Name: an acute retinal model for evaluating blood retinal barrier breach and potential drugs for treatment
Uploaded: 2016-09-13T15:00:00
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Bringhurst Meats (Berlin, NJ) is acknowledged for their genuine help in providing the swine eyeballs.

Alle Protokolle wurden in Übereinstimmung mit den Richtlinien der Institutional Animal Care und Use Committee gegebenenfalls durchgeführt. 1. Vorbereitung <ol><li> Bereiten Sie die Stabilisierungsmedien mit 75% Dulbecco modifiziertem Eagle Medium (DMEM), 25% Hanks &#39;Balanced Salt Solution (HBSS). Gut mischen, aliquotieren und bei -20 ° C bis zur Verwendung. </li><li> Bereiten Sie die Phosphat-gepufferte Saline (PBS) und durch Autoklavieren sterilisieren. Bewahren Sie die Lösung bei ...

<ol>
	<li>Cunha-Vaz, J., Bernardes, R., Lobo, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Blood-retinal+barrier.">Blood-retinal barrier.</a> J Ophthalmol. 21, 3 (2011).</li><li>Kim, J. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Blood-neural+barrier:+intercellular+communication+at+glio-vascular+interface.">Blood-neural barrier: intercellular communication at glio-vascular interface.</a> J Biochem Molec Biol. 39, 339-345 (2006).</li><li>Kumagai, A. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Glucose+transport+in+brain+and+retina:+implications+in+the+management+and+complications+of+diabetes.">Glucose transport in brain and retina: implications in the management and complications of diabetes.</a> Diabetes Metab Res Rev. 15, 261-273 (1999).</li><li>Runkle, E. A., Antonetti, D. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+blood-retinal+barrier:+structure+and+functional+significance.">The blood-retinal barrier: structure and functional significance.</a> Methods Molec Biol. 686, 133-148 (2011).</li><li>Takata, K., Hirano, H., Kasahara, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transport+of+glucose+across+the+blood-tissue+barriers.">Transport of glucose across the blood-tissue barriers.</a> Int Rev Cytol. 172, 1-53 (1997).</li><li>Goncalves, A., Ambrosio, A. F., Fernandes, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regulation+of+claudins+in+blood-tissue+barriers+under+physiological+and+pathological+states.">Regulation of claudins in blood-tissue barriers under physiological and pathological states.</a> Tissue Barriers. 1, 24782 (2013).</li><li>Patton, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Retinal+image+analysis:+concepts,+applications+and+potential.">Retinal image analysis: concepts, applications and potential.</a> Prog Ret Eye Res. 25, 99-127 (2006).</li><li>Di Marco, L. 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G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vivo+three-photon+microscopy+of+subcortical+structures+within+an+intact+mouse+brain.">In vivo three-photon microscopy of subcortical structures within an intact mouse brain.</a> Nat Photonics. 7, (2013).</li><li>Sedeyn, J. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Histamine+Induces+Alzheimer's+Disease-Like+Blood+Brain+Barrier+Breach+and+Local+Cellular+Responses+in+Mouse+Brain+Organotypic+Cultures.">Histamine Induces Alzheimer's Disease-Like Blood Brain Barrier Breach and Local Cellular Responses in Mouse Brain Organotypic Cultures.</a> Biomed Res Int. 2015, 937148 (2015).</li><li>Avdeef, A., Deli, M. A., Neuhaus, W., Di, L., Kerns, E. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Blood-Brain Barrier in Drug Discovery: Optimizing Brain Exposure of CNS Drugs and Minimizing Brain Side Effects for Peripheral Drugs. , 188 (2014).</li><li>Eigenmann, D. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comparative+study+of+four+immortalized+human+brain+capillary+endothelial+cell+lines,+hCMEC/D3,+hBMEC,+TY10,+and+BB19,+and+optimization+of+culture+conditions,+for+an+in+vitro+blood-brain+barrier+model+for+drug+permeability+studies.">Comparative study of four immortalized human brain capillary endothelial cell lines, hCMEC/D3, hBMEC, TY10, and BB19, and optimization of culture conditions, for an in vitro blood-brain barrier model for drug permeability studies.