社）に感謝しています。この作品は、ドイツ学術協会（DFG）によってサポートされていました、HWとLKへSFB1009プロジェクトA03、CRC TR128は、A08を投影します。 LKにZ1とB01 LKとHWに、臨床研究のための学際センター（ミュンスターの医学部）認可番号KL2 / 14分の2015。

動物のケアのためのドイツのガイドラインに従って、すべての実験のために、マウスを交配したとミュンスター大学の中央動物施設における特定の病原体を含まない条件下で維持しました。全ての実験は、動物実験倫理委員会のガイドラインに従って行われ、ノルトライン=ヴェストファーレン州、ドイツ（LANUV、AZ 84-02.05.20.12.217）の地方当局によって承認されました。 1. MBMEC単離および?...

記載されたプロトコルのいくつかのステップが成功した実験のために不可欠です。初期MBMEC単離および培養の間、仕事を真菌胞子または細菌を細胞培養物の汚染を防止するために、可能な限り無菌条件下で行われることが重要です。 ECの純粋な培養物を得るためには、41,42（特に、周皮細胞）、他の細胞型ECの生存を可能にする最初の3日間、ピューロマイシンを含有する培地を使用す?...

3 -血液脳関門は、中枢神経系（CNS）1から全身循環を分離します。それは、細胞の自由な移動と水溶性の分子の拡散を抑制し、病原体および潜在的に有害な物質から脳を保護する物理的障壁を提供します。そのバリア機能に加えて、BBBは、神経組織の適切な機能を確実に脳実質に酸素や栄養素の配信を可能にします。 BBBの機能特性は、高度に専門性の高い電気部品は、その主要構成要素であると、その細胞および無細胞成分によって規制されています。 BBBの電気部品は、タイトジャンクション（TJ）錯体、開窓の欠如、非常に低いピノサイトーシスの活動、および恒久的に能動輸送機構が存在することを特徴とします。 BBBの他の成分EC基底膜、内皮を埋め込む周皮細胞、アストロサイトのエンドフィート=関連するパーenchymal基底膜はまた、BBB 2,4の開発、保守および機能に寄与- 6と、一緒にニューロンおよびミクログリアで、CNS 7を適切に機能可能に神経血管ユニット（NVU）、形成- 9。 このような神経変性、炎症や感染症などの神経疾患、種々のでは、BBBの機能が2,5,10損なわれています。 TJ複合体および分子輸送機構の調節不全は、BBBの透過性、白血球の血管外遊出、炎症および神経損傷の増加につながります。そのような病態生理学的条件下で、BBBの特性を研究するために、様々なインビトロ BBBモデルは9,11,12が確立されています。彼らは一緒に障壁の完全性、透過性だけでなく、輸送機構の変化に貴重な洞察を提供してきました。これらのモデルは、ヒト、マウス、ラット、ブタまたはBの内皮細胞を用いますヒツジの原点13から18; 25 -初代内皮細胞または細胞株は、モノカルチャーとして、あるいは一緒に生体内 19 でより密接にBBBを模倣するために、周皮細胞および/またはアストロサイトのいずれかで培養されます。近年では、経内皮電気抵抗（TEER）の測定は、内皮バリア特性26,27を評価するための広く受け入れられているツールとなっています。 TEERは、細胞単層を横切るイオンフラックスに対するインピーダンスを反映し、その減少が損なわ内皮障壁の完全性、したがって透過性の増大の敏感な尺度を提供します。 30 -様々なTEER測定システムは、上皮Voltohmmeter（EVOM）、電気細胞-基質インピーダンスセンシング（ECIS）、リアルタイム細胞解析15,28を含む、開発されてきました。 TEERは、隣接するECの間のイオンフラックス（傍細胞経路）に対する抵抗性を反映し、に直接比例しています関門の完全性。インピーダンス分光法27,31においては、複素合計インピーダンス（Z）は、CCLを測定することによって、障壁の完全性についての追加情報を提供する、測定されます。 