Name: application of impermeable barriers combined with candidate factor soaked beads to study inductive signals in the chick
Uploaded: 2016-11-17T12:30:00
Duration: 8 min 4 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Application of Impermeable Barriers Combined with Candidate Factor Soaked Beads to Study Inductive Signals in the Chick at JoVE.com

This work was funded by MRC grant MC.PC_13052.

<ol>
	<li>Murillo-Ferrol, N. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Causal+study+of+the+earliest+differentiation+of+the+morphological+rudiments+of+the+extremities.+Experimental+analysis+on+bird+embryos.">Causal study of the earliest differentiation of the morphological rudiments of the extremities. Experimental analysis on bird embryos.</a> Acta Anat (Basel). 62 (1), 80-103 (1965).</li><li>Sweeney, R. M., Watterson, R. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rib+development+in+chick+embryos+analyzed+by+means+of+tantalum+foil+blocks).">Rib development in chick embryos analyzed by means of tantalum foil blocks).</a> Am J Anat. 126 (2), 127-149 (1969).</li><li>Kieny, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=On+the+relations+between+somatic+and+somatopleural+mesoderm+before+and+during+primary+induction+of+chick+embryo+limbs.">On the relations between somatic and somatopleural mesoderm before and during primary induction of chick embryo limbs.</a> C R Acad Sci Hebd Seances Acad Sci D. 268 (26), 3183-3186 (1969).</li><li>Pinot, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+role+of+the+somitic+mesoderm+in+the+early+morphogenesis+of+the+limbs+in+the+fowl+embryo.">The role of the somitic mesoderm in the early morphogenesis of the limbs in the fowl embryo.</a> J Embryol Exp Morphol. 23 (1), 109-151 (1970).</li><li>Eichele, G., Tickle, C., Alberts, B. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microcontrolled+release+of+biologically+active+compounds+in+chick+embryos:+beads+of+200-microns+diameter+for+the+local+release+of+retinoids.">Microcontrolled release of biologically active compounds in chick embryos: beads of 200-microns diameter for the local release of retinoids.</a> Anal Biochem. 142 (2), 542-555 (1984).</li><li>Cohn, M. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fibroblast+growth+factors+induce+additional+limb+development+from+the+flank+of+chick+embryos.">Fibroblast growth factors induce additional limb development from the flank of chick embryos.</a> Cell. 80 (5), 739-746 (1995).</li><li>Nishimoto, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=RA+Acts+in+a+Coherent+Feed-Forward+Mechanism+with+Tbx5+to+Control+Limb+Bud+Induction+and+Initiation.">RA Acts in a Coherent Feed-Forward Mechanism with Tbx5 to Control Limb Bud Induction and Initiation.</a> Cell Rep. 12 (5), 879-891 (2015).</li><li>Hamburger, V., Hamilton, H. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+series+of+normal+stages+in+the+development+of+the+chick+embryo.">A series of normal stages in the development of the chick embryo.</a> J Morphol. 88 (1), 49-92 (1951).</li><li>Stephens, T. D., McNulty, T. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evidence+for+a+metameric+pattern+in+the+development+of+the+chick+humerus.">Evidence for a metameric pattern in the development of the chick humerus.</a> J Embryol Exp Morphol. 61, 191-205 (1981).</li><li>Strecker, T. R., Stephens, T. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Peripheral+nerves+do+not+play+a+trophic+role+in+limb+skeletal+morphogenesis.">Peripheral nerves do not play a trophic role in limb skeletal morphogenesis.</a> Teratology. 27 (2), 159-167 (1983).</li><li>Riddle, R. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sonic+hedgehog+mediates+the+polarizing+activity+of+the+ZPA.">Sonic hedgehog mediates the polarizing activity of the ZPA.</a> Cell. 75 (7), 1401-1416 (1993).</li><li>Ng, J. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+limb+identity+gene+Tbx5+promotes+limb+initiation+by+interacting+with+Wnt2b+and+Fgf10.">The limb identity gene Tbx5 promotes limb initiation by interacting with Wnt2b and Fgf10.</a> Devel. 129 (22), 5161-5170 (2002).</li><li>Takeuchi, J. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tbx5+and+Tbx4+trigger+limb+initiation+through+activation+of+the+Wnt/Fgf+signaling+cascade.">Tbx5 and Tbx4 trigger limb initiation through activation of the Wnt/Fgf signaling cascade.</a> Devel. 130 (12), 2729-2739 (2003).</li><li>Lee, J., Tickle, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Retinoic+acid+and+pattern+formation+in+the+developing+chick+wing:+SEM+and+quantitative+studies+of+early+effects+on+the+apical+ectodermal+ridge+and+bud+outgrowth.">Retinoic acid and pattern formation in the developing chick wing: SEM and quantitative studies of early effects on the apical ectodermal ridge and bud outgrowth.</a> J Embryol Exp Morphol. 90, 139-169 (1985).</li><li>Tickle, C., Crawley, A., Farrar, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Retinoic+acid+application+to+chick+wing+buds+leads+to+a+dose-dependent+reorganization+of+the+apical+ectodermal+ridge+that+is+mediated+by+the+mesenchyme.">Retinoic acid application to chick wing buds leads to a dose-dependent reorganization of the apical ectodermal ridge that is mediated by the mesenchyme.</a> Devel. 106 (4), 691-705 (1989).</li><li>MacCabe, J. A., Parker, B. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evidence+for+a+gradient+of+a+morphogenetic+substance+in+the+developing+limb.">Evidence for a gradient of a morphogenetic substance in the developing limb.</a> Dev Biol. 54 (2), 297-303 (1976).</li><li>Summerbell, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+zone+of+polarizing+activity:+evidence+for+a+role+in+normal+chick+limb+morphogenesis.">The zone of polarizing activity: evidence for a role in normal chick limb morphogenesis.</a> J Embryol Exp Morphol. 50, 217-233 (1979).</li><li>Wilde, S. M., Wedden, S. E., Tickle, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Retinoids+reprogramme+pre-bud+mesenchyme+to+give+changes+in+limb+pattern.">Retinoids reprogramme pre-bud mesenchyme to give changes in limb pattern.</a> Devel. 100 (4), 723-733 (1987).</li></ol>

