Name: application of impermeable barriers combined with candidate factor soaked beads to study inductive signals in the chick
Uploaded: 2016-11-17T12:30:00
Duration: 8 min 4 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Application of Impermeable Barriers Combined with Candidate Factor Soaked Beads to Study Inductive Signals in the Chick at JoVE.com

This work was funded by MRC grant MC.PC_13052.

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	<li>Murillo-Ferrol, N. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Causal+study+of+the+earliest+differentiation+of+the+morphological+rudiments+of+the+extremities.+Experimental+analysis+on+bird+embryos.">Causal study of the earliest differentiation of the morphological rudiments of the extremities. Experimental analysis on bird embryos.</a> Acta Anat (Basel). 62 (1), 80-103 (1965).</li><li>Sweeney, R. M., Watterson, R. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rib+development+in+chick+embryos+analyzed+by+means+of+tantalum+foil+blocks).">Rib development in chick embryos analyzed by means of tantalum foil blocks).</a> Am J Anat. 126 (2), 127-149 (1969).</li><li>Kieny, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=On+the+relations+between+somatic+and+somatopleural+mesoderm+before+and+during+primary+induction+of+chick+embryo+limbs.">On the relations between somatic and somatopleural mesoderm before and during primary induction of chick embryo limbs.</a> C R Acad Sci Hebd Seances Acad Sci D. 268 (26), 3183-3186 (1969).</li><li>Pinot, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+role+of+the+somitic+mesoderm+in+the+early+morphogenesis+of+the+limbs+in+the+fowl+embryo.">The role of the somitic mesoderm in the early morphogenesis of the limbs in the fowl embryo.</a> J Embryol Exp Morphol. 23 (1), 109-151 (1970).</li><li>Eichele, G., Tickle, C., Alberts, B. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microcontrolled+release+of+biologically+active+compounds+in+chick+embryos:+beads+of+200-microns+diameter+for+the+local+release+of+retinoids.">Microcontrolled release of biologically active compounds in chick embryos: beads of 200-microns diameter for the local release of retinoids.</a> Anal Biochem. 142 (2), 542-555 (1984).</li><li>Cohn, M. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fibroblast+growth+factors+induce+additional+limb+development+from+the+flank+of+chick+embryos.">Fibroblast growth factors induce additional limb development from the flank of chick embryos.</a> Cell. 80 (5), 739-746 (1995).</li><li>Nishimoto, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=RA+Acts+in+a+Coherent+Feed-Forward+Mechanism+with+Tbx5+to+Control+Limb+Bud+Induction+and+Initiation.">RA Acts in a Coherent Feed-Forward Mechanism with Tbx5 to Control Limb Bud Induction and Initiation.</a> Cell Rep. 12 (5), 879-891 (2015).</li><li>Hamburger, V., Hamilton, H. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+series+of+normal+stages+in+the+development+of+the+chick+embryo.">A series of normal stages in the development of the chick embryo.</a> J Morphol. 88 (1), 49-92 (1951).</li><li>Stephens, T. D., McNulty, T. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evidence+for+a+metameric+pattern+in+the+development+of+the+chick+humerus.">Evidence for a metameric pattern in the development of the chick humerus.</a> J Embryol Exp Morphol. 61, 191-205 (1981).</li><li>Strecker, T. R., Stephens, T. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Peripheral+nerves+do+not+play+a+trophic+role+in+limb+skeletal+morphogenesis.">Peripheral nerves do not play a trophic role in limb skeletal morphogenesis.</a> Teratology. 27 (2), 159-167 (1983).</li><li>Riddle, R. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sonic+hedgehog+mediates+the+polarizing+activity+of+the+ZPA.">Sonic hedgehog mediates the polarizing activity of the ZPA.</a> Cell. 75 (7), 1401-1416 (1993).</li><li>Ng, J. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+limb+identity+gene+Tbx5+promotes+limb+initiation+by+interacting+with+Wnt2b+and+Fgf10.">The limb identity gene Tbx5 promotes limb initiation by interacting with Wnt2b and Fgf10.</a> Devel. 129 (22), 5161-5170 (2002).</li><li>Takeuchi, J. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tbx5+and+Tbx4+trigger+limb+initiation+through+activation+of+the+Wnt/Fgf+signaling+cascade.">Tbx5 and Tbx4 trigger limb initiation through activation of the Wnt/Fgf signaling cascade.</a> Devel. 130 (12), 2729-2739 (2003).</li><li>Lee, J., Tickle, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Retinoic+acid+and+pattern+formation+in+the+developing+chick+wing:+SEM+and+quantitative+studies+of+early+effects+on+the+apical+ectodermal+ridge+and+bud+outgrowth.">Retinoic acid and pattern formation in the developing chick wing: SEM and quantitative studies of early effects on the apical ectodermal ridge and bud outgrowth.</a> J Embryol Exp Morphol. 90, 139-169 (1985).</li><li>Tickle, C., Crawley, A., Farrar, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Retinoic+acid+application+to+chick+wing+buds+leads+to+a+dose-dependent+reorganization+of+the+apical+ectodermal+ridge+that+is+mediated+by+the+mesenchyme.">Retinoic acid application to chick wing buds leads to a dose-dependent reorganization of the apical ectodermal ridge that is mediated by the mesenchyme.</a> Devel. 106 (4), 691-705 (1989).</li><li>MacCabe, J. A., Parker, B. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evidence+for+a+gradient+of+a+morphogenetic+substance+in+the+developing+limb.">Evidence for a gradient of a morphogenetic substance in the developing limb.</a> Dev Biol. 54 (2), 297-303 (1976).</li><li>Summerbell, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+zone+of+polarizing+activity:+evidence+for+a+role+in+normal+chick+limb+morphogenesis.">The zone of polarizing activity: evidence for a role in normal chick limb morphogenesis.</a> J Embryol Exp Morphol. 50, 217-233 (1979).</li><li>Wilde, S. M., Wedden, S. E., Tickle, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Retinoids+reprogramme+pre-bud+mesenchyme+to+give+changes+in+limb+pattern.">Retinoids reprogramme pre-bud mesenchyme to give changes in limb pattern.</a> Devel. 100 (4), 723-733 (1987).</li></ol>

The authors declare they have no competing financial interests.

We describe the use of impermeable barriers to prevent limb bud formation in the chick embryo. This technique has a number of critical steps. Following preliminary experiments, we found that the hinge shaped barriers used in 9, 10 remain in place in the embryo far better than straight barriers. The distal flat side of the barrier sticks to the vitelline membrane and keeps the barrier in place (Figure 2C&#39;). Careful preparation of hinge shaped barriers from aluminum foil as described in protocol step 1.6 is essential to the success of the operation. A second important step is to ensure that eggs are not left out of the incubator for too long following windowing and staging prior to operating on the embryo. In our experience, embryos survive an operation better if they are at or near incubation temperature when the operation is carried out. Operations should therefore be carried out as quickly as possible and the eggs resealed promptly to ensure good survival rates. Many researchers add a drop of antibiotics to the embryo following microsurgery before returning the eggs to the incubator. The presence of the liquid prevented the barriers from sticking well in position. Addition of antibiotic could also dislodge beads after placement. Therefore not using antibiotics, swift operations and good cleanliness with instruments is recommended to avoid infection. Wiping instruments with 70% ethanol following every stage of an operation is essential to prevent instruments from becoming sticky from contact with the vitelline membrane which can cause both barriers or beads to adhere to forceps (see protocol step 3.1.2.2). Both varieties of beads used could fall out of place following the operation. When the barrier position was checked the next day it was not possible to see through the barrier to ascertain whether the bead remained in place or not. In cases where the bead had fallen out wing bud outgrowth was not rescued (Table 1). Avoiding transferring liquid with the bead when implanting them means that beads stick more easily to the cut face of the LPM (see protocol 2.3.2.3). Finally ensuring that embryos are fixed immediately after harvesting is critical to good subsequent gene expression analysis (see protocol step 4.2).
