Name: application of impermeable barriers combined with candidate factor soaked beads to study inductive signals in the chick
Uploaded: 2016-11-17T12:30:00
Duration: 8 min 4 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Application of Impermeable Barriers Combined with Candidate Factor Soaked Beads to Study Inductive Signals in the Chick at JoVE.com

This work was funded by MRC grant MC.PC_13052.

<ol>
	<li>Murillo-Ferrol, N. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Causal+study+of+the+earliest+differentiation+of+the+morphological+rudiments+of+the+extremities.+Experimental+analysis+on+bird+embryos.">Causal study of the earliest differentiation of the morphological rudiments of the extremities. Experimental analysis on bird embryos.</a> Acta Anat (Basel). 62 (1), 80-103 (1965).</li><li>Sweeney, R. M., Watterson, R. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rib+development+in+chick+embryos+analyzed+by+means+of+tantalum+foil+blocks).">Rib development in chick embryos analyzed by means of tantalum foil blocks).</a> Am J Anat. 126 (2), 127-149 (1969).</li><li>Kieny, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=On+the+relations+between+somatic+and+somatopleural+mesoderm+before+and+during+primary+induction+of+chick+embryo+limbs.">On the relations between somatic and somatopleural mesoderm before and during primary induction of chick embryo limbs.</a> C R Acad Sci Hebd Seances Acad Sci D. 268 (26), 3183-3186 (1969).</li><li>Pinot, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+role+of+the+somitic+mesoderm+in+the+early+morphogenesis+of+the+limbs+in+the+fowl+embryo.">The role of the somitic mesoderm in the early morphogenesis of the limbs in the fowl embryo.</a> J Embryol Exp Morphol. 23 (1), 109-151 (1970).</li><li>Eichele, G., Tickle, C., Alberts, B. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microcontrolled+release+of+biologically+active+compounds+in+chick+embryos:+beads+of+200-microns+diameter+for+the+local+release+of+retinoids.">Microcontrolled release of biologically active compounds in chick embryos: beads of 200-microns diameter for the local release of retinoids.</a> Anal Biochem. 142 (2), 542-555 (1984).</li><li>Cohn, M. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fibroblast+growth+factors+induce+additional+limb+development+from+the+flank+of+chick+embryos.">Fibroblast growth factors induce additional limb development from the flank of chick embryos.</a> Cell. 80 (5), 739-746 (1995).</li><li>Nishimoto, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=RA+Acts+in+a+Coherent+Feed-Forward+Mechanism+with+Tbx5+to+Control+Limb+Bud+Induction+and+Initiation.">RA Acts in a Coherent Feed-Forward Mechanism with Tbx5 to Control Limb Bud Induction and Initiation.</a> Cell Rep. 12 (5), 879-891 (2015).</li><li>Hamburger, V., Hamilton, H. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+series+of+normal+stages+in+the+development+of+the+chick+embryo.">A series of normal stages in the development of the chick embryo.</a> J Morphol. 88 (1), 49-92 (1951).</li><li>Stephens, T. D., McNulty, T. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evidence+for+a+metameric+pattern+in+the+development+of+the+chick+humerus.">Evidence for a metameric pattern in the development of the chick humerus.</a> J Embryol Exp Morphol. 61, 191-205 (1981).</li><li>Strecker, T. R., Stephens, T. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Peripheral+nerves+do+not+play+a+trophic+role+in+limb+skeletal+morphogenesis.">Peripheral nerves do not play a trophic role in limb skeletal morphogenesis.</a> Teratology. 27 (2), 159-167 (1983).</li><li>Riddle, R. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sonic+hedgehog+mediates+the+polarizing+activity+of+the+ZPA.">Sonic hedgehog mediates the polarizing activity of the ZPA.</a> Cell. 75 (7), 1401-1416 (1993).</li><li>Ng, J. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+limb+identity+gene+Tbx5+promotes+limb+initiation+by+interacting+with+Wnt2b+and+Fgf10.">The limb identity gene Tbx5 promotes limb initiation by interacting with Wnt2b and Fgf10.</a> Devel. 129 (22), 5161-5170 (2002).</li><li>Takeuchi, J. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tbx5+and+Tbx4+trigger+limb+initiation+through+activation+of+the+Wnt/Fgf+signaling+cascade.">Tbx5 and Tbx4 trigger limb initiation through activation of the Wnt/Fgf signaling cascade.</a> Devel. 130 (12), 2729-2739 (2003).</li><li>Lee, J., Tickle, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Retinoic+acid+and+pattern+formation+in+the+developing+chick+wing:+SEM+and+quantitative+studies+of+early+effects+on+the+apical+ectodermal+ridge+and+bud+outgrowth.">Retinoic acid and pattern formation in the developing chick wing: SEM and quantitative studies of early effects on the apical ectodermal ridge and bud outgrowth.</a> J Embryol Exp Morphol. 90, 139-169 (1985).</li><li>Tickle, C., Crawley, A., Farrar, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Retinoic+acid+application+to+chick+wing+buds+leads+to+a+dose-dependent+reorganization+of+the+apical+ectodermal+ridge+that+is+mediated+by+the+mesenchyme.">Retinoic acid application to chick wing buds leads to a dose-dependent reorganization of the apical ectodermal ridge that is mediated by the mesenchyme.</a> Devel. 106 (4), 691-705 (1989).</li><li>MacCabe, J. A., Parker, B. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evidence+for+a+gradient+of+a+morphogenetic+substance+in+the+developing+limb.">Evidence for a gradient of a morphogenetic substance in the developing limb.</a> Dev Biol. 54 (2), 297-303 (1976).</li><li>Summerbell, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+zone+of+polarizing+activity:+evidence+for+a+role+in+normal+chick+limb+morphogenesis.">The zone of polarizing activity: evidence for a role in normal chick limb morphogenesis.</a> J Embryol Exp Morphol. 50, 217-233 (1979).</li><li>Wilde, S. M., Wedden, S. E., Tickle, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Retinoids+reprogramme+pre-bud+mesenchyme+to+give+changes+in+limb+pattern.">Retinoids reprogramme pre-bud mesenchyme to give changes in limb pattern.</a> Devel. 100 (4), 723-733 (1987).</li></ol>

The authors declare they have no competing financial interests.