</a> Fluids Barriers CNS. 10, 33 (2013).</li><li>Takeshita, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+in+vitro+blood-brain+barrier+model+combining+shear+stress+and+endothelial+cell/astrocyte+co-culture.">An in vitro blood-brain barrier model combining shear stress and endothelial cell/astrocyte co-culture.</a> J Neurosci Methods. 232, 165-172 (2014).</li><li>Alberghina, M., Lupo, G., Anfuso, C. D., Moro, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Palmitate+transport+through+the+blood-retina+and+blood-brain+barrier+of+rat+visual+system+during+aging.">Palmitate transport through the blood-retina and blood-brain barrier of rat visual system during aging.</a> Neurosci Lett. 150, 17-20 (1993).</li><li>Hosoya, K., Yamamoto, A., Akanuma, S., Tachikawa, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lipophilicity+and+transporter+influence+on+blood-retinal+barrier+permeability:+a+comparison+with+blood-brain+barrier+permeability.">Lipophilicity and transporter influence on blood-retinal barrier permeability: a comparison with blood-brain barrier permeability.</a> Pharm Res. 27, 2715-2724 (2010).</li><li>Minamizono, A., Tomi, M., Hosoya, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Inhibition+of+dehydroascorbic+acid+transport+across+the+rat+blood-retinal+and+-brain+barriers+in+experimental+diabetes.">Inhibition of dehydroascorbic acid transport across the rat blood-retinal and -brain barriers in experimental diabetes.</a> Biol Pharm Bull. 29, 2148-2150 (2006).</li><li>Serlin, Y., Levy, J., Shalev, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Vascular+pathology+and+blood-brain+barrier+disruption+in+cognitive+and+psychiatric+complications+of+type+2+diabetes+mellitus.">Vascular pathology and blood-brain barrier disruption in cognitive and psychiatric complications of type 2 diabetes mellitus.</a> Cardiovasc Psychiatry Neurol. 2011, 609202 (2011).</li><li>Kolb, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=How+the+retina+works+-+Much+of+the+construction+of+an+image+takes+place+in+the+retina+itself+through+the+use+of+specialized+neural+circuits.">How the retina works - Much of the construction of an image takes place in the retina itself through the use of specialized neural circuits.</a> Am Sci. 91, 28-35 (2003).</li><li>Ikram, M. K., Cheung, C. Y., Wong, T. Y., Chen, C. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Retinal+pathology+as+biomarker+for+cognitive+impairment+and+Alzheimer's+disease.">Retinal pathology as biomarker for cognitive impairment and Alzheimer's disease.</a> J Neurol Neurosurgery Psychiatry. 83, 917-922 (2012).</li><li>Tan, Z., Ge, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Amyloid-beta,+the+retina,+and+mouse+models+of+Alzheimer+disease.">Amyloid-beta, the retina, and mouse models of Alzheimer disease.</a> Am J Pathol. 176, 2055 (2010).</li><li>Serhan, C. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pro-resolving+lipid+mediators+are+leads+for+resolution+physiology.">Pro-resolving lipid mediators are leads for resolution physiology.</a> Nature. 510, 92-101 (2014).</li><li>Bucolo, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effects+of+topical+indomethacin,+bromfenac+and+nepafenac+on+lipopolysaccharide-induced+ocular+inflammation.">Effects of topical indomethacin, bromfenac and nepafenac on lipopolysaccharide-induced ocular inflammation.</a> J Pharm Pharmacol. 66, 954-960 (2014).</li><li>Edelman, J. L., Lutz, D., Castro, M. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Corticosteroids+inhibit+VEGF-induced+vascular+leakage+in+a+rabbit+model+of+blood-retinal+and+blood-aqueous+barrier+breakdown.">Corticosteroids inhibit VEGF-induced vascular leakage in a rabbit model of blood-retinal and blood-aqueous barrier breakdown.</a> Exp Eye Res. 80, 249-258 (2005).</li></ol>