This protocol modifies previously published experiments that used barriers to prevent limb bud initiation, defines specific optimum widths for barriers and introduces combining barrier and bead placement followed by gene expression analysis. We found using conventional aluminum foil, which is cheap and readily available in all labs, produces outcomes equal to those that previously used tantalum foil. The foil can be left in the embryo when carrying out in situ hybridization (Figure 2C&#39;) but we usually remove it if more than one embryo is being processed to prevent the sharp edges of the foil damaging embryos. Pilot studies demonstrated that the width of leg region barriers is particularly important. Initially the barriers trialed were too short and leg bud outgrowth was not prevented. 1.2-1.3 mm is the optimum width for a barrier to block leg bud outgrowth completely. The narrowest wing barriers that one can place accurately to prevent bud outgrowth give the best survival rates. This can be as narrow as 0.5-0.7 mm. However, barriers that are a little wider are more likely to result in complete blocking of wing bud outgrowth because they allow for a little inaccuracy of placement (we used 0.7-1 mm). Avoidance of blood vessels when making the incision is critical for wing bud level barriers. Semi-permeable barriers have previously been used to bisect the chick limb bud. MacCabe and Parker, 1976 and Summerbell, 1979 both used filters 0.45 &#181;m and 0.8 &#181;m pore size, respectively 16, 17. They reported that diffusible signals could pass through the pores in the filters and that results gained using semi-permeable barriers were midway between a limb bud with no barrier present and one with an impermeable tantalum foil barrier. This protocol could be adapted to use semi-permeable barriers of varying pore size to differentiate candidate signals based on size or to modify the dynamics of signal diffusion.
This protocol has various limitations mainly associated with the model organism itself. Such techniques could be used to probe further questions in limb development and also other questions of vertebrate embryogenesis. A proviso is that the organ/area in question should be developing when the chick embryo is accessible to intervention. The presence of large blood vessels in the area where a barrier needs to be placed makes barrier placement later than stage 13 or 14 technically challenging. If large blood vessels are cut during barrier placement this can cause embryo mortality. Our investigation of when the transcription factors Tbx5 and Tbx4 are first induced in the LPM was limited by the earliest stage at which we could place a barrier that would later end up opposite either the wing or leg bud respectively. It could be illuminating to attempt to block Tbx gene induction at earlier stages, closer to gastrulation. The earliest a barrier could be placed in the presumptive wing region successfully was stage 8 and in the leg region stage 10. This protocol is probably not suitable for the study of gene expression beyond limb bud stages because subsequent rapid growth would displace the barrier and results would relate only to the initial position of the barrier.
Having related the limitations of the chick embryo in this context, its advantages over other vertebrate model organisms are many. The chick embryo is a very suitable animal model for this type of physical intervention in a vertebrate embryo. The embryos are relatively large and are easily accessible through the eggshell. One can return to the embryo for further experimentation (e.g., the removal of a bead 18 or even a barrier) or to check on progress by simply removing the tape window. There is possible scope to include live imaging or time lapse imaging. We describe a method of windowing chicken eggs that is particularly suited to operating on early stage embryos. In the case of limb studies it is very important and helpful that there is a contralateral control limb for every experiment that serves as an ideal internal control for each biological replicate.
The combination of using impermeable barriers to prevent limb outgrowth and beads soaked in signaling molecules has not been reported before. Our analysis of mRNA expression following such interventions is also novel. These techniques enabled us to dissect the difficult problem of when limb specific transcription factors Tbx5 and Tbx4 are induced in the LPM and also to show that later, prior to limb bud initiation, the presence of these Tbx genes in the LPM is not sufficient for the activation of Fgf10 transcription and the start of limb bud outgrowth. Figures 2G, 2D and 2E illustrate these findings well. The absence of Tbx4 expression following the insertion of a barrier at stage 10 in Figure 2G is in stark contrast to its presence in 2D and 2E following barrier insertion at stage 15, after the induction of Tbx4. The implantation of RA soaked beads facilitated the rescue of limb bud initiation following barrier insertion and so points to RA from the somites being essential in the LPM before limb bud outgrowth can begin. Such techniques could be used to solve further questions in limb development but also other questions of vertebrate embryogenesis. Areas of the brain, eye and trunk are likely to be suitable.