Nous décrivons l&#39;utilisation de barrières imperméables pour empêcher le membre formation des bourgeons dans l&#39;embryon de poulet. Cette technique présente un certain nombre d&#39;étapes critiques. Après des expériences préliminaires, nous avons constaté que les barrières en forme de charnière utilisés dans 9, 10 restent en place dans l&#39;embryon beaucoup mieux que les barrières droites. La face distale plate de la barrière adhère à la membrane vitelline et maintient la barrière en place (figure 2C). Une préparation minutieuse de la charnière barrières en forme de feuille d&#39;aluminium comme décrit dans le protocole étape 1.6 est essentielle à la réussite de l&#39;opération. Une deuxième étape importante consiste à veiller à ce que les œufs ne sont pas exclus de l&#39;incubateur pendant trop longtemps suivant fenêtrage et la mise en scène avant de faire fonctionner sur l&#39;embryon. Dans notre expérience, les embryons survivent une opération mieux si elles sont à ou près de la température d&#39;incubation lorsque l&#39;opération est effectuée. Les opérations doivent donc être effectués aussi rapidement que possible et les oeufs rapidement refermésly pour assurer un bon taux de survie. De nombreux chercheurs ajoutent une goutte d&#39;antibiotiques pour l&#39;embryon suivant microchirurgie avant de retourner les œufs dans l&#39;incubateur. La présence du liquide empêche les barrières se collent bien en place. L&#39;addition d&#39;un antibiotique pourrait également déloger des perles après le placement. Donc pas l&#39;utilisation d&#39;antibiotiques, des opérations rapides et une bonne propreté des instruments est recommandé d&#39;éviter l&#39;infection. Essuyant instruments avec 70% d&#39;éthanol après chaque étape d&#39;une opération est essentielle pour prévenir les instruments de devenir collant de contact avec la membrane vitelline qui peut provoquer à la fois des barrières ou des perles à adhérer à une pince (voir protocole étape 3.1.2.2). Les deux variétés de perles utilisées pourraient tomber sur place après l&#39;opération. Lorsque la position de la barrière a été vérifiée le lendemain, il n&#39;a pas été possible de voir à travers la barrière de vérifier si le cordon est resté en place ou non. Dans les cas où le cordon était tombé sur des bourgeons de l&#39;aile excroissance n&#39;a pas été sauvé ( <strong&gt; Tableau 1). Éviter le transfert du liquide avec le bourrelet lors de leur implantation signifie que des perles collent plus facilement à la face de la LPM de coupe (voir protocole 2.3.2.3). Enfin assurant que les embryons sont fixés immédiatement après la récolte est essentielle à une bonne analyse ultérieure de l&#39;expression des gènes (voir protocole étape 4.2). Ce protocole modifie les expériences publiées antérieurement qui ont utilisé des barrières pour empêcher bourgeon de membre initiation, définit des largeurs optimales spécifiques pour les barrières et introduit la combinaison barrière et le placement de perles suivie d&#39;une analyse de l&#39;expression des gènes. Nous avons trouvé en utilisant une feuille d&#39;aluminium classique, qui est pas cher et facilement disponible dans tous les laboratoires, produit des résultats égaux à ceux qui utilisaient auparavant une feuille de tantale. La feuille peut être laissé dans l&#39;embryon lors de la réalisation d&#39; une hybridation in situ (figure 2C) en général , mais nous enlever si plus d&#39;un embryon est en cours de traitement afin d&#39; éviter les arêtes vives de la feuille d&#39; endommager les embryons. PDes études ont démontré ilot que la largeur des barrières de la région de la jambe est particulièrement importante. Au départ, les obstacles mis à l&#39;essai étaient trop courts et la jambe bourgeon excroissance n&#39;a pas été empêché. 1,2-1,3 mm est la largeur optimale pour une barrière pour bloquer la jambe bourgeon excroissance complètement. Les barrières les plus étroites de l&#39;aile que l&#39;on peut placer avec précision pour empêcher l&#39;excroissance des bourgeons donnent les meilleurs taux de survie. Cela peut être aussi étroite que 0,5-0,7 mm. Cependant, les obstacles qui sont un peu plus larges sont plus susceptibles d&#39;entraîner un blocage complet de l&#39;aile bourgeon excroissance car ils permettent un peu de l&#39;inexactitude du placement (nous avons utilisé 0,7-1 mm). Prévention des vaisseaux sanguins lors de l&#39;incision est critique pour les barrières au niveau des bourgeons de l&#39;aile. barrières semi-perméables ont déjà été utilisés pour bisect le bourgeon poussin membre. MacCabe et Parker, 1976 et Summerbell 1979 filtres utilisés à la fois 0,45 um et 