Name: in vivo study of human endothelial-pericyte interaction using the matrix gel plug assay in mouse
Uploaded: 2016-12-19T14:00:00
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Dr. K. Yuan was supported by an American Heart Association Scientist Development Grant (15SDG25710448) and the Pulmonary Hypertension Association Proof of Concept Award (SPO121940). Dr. V. de Jesus Perez was supported by a career development award from the Robert Wood Johnson Foundation, an NIH K08 HL105884-01 award, a Pulmonary Hypertension Association Award, a Biomedical Research Award from the American Lung Association and a Translational Research and Applied Medicine award from Stanford University.

Declaración de Ética: Los procedimientos que implican sujetos animales han sido aprobados por el Cuidado de Animales institucional y el empleo de la Facultad de Medicina de la Universidad de Stanford. NOTA: Los animales están bajo anestesia con isoflurano al 3% vaporizador y suministro de 3% de gas O2. El uso de ungüento veterinario en los ojos puede ayudar a prevenir la sequedad, mientras que bajo anestesia. 1. Preparación de la célula <ol><li> Crecer cultivos de células endoteliales...

<ol>
	<li>Risau, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mechanisms+of+angiogenesis.">Mechanisms of angiogenesis.</a> Nature. 386 (6626), 671-674 (1997).</li><li>Ribatti, D., Nico, B., Crivellato, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+role+of+pericytes+in+angiogenesis.">The role of pericytes in angiogenesis.</a> Int J Dev Biol. 55 (3), 261-268 (2011).</li><li>Koh, W., Stratman, A. N., Sacharidou, A., Davis, G. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vitro+three+dimensional+collagen+matrix+models+of+endothelial+lumen+formation+during+vasculogenesis+and+angiogenesis.">In vitro three dimensional collagen matrix models of endothelial lumen formation during vasculogenesis and angiogenesis.</a> Methods Enzymol. 443, 83-101 (2008).</li><li>Liu, Y., Senger, D. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Matrix-specific+activation+of+Src+and+Rho+initiates+capillary+morphogenesis+of+endothelial+cells.">Matrix-specific activation of Src and Rho initiates capillary morphogenesis of endothelial cells.</a> FASEB J. 18 (3), 457-468 (2004).</li><li>Grant, D. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Interaction+of+endothelial+cells+with+a+laminin+A+chain+peptide+(SIKVAV)+in+vitro+and+induction+of+angiogenic+behavior+in+vivo.">Interaction of endothelial cells with a laminin A chain peptide (SIKVAV) in vitro and induction of angiogenic behavior in vivo.</a> J Cell Physiol. 153 (3), 614-625 (1992).</li><li>Madri, J. A., Pratt, B. M., Tucker, A. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Phenotypic+modulation+of+endothelial+cells+by+transforming+growth+factor-beta+depends+upon+the+composition+and+organization+of+the+extracellular+matrix.">Phenotypic modulation of endothelial cells by transforming growth factor-beta depends upon the composition and organization of the extracellular matrix.</a> J Cell Biol. 106 (4), 1375-1384 (1988).</li><li>Brooks, P. C., Montgomery, A. M., Cheresh, D. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Use+of+the+10-day-old+chick+embryo+model+for+studying+angiogenesis.">Use of the 10-day-old chick embryo model for studying angiogenesis.</a> Methods Mol Biol. 129, 257-269 (1999).</li><li>Yuan, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Activation+of+the+Wnt/planar+cell+polarity+pathway+is+required+for+pericyte+recruitment+during+pulmonary+angiogenesis.">Activation of the Wnt/planar cell polarity pathway is required for pericyte recruitment during pulmonary angiogenesis.</a> Am J Pathol. 185 (1), 69-84 (2015).</li><li>Johns, A., Freay, A. D., Fraser, W., Korach, K. S., Rubanyi, G. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Disruption+of+estrogen+receptor+gene+prevents+17+beta+estradiol-induced+angiogenesis+in+transgenic+mice.">Disruption of estrogen receptor gene prevents 17 beta estradiol-induced angiogenesis in transgenic mice.</a> Endocrinology. 137 (10), 4511-4513 (1996).</li><li>Chen, C. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+pericytes+for+ischemic+heart+repair.">Human pericytes for ischemic heart repair.</a> Stem Cells. 31 (2), 305-316 (2013).</li><li>Richards, O. C., Raines, S. M., Attie, A. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+role+of+blood+vessels,+endothelial+cells,+and+vascular+pericytes+in+insulin+secretion+and+peripheral+insulin+action.">The role of blood vessels, endothelial cells, and vascular pericytes in insulin secretion and peripheral insulin action.</a> Endocr Rev. 31 (3), 343-363 (2010).</li><li>Ricard, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Increased+pericyte+coverage+mediated+by+endothelial-derived+fibroblast+growth+factor-2+and+interleukin-6+is+a+source+of+smooth+muscle-like+cells+in+pulmonary+hypertension.">Increased pericyte coverage mediated by endothelial-derived fibroblast growth factor-2 and interleukin-6 is a source of smooth muscle-like cells in pulmonary hypertension.</a> Circulation. 129 (15), 1586-1597 (2014).</li><li>Buchwalow, I. B., Bocker, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Immunohistochemistry: Basics and Methods. , 1-153 (2010).</li><li>Tata, D. A., Anderson, B. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+new+method+for+the+investigation+of+capillary+structure.">A new method for the investigation of capillary structure.</a> J Neurosci Methods. 113 (2), 199-206 (2002).</li></ol>