CCLは、細胞膜（経細胞経路）を介して容量性電流に関する：細胞層は、膜の両側での電荷分離、等価電気回路におけるコンデンサと同様に機能し、障壁の完全性に反比例します。透過性インサート上で成長させた場合には、ECが、付着増殖し、微多孔膜に広がります。これは、（それ自体がコンデンサのように作用する）のインサートのバックグラウンド容量性電流に抵抗し、その最低レベルに達するまでの容量の低下を招きます。これは、TJの確立隣接する電気部品との間のスペースからそのシールを複合体が続いています。これは、傍細胞経路を介してイオン流束を制限し、そしてそれがそのプラトーに達するまでTEERが増加します。炎症状態下で、しかし、endotheliアル障壁が侵害された：TJが破壊を取得複合体およびインサートの容量成分が再び上昇するとCCLが増加するにつれて、TEERは減少します。 私たちのTEERの測定は、自動化されたセル監視32システムを使用しています。それは、インピーダンス分光法の原理に従っており、その前のアプリケーションを拡張します。ここでは、免疫細胞と脳内皮の相互作用を含むバリア性の研究を可能にインビトロ BBBモデルを記述します。特に、T細胞を活性化します。 37 -このような病態生理学的状態は、多発性硬化症およびその動物モデルの実験的自己免疫性脳脊髄炎33のようなCNSの自己免疫疾患において観察されます。ここで、重要なステップは、BBBを横切る脳炎誘発性、ミエリン特異的T細胞の遊出があります。これは、それらが他の免疫細胞を動員し、私血管周囲空間と脳実質への参入、中にそれらの再活性化が続いていますdiate炎症およびその後の脱髄1,35,38。しかしながら、このようなT細胞と内皮細胞との相互作用の分子機構は、BBBの主な成分は、よく理解されていません。私たちのプロトコルは、このギャップを埋め、活性化T細胞との直接接触との複雑な相互作用の際に内皮細胞（ すなわち、障壁の完全性と透過性）に影響新たな洞察を与えることを目指しています。 ここで説明するプロトコルは、微多孔膜と通気性のインサート上の単層として成長した初代マウス脳微小血管内皮細胞を利用します。内皮細胞を、ポリクローナルまたは抗原特異的な様式で予備活性化することができるCD4 + T細胞と共培養されます。予め活性化とMBMECsの共培養ではなく、ナイーブT細胞TEERの低下やMBMEC機能障害およびバリア破壊の定量的な尺度を提供するCCLの増加を誘導します。技術非侵襲的である：それは、EC単層の主要な乱れを防ぐビルトインの代わりに箸電極を、使用しています。細胞マーカーを使用することなく、バリア機能を監視するために使用することができます。これは、自動化された方法で連続測定を行うと同時に、時間をかけて2バリアパラメータ（TEERとCCL）の独立した評価を可能にします。この方法はまた、別のT細胞活性化のレベルとのECのようなT細胞の効果を区別するのに十分な感度です。 これは、機能的アッセイの広い範囲で使用することができる：炎症プロセスに関与する種々のサイトカインおよび/またはケモカインはMBMECs及びT細胞の共培養物に添加することができます。 ECまたはT細胞側のいずれかの細胞接着分子に対するブロッキング抗体を使用することができます。およびT細胞活性化マーカーの、またはそれらの細胞傷害特性の阻害剤は、T細胞プライミングまたは電気部品との共培養の間に添加することができます。アッセイはまた、T細胞の遊出するのに便利ですこれはT細胞の添加前にMBMEC単層の完全性の品質管理としての役割を果たすことができるようにアッセイ。このすべてが、この方法EC単層の完全性に活性化T細胞の効果に焦点を当てて、in vitroで BBBを研究するための汎用性と信頼性の高いツールになります。これは、自己反応、脳炎誘発性T細胞がBBBを横断し、炎症および神経損傷を引き起こすMS、その動物モデルEAEなどの自己免疫疾患の病因にBBB破壊のメカニズムを理解するために特に重要です。