クラシック胎生学者は伝統的に胚発生を制御するメカニズムを調べるために物理的技術を採用します。 1960年代と1970年代に研究者らは、胚形成の間、誘導信号の重要性を実証するために、発生中の胚の組織の間に挿入された不透過性の障壁を使用する技術を開発しました。私たちの関心は肢芽の伸長の前にどのようなイベント脊椎動物の四肢の開発に、特にあります。例えば、バリアの挿入は、対、無操作側に正常に進行させながら、ニワトリ胚の片側に発生肢芽の成長を防止することができます。これらの障壁が変化するために使用される材料。例えば、マイカ板1とタンタル箔2。これらの障壁は、効果的に、近軸中胚葉から形成された体節から、から肢芽の形態、側板中胚葉（LPM）を分離します。外科的移植する技術は、その密接な関係のウィットを実証します肢芽の開始はLPM 3 4で発生することがある場合は時間体節が不可欠です。 80年代と90年代に発達生物学者は、発生過程の制御に不可欠である拡散性シグナル伝達分子を発見しました。これらのシグナル伝達分子に浸したビーズは、胚の特定の領域に移植し、胚発生に変化を生み出すことができます。ニワトリ胚に注入し、数字5の鏡像複製を生成することができる場合、例えば、イオン交換ビーズによって取り込まレチノイン酸（RA）は、24時間にわたって放出されます。 FGFタンパク質を含有するヘパリンアクリルビーズは、肢のLPM 6から肢芽の伸長を開始することができます。 さらに最近では、マウスや魚の遺伝学は、（7件）新たな時代に、脊椎動物の四肢開始の研究をとっています。肢芽の開始に先立って体節でRAの存在は、LPによって必要不可欠拡散信号であることを十分な証拠がありますMは、四肢の出芽を開始します。私たちは、肢芽開始の頃LPMにおける遺伝子発現に対する障壁注入の効果を分析するためにニワトリ胚のアクセシビリティと実験的な堅牢性を悪用したかったです。本手法の新規適応はバリアによってブロックされた外因的に供給候補内因性因子に対する障壁にバリアをビーズの配置、横方向と軸方向の組織からの遮断信号を組み合わせることです。次のプロトコルは、肢芽の誘導および開始のメカニズムを引き出すために開発されたものです。 肢芽の開始を研究することは、早期段階の胚を使用することを意味します。最初の皮下注射針で気嚢を通してアルブミンの一部を除去することにより、多くの研究者ウィンドウの鶏の卵。卵黄の上に位置する胚は、その後、卵の下位に位置します。これは、エレクトロポレーションのようないくつかの技術のために有利であるが、胚の外科的処置が所望される場合に不利であることができます。我々は可能な限り卵の開口部に近いが利点であるとして、胚を持つ見つけます。 質問は、脊椎動物の肢芽の誘導と開始を制御する信号についてのままであり、以下のプロトコルは、それらに対処するのに適しています。私たちは、早い段階12 8より段階でニワトリ肢芽の伸長を防止するための障壁を挿入するためのプロトコルを開発する最初のものです。これらのプロトコルの修正版もアクセス可能な誘導組織が誘導されている原基に隣接している誘導性手がかりの起源とタイミング上の他の質問に対処するために使用することができました。胚の領域は、関連する発達段階でのアクセスが設けられて、その後、バリアは2つの組織の間に配置することができ、開発における必然的な変化を研究しました。例としては、脳の発達、軸延長や、肝臓や腎臓の誘導のような可能性の臓器の開発に見ることができます。

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="926">
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:283px;">Dumont No.5 watchmakers forceps, x2&#160;</td>
			<td style="width:277px;">Fine Science Tools&#160; www.finescience.de</td>
			<td style="width:149px;">11251-20</td>
			<td style="width:217px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Dumont No.4 watchmakers forceps, x2&#160;&#160;&#160;</td>
			<td>Fine Science Tools&#160; www.finescience.de</td>
			<td>11241-30</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Dumont strong forceps, type AA&#160;&#160;</td>
			<td>Fine Science Tools&#160; www.finescience.de</td>
			<td>11210-10</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Curved scissors with blades 2.5 cm long</td>
			<td>Fine Science Tools&#160; www.finescience.de</td>
			<td>14061-11</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Blunt ended curved forceps,&#160;</td>
			<td>Fine Science Tools&#160; www.finescience.de</td>