El ensayo de tapón de gel de matriz ha demostrado ser un método conveniente y potente para evaluar la regulación de genes en la angiogénesis, los compuestos angiogénicos y antiangiogénicos en vivo, y como complemento a las pruebas in vitro. A continuación, describimos en detalle un nuevo ensayo tapón de gel de la matriz de la angiogénesis humana que investiga la interacción entre las células endoteliales y pericitos durante la formación de los vasos. Ha...

La angiogénesis es el proceso por el que los nuevos vasos sanguíneos se forman a partir de una red vascular preexistente 1 y es el foco de la investigación en curso a través de muchas áreas que van desde el desarrollo normal a la enfermedad. Este proceso dinámico implica la proliferación y migración de células endoteliales (EC) y el reclutamiento de pericitos para la construcción de un tubo vascular que se dirige hacia el sitio que necesita oxígeno y nutrientes 2. Para estudiar este proceso requiere un ensayo igualmente dinámico, lo más importante que puede recapitular la naturaleza tridimensional de la formación del tubo. Los ensayos in vitro de la matriz 3D se han desarrollado para hacer frente a esta necesidad y han funcionado bien para permitir que los investigadores definir los pasos discretos en el espacio y el tiempo en el que tiene lugar la angiogénesis 3, 4, 5, 6. Sin embargo, estos modelos matriciales en 3D in vitro se limitan a estudiar los vasos no perfundidos unad por lo tanto, carecen de los componentes críticos pertinentes para el proceso de angiogénesis (por ejemplo, haciendo circular el crecimiento y factores inhibidores, la tensión antinatural / fuerzas a través del lecho vascular) y dejar de simular el complejo entorno presente en el tejido vivo. Para hacer frente a esta limitación, varios ensayos de angiogénesis in vivo se han desarrollado 7, incluyendo el ensayo de tapón de gel de matriz que será el tema central de nuestro informe 8, 9. El ensayo de tapón de gel de matriz es un ensayo de angiogénesis in vivo bien establecido que atrae a los investigadores, ya que proporciona una plataforma sólida para probar las funciones de las diferentes células y sustancias en la angiogénesis. gel Matrix es una solución de membrana basal disponibles en el mercado que es secretada por la línea celular de sarcoma de ratón de Engelbreth-Holm-Swarm (EHS) que se solidifica en un material similar a un gel a 37 ° C. El gel de matriz puede mezclarse con células y / o sustancias, tales como factores de crecimiento, y injected por vía subcutánea en el ratón. El anfitrión EC invadirá el tapón de más de 14 días, formar una red vascular, y se convierten en perfusión de la sangre del huésped. Hasta la fecha, los ensayos tapón de gel de matriz se han centrado exclusivamente en el estudio del comportamiento de las células endoteliales durante la angiogénesis, sin embargo, a lo mejor de nuestro conocimiento todavía no se ha hecho ningún esfuerzo para determinar si este ensayo puede usarse células endoteliales de co-cultivo y pericitos para estudiar cómo interactúan estos dos tipos de células durante la angiogénesis. Específicamente, la comprensión de la relación entre la EC y pericitos es valioso para el estudio de enfermedades en las que la pérdida de vasos sanguíneos es patológica, incluyendo isquemia microvascular y enfermedad vascular periférica 10, 11, 12. A continuación, se describe un protocolo que introduce pericitos derivadas de seres humanos a la mezcla de gel de la matriz junto con EC humana y el factor de crecimiento de fibroblastos (bFGF). Esta mezcla luego se puede inyectar por vía subcutánea in el dorso de ratones SCID para permitir la formación de vasos híbridos, totalmente funcionales, con recubrimiento de pericitos. Nuestro protocolo se describe cómo preparar tapones de gel de matriz que contienen EC humanos, ya sea con o sin pericitos humanos, la colocación en ratones SCID y cómo analizar los cortes histológicos de los puntos finales de la angiogénesis críticos.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="806">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:405px;">PBS (Phosphate buffered saline)</td>
			<td style="width:115px;">Corning</td>
			<td style="width:119px;">21-031-CV</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:405px;">0.25% Trypsin/0.53mM EDTA</td>
			<td style="width:115px;">Corning</td>
			<td style="width:119px;">25-053-CI</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:405px;">Endothelial Cell Media (ECM) kit</td>
			<td style="width:115px;">Sciencell</td>
			<td style="width:119px;">1001</td>
			<td>includes media, EC growth supplement, and penicillin/streptomycin, each supplied at the appropriate volume for easy mixing</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:405px;">Pericyte Media (PM) kit</td>