The authors declare they have no competing financial interests.

Vi beskriver användningen av ogenomträngliga barriärer för att förhindra lem knopp bildning i kycklingembryo. Denna teknik har ett antal kritiska steg. Efter preliminära experiment, fann vi att gångjärnsformade barriärer som används i 9, 10 kvar i embryot mycket bättre än raka hinder. Den distala flata sidan av barriären fastnar på vitellinmembranet och håller barriären på plats (figur 2C). Noggranna förberedelser av gångjärns formade hinder från aluminiumfolie som beskrivs i protokoll steg 1,6 är avgörande för framgången av verksamheten. En annan viktig steg är att se till att äggen inte lämnas ut ur inkubatorn för länge efter fönster och iscensättning före drift på embryot. I vår erfarenhet, embryon överlever en operation bättre om de är vid eller i närheten av inkubationstemperatur när operationen utförs. Verksamheten bör därför genomföras så snabbt som möjligt och äggen återförslutas promptly att säkerställa goda överlevnad. Många forskare lägger en droppe av antibiotika för att embryot efter mikro innan han återvände äggen till inkubatorn. Närvaron av vätskan förhindras barriärerna från att fastna väl i läge. Tillsats av antibiotika kan också rubba pärlor efter placering. Därför inte använder antibiotika, snabba operationer och god renhet med instrument rekommenderas för att undvika infektion. Torka instrument med 70% etanol efter varje steg i en operation är nödvändig för att förhindra instrument blir klibbigt kontakt med vitellinmembranet som kan orsaka både hinder eller pärlor att följa pincett (se protokoll steg 3.1.2.2). Båda sorter av pärlor som används kan falla på sin plats efter operationen. När barriär läge kontrollerades nästa dag var det inte möjligt att se igenom barriären att avgöra om kulan kvar på plats eller inte. I de fall där vulsten hade fallit ut ving knopp utväxt inte räddades ( <stRong&gt; Tabell 1). Undvika överföring av vätska med pärlan när implanterar dem innebär att kulorna fastnar lättare på den avskurna ytan av LPM (se protokoll 2.3.2.3). Slutligen se till att embryon fixeras omedelbart efter skörden är avgörande för god efterföljande genexpressionsanalys (se protokoll steg 4,2). Detta protokoll modifierar tidigare publicerade experiment som använde barriärer för att förhindra lem knopp initiering definierar specifika optimala bredder för hinder och introducerar kombinera barriär och pärla placering följt av genuttryck analys. Vi fann att använda konventionell aluminiumfolie, som är billig och lätt tillgänglig i alla labb, producerar resultat likvärdiga med dem som tidigare använt tantal folie. Folien kan vara kvar i embryot när de utför in situ hybridisering (figur 2C) men vi brukar ta bort det om mer än ett embryo bearbetas för att förhindra att skarpa kanter på folien skada embryon. PIlot studier visade att bredden av benet region hinder är särskilt viktigt. Initialt hindren trialed var alltför kort och ben knopp utväxt inte förhindras. 1,2-1,3 mm är den optimala bredden för en barriär för att blockera benet knopp utväxt helt. De smalaste ving hinder som man kan placera noggrant för att förhindra knopp utväxt ger bäst överlevnad. Det kan vara så smal som 0,5-0,7 mm. Men hindren som är lite bredare är mer sannolikt att resultera i fullständig blockering av ving knopp utväxt eftersom de möjliggör en liten felaktighet av placering (vi använde 0,7-1 mm). Undvikande av blodkärl när du gör snittet är avgörande för ving knopp nivå hinder. Semipermeabla barriärer har tidigare använts för att halvera ungen lem knopp. MacCabe och Parker, 1976 och Summer, 1979 båda används filter 0,45 um och 0,8 um porstorlek, respektive 16, 17. De rapporterade att diffunderbara signaler kan passera genom porerna i filtren och attresultat fick hjälp av halvgenomträngliga hinder var halvvägs mellan en lem knopp utan hinder är närvarande och ett med en ogenomtränglig tantal foliebarriär. Detta protokoll skulle kunna anpassas för att använda semipermeabla barriärer med varierande porstorlek för att differentiera kandidatsignalerna baserade på storlek eller för att modifiera de dynamiken i signal diffusion. Detta protokoll har olika begränsningar främst i samband med modellorganism själv. Sådana tekniker kan användas för att undersöka ytterligare frågor i lem utveckling och även andra frågor av ryggradsdjur embryogenes. En förutsättning är att organet / aktuella området bör utvecklas när kycklingembryo är tillgänglig för intervention. Närvaron av stora blodkärlen i området där en barriär måste placeras gör barriär placering senast steget 13 eller 14 tekniskt utmanande. Om stora blodkärl skärs under barriär placering kan detta leda till embryodödlighet. Vår undersökning av när transkriptionsfaktorer TBX5 och Tbx4 först induceras i LPM begränsades av den tidigaste skede då vi kan placera en barriär som senare skulle hamna mitt emot antingen vingen eller benet knopp respektive. Det skulle kunna belysa att försöka blockera TBX geninduktion i tidigare skeden, närmare gastrulation. Det tidigaste en barriär skulle kunna placeras i den presumtiva wing region med framgång var etapp 8 och i benområdet steget 10. Detta protokoll är förmodligen inte lämpar sig för studier av genuttryck bortom lem knopp stadier eftersom efterföljande snabb tillväxt skulle förskjuta barriären och resultat skulle endast avse den initiala positionen av barriären. Efter att ha relaterade begränsningar i kycklingembryo i detta sammanhang, dess fördelar jämfört med andra ryggradsdjur modellorganismer är många. Kycklingembryo är en mycket lämplig djurmodell för denna typ av fysiskt ingrepp i ett ryggradsdjur embryo. Embryona är relativt stora och är lättillgängliga through äggskal. Man kan återvända till embryot för ytterligare experiment (t.ex. avlägsnande av en sträng 18 eller till och med en barriär) eller för att kontrollera om framstegen genom att helt enkelt ta bort tejpen fönstret. Det är möjligt att även omfatta levande avbildning eller tidsförlopp avbildning. Vi beskriver en metod för fönster hönsägg som är särskilt lämpade för drift på embryon tidigt stadium. I fallet med lem studier är det mycket viktigt och användbart att det finns en kontralaterala kontroll lem för varje experiment som fungerar som en idealisk intern kontroll för varje biologisk replikat. Kombinationen av att använda ogenomträngliga barriärer för att förhindra lem utväxt och pärlor indränkt i signalmolekyler har inte rapporterats tidigare. Vår analys av mRNA-uttryck efter sådana insatser är också ny. Dessa tekniker det möjligt för oss att dissekera det svåra problemet med när lem specifik transkriptionsfaktorer Tbx5 och Tbx4 induceras i LPM och ävenför att visa att senare, före lem knopp initiering, är närvaron av dessa TBX gener i LPM inte är tillräcklig för aktivering av Fgf10 transkription och starten av extremitetsanlag utväxt. Figurerna 2G, 2D och 2E visar dessa resultat väl. Frånvaron av Tbx4 uttryck efter införandet av en barriär vid steg 10 i figur 2G står i skarp kontrast till sin närvaro i 2D och 2E följande barriär insättning vid steg 15, efter induktion av Tbx4. Implantation av RA indränkt pärlor lättade räddnings lem knopp initiering efter barriär insättning och så pekar RA från somites vara viktigt i LPM innan lem knopp utväxt kan börja. Sådana tekniker kan användas för att lösa frågor i lem utveckling men även andra frågor av ryggradsdjur embryogenes. Områden i hjärnan, ögat och stammen kommer sannolikt att vara lämpliga.