In this report, we present a powerful ex vivo acute retinal model of BRB dysfunction using the swine retina. This model system does not require special instruments and can be easily adapted under most laboratory settings. However, to obtain a successful result, several steps require close attention. After obtaining the eyeballs from the source, they must be kept at 4 &#176;C or on ice and processed as soon as possible. When the effect of a treatment is being analyzed, two halves of the same retina must be used -...

Eine wachsende Zahl von Hinweisen unterstützt die Existenz von Blut Retina - Schranke (BRB) 1-5 und seine Ähnlichkeit mit dem Blut - Hirn - Schranke (BBB) ​​6,7. Kompromiss der BBB wurde ursächlich oder als diagnostischer Marker für chronische neurodegenerative Erkrankungen, wie Alzheimer-Krankheit (AD) 8,9 und akuter Erkrankungen wie Delirium 10 fest verbunden. Mechanistische Einblicke in diese Pathologien und Entdeckungen für potentielle Arzneimittelziele werden durch die begrenzte Zugänglichkeit und Netzwerk Kompliziertheit des Gehirns im Allgemeinen behindert. Alternativen , wie beispielsweise in vivo - Bildgebung 11, Gehirn organotypische Kultur 12, primären Zellkulturen 13,14 und Co-Kultursysteme 15 erzeugt worden sind . Allerdings sind die meisten dieser Modelle erfordern spezielle Instrumente, lange Versuchszeiten oder mehrere Marker-Zellen zu identifizieren. Funktionelle und strukturelle Ähnlichkeiten zwischen BBB und BRB sowie eine Korrelation zwischen der dysfunctions der beiden wurden 16-19 argumentiert. Zusätzlich leichteren Zugang, gut definierte Zelltypen und eine Schichtstruktur haben, die gut charakterisierten Netzhaut als ein Fenster zum Gehirn erlaubt. Die strukturellen und funktionellen Identität der BBB und BRB bleiben im Detail verglichen werden. Jedoch retinale Pathologien, insbesondere die BRB Verletzung, wurden ebenfalls mit dem Fortschreiten von verschiedenen Krankheiten eng in Verbindung gebracht worden, einschließlich Diabetes 18-19 und AD 21,22. Somit ist es von Interesse, eine BRB Dysfunktion System zu etablieren, nicht nur den Mechanismus zu beschreiben, sondern auch potentielle Arzneimittel zu screenen. In diesem Bericht wird ein Protokoll ermöglicht BRB Dysfunktion eine einfache akute retinale Kultur unter Verwendung entwickelt und präsentiert. Erhöht BBB Permeabilität und AD-ähnliche pathologische Veränderungen wurden in einem Gehirn organotypischen Kultur etabliert mit Histamin inkubiert, einem pro-inflammatorischen Mediators 12. Daher wird in dem dargestellten System war Histamin applied zur ex - vivo - Retinal Kultur BRB Dysfunktion zu induzieren. Retinas von mehreren Arten, wie Mus musculus und Bos Taurus, getestet wurden. Aufgrund ihrer kommerziellen Verfügbarkeit und Ähnlichkeit mit menschlichem Gewebe, frisch wurden Schweine Augäpfel verwendet, um die Daten hier berichtet zu liefern. Nach Inkubation mit Histamin und / oder andere Medikamente wurden die Retinas zur Auswertung verarbeitet durch Immunfärbung für mehrere Proteine ​​12, wie Immunoglobulin G (IgG), eine der Hauptkomponenten des Blutes; glial fibrillary acidic protein (GFAP), ein bekannter Marker für Gliazellen Aktivierung; und Mikrotubuli-assoziierten Protein 2 (MAP2), ein Neuron-spezifischen Zytoskelettprotein essentiell für Mikrotubuluszusammenbau. Darüber hinaus ermöglicht die geschichtete Struktur der Netzhaut, eine detaillierte Analyse der Prozesse der Müller-Zellen und Ganglionzellen, wie beispielsweise Veränderungen in ihrer Breite und Kontinuität. So einige zusätzliche Parameter zur Verfügung, die Folgen der zu bewertenBRB Verletzung in einem frühen Stadium und auch die Umkehrung Auswirkungen möglicher Behandlungen zu bewerten. In diesem Protokoll werden mögliche Umkehrung Wirkungen gescreent Drogen aus drei Perspektiven bewertet: das Austreten von Blutgefäßen (BVs), die Aktivierung von Gliazellen und beschädigungs Reaktion von neuronalen Zellen. Mehrere Quantifizierungsverfahren werden verwendet, zum Beispiel die Expressionsniveaus von einem Verbesserungsfilter dargestellt durch Intensität der Immunfärbung Breitenmessung eines Prozesses und die Kontinuität der neuronalen Prozesse gezeigt. Zum besseren Verständnis der Methode veranschaulichen und zu helfen , Ergebnisse zu interpretieren, Lipoxin A4 (LXA 4) eine Verbindung synthetisiert endogen als Reaktion auf entzündliche Verletzungen und mildernde endotheliale Dysfunktion 23, wurde zu Demonstrationszwecken gewählt.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="984">
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:291px;">DMEM</td>
			<td style="width:269px;">Life Technologies&#160;</td>
			<td style="width:119px;">11965-092</td>
			<td style="width:305px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:291px;">HBSS</td>
			<td style="width:269px;">Life Technologies&#160;</td>
			<td style="width:119px;">14170-112</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:291px;">Sucrose</td>
			<td style="width:269px;">J.T.Baker</td>
			<td style="width:119px;">4072-05</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:291px;">Histamine&#160;</td>
			<td style="width:269px;">Sigma</td>
			<td style="width:119px;">H7125-1G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:291px;">Penicillin-Streptomycin&#160;</td>
			<td style="width:269px;">Invitrogen</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:291px;">PFA</td>
			<td style="width:269px;">Electron Microscopy Sciences</td>
			<td style="width:119px;">15710</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:291px;">Freezing Media&#160;</td>
			<td style="width:269px;">Triangle Biomedical Sciences</td>
			<td style="width:119px;">TFM-5</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:291px;">Normal Goat Serum&#160;</td>
			<td style="width:269px;">Rockland</td>
			<td style="width:119px;">D104-00-0050</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:291px;">Triton X-100</td>
			<td style="width:269px;">Sigma</td>
			<td style="width:119px;">T8787</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:291px;">GFAP Antibody</td>
			<td style="width:269px;">Millipore</td>
			<td style="width:119px;">AB5804</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:291px;">MAP2 Antibody</td>
			<td style="width:269px;">EMD Millipore</td>
			<td style="width:119px;">MAB3418</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:291px;">FITC conjugated Donkey anti-rabbit IgG</td>
			<td style="width:269px;">Jackson ImmunoResearch Laboratories, Inc.</td>
			<td style="width:119px;">711-095-152</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:291px;">Cy3 conjugated Donkey anti-mouse IgG</td>
			<td style="width:269px;">Jackson ImmunoResearch Laboratories, Inc.</td>
			<td style="width:119px;">715-165-150</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:291px;">mounting medium containing DAPI</td>
			<td style="width:269px;">Vector Laboratories, Inc.</td>
			<td style="width:119px;">H-1200</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:291px;">Laser Confocal Microscope</td>
			<td style="width:269px;">Nikon</td>
			<td style="width:119px;">Eclipse Ti microscope</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:291px;">ImageJ</td>
			<td style="width:269px;">National Institutes of Health</td>
			<td style="width:119px;">1.45s</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