			<td>11065-07</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">ends approx 0.5 cm long</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Steel pin, 0.2 mm wide</td>
			<td>Fine Science Tools&#160; www.finescience.de</td>
			<td>26002-20</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Sharpening stone, square</td>
			<td>Fine Science Tools&#160; www.finescience.de</td>
			<td>29008-01</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Mineral oil</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Needle holder</td>
			<td>Fine Science Tools&#160; www.finescience.de</td>
			<td>26016-12</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Clear tape, 50 mm x 66 m</td>
			<td>www.5staroffice.com</td>
			<td align="right">295985</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">FGF4 protein</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>A gift from Cliff Tabin.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">all-trans-retinoic acid</td>
			<td>Sigma&#160; www.sigmaaldrich.com</td>
			<td>R2625-50MG</td>
			<td>Remember to protect from light.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">BMS 493</td>
			<td>Sigma&#160; www.sigmaaldrich.com</td>
			<td>B6688-5MG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Scalpel blade No. 15</td>
			<td>www.swann-morton.com</td>
			<td>cat no. 0105</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Affi-Gel Blue, affinity chromatography gel</td>
			<td>Bio-Rad&#160; www.bio-rad.com</td>
			<td>153-7301</td>
			<td>Beads for delivering protein.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">AG1-X2 Ion exchange resin</td>
			<td>Bio-Rad&#160; www.bio-rad.com</td>
			<td>140-1251</td>
			<td>Beads for delivering RA or BMS 493.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Incubator for eggs</td>
			<td>Memmert&#160; www.hce-uk.com</td>
			<td>LAB128</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Paraformaldehyde (PFA)</td>
			<td>Sigma&#160; www.sigmaaldrich.com</td>
			<td>P6148-1KG</td>
			<td>Harmful, irritant, corrosive.&#160; Handle powder in fumehood with full protective clothing.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Ethanol</td>
			<td>Sigma&#160; www.sigmaaldrich.com</td>
			<td>32221-2.5L</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">DMEM, high glucose</td>
			<td>Gibco&#160; www.thermofisher.com</td>
			<td>41965-039</td>
			<td>500ml</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Dimethyl sulfoxide (DMSO)</td>
			<td>Fisher Scientific&#160; webshop.fishersci.com</td>
			<td>D/4121/PB08</td>