0,8 um taille des pores, respectivement 16, 17. Ils ont indiqué que les signaux diffusibles pourraient passer à travers les pores dans les filtres et querésultats obtenus en utilisant des barrières semi-perméables étaient à mi-chemin entre un bourgeon de membre sans barrière présente et une avec une barrière de feuille de tantale imperméable. Ce protocole peut être adapté pour utiliser des barrières semi-perméables de différentes tailles de pores pour différencier les signaux candidats en fonction de la taille ou de modifier la dynamique de la diffusion du signal. Ce protocole comporte des limites principalement associées à l&#39;organisme modèle lui-même. Ces techniques pourraient être utilisées pour sonder d&#39;autres questions dans le développement des membres ainsi que d&#39;autres questions de l&#39;embryogenèse des vertébrés. Une condition est que l&#39;organe / zone en question devrait développer lorsque l&#39;embryon de poulet est accessible à l&#39;intervention. La présence de gros vaisseaux sanguins dans la zone où une barrière doit être placée rend le placement de barrière plus tard que le stade 13 ou 14 techniquement difficile. Si les gros vaisseaux sanguins sont coupés lors de la pose de barrière cela peut entraîner une mortalité embryonnaire. Notre enquête quand les facteurs de transcription TBX5 et Tbx4 sont induits en premier dans la LPM a été limitée par la première étape à laquelle nous pourrions placer une barrière qui allait plus tard se retrouver en face soit l&#39;aile ou de la jambe bud respectivement. Il pourrait être éclairant pour tenter de bloquer Tbx induction du gène à des stades précoces, plus proche de la gastrulation. La première barrière pourrait être placée dans la région de l&#39;aile présomptif était avec succès l&#39;étape 8 et à l&#39;étape de la région de la jambe 10. Ce protocole est probablement pas adapté à l&#39;étude de l&#39;expression génique au-delà des étapes branche bourgeon parce que la croissance rapide ultérieure entraînerait le déplacement de la barrière et les résultats ne porterait que sur la position initiale de la barrière. Après avoir lié les limites de l&#39;embryon de poulet, dans ce contexte, de ses avantages par rapport à d&#39;autres organismes modèles vertébrés sont nombreux. L&#39;embryon de poulet est un modèle animal bien adapté à ce type d&#39;intervention physique dans un embryon de vertébré. Les embryons sont relativement importants et sont facilement accessibles through la coquille. On peut revenir à l&#39;embryon pour une expérimentation plus poussée (par exemple, la suppression d&#39;un cordon 18 ou même une barrière) ou pour vérifier les progrès en retirant simplement la fenêtre de la bande. Il est possible possible d&#39;inclure l&#39;imagerie en direct ou à la prescription imagerie en temps. Nous décrivons une méthode de fenêtrage des œufs de poule qui est particulièrement adaptée à l&#39;exploitation sur les embryons à un stade précoce. Dans le cas des études des membres, il est très important et utile qu&#39;il y ait un membre de commande controlatéral pour chaque expérience qui sert de contrôle interne idéal pour chaque répétition biologique. La combinaison de l&#39;utilisation de barrières imperméables pour empêcher la croissance du membre et des billes trempées dans des molécules de signalisation n&#39;a pas été signalée auparavant. Notre analyse de l&#39;expression de l&#39;ARNm suite de ces interventions est également nouvelle. Ces techniques nous ont permis de disséquer le problème difficile du moment branche transcription spécifique des facteurs Tbx5 et Tbx4 sont induits dans la LPM et aussipour montrer que plus tard, avant Elaguez initiation bourgeon, la présence de ces gènes TBX dans la LPM ne suffit pas pour l&#39;activation de la transcription Fgf10 et le début du bourgeon de membre excroissance. Les figures 2G, 2D et 2E illustrent bien ces résultats. L&#39;absence d&#39;expression de Tbx4 suite à l&#39;insertion d&#39;une barrière à l&#39; étape 10 de la figure 2G est en contraste frappant avec sa présence en 2D et 2E après l&#39; insertion de barrière à l&#39; étape 15, après l&#39;induction de Tbx4. L&#39;implantation de billes RA imbibés facilité le sauvetage de bourgeon de membre initiation après l&#39;insertion de la barrière et donc des points à RA des somites étant essentiel dans la LPM avant bourgeon de membre excroissance peut commencer. Ces techniques pourraient être utilisées pour résoudre d&#39;autres questions dans le développement des membres, mais aussi d&#39;autres questions de vertébrés embryogenèse. Les zones du cerveau, des yeux et du tronc sont susceptibles de convenir.