Klassiska embryologer traditionellt användes fysiska tekniker för att förhöra de mekanismer som styr embryoutveckling. Under 1960- och 1970-talet utvecklade utredare tekniker som används ogenomträngliga barriärer insatta mellan vävnader i det utvecklande embryot att visa betydelsen av induktiva signaler under embryogenes. Vårt intresse är i ryggradsdjur lem utveckling och i synnerhet vilka händelser före lem knopp utväxt. Till exempel kan insättningen av en barriär förhindrar extremitetsanlag utväxt från att uppstå på en sida av kycklingembryo och tillåta det att fortsätta normalt på den kontra, oanvänd sida. Material som används för att göra dessa hinder varierad; exempelvis glimmerplattor 1 och tantal folie 2. Dessa hinder effektivt separera sidoplåten mesoderm (LPM), från vilken lem knopp former, från somites bildas från det paraxiella mesoderm. Kirurgiska ympning tekniker visar att nära samarbete with somites är en förutsättning för att lem knopp initiering skall ske i LPM 3 4. På 80-talet och 90-talet upptäckte utvecklingsbiologer diffunderbara signalmolekyler som är nödvändiga för att kontrollera utvecklingsprocesser. Pärlor indränkt med dessa signalmolekyler kan implanteras i specifika regioner i embryot och producera ändringar i embryonal utveckling. Till exempel är retinsyra (RA) tas upp av jonbytarmaterial pärlor frisätts över en 24-timmarsperiod när de implanteras in i en kycklingembryo och kan producera spegelbild dubblering av siffrorna 5. Heparin akrylpärlor innehållande FGF protein kan initiera lem knopp utväxt från interlimb LPM 6. På senare tid har mus och fisk genetik har tagit studien av ryggradsdjur lem inledande in i en ny era (översikt i 7). Det finns goda bevis för att RA förekommer i somites före lem knopp initiering är det väsentliga diffunderbart signal som krävs av LPM att initiera lem spirande. Vi ville utnyttja tillgängligheten och experimentell robusthet kycklingembryo att dissekera effekten av barriär implantation på genuttryck i LPM runt tiden för lem knopp inledande. En ny anpassning av vår metod är att kombinera ett hinder som blockerar signalerna från axiella vävnader med pärla placering i sidled till hinder för exogent försörjningskandidat endogena faktorer som har blockerats av barriären. Följande protokoll är de som utvecklats för att locka fram de mekanismer för lem knopp induktion och initiering. Studera lem knopp initiering innebär att använda embryon tidigt stadium. Många forskare fönster hönsägg genom att först ta bort en del av albumin genom luftsäcken med en injektionsnål. Embryot, som ligger på toppen av äggulan, därefter kommer att ligga lägre i ägget. Detta är en fördel för vissa tekniker, såsom elektroporation, men kan vara en nackdel om kirurgisk manipulation av embryot önskas.Vi finner att ha embryot så nära öppningen i ägget som möjligt är en fördel. Frågor kvarstår om de signaler som styr ryggradsdjur lem knopp induktion och initiering och följande protokoll är lämpliga för att ta itu med dem. Vi är de första att utveckla ett protokoll för införande av barriärer för att förhindra chick lem knopp utväxt på ett stadium tidigare än steget 12 8. Modifierade versioner av dessa protokoll kan också användas för att ta itu med andra frågor om ursprung och tidpunkten för induktiva signaler där en tillgänglig inducerande vävnad ligger intill primordium induceras. Förutsatt regionen av embryot är tillgänglig vid den aktuella utvecklingsstadiet, då en barriär skulle kunna placeras mellan de två vävnaderna och därav följande förändringar i utvecklingen som studerats. Exempel kan hittas i hjärnans utveckling, axel förlängning och eventuellt organutveckling såsom lever eller njure induktion.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="926">
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:283px;">Dumont No.5 watchmakers forceps, x2&#160;</td>
			<td style="width:277px;">Fine Science Tools&#160; www.finescience.de</td>
			<td style="width:149px;">11251-20</td>
			<td style="width:217px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Dumont No.4 watchmakers forceps, x2&#160;&#160;&#160;</td>
			<td>Fine Science Tools&#160; www.finescience.de</td>
			<td>11241-30</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Dumont strong forceps, type AA&#160;&#160;</td>
			<td>Fine Science Tools&#160; www.finescience.de</td>
			<td>11210-10</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Curved scissors with blades 2.5 cm long</td>
			<td>Fine Science Tools&#160; www.finescience.de</td>
			<td>14061-11</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Blunt ended curved forceps,&#160;</td>
			<td>Fine Science Tools&#160; www.finescience.de</td>
			<td>11065-07</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">ends approx 0.5 cm long</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Steel pin, 0.2 mm wide</td>
			<td>Fine Science Tools&#160; www.finescience.de</td>
			<td>26002-20</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Sharpening stone, square</td>
			<td>Fine Science Tools&#160; www.finescience.de</td>
			<td>29008-01</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Mineral oil</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Needle holder</td>
			<td>Fine Science Tools&#160; www.finescience.de</td>
			<td>26016-12</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Clear tape, 50 mm x 66 m</td>
			<td>www.5staroffice.com</td>
			<td align="right">295985</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">FGF4 protein</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>A gift from Cliff Tabin.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">all-trans-retinoic acid</td>
			<td>Sigma&#160; www.sigmaaldrich.com</td>
			<td>R2625-50MG</td>
			<td>Remember to protect from light.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">BMS 493</td>
			<td>Sigma&#160; www.sigmaaldrich.com</td>
			<td>B6688-5MG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Scalpel blade No. 15</td>
			<td>www.swann-morton.com</td>
			<td>cat no. 0105</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Affi-Gel Blue, affinity chromatography gel</td>
			<td>Bio-Rad&#160; www.bio-rad.com</td>
			<td>153-7301</td>
			<td>Beads for delivering protein.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">AG1-X2 Ion exchange resin</td>
			<td>Bio-Rad&#160; www.bio-rad.com</td>
			<td>140-1251</td>
			<td>Beads for delivering RA or BMS 493.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Incubator for eggs</td>
			<td>Memmert&#160; www.hce-uk.com</td>
			<td>LAB128</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Paraformaldehyde (PFA)</td>
			<td>Sigma&#160; www.sigmaaldrich.com</td>
			<td>P6148-1KG</td>
			<td>Harmful, irritant, corrosive.&#160; Handle powder in fumehood with full protective clothing.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Ethanol</td>
			<td>Sigma&#160; www.sigmaaldrich.com</td>
			<td>32221-2.5L</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">DMEM, high glucose</td>
			<td>Gibco&#160; www.thermofisher.com</td>
			<td>41965-039</td>
			<td>500ml</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Dimethyl sulfoxide (DMSO)</td>
			<td>Fisher Scientific&#160; webshop.fishersci.com</td>
			<td>D/4121/PB08</td>
			<td>500ml</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Binocular Microscope&#160;</td>
			<td>Leica&#160;&#160; www.leica-microsystems.com</td>
			<td>MZ6</td>
			<td>Replaced by M60</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Chicken eggs</td>
			<td>Henry Stewart &#38; Co Ltd&#160;&#160; sales@medeggs.com</td>
			<td></td>
			<td>Brown Eggs</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