			<td>500ml</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Binocular Microscope&#160;</td>
			<td>Leica&#160;&#160; www.leica-microsystems.com</td>
			<td>MZ6</td>
			<td>Replaced by M60</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Chicken eggs</td>
			<td>Henry Stewart &#38; Co Ltd&#160;&#160; sales@medeggs.com</td>
			<td></td>
			<td>Brown Eggs</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

application of impermeable barriers combined with candidate factor soaked beads to study inductive signals in the chick

ニワトリ胚は、直接的な方法で発達質問を分析するために使用することができる優れた脊椎動物のモデルを提供します。外科的介入後のアクセシビリティと堅牢性が重要な実験的な強みです。マイカ板は、ニワトリ肢芽開始1を防止するために使用される最初の障壁でした。翼の芽や脚の芽の誘導およびまたは開始に不透過性障壁としてアルミ箔を使用するプロトコルが記載されています。我々は、バリアによってブロックされた外因的に供給候補内因性因子への障壁にビーズ配置横でこの技術を兼ね備えています。結果は、その後の遺伝子発現のインサイチュハイブリダイゼーションを用いて分析します。私たちの主な焦点は、誘導にレチノイン酸シグナル伝達およびニワトリ胚の前部と後肢の後に開始の役割にあります。私たちは、BMS 493（レチノイン酸受容体（RAR）の逆アゴニスト）は、バーの効果を模倣するために側板中胚葉（LPM）に移植されたビーズを浸し使用しますRIERは体節（レチノイン酸（RA）のソース）と肢芽が成長するからLPMの間に配置されました。これらのプロトコルの修正版は、誘導手がかりの起源とタイミング上の他の質問に対処するために使用することができました。ニワトリ胚の領域は、関連する発達段階でのアクセスが提供される、バリアは2つの組織の間に配置することができ、開発における必然的な変化を研究しました。例としては、肝臓や腎臓の誘導として、脳の発達、軸延長にと臓器の開発に見ることができます。

上記の詳細なプロトコールは、西本らに用いられる方法を説明します。 、2015年論文は、ニワトリ胚の前部と後肢の両方で肢芽の誘導と開始を研究しています。前肢芽の伸長を防ぐために、不浸透性の障壁を挿入し、次の結果は、以前に1、2、9しかし脚芽開始1を防ぐ障壁を記述する唯一の研究がなされている公開されています。西本らから後肢のデータ。 2015年は、バリア挿入、次のmRNA発現の研究​​の代表的な結果として、ここで提示されています。 LPMでTbx4の発現は、後肢伸長を開始するのに十分なされていません。 図2BおよびC（ 表2）は、ステージ15（ 図2A）でそのバリア挿入が（プロトコル3.2を参照）の両方FGF10につながる表示しますそして、FGF8の発現が運営右側に（括弧で表記）脚芽領域に不在です。無操作左側と比較してください。しかし、Tbx4発現が操作側（ 図2DおよびE）にステージ19とステージ23の双方で観測されます。我々は、単独でTbx4発現がLPMから後肢伸長を開始するのに十分ではないと結論付けます。ニワトリにおける他の研究は、TBX遺伝子発現が前肢芽形成12,13を開始するのに十分であることを示唆しています。 図2Cは、「バリアが胚ポスト固定の脚部の領域に埋め込まれたどのように見えるかを説明するために含まれています。例障壁の大部分では前in situハイブリダイゼーション（プロトコル4.3） 中に除去しました。 体節からRAはFGF10誘導肢芽O前にLPMに不可欠ですutgrowth： 図3Aは、ステージ15（プロトコル3.2.1.3）に挿入障壁にRA浸漬ビーズ遠位の添加を示す概略図です。 （アスタリスクで示される）この操作肢芽の伸長、彼らがコントロール左側にあるように芽で表現されている操作右側とTbx4、FGF10とFGF8上で観察されるに続いて（ 図3B、CおよびD、 表2） 。したがって、LPMにRAの添加は障壁と肢芽開始進行の影響を克服します。私たちは、肢芽の伸長を開始する前に、体節からの正常な発達のRAにLPMに不可欠であると結論付けています。その結果後肢芽は、制御側のものよりも一般的に小さくなっています。これは、野生型の状況と同等でないというLPMにRAの用量に起因する可能性があります。 RAの用量が高すぎるとアピカル外胚葉リッジ（AER）を短縮することができ、小さな芽を生じます14、15。 LPMでのRA（体節から）は、通常の肢芽の開始のためにRAR、BMS 493の逆アゴニストを必要としていることを確認するために、使用されました。ビーズは、ステージ15で脚領域LPM（プロトコル3.2.1.4を参照）（ 図3E）に注入されます。 FGF10の発現が制御側（; 表3、 図3F）に比べて小さい後肢芽で、その結果、LPMでBMS 493ビーズの次のアプリケーションをダウンレギュレートされます。制御DMSOビーズは、これらの欠陥（; 表3、 図3Gおよび3H）を引き起こしません。 BMS 493適用後に観察された欠陥はバリア操作によって誘導されるものよりも穏やかです。 すなわち、FGF10 は依然として発現され、肢芽が形成されています。 BMS 493の効果は、ビーズの周りに局所的に制限され、AXIによって生成された全てのRAをアンタゴナイズすることができないかもしれないので、これは可能性がありますアル組織。 