			<td style="width:115px;">Sciencell</td>
			<td style="width:119px;">1201</td>
			<td>includes media, Pericyte growth supplement, and penicillin/streptomycin, each supplied at the appropriate volume for easy mixing</td>
		</tr>
		<tr height="84">
			<td height="84" style="height:84px;width:405px;">primary human pulmonary microvascular endothelial cells</td>
			<td style="width:115px;">Pulmonary Hypertension Breakthrough Initiative</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td>this cell type is also available commercially. Cells used at passage 1-4</td>
		</tr>
		<tr height="84">
			<td height="84" style="height:84px;width:405px;">primary human pulmonary pericytes</td>
			<td style="width:115px;">Pulmonary Hypertension Breakthrough Initiative</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td>this cell type is not available commercially, but brain paricytes are.&#160; Cells used at passage 1-4</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:405px;">bFGF (basic Fibroblast Growth Factor)</td>
			<td style="width:115px;">Peprotech</td>
			<td style="width:119px;">100-18B</td>
			<td>stock solution is 50ug/ml in 0.1% BSA in PBS, aliquots at 50 uL and stored at -20 degrees</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:405px;">Matrigel Basement Membrane Matrix</td>
			<td style="width:115px;">BD</td>
			<td style="width:119px;">356237</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:405px;">28G 1cc Insluin Syringe</td>
			<td style="width:115px;">BD</td>
			<td style="width:119px;">329410</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:405px;">SCID (Severe Combined Immune Deficiency) mice</td>
			<td style="width:115px;">The Jackson Laboratory</td>
			<td>5557</td>
			<td>NOD.SCID IL2R gamma knockout strain is the best strain; 4-6 weeks of age</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:405px;">1.5mL microcentrifuge tubes, sterile</td>
			<td style="width:115px;">Thermo Fisher Scientific</td>
			<td style="width:119px;">05-408-129</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:405px;">15 mL screw top tubes, sterile</td>
			<td style="width:115px;">BD Biosciences</td>
			<td style="width:119px;">352096</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:405px;">PAP pen</td>
			<td style="width:115px;">Life Technologies</td>
			<td style="width:119px;">8899</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:405px;">hemocytometer</td>
			<td style="width:115px;">ThermoFisher Scientific</td>
			<td style="width:119px;">02-671-6</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:405px;">Nair hair removal cream</td>
			<td style="width:115px;">Walmart</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:405px;">anti-human CD31 primary antibody</td>
			<td style="width:115px;">LifeSpan Biosciences</td>
			<td>LS-B4737</td>
			<td>working solution is 1:50</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">anti-human Smooth Muscle actin CY3 primary fluorescent antibody</td>
			<td style="width:115px;">Sigma</td>
			<td>C6198</td>
			<td>working solution is 1:300</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;">goat anti-rabbit secondary antibody; 488/green</td>
			<td style="width:115px;">ThermoFisher Scientific</td>
			<td style="width:119px;">A-11008</td>
			<td>working solution is 1:250</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:405px;">Prolong Gold DAPI solution</td>
			<td style="width:115px;">Cell Signaling</td>
			<td style="width:119px;">8961S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:405px;">microscope slides</td>
			<td style="width:115px;">VWR</td>
			<td style="width:119px;">48300-047</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:405px;">no. 1.5 cover slips</td>
			<td style="width:115px;">Thermo Fisher Scientific</td>
			<td style="width:119px;">12-544-D</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:405px;">citrate buffer 10x</td>
			<td style="width:115px;">Millipore</td>
			<td style="width:119px;">21545</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:405px;">extra fine surgical scissors</td>
			<td style="width:115px;">Fine Science Tools</td>
			<td style="width:119px;">14084-08</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:405px;">Formalin (paraformaldehyde)</td>
			<td style="width:115px;">Thermo Fisher Scientific</td>
			<td style="width:119px;">245-685</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:405px;">Tissue cassettes</td>
			<td style="width:115px;">Simport</td>
			<td>M492-12</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:405px;">goat serum</td>
			<td style="width:115px;">Dako</td>
			<td style="width:119px;">X0907</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