embryologistes classiques traditionnellement employées techniques physiques pour interroger les mécanismes contrôlant le développement embryonnaire. Dans les années 1960 et 1970 chercheurs ont développé des techniques qui utilisent des barrières imperméables insérées entre les tissus de l&#39;embryon en développement afin de démontrer l&#39;importance des signaux inductifs pendant l&#39;embryogenèse. Notre intérêt est de vertébrés développement des membres et en particulier les événements qui précèdent bourgeon de membre excroissance. Par exemple, l&#39;insertion d&#39;une barrière peut empêcher bourgeon de membre excroissance de se produire sur un côté de l&#39;embryon de poulet tout en lui permettant de procéder normalement sur le côté controlatéral non opéré. Les matériaux utilisés pour rendre ces barrières variées; par exemple, des plaques de mica et de tantale feuille 1 2. Ces barrières séparent efficacement le mésoderme latéral (LPM), à partir duquel la forme de bourgeon branche, à partir des somites formés à partir du mésoderme paraxial. techniques de greffage chirurgicales démontrent que étroite association with l&#39;somites est essentielle si bourgeon de membre initiation doit se produire dans la LPM 3 4. Dans les années 80 et 90 les biologistes du développement ont découvert diffusible molécules qui sont essentielles dans le contrôle des processus de développement de signalisation. Perles imprégnées de ces molécules de signalisation peuvent être implantées dans des régions spécifiques de l&#39;embryon et produisent des altérations du développement embryonnaire. Par exemple, l&#39; acide rétinoïque (RA) pris par des billes d&#39;échange d&#39;ions est libéré sur une période de 24 heures lorsqu&#39;elle est implantée dans un embryon de poulet et peut produire image miroir duplication des chiffres 5. Perles acryliques héparine contenant des protéines de FGF peuvent initier bourgeon de membre excroissance de la interlimb LPM 6. Plus récemment , la souris et les poissons de la génétique ont pris l&#39;étude des vertébrés branche initiation à une nouvelle ère (revue dans 7). Il y a de bonnes preuves que RA présente dans les somites avant l&#39;initiation du bourgeon de membre est le signal diffusible essentiel requis par le LPM pour lancer membre bourgeonnement. Nous voulions exploiter l&#39;accessibilité et la robustesse expérimentale de l&#39;embryon de poulet à disséquer l&#39;effet de barrière implantation sur l&#39;expression génique dans le LPM au moment de l&#39;initiation du bourgeon de membre. Une nouvelle adaptation de notre méthode consiste à combiner une barrière qui bloque les signaux provenant de tissus axiaux avec le placement de talon latéral à la barrière à candidats d&#39;alimentation facteurs endogènes exogène qui ont été bloqués par la barrière. Les protocoles suivants sont ceux développés pour démêler les mécanismes de bourgeon de membre induction et d&#39;initiation. Étudier bourgeon de membre initiation signifie l&#39;utilisation d&#39;embryons à un stade précoce. De nombreux oeufs fenêtre chercheurs de poulet par première enlever une partie de l&#39;albumine à travers le sac d&#39;air avec une aiguille hypodermique. L&#39;embryon, qui se trouve au-dessus du jaune, alors mentir plus bas dans l&#39;œuf. Ceci est un avantage pour certaines techniques telles que l&#39;électroporation, mais peut être un inconvénient si la manipulation chirurgicale de l&#39;embryon est souhaitée.Nous trouvons ayons l&#39;embryon comme proche de l&#39;ouverture dans l&#39;œuf que possible est un avantage. Des questions demeurent en ce qui concerne les signaux qui contrôlent des membres des vertébrés bourgeon induction et l&#39;initiation et les protocoles suivants sont appropriés pour y faire face. Nous sommes les premiers à développer un protocole pour l&#39;insertion des barrières pour empêcher poussin bourgeon de membre excroissance à un stade plus précoce que l&#39; étape 12 8. Des versions modifiées de ces protocoles pourraient également être utilisés pour répondre à d&#39;autres questions sur l&#39;origine et le calendrier des signaux inductifs où un tissu inducteur accessible se trouve à côté de la primordium étant induite. Pourvu que la région de l&#39;embryon est accessible au stade de développement pertinent, une barrière pourrait être placée entre les deux tissus et les changements qui en découlent dans le développement étudiés. Des exemples peuvent être trouvés dans le développement du cerveau, l&#39;extension de l&#39;axe et le développement éventuellement un organe comme le foie ou les reins induction.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="926">
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:283px;">Dumont No.5 watchmakers forceps, x2&#160;</td>
			<td style="width:277px;">Fine Science Tools&#160; www.finescience.de</td>
			<td style="width:149px;">11251-20</td>
			<td style="width:217px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Dumont No.4 watchmakers forceps, x2&#160;&#160;&#160;</td>
			<td>Fine Science Tools&#160; www.finescience.de</td>
			<td>11241-30</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Dumont strong forceps, type AA&#160;&#160;</td>
			<td>Fine Science Tools&#160; www.finescience.de</td>
			<td>11210-10</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Curved scissors with blades 2.5 cm long</td>