初期の軸方向の信号は後でTbx4エクスプレス LPMセルを指定します 。 LPMは将来の脚形成領域にTbx4を表現する能力を取得したとき私たちは、テストしました。バリアがその後脚芽の伸長を阻止することを挿入することができる最も早い段階では、我々はステージよりも前の段階で近軸中胚葉と推定される脚部との間に挿入12.障壁を障壁を挿入するためのプロトコルを開発する最初のものであるステージ10でありますステージ10でのLPMステージ10における軸方向の組織からの信号は以降の発現に必要であることを示唆し、脚形成LPM（ 図2F及び2G、 表2）のブロック脚芽形成とTbx4の発現（プロトコル3.4を参照してください）後肢LPMでTbx4。後でバリア挿入がTbx4の発現を可能にする図2DおよびEでこの結果を比較確立されます。さらに、我々は、この軸方向の信号はRARの逆アゴニストはTbx4の発現を減少させるかどうかを観察することによってRAかもしれないかどうかを試験しました。ステージ10（プロトコル3.4.1.3を参照）で後肢LPMに配置されたBMS 493ビーズをDMSOに浸したコントロールビーズがTbx4式（ 図2Jおよび2K）には影響しません一方、Tbx4式 （ 図2Hおよび2I）をダウンレギュレートします。一緒に、これらの結果は、軸組織からのRA信号を積極後肢LPM 7にTbx4を調節することにより、四肢誘導を調節するモデルをサポートしています。 術後死： 表1、表2、表 3は、術後、収穫前に死亡したニワトリ胚の数を含む実験結果の詳細を与えます。一部の死亡は、この種のマイクロサージェリーの後に予想されます。瀕死の数字は保つことができます<html>楽器が汚れていないことを確認することによって最小限に、卵の穴は、胚は、この最後の点の操作に連動して、最小限の時間のための粘着テープシールの保護なし左とされていることを、最小サイズ必要です可能な限り迅速に行われます。これらの操作はいずれも、非常に時間がかかりませんが、ビーズや障壁に関係する操作は、もう少し時間がかかります。これらの措置にもかかわらず、操作は最も初期の段階で行われ、翼の地域のものは死をもたらす可能性が高いです。死による失血につながる可能性四肢形成領域及びこれらの血管の偶発的な破裂の周りに大きな血管があります。我々卵がステージ8または9で開かれたことがわかり、その胚に操作されていない、多くの場合、翌日までに死んでしまいます。したがって、これらの問題に対する唯一の解決策は、実験の多数を行うことです。 D / 54618 / 54618fig2.jpg &quot;/&gt; 推定的レッグレベルでのバリアまたはビーズの挿入を次の 図2. マーカー遺伝子発現の変化。 （A）ステージ15胚における推定脚レベル（体節26-32）で示す概略図バリア位置（緑の線）。 （B - EおよびG）操作胚上WISH分析。脚部領域は（カッコ）に概説されています。 （B）FGF10発現を操作LPMには存在しないが、強い発現が左側芽において検出されます。 （C）FGF8発現にはAERがありません示唆し、運営側には存在しません。 （C &#39;）の障壁が取り除かれた前に、同じ胚。 （D）Tbx4は、制御芽と同じ吻側-尾側レベルでLPMで表現されています。 （E）Tbx4発現は肢の成長の欠如にもかかわらず、右脚領域に維持されます。 （F）段階の模式図<html>推定脚レベルでのバリア位置（緑の線）を示す10ニワトリ胚。 （G）Tbx4式が運営右LPM（ブラケット）には存在しません。 （H）推定脚レベルでBMS 493ビーズの位置（紫円）を示すステージ10ニワトリ胚の模式図。 （I）Tbx4式は、BMS 493（J）コントロールDMSOビーズ位置（灰色の円）を示すステージ10ニワトリ胚の模式図で処理した後の操作右側にダウンレギュレートされます。 （K）Tbx4はDMSOのみで処理した後の制御左側のと同様のレベルで操作右側に表現されています。この図7から変更されています。 <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/54618/54618fig2large.jpg" target="_blank">この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。</a> D / 54618 / 54618fig3.jpg &quot;/&gt; 図3. RA救助肢芽の不在は、バリア挿入によるレッグバド伸長する前にLPMに必須です。 （A）推定脚レベル（体節26-32）とRA-浸したビーズ（赤い円）でバリア位置（緑の線）を示す概略図。 （B - D）（アスタリスクで示す）RA救出脚芽伸長。 （B）Tbx4式は、非手術側に類似救出脚芽に存在しています。 （C）FGF10を救出戦で発現している非手術側に似て出芽します。 （D）FGF8は救出右脚芽のAERで表現されています。 BMS 493ビーズ（紫円）はステージ15の胚の推定脚LPMに入れたところ（E）の回路図を示します。 （F）FGF10の発現が運営右側にダウンレギュレートし、足の芽は、BMS 49以下の小さいです3治療。ビーズは、アスタリスクを付しています。 （E）から（G）同様の概略図、制御DMSOビーズ（灰色の円）の位置を示します。 （アスタリスクで示す）（H）DMSOビーズは、FGF10の発現や脚の芽の大きさに影響を与えませんでした。この図7から変更されています。 <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/54618/54618fig3large.jpg" target="_blank">この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。