application of impermeable barriers combined with candidate factor soaked beads to study inductive signals in the chick

Kycklingembryo ger en superb ryggradsdjur modell som kan användas för att dissekera utvecklingsmässiga frågor på ett direkt sätt. Dess tillgänglighet och robusthet efter kirurgiskt ingrepp är viktiga experimentella styrkor. Mica plattorna var de första hindren som används för att förhindra chick lem knopp initiering 1. Protokoll som använder aluminiumfolie som en ogenomtränglig barriär mot ving knopp eller ben knopp induktion och eller initiering beskrivs. Vi kombinerar denna teknik med pärla placering i sidled till hinder för exogen tillförsel kandidat endogena faktorer som har blockerats av barriären. Resultaten analyseras med användning av in situ-hybridisering av efterföljande genexpression. Vårt huvudsakliga fokus ligger på sig rollen av retinsyra signalering i induktion och senare initiering av kycklingembryo förgrunden och bakbenen. Vi använder BMS 493 (en invers agonist av retinsyrareceptorer (RAR)) bomullstrasa pärlor implanterade i den laterala plattan mesoderm (LPM) för att efterlikna effekten av en bartransportören placeras mellan somites (en källa av retinsyra (RA)) och LPM som lem knoppar växa. Modifierade versioner av dessa protokoll kan också användas för att ta itu med andra frågor om ursprung och tidpunkten för induktiva signaler. Förutsatt den region i kycklingembryo är tillgänglig vid den aktuella utvecklingsstadiet, kan en barriär placeras mellan de två vävnaderna och därav följande förändringar i utvecklingen som studerats. Exempel kan återfinnas i den växande hjärnan, axel förlängning och organutveckling, såsom lever eller njure induktion.