in vivo study of human endothelial-pericyte interaction using the matrix gel plug assay in mouse

Angiogenesis is the process by which new blood vessels are formed from existing vessels. New vessel growth requires coordinated endothelial cell proliferation, migration, and alignment to form tubular structures followed by recruitment of pericytes to provide mural support and facilitate vessel maturation. Current in vitro cell culture approaches cannot fully reproduce the complex biological environment where endothelial cells and pericytes interact to produce functional vessels. We present a novel application of the in vivo matrix gel plug assay to study endothelial-pericyte interactions and formation of functional blood vessels using severe combined immune deficiency mutation (SCID) mice. Briefly, matrix gel is mixed with a solution containing endothelial cells with or without pericytes followed by injection into the back of anesthetized SCID mice. After 14 days, the matrix gel plugs are removed, fixed and sectioned for histological analysis. The length, number, size and extent of pericyte coverage of mature vessels (defined by the presence of red blood cells in the lumen) can be quantified and compared between experimental groups using commercial statistical platforms. Beyond its use as an angiogenesis assay, this matrix gel plug assay can be used to conduct genetic studies and as a platform for drug discovery. In conclusion, this protocol will allow researchers to complement available in vitro assays for the study of endothelial-pericyte interactions and their relevance to either systemic or pulmonary angiogenesis.

Representante tinción H &amp; E y de inmunofluorescencia de secciones tapón de gel de la matriz se muestran en la Figura 2. Secciones de la CE únicamente las clavijas muestran algunos vasos que en su mayoría no son perfundidos con sangre (Figura 2 arriba a la izquierda, flechas negras), mientras que los tapones que contienen tanto las EC y los pericitos mostrar varios perfundidos vasos de mayor diámetro y la cobertura de pericitos completa, como se ...

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Se presenta un protocolo para estudiar las interacciones del endotelio de pericitos humanos en ratón usando una variación del ensayo de angiogénesis tapón de gel de matriz.

Estudio in vivo de Interacción Humano-endotelial de pericitos Utilización de Plug Ensayo matriz de gel en el ratón

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