			<td>Fine Science Tools&#160; www.finescience.de</td>
			<td>14061-11</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Blunt ended curved forceps,&#160;</td>
			<td>Fine Science Tools&#160; www.finescience.de</td>
			<td>11065-07</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">ends approx 0.5 cm long</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Steel pin, 0.2 mm wide</td>
			<td>Fine Science Tools&#160; www.finescience.de</td>
			<td>26002-20</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Sharpening stone, square</td>
			<td>Fine Science Tools&#160; www.finescience.de</td>
			<td>29008-01</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Mineral oil</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Needle holder</td>
			<td>Fine Science Tools&#160; www.finescience.de</td>
			<td>26016-12</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Clear tape, 50 mm x 66 m</td>
			<td>www.5staroffice.com</td>
			<td align="right">295985</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">FGF4 protein</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>A gift from Cliff Tabin.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">all-trans-retinoic acid</td>
			<td>Sigma&#160; www.sigmaaldrich.com</td>
			<td>R2625-50MG</td>
			<td>Remember to protect from light.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">BMS 493</td>
			<td>Sigma&#160; www.sigmaaldrich.com</td>
			<td>B6688-5MG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Scalpel blade No. 15</td>
			<td>www.swann-morton.com</td>
			<td>cat no. 0105</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Affi-Gel Blue, affinity chromatography gel</td>
			<td>Bio-Rad&#160; www.bio-rad.com</td>
			<td>153-7301</td>
			<td>Beads for delivering protein.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">AG1-X2 Ion exchange resin</td>
			<td>Bio-Rad&#160; www.bio-rad.com</td>
			<td>140-1251</td>
			<td>Beads for delivering RA or BMS 493.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Incubator for eggs</td>
			<td>Memmert&#160; www.hce-uk.com</td>
			<td>LAB128</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Paraformaldehyde (PFA)</td>
			<td>Sigma&#160; www.sigmaaldrich.com</td>
			<td>P6148-1KG</td>
			<td>Harmful, irritant, corrosive.&#160; Handle powder in fumehood with full protective clothing.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Ethanol</td>
			<td>Sigma&#160; www.sigmaaldrich.com</td>
			<td>32221-2.5L</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">DMEM, high glucose</td>
			<td>Gibco&#160; www.thermofisher.com</td>
			<td>41965-039</td>
			<td>500ml</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Dimethyl sulfoxide (DMSO)</td>
			<td>Fisher Scientific&#160; webshop.fishersci.com</td>
			<td>D/4121/PB08</td>
			<td>500ml</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Binocular Microscope&#160;</td>
			<td>Leica&#160;&#160; www.leica-microsystems.com</td>
			<td>MZ6</td>
			<td>Replaced by M60</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Chicken eggs</td>
			<td>Henry Stewart &#38; Co Ltd&#160;&#160; sales@medeggs.com</td>
			<td></td>
			<td>Brown Eggs</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

application of impermeable barriers combined with candidate factor soaked beads to study inductive signals in the chick

L&#39;embryon de poulet fournit un modèle vertébré superbe qui peut être utilisé pour disséquer les questions de développement de manière directe. Son accessibilité et la robustesse suite à une intervention chirurgicale sont des forces expérimentales clés. Plaques Mica ont été les premières barrières utilisées pour empêcher poussin bourgeon de membre initiation 1. Les protocoles qui utilisent une feuille d&#39;aluminium comme une barrière imperméable aux bourgeons de l&#39;aile ou de la jambe bourgeon induction et ou d&#39;initiation sont décrits. Nous combinons cette technique avec le placement de talon latéral à la barrière à exogène candidats d&#39;approvisionnement des facteurs endogènes qui ont été bloqués par la barrière. Les résultats sont analysés en utilisant l&#39;hybridation in situ de l&#39; expression génétique subséquente. Notre objectif principal est le rôle de la signalisation de l&#39;acide rétinoïque dans l&#39;induction et l&#39;initiation plus tard, de l&#39;avant d&#39;embryon de poulet et postérieurs. Nous utilisons BMS 493 (un agoniste inverse des récepteurs de l&#39;acide rétinoïque (RAR)) perles trempées implantées dans le mésoderme de la plaque latérale (LPM) pour imiter l&#39;effet d&#39;un barrier placé entre les somites (une source d&#39;acide rétinoïque (RA)) et de la LPM à partir de laquelle se développent les bourgeons des membres. Des versions modifiées de ces protocoles pourraient également être utilisés pour répondre à d&#39;autres questions sur l&#39;origine et le calendrier des signaux inductifs. Pourvu que la région de l&#39;embryon de poulet est accessible au stade de développement pertinent, une barrière pourrait être placée entre les deux tissus et les changements qui en découlent dans le développement étudiés. Des exemples peuvent être trouvés dans le cerveau, l&#39;extension de l&#39;axe en développement et dans le développement des organes, comme le foie ou le rein induction.