Protokollet beskrivs ovan beskriver de metoder som används i Nishimoto et al. Studerar 2015. Pappers lem knopp induktion och initiering i både fram- och bakbenen av kycklingembryo. Resultat efter införandet av ogenomträngliga barriärer för att förhindra utväxt av forelimb knopp har tidigare publicerats en, två, nio, men det har varit bara en studie som beskriver barriärer som förhindrar ben knopp initiering 1. Bakben data från Nishimoto et al. 2015 presenteras här som representativa resultat av studien av mRNA-expression efter barriär insättning. Tbx4 ​​Expression i LPM är inte tillräcklig för att initiera bakdelen utväxt: Figurerna 2B och C (tabell 2) visar att barriär infogning vid stadium 15 (Figur 2A) (se protokoll 3,2) leder till både Fgf10och FGF8 uttryck är frånvarande i benet knopp regionen (betecknad konsol) på den opererade höger sida. Jämför med oanvänd vänster sida. Dock är Tbx4 uttryck observeras vid både scen 19 och steget 23 på den opererade sidan (Figur 2D och E). Vi avslutar ensam att Tbx4 uttryck är inte tillräcklig för att initiera bakdelen utväxt från LPM. Andra studier i ungen har föreslagit att TBX genuttryck är tillräcklig för att initiera forelimb knopp bildning 12, 13. Figur 2C &#39;är inkluderad för att illustrera hur en barriär ser inbäddad i benet regionen av embryot stolpen fixering. I själva verket oftast hinder avlägsnades före in situ-hybridisering (protokoll 4,3). RA från somites är viktigt i LPM innan Fgf10 Orsakar Limb Bud Outgrowth: Figur 3A är en schematisk representerar tillsatsen av en RA indränkt vulst distalt om en barriär införd vid steg 15 (protokoll 3.2.1.3). Efter denna operation lem knopp utväxt (som betecknas med en asterisk) observeras på den opererade höger och Tbx4, Fgf10 och FGF8 uttrycks i sin linda eftersom de är i kontroll vänster sida (Figur 3B, C och D, Tabell 2) . Sålunda tillsats av RA till LPM övervinner effekten av barriären och lem knopp initierings- fortskrider. Vi drar slutsatsen att i normal utveckling RA från somites är viktigt i LPM innan lem knopp utväxt kan initieras. De resulterande bakdelen knoppar är i allmänhet mindre än på kontrollsidan. Detta kan bero på att RA dos i LPM är inte ekvivalent med vildtypen situationen. Om RA dosen är för hög apikala Ectodermal Ridge (AER) kan förkortas och mindre knoppar skulle resultera14, 15. För att bekräfta att RA (från somites) i LPM krävs för normal extremitetsanlag initiering en invers agonist av RAR, BMS 493, användes. Pärlor implanteras i benområdet LPM vid steg 15 (se protokoll 3.2.1.4) (figur 3E). Fgf10 expression nedregleras efter applicering av BMS 493 pärlor i LPM, vilket resulterar i mindre bakben knoppar jämfört med kontrollsidan (figur 3F; Tabell 3). Kontroll DMSO pärlor inte orsaka dessa defekter (figurerna 3G och 3H, tabell 3). Defekterna observerades efter BMS 493 ansökan är mildare än de som induceras av en barriär operation; dvs Fgf10 fortfarande uttrycks och lem knoppar bildas. Detta kommer sannolikt att bero på effekterna av BMS 493 begränsas lokalt runt kulorna och får inte kunna motverka alla RA som produceras av axial vävnader. Tidigt Axial Signaler Ange LPM Celler som Senare Express Tbx4: Vi testade när LPM förvärvar sin förmåga att uttrycka Tbx4 i den blivande benet bildande regionen. Den tidigaste tidpunkt när en barriär kan införas som senare kommer att blockera benet knopp utväxt, är steget 10. Vi är de första att utveckla ett protokoll för att sätta hinder i etapper tidigare än steget 12. Hinder insatta mellan det paraxiella mesoderm och presumtiva benet LPM vid steg 10 (se protokoll 3,4) blocket benet knopp bildningen och uttrycket av Tbx4 i benet bildande LPM (figurerna 2F och 2G, tabell 2), vilket