</a> <table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody><tr><td> ステージバリア置か（+ビーズ）* </td><td> 番号操作 </td><td> 行方不明ウィング** </td><td> 現在ウィング** </td><td> 数の死者 </td></tr><tr><td>ステージ12-14 </td><td> 40 </td><td> 24 </td><td> 1 </td><td> 15 </td></tr><tr><td>ステージ8/9 </td><td> 65 </td><td> 23 </td><td> 0 </td><td> 42 </td></tr><tr><td>ステージ12-13（FGF4ビーズ） </td><td> 41 </td><td> 7（ビーズ不足しています） </td><td> 17 </td><td> 17 </td></tr><tr><td>ステージ12-13（RAビーズ） </td><td> 75 </td><td> 9（ビーズ不足しています） </td><td> 32 </td><td> 34 </td></tr><tr><td>ステージ13（コントロールビーズ） </td><td> 5 </td><td> 3 </td><td> 0 </td><td> 2 </td></tr><tr><td colspan="5">体節15-20と側板中胚葉との間に配置された* 0.7〜1ミリメートル箔障壁。 0.35 mg / mlでFGF4ビーズ。 0.05〜0.1 mg / mlでのRAビーズ。 </td></tr><tr><td colspan="5"> DMSOコントロールビーズ。 </td></tr><tr><td colspan="5"> **ニワトリ胚の固定台21-23 </td></tr></tbody></table> 表1.ウィングレベルのバリアとビーズ実験の成果。 <table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody><tr><td> ステージバリア置か（+ビーズ）* </TD&gt; <td> 番号操作 </td><td> 行方不明の脚** </td><td> 脚存在** </td><td> 数の死者 </td></tr><tr><td>ステージ12-15 </td><td> 43 </td><td> 39 </td><td> 0 </td><td> 4 </td></tr><tr><td>ステージ10月11日</td><td> 23 </td><td> 16 </td><td> 0 </td><td> 7 </td></tr><tr><td>ステージ15（FGF4ビーズ） </td><td> 8 </td><td> 0 </td><td> 5 </td><td> 3 </td></tr><tr><td>ステージ15（RAビーズ） </td><td> 18 </td><td> 0 </td><td> 18 </td><td> 0 </td></tr><tr><td colspan="5">体節26-32と側板中胚葉との間に配置された* 0.7〜1.3ミリメートル箔障壁。 0.35 mg / mlでFGF4ビーズ。 0.05〜0.1 mg / mlでのRAビーズ。 </td></tr><tr><td colspan="5"> **ニワトリ胚の固定台18-24 </td></tr></tbody></table> 表2脚レベル障壁とビーズ実験の成果。 <table borデア= &quot;1&quot;のfo：キープtogether.withinページ= &quot;1&quot;のfo：キープで-next.within-ページ= &quot;常に&quot;&gt; <tbody><tr><td> 番号操作 </td><td> 脚は小さな芽 </td><td> 脚は少し小さな芽 </td><td> 脚芽通常のサイズ </td><td> 数の死者 </td></tr><tr><td> BMS 493ビーズ* </td><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td> 15 </td><td> 12 </td><td> 3 </td><td> 0 </td><td> 0 </td></tr><tr><td> DMSOビーズ** </td><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td> 12 </td><td> 0 </td><td> 3 </td><td> 9 </td><td> 0 </td></tr><tr><td colspan="5"> * 2-3ビーズを5mgに浸し/ミリリットルBMS 493は、脚のレベルで右のステージ14-15 LPMに入れました。 </td></tr><tr><td colspan="5"> DMSOに浸し** 2-3ビーズだけでは足のレベルで右ステージ15 LPMに入れました。 </td></tr><tr><td colspan="5">ニワトリ胚は段階で固定17-19。 </td></tr></tbody></table> 表3脚レベルBMS 493ビーズ実験の成果。

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Application of Impermeable Barriers Combined with Candidate Factor Soaked Beads to Study Inductive Signals in the Chick

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