Le protocole détaillé ci - dessus décrit les méthodes employées dans Nishimoto et al. 2015. Le document étudie bourgeon de membre induction et de l&#39;initiation à la fois l&#39;avant et postérieurs de l&#39;embryon de poulet. Résultats suite à l&#39;insertion de barrières imperméables pour empêcher l&#39;excroissance du bourgeon forelimb ont été publiés précédemment 1, 2, 9 , mais il n&#39;y a eu qu&#39;une seule étude des obstacles empêchant la jambe décrivant l&#39; initiation du bourgeon 1. Données hindlimb de Nishimoto et al. 2015 sont présentés ici comme des résultats représentatifs de l&#39;étude de l&#39;expression de l&#39;ARNm suivant l&#39;insertion de la barrière. Tbx4 ​​Expression dans la LPM ne suffit pas à Initier Excroissance membres postérieurs: Figures 2B et C (tableau 2) montrent que l&#39; insertion de la barrière à l&#39; étape 15 (figure 2A) (voir le protocole 3.2) conduit à la fois Fgf10et l&#39; expression Fgf8 étant absent dans la région jambe du bourgeon (désigné par le support) sur le côté droit opéré. Comparer avec le côté gauche non opéré. Cependant, l&#39; expression Tbx4 est observée à la fois l&#39; étape 19 et l&#39; étape 23 du côté opéré (Figure 2D et E). Nous concluons que l&#39; expression Tbx4 seule ne suffit pas de lancer hindlimb excroissance de la LPM. D&#39; autres études dans le poussin ont suggéré que l&#39; expression du gène Tbx est suffisante pour initier la formation forelimb bourgeon 12, 13. Figure 2C &#39;est inclus pour illustrer comment une barrière semble ancrée dans la région jambe de l&#39;embryon après fixation. Dans la majorité des cas , les obstacles ont été éliminés avant l&#39;hybridation in situ (protocole 4.3). RA des somites est essentielle dans la LPM avant FGF10 Induit Limb Bud Outgrowth: La figure 3A est un schéma représentant l&#39;addition d&#39;un bourrelet distal RA imbibé d&#39;une barrière inséré à l&#39; étape 15 (protocole 3.2.1.3). À la suite de cette opération bourgeon de membre excroissance (désigné par un astérisque) est observée sur le côté droit exploité et Tbx4, Fgf10 et Fgf8 sont exprimés dans l&#39;œuf car ils sont dans le contrôle du côté gauche (figure 3B, C et D, le tableau 2) . Ainsi l&#39;addition de RA à la LPM surmonte l&#39;effet de la barrière et de bourgeon de membre initiation produit. Nous concluons que, dans RA développement normal du somites est essentiel dans la LPM avant bourgeon de membre excroissance peut être initiée. Les bourgeons des membres postérieurs qui en résultent sont généralement plus petits que ceux du côté de commande. Cela peut être dû à la dose de RA dans le LPM étant pas équivalent à la situation de type sauvage. Si la dose de RA est trop élevée, le apicale ectodermique Ridge (AER) peut être raccourci et plus petits bourgeons se traduirait14, 15. Pour confirmer que RA (des somites) dans la LPM est nécessaire pour la normale initiation du bourgeon de membre d&#39;un agoniste inverse de RAR, BMS 493, a été utilisé. Les perles sont implantées dans la région LPM jambe à l&#39; étape 15 (voir protocole 3.2.1.4) (Figure 3E). L&#39; expression est régulée à la baisse Fgf10 après l&#39; application de BMS 493 perles dans la LPM, ce qui entraîne les petits boutons de la patte arrière par rapport au côté de commande (figure 3F; tableau 3). Perles de contrôle DMSO ne provoquent pas ces défauts (figures 3G et 3H; tableau 3). Les défauts constatés suivant BMS 493 applications sont plus douces que celles induites par une opération de barrière; à savoir, Fgf10 est toujours exprimée et les bourgeons de membres sont formés. Ceci est susceptible d&#39;être parce que les effets de BMS 493 sont limités localement autour des perles et peuvent ne pas être en mesure de contrarier tout le RA produit par axiles tissus al. Early Signals Axial Spécifiez les cellules LPM qui expriment plus tard Tbx4: Nous avons testé lorsque le LPM acquiert sa capacité à exprimer Tbx4 dans la région de la jambe de formation prospective. La première étape à laquelle une barrière peut être inséré qui sera ensuite bloquer la jambe bourgeon excroissance, est l&#39;étape 10. Nous sommes les premiers à développer un protocole pour insérer des obstacles à des étapes antérieures à l&#39;étape 12. Les obstacles insérés entre le mésoderme paraxial et la jambe présomptif LPM à l&#39; étape 10 (voir le protocole 3.4) la formation des bourgeons de la jambe de bloc et l&#39;expression de Tbx4 dans la jambe formant LPM (figures 2F et 2G, tableau 2), ce qui suggère qu&#39;un signal à partir de tissus axiaux à l&#39; étape 10 est nécessaire pour l&#39; expression ultérieure de Tbx4 