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>cellZscope</td>
			<td>nanoAnalytics GmbH</td>
			<td>www.nanoanalytics.com</td>
			<td>including: 24-well Cell Module, Controller, PC with cellZscope software v2.2.2&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ultracentrifuge</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>www.thermoscientific.com</td>
			<td>SORVALL RC 6+; rotor F21S-8x50y; for MBMEC isolation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>flow cytometer</td>
			<td>Beckman Coulter</td>
			<td>www.beckmancoulter.com</td>
			<td>for analysis of T cell transmigration</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FlowJo7.6.5 software</td>
			<td>Tree Star</td>
			<td>www.flowjo.com</td>
			<td>for analysis of T cell transmigration</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Oak Ridge centrifuge tubes, PC</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>3118-0050</td>
			<td>50 ml; for MBMEC isolation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Transwell membrane inserts - pore size 0.4 &#181;m</td>
			<td>Corning</td>
			<td>3470</td>
			<td>for TEER measurement as the main readout</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Transwell membrane inserts - pore size 3 &#181;m</td>
			<td>Corning</td>
			<td>3472</td>
			<td>for TEER measurement as the quality control prior to T-cell transmigration assay</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>24-well cell culture plate</td>
			<td>Greiner</td>
			<td>650 180</td>
			<td>flat-bottom; for MBMEC culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>96-well cell culture plate</td>
			<td>Costar</td>
			<td>3526</td>
			<td>round-bottom; for immune cell culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>QuadroMACS Separator</td>
			<td>Miltenyi Biotec</td>
			<td>130-090-976</td>
			<td>for T cell and B cell isolation; supports MACS LS columns</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>OctoMACS Separator</td>
			<td>Miltenyi Biotec</td>
			<td>130-042-109</td>
			<td>for dendritic cell isolation; supports MACS MS columns</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Neubauer counting chamber</td>
			<td>Marienfeld</td>
			<td>MF-0640010</td>
			<td>for cell counting</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell strainer, 70 &#181;m</td>
			<td>Corning</td>
			<td>352350</td>
			<td>for immune cell isolation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell strainer, 40 &#181;m</td>
			<td>Corning</td>
			<td>352340</td>
			<td>for immune cell isolation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MACS MultiStand</td>
			<td>Miltenyi Biotec</td>
			<td>130-042-303</td>
			<td>for immune cell isolation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MACS LS separation columns</td>
			<td>Miltenyi Biotec</td>
			<td>130-042-401</td>
			<td>for T cell and B cell isolation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MACS MS separation columns</td>
			<td>Miltenyi Biotec</td>
			<td>130-042-201</td>
			<td>for dendritic cell isolation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mouse CD4 MicroBeads</td>
			<td>Miltenyi Biotec</td>
			<td>130-049-201</td>
			<td>for CD4+ T cell isolation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mouse CD19 MicroBeads</td>
			<td>Miltenyi Biotec</td>
			<td>130-052-201</td>
			<td>for B cell isolation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mouse CD11c MicroBeads</td>
			<td>Miltenyi Biotec</td>
			<td>130-052-001</td>
			<td>for dendritic cell isolation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Collagen type IV from human placenta</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>C5533</td>
			<td>for MBMEC coating solution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fibronectin from bovine plasma</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>F1141-5MG</td>
			<td>for MBMEC coating solution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Collagenase 2 (CSL2)</td>
			<td>Worthington</td>
			<td>LS004176</td>
			<td>for MBMEC isolation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Collagenase/Dispase (C/D)</td>
			<td>Roche</td>
			<td>11097113001</td>
			<td>for MBMEC isolation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DNase I</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>DN25</td>
			<td>for MBMEC isolation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal Bovine Serum (FBS)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>F7524</td>
			<td>for MBMEC isolation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bovine Serum Albumin (BSA)</td>
			<td>Amresco</td>
			<td>0332-100G</td>
			<td>for MBMEC isolation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Percoll</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P1644-1L</td>
			<td>for MBMEC isolation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM (+ GlutaMAX)</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>31966-021</td>
			<td>for MBMEC isolation and MBMEC culture medium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin/Streptomycin</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P4333</td>
			<td>for MBMEC isolation and MBMEC culture medium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphate-Buffered Saline (PBS)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>D8537</td>
			<td>for MBMEC and immune cell isolation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Heparin</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>H3393</td>
			<td>for MBMEC culture medium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Human Basic Fibroblast Growth Factor (bFGF)</td>
			<td>PeproTech</td>
			<td>100-18B</td>
			<td>for MBMEC culture medium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Puromycin</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P8833</td>
			<td>for MBMEC culture medium; only for the first three days</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>0.05% Trypsin-EDTA</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>25300-054</td>
			<td>for harvesting MBMECs</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Collagenase Type IA</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>C9891</td>
			<td>for dendritic cell isolation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypan Blue solution, 0.4%</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>15250061</td>
			<td>for cell counting</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EDTA</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>E5134</td>
			<td>for immune cell isolation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>IMDM + 1% L-Glutamin</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>21980-032</td>
			<td>for T cell culture medium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>X-VIVO 15</td>
			<td>Lonza</td>
			<td>BE04-418Q</td>
			<td>protect from light; for B cell culture medium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&#946;-mercaptoethanol</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>31350-010</td>
			<td>for B cell culture medium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-Glutamine (100x Glutamax)</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>35050-061</td>
			<td>for B cell culture medium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>mouse MOG35&#8212;55 peptide</td>
			<td>Biotrend</td>
			<td>BP0328</td>
			<td>for antigen-specific T cell activation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>purified anti-mouse CD3 Ab</td>
			<td>BioLegend</td>
			<td>100302</td>
			<td>clone 145-2C11; for polyclonal T cell activation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>purified NA/LE anti-mouse CD28 Ab</td>
			<td>BD Pharmingen</td>
			<td>553294</td>
			<td>clone 37.51; for polyclonal T cell activation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Recombinant Murine IFN-&#947;</td>
			<td>PeproTech</td>
			<td>315-05</td>
			<td>for T-cell transmigration assays</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Recombinant Murine TNF-&#945;</td>
			<td>PeproTech</td>
			<td>315-01A</td>
			<td>for T-cell transmigration assays</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NA/LE purified anti-mouse IFN-&#947; antibody</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>554408</td>
			<td>clone XMG1.2; recommended final concentration: 20 &#181;g/ml</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Granzyme B Inhibitor II</td>
			<td>Calbiochem</td>
			<td>368055</td>
			<td>recommended final concentration: 10 &#181;M</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PE anti-mouse CD4 antibody</td>
			<td>Biolegend</td>
			<td>116005</td>
			<td>clone RM4-4; for analysis of T cell transmigration</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