an acute retinal model for evaluating blood retinal barrier breach and potential drugs for treatment

A low-cost, easy-to-use and powerful model system is established to evaluate potential treatments that could ameliorate blood retinal barrier breach. An inflammatory factor, histamine, is demonstrated to compromise vessel integrity in the cultured retina through positive staining of IgG outside of the blood vessels. The effects of histamine itself and those of candidate drugs for potential treatments, such as lipoxin A4, are assessed using three parameters: blood vessel leakage via IgG immunostaining, activation of M&#252;ller cells via GFAP staining and change in neuronal dendrites through staining for MAP2. Furthermore, the layered organization of the retina allows a detailed analysis of the processes of M&#252;ller and ganglion cells, such as changes in width and continuity. While the data presented is with swine retinal culture, the system is applicable to multiple species. Thus, the model provides a reliable tool to investigate the early effects of compromised retinal vessel integrity on different cell types and also to evaluate potential drug candidates for treatment.

Wir stellen eine kostengünstige, zeitsparende und einfach zu bedienendes System, mögliche Behandlungen zu bewerten, die gegen die BRB Verletzung durch Histamin induzierte schützen könnte. IgG wird in den Gefäßen in Kontrollnetzhaut (Abbildung 1A) beschränkt, sondern tritt aus der Blutgefäße auf Histamin - Exposition (Abbildung 1B), was bestätigt , dass das Modell erfolgreich etabliert. <p class="jove_content" fo:keep-together.within-page="1...

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An Acute Retinal Model for Evaluating Blood Retinal Barrier Breach and Potential Drugs for Treatment

Eine kostengünstige, einfach zu bedienende und leistungsfähige System etabliert mögliche Behandlungen zu bewerten, die Blut Retina-Schranke Verletzung durch Histamin induzierte verbessern könnte. Blutgefäße Leckage, Müller-Zell-Aktivierung und die Kontinuität der neuronalen Prozesse werden genutzt, um die Schadensantwort und deren Umkehrung mit einem potenziellen Medikament, Lipoxin A4 zu beurteilen.

Eine akute Retinal Modell zur Bewertung von Blut Retinal Barrier Breach und potenzielle Medikamente für die Behandlung

A low-cost, easy-to-use and powerful model system is established to evaluate potential treatments that could ameliorate blood retinal barrier breach. An ...

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