dans hindlimb LPM. Comparer ce résultat avec les figures 2D et E où l&#39; insertion de barrière plus tard , permet l&#39; expression de Tbx4être établit. En outre, nous avons testé si ce signal axial pourrait être RA en observant si l&#39;agoniste inverse de RAR réduit l&#39; expression de Tbx4. Un BMS 493 perles placé dans le LPM de hindlimb à l&#39; étape 10 (voir protocole 3.4.1.3) régule négativement l&#39; expression de Tbx4 (figures 2H et 2I), alors que des billes de contrôle trempées dans du DMSO ne touchent pas l&#39; expression Tbx4 (figures 2J et 2K). Ensemble, ces résultats supportent un modèle d&#39; un signal RA à partir de tissus axial régule la branche d&#39; induction en régulant positivement Tbx4 dans la patte arrière 7 LPM. Mort post-opératoire: Les tableaux 1, 2 et 3 donnent des détails sur les résultats expérimentaux , y compris le nombre d&#39;embryons de poulets qui sont morts après l&#39; opération et avant la récolte. Certains décès sont à prévoir après la microchirurgie de cette nature. Le nombre mort peut être conservé<html> au minimum en faisant en sorte que les instruments sont propres, le trou dans l&#39;œuf est la taille minimale requise, que les embryons sont laissés sans la protection du joint de ruban adhésif pour un minimum de temps et, en liaison avec ce dernier point que l&#39;opération est effectuée le plus rapidement possible. Aucune de ces opérations prennent beaucoup de temps, mais les opérations impliquant des perles et des barrières prendre un peu plus de temps. En dépit de ces mesures, les opérations effectuées dans les premiers stades et ceux de la région de l&#39;aile sont plus susceptibles d&#39;entraîner la mort. Il y a de grands vaisseaux sanguins autour des régions des membres formant et rupture accidentelle de ces navires peuvent entraîner la mort en raison de la perte de sang. Nous trouvons que les œufs ont ouvert à l&#39;étape 8 ou 9, dont les embryons ont pas été opéré, sera souvent mourir le lendemain. Par conséquent, la seule solution à ces problèmes est de réaliser un grand nombre d&#39;expériences. d / 54618 / 54618fig2.jpg &quot;/&gt; Figure 2. Marqueur Gene Expression Changements suivants Barrière ou Bead Insertion au présomptif Leg Level. (A) Position montrant Schéma de barrière (ligne verte) au niveau de la jambe présomptif (somites 26-32) dans un embryon stade 15. (B - E et G) analyse WISH sur les embryons opérés. La région jambe est indiquée (entre parenthèses). (B) l&#39; expression de Fgf10 est absent dans le LPM exploité, mais une expression robuste est détectée dans le bourgeon gauche. (C) l&#39; expression de Fgf8 est absent du côté opéré, ce qui suggère qu&#39;il n&#39;y a pas de l&#39; ARE. (C &#39;) de même embryon avant que la barrière a été enlevée. (D) Tbx4 est exprimée dans la LPM au même niveau rostro-caudale comme le bourgeon de contrôle. (E) l&#39; expression Tbx4 est maintenue dans la région de la jambe droite , malgré l&#39; absence de croissance du membre. (F) Schéma d&#39;une étape<html> 10 embryon de poulet montrant la position de la barrière (ligne verte) au niveau de la jambe présomptif. (G) l&#39; expression Tbx4 est absente dans le droit exploité LPM (support). (H) Schéma d&#39;un embryon de poulet stade 10 montrant BMS 493 position de talon (cercle violet) au niveau de la jambe présomptif. (I) l&#39; expression Tbx4 est downregulated sur le côté droit opéré après un traitement avec BMS 493. (J) Schéma d&#39;un embryon de poulet stade 10 montrant la position du DMSO de perles de commande (cercle gris). (K) Tbx4 est exprimé sur le côté droit fonctionnant à un niveau similaire à celui du contrôle du côté gauche suite à un traitement avec du DMSO seul. Ce chiffre a été modifié depuis 7. <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/54618/54618fig2large.jpg" target="_blank">S&#39;il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.</a> d / 54618 / 54618fig3.jpg &quot;/&gt; Absence de Figure 3. RA Sauvetages Limb Bud Causée par la barrière d&#39; insertion et est essentielle dans la LPM Avant Leg Bud Excroissance. (A) Représentation schématique indiquant la position de la barrière (ligne verte) au niveau de la jambe présomptif (somites 26-32) et un bourrelet RA-imbibée (cercle rouge). (B - D) RA sauvetages excroissance jambe bourgeon (représenté par un astérisque). (B) l&#39; expression de Tbx4 est présent dans l&#39;œuf sauvé la jambe similaire à la partie non-exploité. (C) Fgf10 est exprimé dans la jambe secouru bourgeon similaire au côté non exploité. (D) Fgf8 est exprimée dans l&#39;ARE du bourgeon de la jambe droite sauvé. (E) Schéma indiquant