an in vitro model of the blood-brain barrier using impedance spectroscopy: a focus on t cell-endothelial cell interaction

Breakdown of the blood-brain barrier (BBB) is a critical step in the development of autoimmune diseases such as multiple sclerosis (MS) and its animal model experimental autoimmune encephalomyelitis (EAE). This process is characterized by the transmigration of activated T cells across brain endothelial cells (ECs), the main constituents of the BBB. However, the consequences on brain EC function upon interaction with such T cells are largely unknown. Here we describe an assay that allows for the evaluation of primary mouse brain microvascular EC (MBMEC) function and barrier integrity during the interaction with T cells over time. The assay makes use of impedance cell spectroscopy, a powerful tool for studying EC monolayer integrity and permeability, by measuring changes in transendothelial electrical resistance (TEER) and cell layer capacitance (Ccl). In direct contact with ECs, stimulated but not na&#239;ve T cells are capable of inducing EC monolayer dysfunction, as visualized by a decrease in TEER and an increase in Ccl. The assay records changes in EC monolayer integrity in a continuous and automated fashion. It is sensitive enough to distinguish between different strengths of stimuli and levels of T cell activation and it enables the investigation of the consequences of a targeted modulation of T cell-EC interaction using a wide range of substances such as antibodies, pharmacological reagents and cytokines. The technique can also be used as a quality control for EC integrity in in vitro T-cell transmigration assays. These applications make it a versatile tool for studying BBB properties under physiological and pathophysiological conditions.

図1は、T細胞および内皮細胞間の相互作用を研究するために使用されるのin vitro BBBモデルの一般的な概要を提供します。実験は、次の3つの主要手順で構成されています。最初のステップは、脳皮質からの一次MBMECsの単離、および5日間彼らの文化です。それらは、細胞培養プレート中でコンフルエンスに達したとき、MBMECsをトリプシン処理し、次い...

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An In Vitro Model of the Blood-brain Barrier Using Impedance Spectroscopy: A Focus on T Cell-endothelial Cell Interaction

Here, we describe an in vitro murine model of the blood-brain barrier that makes use of impedance cell spectroscopy, with a focus on the consequences on endothelial cell integrity and permeability upon interaction with activated T cells.

アン<em&gt;インビトロ</em&gt;インピーダンス分光法を用いた血液脳関門のモデル：T細胞 - 内皮細胞の相互作用に焦点を当て

Breakdown of the blood-brain barrier (BBB) is a critical step in the development of autoimmune diseases such as multiple sclerosis (MS) and its animal ...

Research

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