antyder att en signal från axiella vävnader vid steg 10 krävs för senare uttryck av Tbx4 i bakbens LPM. Jämför detta resultat med figurerna 2D och E där senare barriär insättning tillåter Tbx4 uttrycksom skall upprättas. Dessutom undersökte vi om denna axiella signal skulle kunna vara RA genom att observera huruvida omvänd agonist av RAR reducerar Tbx4 uttryck. En BMS 493 pärla placeras i bakdelen LPM vid steg 10 (se protokoll 3.4.1.3) nedreglerar Tbx4 uttryck (figurerna 2H och 2i), medan kontroll pärlor indränkt i DMSO inte påverkar Tbx4 uttryck (fig 2J och 2K). Tillsammans utgör dessa resultat stöder en modell som en RA-signal från axiella vävnader reglerar lem induktion av positivt reglera Tbx4 i bakbenen LPM 7. Postoperativ död: Tabellerna 1, 2 och 3 redogöra för experimentella resultat inklusive antalet kycklingembryon som dog efter operation och före skörden. Vissa dödsfall är att vänta efter mikro av detta slag. Talen döende kan hållas<html> till ett minimum genom att se till att instrumenten är rena, hålet i ägget är den minsta storlek som krävs, att embryona lämnas utan skydd av den klibbiga tejpen minst tid och i samband med denna sista punkt att verksamheten utförs så snabbt som möjligt. Ingen av dessa operationer är mycket tidskrävande men verksamheten omfattar pärlor och barriärer ta lite mer tid. Trots dessa åtgärder, som genomförs på de tidigaste stadierna och de i flygeln regionen är mer benägna att leda till döden. Det finns stora blodkärl runt lem bildande regioner och oavsiktlig bristning av dessa fartyg kan leda till döden på grund av blodförlust. Vi finner att ägg öppnade i skede 8 eller 9, vars embryon inte har opererats, kommer ofta dö genom nästa dag. Därför är den enda lösningen på dessa problem är att utföra ett stort antal experiment. d / 54.618 / 54618fig2.jpg &quot;/&gt; Figur 2. markörgenuttryck Förändringar efter Barrier eller Bead Insättning på Presumtiva Leg nivå. (A) Schematisk visning barriärposition (grön linje) till presumtiva benet nivå (somiter 26-32) i ett skede 15 embryo. (B - E och G) WISH analys drivs embryon. Benet region beskrivs (parentes). (B) Fgf10 uttryck är frånvarande i den opererade LPM, men robust uttryck detekteras i den vänstra linda. (C) FGF8 uttryck är frånvarande i den opererade sidan, vilket tyder på att det inte finns någon AER. (C &#39;) Samma embryo före barriären avlägsnades. (D) Tbx4 uttrycks i LPM vid samma Rostro-caudal nivå som kontroll linda. (E) Tbx4 expression bibehålls i det högra benet regionen trots frånvaro av lem tillväxt. (F) Schematiskt diagram av en etapp<html> 10 kycklingembryo visar spärrläge (grön linje) på presumtiva benet nivå. (G) Tbx4 uttryck är frånvarande i den opererade höger LPM (konsol). (H) Skiss av en scen 10 kycklingembryo visar BMS 493 pärla läge (lila cirkel) på presumtiva benet nivå. (I) Tbx4 expression nedregleras på den opererade höger sida efter behandling med BMS 493. (J) Schematiskt diagram av en etapp 10 kycklingembryo som visar styr DMSO bead position (grå cirkel). (K) Tbx4 uttrycks på den opererade högra sidan på en liknande nivå med den hos kontroll vänster sida efter behandling med enbart DMSO. Denna siffra har ändrats från 7. <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/54618/54618fig2large.jpg" target="_blank">Klicka här för att se en större version av denna siffra.