où BMS 493 perles (cercles violets) ont été placés dans la LPM jambe présomptif de stade 15 embryons. (F) l&#39; expression Fgf10 est downregulated sur le côté droit exploité et le bourgeon de la jambe est faible BMS 49 suivant3 traitements. Les perles sont marqués d&#39;un astérisque. (G) , schématique similaire à (E), qui indique la position de perles de DMSO de contrôle (cercles gris). (H) perles de DMSO (représentés par des astérisques) n&#39;a pas affecté l&#39; expression Fgf10 ou la taille jambe du bourgeon. Ce chiffre a été modifié depuis 7. <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/54618/54618fig3large.jpg" target="_blank">S&#39;il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.</a> <table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody><tr><td> Étape barrière placée (+ perle) * </td><td> Nombre exploité </td><td> Wing manquant ** </td><td> Wing présente ** </td><td> Nombre morts </td></tr><tr><td> étape 12-14 </td><td> 40 </td><td> 24 </td><td> 1 </td><td> 15 </td></tr><tr><td> Etape 8/9 </td><td> 65 </td><td> 23 </td><td> 0 </td><td> 42 </td></tr><tr><td> Etape 12-13 (FGF4 perle) </td><td> 41 </td><td> 7 (bourrelet manquant) </td><td> 17 </td><td> 17 </td></tr><tr><td> Etape 12-13 (RA perle) </td><td> 75 </td><td> 9 (bourrelet manquant) </td><td> 32 </td><td> 34 </td></tr><tr><td> Etape 13 (contrôle perle) </td><td> 5 </td><td> 3 </td><td> 0 </td><td> 2 </td></tr><tr><td colspan="5"> * Barrières de feuilles 0,7-1 mm placés entre somites 15-20 et le mésoderme latéral. 0,35 mg / ml FGF4 perle. 0,05-0,1 mg / ml RA perle. </td></tr><tr><td colspan="5"> DMSO bille de contrôle. </td></tr><tr><td colspan="5"> ** stades des embryons de poussins fixes 21-23 </td></tr></tbody></table> Tableau 1. Wing Barrière et résultats Bead __gVirt_NP_NN_NNPS&lt;__ Experiment. <table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody><tr><td> Étape barrière placée (+ perle) * </td&gt; <td> Nombre exploité </td><td> Jambe manquantes ** </td><td> Leg présente ** </td><td> Nombre morts </td></tr><tr><td> Etape 12-15 </td><td> 43 </td><td> 39 </td><td> 0 </td><td> 4 </td></tr><tr><td> Etape 10/11 </td><td> 23 </td><td> 16 </td><td> 0 </td><td> 7 </td></tr><tr><td> Etape 15 (FGF4 perle) </td><td> 8 </td><td> 0 </td><td> 5 </td><td> 3 </td></tr><tr><td> Etape 15 (RA talon) </td><td> 18 </td><td> 0 </td><td> 18 </td><td> 0 </td></tr><tr><td colspan="5"> * Barrières de feuilles 0,7-1,3 mm placés entre somites 26-32 et le mésoderme latéral. 0,35 mg / ml FGF4 perle. 0,05-0,1 mg / ml RA perle. </td></tr><tr><td colspan="5"> ** stades des embryons de poussins fixes 18-24 </td></tr></tbody></table> Tableau 2. Leg Barrière et résultats Bead __gVirt_NP_NN_NNPS&lt;__ Experiment. <table border = &quot;1&quot; fo: keep-together.within-page = &quot;1&quot; fo: keep-with-next.within page = &quot;always&quot;&gt; <tbody><tr><td> Nombre exploité </td><td> Leg bourgeon petit </td><td> Leg bourgeon un peu petite </td><td> Leg taille normale bourgeon </td><td> Nombre morts </td></tr><tr><td> BMS 493 perles * </td><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td> 15 </td><td> 12 </td><td> 3 </td><td> 0 </td><td> 0 </td></tr><tr><td> Perles de DMSO ** </td><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td> 12 </td><td> 0 </td><td> 3 </td><td> 9 </td><td> 0 </td></tr><tr><td colspan="5"> * 2-3 perles trempées dans 5 mg / ml BMS 493 placés dans la bonne étape 14-15 LPM au niveau de la jambe. </td></tr><tr><td colspan="5"> ** 2-3 perles trempées dans du DMSO seul placés dans la bonne étape 15 LPM au niveau de la jambe. </td></tr><tr><td colspan="5"> embryons de poulet fixés à des stades 17-19. </td></tr></tbody></table> Tableau 3. Résultats Leg Level BMS 493 Bead __gVirt_NP_NN_NNPS&lt;__ Experiment.

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Application of Impermeable Barriers Combined with Candidate Factor Soaked Beads to Study Inductive Signals in the Chick

Protocols using impermeable barriers to block induction events between tissues of the main body axis and flank in the chick embryo required for limb formation are described. Beads soaked in candidate inductive signals are used to overcome the effect of barrier placement and analysis of gene expression confirms this.

Application des barrières imperméables combinées avec le facteur de candidat Perles Soaked pour étudier les signaux inductifs dans le poussin

The chick embryo provides a superb vertebrate model that can be used to dissect developmental questions in a direct way. Its accessibility and robustness ...

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