</a> d / 54.618 / 54618fig3.jpg &quot;/&gt; Figur 3. RA räddar Limb Bud frånvaro orsakad av Barrier Insertion och är viktigt i LPM Före Leg Bud utväxt. (A) Schematisk indikerar barriärläge (grön linje) på presumtiva benet nivå (somites 26-32) och en RA-indränkt pärla (röd cirkel). (B - D) RA räddar benet knopp utväxt (visas med en asterisk). (B) Tbx4 uttryck förekommer i den räddade benet knopp som liknar den icke-opererade sidan. (C) Fgf10 uttrycks i räddade benet knopp liknar en icke-opererad sida. (D) FGF8 uttrycks i AER av de räddade höger ben knopp. (E) Schematisk som indikerar var BMS 493 pärlor (lila cirklar) placerades i det presumtiva benet LPM av scen 15 embryon. (F) Fgf10 uttryck nedregleras på den opererade höger och benet knopp är liten följande BMS 493 behandling. Pärlor är asterisk. (G) Liknande schema till (E), som anger läget för styr DMSO pärlor (grå cirklar). (H) DMSO pärlor (visas med asterisker) påverkade inte Fgf10 uttryck eller ben bud storlek. Denna siffra har ändrats från 7. <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/54618/54618fig3large.jpg" target="_blank">Klicka här för att se en större version av denna siffra.</a> <table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody><tr><td> Stage barriär placerad (+ pärla) * </td><td> antal drivs </td><td> Vinge saknas ** </td><td> Wing föreliggande ** </td><td> antal döda </td></tr><tr><td> stadium 12-14 </td><td> 40 </td><td> 24 </td><td> 1 </td><td> 15 </td></tr><tr><td> stadium 8/9 </td><td> 65 </td><td> 23 </td><td> 0 </td><td> 42 </td></tr><tr><td> Stadium 12-13 (FGF4 bead) </td><td> 41 </td><td> 7 (bead saknas) </td><td> 17 </td><td> 17 </td></tr><tr><td> Stage 12-13 (RA pärla) </td><td> 75 </td><td> 9 (bead saknas) </td><td> 32 </td><td> 34 </td></tr><tr><td> Stage 13 (kontroll pärla) </td><td> 5 </td><td> 3 </td><td> 0 </td><td> 2 </td></tr><tr><td colspan="5"> * 0,7-1 mm folie hinder placerade mellan somites 15-20 och sidoplåten mesoderm. 0,35 mg / ml FGF4 pärla. 0,05-0,1 mg / ml RA pärla. </td></tr><tr><td colspan="5"> DMSO kontroll pärla. </td></tr><tr><td colspan="5"> ** Kycklingembryon fasta stegen 21-23 </td></tr></tbody></table> Tabell 1. Wing nivå Barrier och Bead Experiment Resultat. <table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody><tr><td> Stage barriär placerad (+ pärla) * </td&gt; <td> antal drivs </td><td> Ben saknas ** </td><td> Benet föreliggande ** </td><td> antal döda </td></tr><tr><td> stadium 12-15 </td><td> 43 </td><td> 39 </td><td> 0 </td><td> 4 </td></tr><tr><td> stadium 10/11 </td><td> 23 </td><td> 16 </td><td> 0 </td><td> 7 </td></tr><tr><td> Stadium 15 (FGF4 bead) </td><td> 8 </td><td> 0 </td><td> 5 </td><td> 3 </td></tr><tr><td> Stage 15 (RA pärla) </td><td> 18 </td><td> 0 </td><td> 18 </td><td> 0 </td></tr><tr><td colspan="5"> * 0,7-1,3 mm folie hinder placerade mellan somites 26-32 och sidoplåten mesoderm. 0,35 mg / ml FGF4 pärla. 0,05-0,1 mg / ml RA pärla. </td></tr><tr><td colspan="5"> ** Kycklingembryon fasta stegen 18-24 </td></tr></tbody></table> Tabell 2. Ben nivå Barrier och Bead Experiment Resultat. <table border = &quot;1&quot; fo: keep-together.within-page = &quot;1&quot; fo: keep-med-next.within-page = &quot;always&quot;&gt; <tbody><tr><td> antal drivs </td><td> Benet knopp liten </td><td> Leg knopp något mindre </td><td> Leg knopp normal storlek </td><td> antal döda </td></tr><tr><td> BMS 493 pärlor * </td><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td> 15 </td><td> 12 </td><td> 3 </td><td> 0 </td><td> 0 </td></tr><tr><td> DMSO pärlor ** </td><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td> 12 </td><td> 0 </td><td> 3 </td><td> 9 </td><td> 0 </td></tr><tr><td colspan="5"> * 2-3 pärlor indränkt i 5 mg / ml BMS 493 placerad i rätt skede 14-15 LPM i etapp nivå. </td></tr><tr><td colspan="5"> ** 2-3 pärlor indränkt i DMSO enbart placeras i rätt skede 15 LPM i etapp nivå. </td></tr><tr><td colspan="5"> Kycklingembryon fast vid stegen 17-19. </td></tr></tbody></table> Tabell 3. Leg Level BMS 493 Bead Experiment Resultat.

Watch this Scientific Journal Video about Application of Impermeable Barriers Combined with Candidate Factor Soaked Beads to Study Inductive Signals in the Chick at JoVE.com

Application of Impermeable Barriers Combined with Candidate Factor Soaked Beads to Study Inductive Signals in the Chick

Protocols using impermeable barriers to block induction events between tissues of the main body axis and flank in the chick embryo required for limb formation are described. Beads soaked in candidate inductive signals are used to overcome the effect of barrier placement and analysis of gene expression confirms this.

Tillämpning av Ogenomträngliga hinder Kombinerat med kandidat faktor Fuktiga pärlor att studera Induktiva signaler i Chick

The chick embryo provides a superb vertebrate model that can be used to dissect developmental questions in a direct way. Its accessibility and robustness ...

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

Forward Genetic Approach to Uncover Stress Resistance Genes in Mice &#8212; A High-throughput Screen in ES Cells

Forward Genetic Approach to Uncover Stress Resistance Genes in Mice ÃƒÂ¢Ã¢â€šÂ¬Ã¢â‚¬Â A High-throughput Screen in ES Cells

Framåt Genetisk strategi för Avslöja Stress resistensgener i möss - En hög kapacitet skärm i ES-celler

Phenotype-driven genetic screens in mice is a powerful technique to uncover gene functions, but are often hampered by extremely high costs, which severely ...

Analysis of Zebrafish Larvae Skeletal Muscle Integrity with Evans Blue Dye

Analys av Zebrafish Larver skelettmuskulatur Integrity med Evans Blue Dye

The zebrafish model is an emerging system for the study of neuromuscular disorders.  In the study of neuromuscular diseases, the integrity of the muscle ...

Application of Chronic Stimulation to Study Contractile Activity-induced Rat Skeletal Muscle Phenotypic Adaptations

Tillämpningen av kronisk stimulering att studera kontraktila aktivitet-inducerad råtta skelettmuskulaturen fenotypiska anpassningar

Skeletal muscle is a highly adaptable tissue, as its biochemical and physiological properties are greatly altered in response to chronic exercise. To ...

Application of RNAi and Heat-shock-induced Transcription Factor Expression to Reprogram Germ Cells to Neurons in C. elegans

Application of RNAi and Heat-shock-induced Transcription Factor Expression to Reprogram Germ Cells to Neurons in C. elegans

Tillämpningen av RNAi och värme-chock-inducerad transkription faktorn uttryck att omprogrammera könsceller att nervceller i C. elegans

Studying the cell biological processes during converting the identities of specific cell types provides important insights into mechanism that maintain ...

Cell Aggregation Assays to Evaluate the Binding of the Drosophila Notch with Trans-Ligands and its Inhibition by Cis-Ligands

Cell Aggregation Assays to Evaluate the Binding of the Drosophila Notch with Trans-Ligands and its Inhibition by Cis-Ligands

Cell Aggregation analyser att utvärdera bindningen av Drosophila skåran med Trans-ligander och dess hämning av Cis-ligander

Notch signaling is an evolutionarily conserved cell-cell communication system used broadly in animal development and adult maintenance. Interaction of the ...

Three-dimensional Rendering and Analysis of Immunolabeled, Clarified Human Placental Villous Vascular Networks

Tredimensionell Rendering och analys av Immunolabeled, klargöras mänskliga placenta villösa vaskulär nätverk

Nutrient and gas exchange between mother and fetus occurs at the interface of the maternal intervillous blood and the vast villous capillary network that ...

Efficient Generation of Pancreas/Duodenum Homeobox Protein 1+ Posterior Foregut/Pancreatic Progenitors from hPSCs in Adhesion Cultures

Efficient Generation of Pancreas/Duodenum Homeobox Protein 1+ Posterior Foregut/Pancreatic Progenitors from hPSCs in Adhesion Cultures

Effektiv generering av bukspottkörteln/tolvfingertarmen Homeobox Protein 1+ bakre framtarmen/pankreas stamfäder från hPSCs i vidhäftning kulturer

Human pluripotent stem cell (hPSC)-derived pancreatic cells are a promising cell source for regenerative medicine and a platform to study human ...

Visualization of Tangential Cell Migration in the Developing Chick Optic Tectum

Visualisering av tangentiella cellmigration i den framkallande Chick fiberoptiska Tectum

Time-lapse imaging is a powerful method to analyze migrating cell behavior. After fluorescent cell labeling, the movement of the labeled cells in culture ...

In Vitro Generation of Somite Derivatives from Human Induced Pluripotent Stem Cells

I Vitro Generation av Somite derivat från mänskliga inducerade stamceller pluripotenta

In response to signals such as WNTs, bone morphogenetic proteins (BMPs), and sonic hedgehog (SHH) secreted from surrounding tissues, somites (SMs) give ...

In Vitro Reconstitution of Spatial Cell Contact Patterns with Isolated Caenorhabditis elegans Embryo Blastomeres and Adhesive Polystyrene Beads

In Vitro Reconstitution of Spatial Cell Contact Patterns with Isolated Caenorhabditis elegans Embryo Blastomeres and Adhesive Polystyrene Beads

In vitro-beredning av rumslig cell kontakt mönster med isolerad Caenorhabditis elegans embryo Blastomeres och lim polystyren pärlor

In multicellular systems, individual cells are surrounded by the various physical and chemical cues coming from neighboring cells and the environment. ...